CN103827293A - 用于增强雌性生殖细胞中生物能状态的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了包含生物能剂的组合物和方法，所述生物能剂用于恢复衰老卵母细胞的品质、增强卵原干细胞或改善其衍生物(例如，胞质或分离的线粒体)以用于受精能力增强法。

Description

用于增强雌性生殖细胞中生物能状态的组合物和方法
相关主题的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2011年6月29日提交的美国临时申请系列号61／502,840和2012年2月17日提交的美国临时申请系列号61／600,529的权益，所述文献的完整披露内容通过引用的方式结合在此。
对联邦资助的研究下所做出发明的拥有权利的声明
本项工作部分地由美国国家健康研究所基金号NIH R37-AG012279支持。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
自从二十世纪50年代早期，与卵巢功能不全和早衰(包括因衰老或损害所致的不育)相关的临床管理问题已经受以下认识限制：出生时提到的卵母细胞池不可替换或更新(Zuckerman，Recent Prog Horm Res19516：63-108)。换句话说，任何治疗性介入应当顺应于含有卵母细胞的现有卵泡储备的操作以产生所需的临床转归。然而，在2004年，采用小鼠的研究挑战如下观点：卵母细胞的固定卵巢储备在出生时赋予(Johnson(约翰逊)等人，Nature(自然)2004428：145-150)。基于来自几种实验方案的结果，得出结论：成年雌性哺乳动物的卵巢保留罕有的种系或卵原干细胞(OSC)，所述种系或卵原干细胞以类似于种系干细胞支持成年睾丸中精子产生的方式常规产生新卵母细胞(Spradling(斯普拉德林)，Nature(自然)2004428：133-134)。几年后，从新生和成年小鼠卵巢成功地分离OSC(Zou(邹)等人，Nat CellBiol(天然细胞生物学)200911：631-636；Pachiarotti(帕卡洛提)等人，Differentiation(分化)201079：159-170)。总体上，这些研究，连同来自小鼠研究的几份其他报告(Johnson(约翰逊)等人，Cell(细胞)2005122：303-315；Wang(王)等人，Cell Cycle(细胞周期)20109：339-349；Niikura(尼基塔)等人，Aging(老化)20102：999-1003)已经概念性验证了OSC作为移植治疗药和作为调制卵巢功能和雌性受精能力(fertility)的新疗法的靶标的用途(Tilly(迪利)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)200980：2-12；Tilly(迪利)等人，Mol Hum Reprod(人类繁殖分子学)2009；15：393-398)。此外，在年老小鼠的萎缩卵巢中鉴定到休眠性OSC，表明卵巢衰老可能是可逆的，其中所述休眠性OSC在暴露于年轻成年卵巢环境时自发重新开始卵母细胞形成(Niikura(尼基塔)等人，Aging(老化)20091：971-978；Massasa(玛莎莎)等人，Aging(老化)2010；2：1-2)。OSC的临床应用现在进一步由本文中显示的以下证据证实：产生卵母细胞的干细胞的可比较的群体存在于健康育龄女性的卵巢中并且可以从中纯化。
虽然这些新研究表明通过基于OSC的技术，成年卵巢中的卵母细胞数目对治疗性扩充是可行的，但是卵巢衰老和早衰由卵母细胞数目下降以及巢中存在的卵母细胞的品质下降决定。因此，确定用于改善卵母细胞品质、尤其在大龄女性中改善卵母细胞品质的方法是迫切的。在过去的数十年期间，由于文化和社会变动，发达国家的女性已显著推迟分娩。例如，在过去的40年，年龄35-44岁的女性的初育率在美国已增加超过8倍(Ventura Vital Health Stat(凡吐拉市病毒与健康数据)200947：1-27；Matthews(马修斯)，NCHS Data Brief(NCHS数据简报)200921：1-8)。众所周知的是，35岁或更大年龄女性中的妊娠速率天然地以及在辅助生殖的情况下均显著较低。活产率的下降反映了卵巢对促性腺激素激素(促卵泡激素或FSH和促黄体激素或LH)刺激作用的反应下降、降低的卵母细胞及胚胎品质以及妊娠率，和增加的流产及胎儿非整倍性的出现率。实际上，认为卵子中衰老相关的染色体和减数分裂纺锤体异常是造成高生育年龄的女性中不育、胎儿丢失(流产)以及造成出生缺陷(最值得注意的是21三体或唐氏综合征)的受孕的发生率增加的主要因素(Henderson(亨德森)等人，Nature(自然)1968218：22-28；Hassold(哈索德)等人，Hum Genet(人类遗传学)198570：11-17；Battaglia(巴塔利亚)等人，Hum Reprod(人类繁殖)199611：2217-2222；Hunt(亨特)等人，Trends Genet(趋势遗传学)200824：86-93)。虽然已经广泛地研究人和动物模型的卵母细胞中衰老相关的非整倍性的发生和后果(Tarín(塔林)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)200165：141-150；Pan(潘)等人，Dev Biol(发育生物学)2008316：397-407；Duncan(邓肯)等人，BiolReprod(繁殖生物学)200981：768-776)，但是仍难以找到随年龄增加维持细胞减数分裂期间染色体分离精确度的方法。