CN111925986A - 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脐带间充质干细胞无血清培养基，包括维生素H，转铁蛋白，血清白蛋白，血小板衍生生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，转化生长因子，纳米粒子胆固醇，芹菜素以及茉莉酮酸甲酯；可显著提高间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，并有效降低细胞致畸率，还解决了现有技术存在的常规血清或蛋白培养基存在存活率低且代数品质不够的问题。

Description

一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是人体中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞，广泛分布于动物体内的骨髓、肝脏和脂肪等多种组织中。其有较好的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，同时MSCs还是一种重要的免疫调节细胞。MSCs在炎症细胞因子刺激后对免疫系统表现出很强的抑制作用，可以减少体内的免疫排斥，延长移植物的存活时间。因此，间充质干细胞在组织工程中的化骨、软骨，心肌构建的种子细胞和在造血干细胞、器官移植中具有广泛的应用前景。
传统上，间充质干细胞的培养方法是使用含有动物血清的培养基培养。为了使细胞在体外维持的时间更长，促进细胞增殖，通常选择在基础培养基中添加 1%～20%的小牛血清（用于重组蛋白）或胎牛血清（用于杂交瘤生产单抗）。虽然来源于动物体的血清是复杂的多成分混合物，含有的生长因子、蛋白质、维生素、微量元素、激素等可促进细胞生长，刺激产物分泌，并可保护细胞免受环境 pH、剪切力及蛋白酶等的损伤。但血清的使用在大规模工业化生产中存在许多问题：①来源污染问题；②季节与地域的不同以及动物个体或群体的差异均会造成血清的批间差异；③成分复杂问题；④下游的纯化区分困难。因此，单抗药物的生产工艺中已不再添加血清作为细胞生长的辅助成分，无血清培养成为哺乳动物细胞规模化培养的趋势。
当前，无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，以满足干细胞的培养要求，同时避免因使用血清带来的诸多不利因素。无血清培养基大致可分为以下几类：①无血清培养基，不含血清，但含有大量的动物或植物蛋白（如 BSA 和动物激素等）和其他一些细胞因子，这类方法仍然不利于目标蛋白的分离纯化；②无蛋白培养基，不含有大分子蛋白组分，但可能含有多肽片段（蛋白水解物），生产成本低，此类是目前市售的主要产品；③无动物源性组分培养基，该培养基不含动物源性或人源性组分，可能含有细菌或酵母水解物及植物水解物，细胞培养与生产易做到恒定无动物源，使用风险低；④化学界定培养基，培养基中所有成分均是明确的，不含有动物蛋白与植物水解物，可添加一些结构与功能已知的小分子化合物，如短肽、植物激素等。这种培养基质量稳定，有利于细胞目标产物的分析。
已有研究表明，在培养液中使用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等生长因子，以及三七总皂甙、丹参酮ⅡA等中药成分能有效促进干细胞的增殖。与干细胞生物学行为相关的生长因子主要有血小板衍生生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子。无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件，也是近年来的研究热点之一。
中国专利申请CN201410018678.2公开了一种培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基，所述无血清培养基以DMEM培养液为基础，还含有成纤维细胞生长因子受体2、生长激素、胰岛素、转铁蛋白、谷胱甘肽、BMP-4、L-谷氨酸胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及纳米粒子胆固醇。该无血清培养基可以实现胎盘间充质干细胞的贴壁生长，保持细胞的增殖能力。但是，该培养基中的纳米粒子胆固醇是一种具有强烈刺激性气味、毒性较高的有机化合物，引入的外延基因以及病毒基因，极易导致致畸提高，并严重影响后续代数的细胞品质，不容易在保证遗传背景的情形下延长和保证细胞代数。
中国专利申请CN201310134502.9公开了一种无血清的间充质干细胞培养基，该培养基在DMEM-LG培养基的基础上添加了碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、肝素、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子和丙酮酸钠等组分，但未添加促进贴壁的细胞因子，需要使用包被的培养器皿以提高贴壁性能，且未添加白蛋白等营养成分，增殖较缓慢等问题。