目前，不存在改善年老女性患者的妊娠结局的已知介入治疗。在动物研究中，已经报道在青少年期间并且在成年育龄期间自始至终长期施用药理剂量的抗氧化剂在衰老雌性小鼠中改善卵母细胞品质(Tarín(塔林)等人，Mol Reprod Dev(分子生殖发育)200261：385-397)。然而，这种方案对卵巢和子宫功能具有明显长期负面作用，在治疗的动物中导致较高的胎儿死亡和吸收率以及减少的产仔频率和大小(Tarin(塔林)等人，Theriogenology(兽医产科学)200257：1539-1550)。因而，在育龄期间自始至终长期抗氧化疗法以便维持或改善衰老女性中卵母细胞品质的临床转换是不切实际的。
线粒体功能障碍在生殖衰老中具有主要作用，并且因此，可能通过使用线粒体营养物改善年老女性中的生殖功能(Bentov(本托福)等人，Fertil Steril(生育与不孕)201093：272-275)。衰老和年龄相关性病理学往往与因线粒体数目减少(生物生成和自噬)、线粒体聚集增加、线粒体活性(产生作为细胞主要能量来源的ATP)削弱和线粒体膜电位和／或线粒体DNA(mtDNA)突变和缺失积累所致的线粒体功能丧失相关。随着卵母细胞衰老以及卵母细胞线粒体能量产生减少，为产生有活力卵子所需的卵母细胞成熟的许多关键过程(尤其胞核纺锤体活性和染色体分离)变得受损(Bartmann(巴特曼)等人，J Assist Reprod Genet(辅助生殖与遗传学杂志)200421：79-83；Wilding(怀尔丁)等人，Zygote(合子)200513：317-23)。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是许多其他过程的小分子调节物，所述过程包括信号传导途径、细胞-细胞通讯和表观遗传变化。一旦认为非常稳定的，NAD+的水平响应于膳食和锻炼而增高。增加的NAD+水平也与膳食相关，称作热量限制(CR)，已知它延迟衰老和疾病(包括不育)的许多方面(Sinclair(辛克莱)Mech Ageing Dev(衰老与发育机制)200526：987；Selesniemi(斯莱斯尼米)等人，AgingCell(细胞老化)7：622-629，2008)。
NAD+水平对含有它们的线粒体和细胞的正常功能是重要的。线粒体NAD+低的细胞倾向于出现细胞功能障碍和死亡(Yang(杨)等人，Cell(细胞)2008)。肥胖症和衰老均降低线粒体NAD+水平，导致线粒体功能降低、细胞死亡增加和年龄相关性疾病的加速(Hafner(哈夫纳)等人，Aging(老化)20102：1-10)。随着卵母细胞衰老以及卵母细胞线粒体能量产生减少，卵母细胞成熟的许多过程(尤其是减数分裂的纺锤体活性和染色体分离)变得受损(Bartmann(巴特曼)等人，J AssistReprod Genet(辅助生殖与遗传学杂志)200421：79-83；Wilding(怀尔丁)等人，Zygote(合子)200513：317-23)。升高NAD+水平是增加细胞、器官、组织和胚胎发育的生物能学和生存力的有效选项。下游介体包括sirtuin去乙酰化酶(SIRT1-7)和聚ADP核糖聚合酶(PARPs)。本领域技术人员已知增加NAD+水平并加强线粒体功能可以模拟热量限制的健康益处(Yang(杨)等人，Exp Gerontol(实验老年学)200641：718-726)。
在维持高育龄女性中卵母细胞品质的长期抗氧化疗法之间建立联系(Tarín(塔林)等人，Hum Reprod(人类繁殖)199510：1563-1565)，并且可获得支持卵子中线粒体功能障碍作为年龄相关性受精能力问题背后之推动力的关键作用的数据。例如，实验诱导的氧化应激在分离的小鼠卵母细胞中降低ATP水平，这增加减数分裂纺锤体异常，导致染色体错排列(Zhang(张)等人，CellRes(细胞研究)200616：841-850)。另外，尽管人卵母细胞的减数分裂成熟可以在一定的ATP浓度范围内继续进行，但是具有较高ATP含量的卵母细胞显示大得多的成功胚胎发生、植入和发育潜力(Van Blerkom(凡布莱克姆)等人，Hum Reprod(人类繁殖)199510：415-424)。
与此同时，异源转移来自年轻供体卵母细胞(即，从不同女性获得)的胞质提取物至中具有生殖失败病史的较年长女性的卵母细胞(称作卵胞质移植或卵胞质转移的方法)展示出改善的胚胎发育和活后代分娩。然而不幸地，按这种方法出生的儿童显示出线粒体异质性或存在来自两个不同来源的线粒体(Cohen(科亨)等人，Mol Hum Reprod(人类繁殖分子学)19984：269-280；Barritt(巴里特)等人，HumReprod(人类繁殖)200116：513-516；Muggleton-Harris(马格顿-哈里斯)等人，Nature(自然)1982299：460-462；Harvey(哈维)等人，Curr Top Dev Biol(发育生物学当前主题)200777：229-249)。这与以下事实一致：卵子中存在的母源线粒体被用来向胚胎“播种”线粒体，因为来自精子的父源线粒体在受精之后不久被摧毁(Sutovsky(所托威斯克)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)200063：582-590)。