无血清培养虽然已经应用极广，但因为培养液的单一对应特征、场景细分需求、立体贴壁培养需要、致畸性能分化等问题，也存在较多缺陷。这类问题的解决，需要提出更优的培养基，可作为研究动物细胞生长、分化和发育的基础，还可用于在未来更复杂的建立体外疾病模型提供协助，故其具有巨大的潜在挖掘价值。
发明内容
为解决现有技术存在的相关问题，本发明提供了一种干细胞无血清培养基，通过添加指定量的芹菜素和茉莉酮酸甲酯，可显著提高干细胞的贴壁性能和增殖速率，并能有效的降低其致畸率，提升干细胞耐受特性，利于干细胞的增殖和特性保持，培养基的成分也相对较简单，成本较低，易于保存。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种间充质干细胞无血清培养基，包括维生素H，转铁蛋白，血清白蛋白，血小板衍生生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，转化生长因子，纳米粒子胆固醇，芹菜素以及茉莉酮酸甲酯。
优选的，所述无血清培养基中维生素H的浓度为2ug/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，所述芹菜素的浓度为15-22μg/mL，所述茉莉酮酸甲酯的浓度为9-15μg/mL。
优选的，所述无血清培养基中芹菜素的浓度为20μg/mL。
优选的，所述无血清培养基中茉莉酮酸甲酯的浓度为11μg/mL。
相对应的，制备方法为，取DMEM低糖培养基，加入维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞的无血清培养基。
茉莉酮酸甲酯，学名为2-戊烯基环戊酮-3-乙酸甲酯；其制备方法为利用双键在多相加氢催化剂作用下，催化含α，β双键的茉莉酮酸甲酯加氢生成顺式-二氢茉莉酮酸甲酯，在含α，β双键的茉莉酮酸甲酯在醇类或酯类溶剂中，用催化剂Pd/C进行加氢制备顺式-二氢茉莉酮酸甲酯；为了提高产品中顺式-二氢茉莉酮酸甲酯的含量，还可以加入了适量的有机铝化合物，使Pd/C的难以回收套用，且加入的溶剂也会和含α，β双键的茉莉酮酸甲酯以及其加氢产物二氢茉莉酮酸甲酯之间发生酯交换反应，虽然不影响产物中顺式-二氢茉莉酮酸甲酯所占比例，但是降低了顺式-二氢茉莉酮酸甲酯的收率。
芹菜素，又名芹黄素，有“植物雌激素”之称，属于黄酮类化合物。芹菜素化学名称为4’，5，7-三羟基黄酮，其中，4’， 5，7位置的三个羟基与之间的双键决定了其生物活性。因芹菜素在天然植物中的含量稀少、提取率较低，因此限制了芹菜素的发展和应用。合成法尤其是半合成法成为了制备芹菜素的主要方法。芹菜素可由芹菜甙酸化脱糖制得，而芹菜甙在自然界天然植物中含量也较少。由于柚皮甙广泛存在于自然界植物中，且含量较高，以柚皮甙为原料进行半合成是目前制备芹菜素最主要的方法；该方法在制备过程中使用大量吡啶作为反应溶剂，单质碘作为氧化剂。
本品中的芹菜素因应用于培养基，在得到粗品之后，将制得的芹菜素粗品溶解在氢氧化钠溶液中，进行第一次过滤，收集滤液，并向滤液中缓慢加入浓盐酸至pH为3～4，析出淡黄色固体后，进行第二次过滤，收集滤饼，将滤饼水洗至中性后用乙醇淋洗，干燥得芹菜素精品，更加安全卫生。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供了一种间充质干细胞无血清培养基，通过添加指定量的芹菜素和茉莉酮酸甲酯，可显著提高间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，并有效降低细胞致畸率，还解决了现有技术存在的常规血清或蛋白培养基存在存活率低且代数品质不够的问题，并通过添加纳米粒子胆固醇混合剂（NCM，nanoparticle cholesterol mixture）实现脂类的融入培养基问题，能够最大程度的避免使用乙醇或甘油类带来的附加毒性。
本发明的间充质干细胞的增殖和干细胞特性保持效果良好，培养基的成分较简单，成本较低，可以制得质量稳定的间充质干细胞无血清培养基。
附图说明
图1为不同浓度茉莉酮酸甲酯对间充质干细胞增值影响。
图2为初始时间间充质细胞培养基中的表面标志物的响应表达。
图3为48小时时间充质细胞培养基中的表面标志物的响应表达。
图4为72小时时间充质细胞培养基中的表面标志物的响应表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
本发明中，所涉及的组分、试剂和试剂盒均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得，如DMEM低糖培养基购自Gibco等。
维生素H 的浓度为2ug/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为15-22μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为9-15μg/mL。
实施例一 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯；
维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为20μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为11μg/mL。本发明中，各组分的浓度均以间充质干细胞无血清培养基的终体积计。
制备方法：取DMEM低糖培养基，加入维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞的无血清培养基。
实施例二 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯；维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为22μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为9μg/mL。
制备方法：取DMEM低糖培养基，加入维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞的无血清培养基。
实施例三 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯；维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为15μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为15μg/mL。
制备方法：取DMEM低糖培养基，加入维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞的无血清培养基。
对比例1 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子和芹菜素；维生素H的浓度为2ug/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为20μg/mL。
对比例2 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇和茉莉酮酸甲酯；
维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为11μg/mL。
对比例3 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子；
维生素H的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL；
对比例4 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯；
维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为30μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为11μg/mL。
对比例5 间充质干细胞无血清培养基
间充质干细胞无血清培养基，包括DMEM低糖培养基，还包括维生素、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯；
维生素H 的浓度为2μg/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，芹菜素的浓度为20μg/mL，茉莉酮酸甲酯的浓度为20μg/mL。
间充质干细胞的分离培养
以脐带间充质干细胞获取培养为例，使用试验大白鼠，解剖，分离出股骨、胫骨、尺骨、挠骨，并浸泡入75％乙醇中5-10分钟。PBS冲洗3～5遍，用碎骨钳进行碎骨处理，转入两个离心管中，加入15～30mL PBS，震荡，取上清。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入30mLPBS，混合均匀后，在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入10mL PBS混合均匀，经150目筛网过滤，收集滤液，离心，无血清的α-MEM培养基重新悬浮。将该脐带提取物沿离心管壁缓慢加至等体积Ficoll分离液上，在3000rpm条件下水平离心30分钟。用尖吸管吸取中间雾层，加PBS离心洗涤。用α-MEM+10％FBS培养液将细胞悬浮，台盼蓝拒染法计数。然后将细胞悬液稀释至1×106 cells/mL，接种至10cm培养皿中，于CO2培养箱中培养，24～48小时后观察细胞贴壁，换液除去悬浮细胞。每隔3～4天更换培养基。原代细胞经7～10天长满了培养皿底部后，进行1:3传代培养。取第三代进行贴壁检测和细胞增殖试验。
茉莉酮酸甲酯，学名为2-戊烯基环戊酮-3-乙酸甲酯；其制备方法为利用双键在多相加氢催化剂作用下，催化含α，β双键的茉莉酮酸甲酯加氢生成顺式-二氢茉莉酮酸甲酯，在含α，β双键的茉莉酮酸甲酯在醇类或酯类溶剂中，用催化剂Pd/C进行加氢制备顺式-二氢茉莉酮酸甲酯；为了提高产品中顺式-二氢茉莉酮酸甲酯的含量，还可以加入了适量的有机铝化合物，使Pd/C的难以回收套用，且加入的溶剂也会和含α，β双键的茉莉酮酸甲酯以及其加氢产物二氢茉莉酮酸甲酯之间发生酯交换反应，虽然不影响产物中顺式-二氢茉莉酮酸甲酯所占比例，但是降低了顺式-二氢茉莉酮酸甲酯的收率。
芹菜素，又名芹黄素，有“植物雌激素”之称，属于黄酮类化合物。芹菜素化学名称为4’，5，7-三羟基黄酮，其中，4’， 5，7位置的三个羟基与之间的双键决定了其生物活性。因芹菜素在天然植物中的含量稀少、提取率较低，因此限制了芹菜素的发展和应用。合成法尤其是半合成法成为了制备芹菜素的主要方法。芹菜素可由芹菜甙酸化脱糖制得，而芹菜甙在自然界天然植物中含量也较少。由于柚皮甙广泛存在于自然界植物中，且含量较高，以柚皮甙为原料进行半合成是目前制备芹菜素最主要的方法；该方法在制备过程中使用大量吡啶作为反应溶剂，单质碘作为氧化剂。
本品中的芹菜素因应用于培养基，在得到粗品之后，将制得的芹菜素粗品溶解在氢氧化钠溶液中，进行第一次过滤，收集滤液，并向滤液中缓慢加入浓盐酸至pH为3～4，析出淡黄色固体后，进行第二次过滤，收集滤饼，将滤饼水洗至中性后用乙醇淋洗，干燥得芹菜素精品，更加安全卫生。
间充质干细胞抗致畸测定方法
首先，本案中通过蛋白表达测定干细胞的抗畸耐变特性，例如在细胞孔中通过抗体染色体，并定量该抗体所染色的细胞的特定荧光方法来判定。具体可以为，使致畸化合物与正在向分化一定阶段的间充质干细胞进行接触；在分化的第三天测量一个或多个测量细胞标记的蛋白质表达，其中具体标记可以选自Sox17；再测定致畸化合物的IC50浓度，其导致一个或多个标记的蛋白质表达的50％抑制；将测定的IC50浓度与已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险系数（IC50的相对比值）。其中致畸风险的化合物选定沙利度胺，无致畸风险的化合物选择叶酸。
试验例一 贴壁检测
取未经包被的24孔板，设置实施例一组、实施例二组、实施例三组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组和阳性对照组，分别加入实施例一、实施例二、实施例三、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的无血清培养基以及含10％FBS的DMEM低糖培养基，每组3个复孔，每孔接种1×105个ADSCs，放置于细胞培养箱中孵育2h，弃去培养基，使用PBS冲洗去除未贴壁细胞，然后进行消化并收集计数，结果如表1所示。
表1 不同无血清培养基的细胞贴壁检测结果
分类 贴壁数量
实施例一组 197.1±10.5
实施例二组 239.3±12.1
实施例三组 162.4±13.3
对比例1组 177.8±11.5
对比例2组 77.2±19.3
对比例3组 73.7±12.4
对比例4组 199.4±11.6
阳性对照组 235.7±13.5
从表1可知，本发明提供的无血清培养基能相对保证贴壁数量的饱和稳定，尤其实施例一组的表现，实施例一至三组中与阳性对照组的细胞贴壁数的差异平均在20%左右；
相对应的，在对比例3组中，未添加芹菜素和茉莉酮酸甲酯，可以发现间充质干细胞贴壁性能明显较差，差异达到70%左右，比较明确的展示了无血清培养基中所含有的血小板衍生生长因子、表皮生长因子和转化生长因子等没有显著提高间充质干细胞的贴壁性能；
对比例2组，没有添加芹菜素，可以发现间充质干细胞贴壁性能明显较差，差异达到67%左右，可以发现间充质干细胞贴壁性能较差，说明添加芹菜素可显著影响间充质干细胞的贴壁性能；
对比例1组中，未添加茉莉酮酸甲酯，可以发现间充质干细胞贴壁性能一般，其贴壁数高于实施例三组，但还是低于实施例一组，可以发现不加茉莉酮酸甲酯对贴壁有影响，但是其影响相比较于芹菜素要低；
对比实施例二与三两组，发现芹菜素的量对贴壁数影响较大，而茉莉酮酸甲酯对贴壁的培养反馈的影响不够正面。
通过对比各试验组，可以发现：对比例2组和对比例3组不利于间充质干细胞的贴壁，难以实现后续的快速增殖；一定含量芹菜素和茉莉酮酸甲酯的共同添加起到了协同促进间充质干细胞贴壁的效果，芹菜素的影响相对较强，茉莉酮酸甲酯则影响较弱，但是芹菜素的量在超过20μg/ml后对细胞的贴壁增长有抑制。
试验例二 抗畸耐受特性检测
使用实施例一的培养基培养间充质干细胞至第10代，收集间充质干细胞并提取RNA，反转录，采用蛋白表达检测IC50，将测定的IC50浓度与已知具有致畸风险的化合物的IC50浓度和已知无致畸风险的化合物的IC50浓度相比较，以确定所评估的化合物的致畸风险系数，更具体的，IC50浓度的相对比值，具体计算可采用无致畸IC50浓度与致畸IC50浓度的按比例进行归一化取值。
如下表2可见，试验例子测定结果为
表2不同对照组的抗畸耐变特性
分类 致畸风险系数
实施例一组 0.9014
实施例二组 1.0547
实施例三组 0.8719
对比例1组 1.3897
对比例2组 0.9197
对比例3组 1.5010
对比例5组 0.8344
阳性对照组 0.9357
从表2可知，本发明提供的无血清培养基能显著提升干细胞对致畸化合物的抗畸和耐受特性，与阳性组相比较而言，在添加了茉莉酮酸甲酯之后，都可以显著的提升致畸率降低的效果；实施例一至三，可以看出，当茉莉酮酸甲酯的量提升时，芹菜素对风险系数的影响较为被动，再结合对比例5，如果茉莉酮酸甲酯大幅提升，仍然能够有较好的抗畸特性；
但是参考实施例一和对比例2两组发现，芹菜素在对抗畸特性的影响虽然有限，但其存在与茉莉酮酸甲酯工作协助作用的关联关系，在完全没有芹菜素的情形下，干细胞的耐受特性受到负面影响。
试验例三 存活率测试
DMEM低糖培养基将茉莉酮酸甲酯分别按照0.69-22.18μg/mL份量形成培养基的药物溶液。结合实施例三的分立培养方式，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加有茉莉酮酸甲酯的处理组的吸光值与不加茉莉酮酸甲酯的正常细胞组的吸光值相对比，求算每孔的细胞存活率，结果如图1所示。
图1中进行24-72h试验的轮取数据值参见下表3
表3茉莉酮酸甲酯的不同浓度活性
浓度（μg/mL） 24h存活率（%） 48h存活率（%） 72h存活率（%）
0.69 102.11 103.11 101.24
1.39 108.09 113.39 109.09
2.77 114.78 115.01 118.23
5.55 126.23 136.2 120.91
11.09 159.98 168.12 135.87
14.77 148.85 150.23 129.98
18.48 133.25 138 120.88
22.18 103.12 112.24 109.91
从图1可知，当茉莉酮酸甲酯浓度达到5-11μg/mL左右时，存活率呈现升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当茉莉酮酸甲酯浓度达到11.09μM时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。
图2-图4中三图分别展示了选择11.09μg/mL茉莉酮酸甲酯的浓度时，在初始期、48小时、72小时的间充质表面标志物的响应表达，初始期培养基配方中的培养细胞呈现正常的纺锤状成纤维样形态，48小时展现比较均一的细胞成长外观，但未见相关衰老迹象，总体具有较好的成长活性表现，72小时则有加快衰老的速度的迹象，具体参考图2-图4。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基的构成成分包括有：维生素H，转铁蛋白，血清白蛋白，血小板衍生生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，转化生长因子，纳米粒子胆固醇，芹菜素以及茉莉酮酸甲酯；其中，所述无血清培养基中维生素H的浓度为2ug/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，所述芹菜素的浓度为15-22μg/mL，所述茉莉酮酸甲酯的浓度为9-15μg/mL。
2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基中芹菜素的浓度为20μg/mL。
3.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基中茉莉酮酸甲酯的浓度为11.09μg/mL。
4.一种脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，取DMEM低糖培养基，加入维生素H、转铁蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、纳米粒子胆固醇、芹菜素和茉莉酮酸甲酯，搅拌均匀，经滤膜过滤除菌，得到间充质干细胞的无血清培养基；其中，所述无血清培养基中维生素H 的浓度为2ug/ml，转铁蛋白的浓度为15μg/mL，血清白蛋白的浓度为4mg/mL，血小板衍生生长因子的浓度为20ng/mL，成纤维细胞生长因子12ng/ml，表皮生长因子的浓度为20ng/mL，转化生长因子的浓度为15ng/mL，纳米粒子胆固醇的浓度为10μg/mL，所述芹菜素的浓度为15-22μg/mL，所述茉莉酮酸甲酯的浓度为9-15μg/mL。
5.如权利要求4所述的脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，其特征在于，培养基的致畸耐受特性测试中，致畸风险的化合物选定沙利度胺，无致畸风险的化合物选择叶酸。
6.如权利要求4所述的脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，其特征在于，培养基中的茉莉酮酸甲酯制备方法为利用双键在多相加氢催化剂作用下，催化含α，β双键的茉莉酮酸甲酯加氢生成顺式-二氢茉莉酮酸甲酯。
7.如权利要求4所述的脐带间充质干细胞无血清培养基制备方法，其特征在于，培养基中芹菜素可由芹菜甙酸化脱糖制得，以柚皮甙为原料进行半合成制备；在制备过程中使用吡啶作为反应溶剂，单质碘作为氧化剂。
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