虽然该方法涉及转移来自供体卵子的细胞质和未纯化的线粒体，但是普遍认为供体线粒体在转移的细胞质中的存在(由“外来”线粒体传递至后代所证实)是异源卵胞质转移为何提供受精能力益处的原因(Harvey(哈维)等人，Curr Top Dev Biol(发育生物学当前主题)200777：229-249)。无论如何，这些儿童中所引起的线粒体异质性的健康影响仍是未知的；然而，已经展示一种线粒体异质性小鼠模型产生与代谢综合征一致的表型(Acton(阿克顿)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)200777：569-576)。可商榷地，伴随异源卵胞质转移的最明显问题与如下事实有关：线粒体还含有与生物学母亲和生物学父亲所提供的核基因不同的遗传物质。因此，按照这种方法孕育的儿童具有三个遗传亲本(生物学母亲、生物学父亲、卵子供体)，并且因此代表遗传操作人种系以产生胚胎的实例。导致线粒体异质性的卵胞质移植方法因此现在受到管制并且大多被FDA禁止。关于细节，参见CBER2002会议文件(CBER2002Meeting Documents)，2002年5月9日的生物反应调节剂咨询委员会(BiologicalResponse Modifiers Advisory Committee)纪要，这些文件从FDA可公开获得，以及“致资助者／研究者的信-涉及在通过除配子核结合以外的手段转移遗传物质的疗法中使用的人类细胞(Letter to Sponsors／Researchers-Human Cells Used in TherapyInvolving the Transfer of Genetic Material By Means Other Than the Union of GameteNuclei)”，它同样可从FDAhttp：／／www.fda.gov／BiologicsBloodVaccines／SafetyAvailability／ucm105852.htm公开获得。尽管使用来自体细胞的自体线粒体将避免线粒体异质性，然而体细胞线粒体是不充分的，因为它们易出现导线粒体DNA损伤和缺失，导致可遗传的突变。在卵胞质移植方法中，女性生殖细胞的自体来源，即OSC及其获得的组合物(例如，OSC细胞质或分离的线粒体)将防止线粒体异质性并且降低目前与该方法相关的伦理和安全顾虑。重要地，易于出现衰老相关性缺陷的卵母细胞在数量或品质上并没有高到足以可靠地用于这类方法中。
因此，需要恢复衰老卵母细胞的品质以及进一步增强OSC或改善其衍生物(例如，细胞质或分离的线粒体)以便用于实施一系列辅助生殖技术。
发明概述
本发明提供多种药剂在卵母细胞、出生后雌性种系干细胞(在本文中也称作OSC)和／或植入前胚胎中，在实施体外受精方法之前和／或在体外受精方法后或在卵巢、卵母细胞、OSC和／或植入前胚胎体内暴露后增强线粒体数目、线粒体活性、细胞能量水平或细胞产能潜力(统称为“生物能状态”)的用途。在某些实施例中，用于此类用途的药剂包括NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、Sirt1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物。这些药剂将在本文统称为“生物能剂(bioenergetic agent)”。
在一个方面，本发明提供一种组合物，所述组合物含有卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代中的一种或多种和生物能剂(例如，NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一种或多种)。
在另一个方面，本发明提供一种具有增强的线粒体功能的分离细胞，其中该细胞是卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代中的一种或多种，其中该细胞已经与生物能剂(NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷(nicotinamide riboside)和烟酸)、漆树黄酮(fisetin)、槲皮素(quercetin)、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、酪氨酸磷酸化抑制剂8(tryphostin8)、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一种或多种)接触。
在又一个方面，本发明提供一种含有OSC线粒体或卵母细胞线粒体和生物能剂的组合物，所述生物能剂是NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一种或多种。
在又一个方面，本发明提供一种分离的线粒体，其中所述线粒体已经与生物能剂接触，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在又一个方面，本发明提供一种含有OSC线粒体或卵母细胞线粒体和生物能剂的分离的无细胞组合物，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在另一个方面，本发明提供一种制备卵母细胞以用于体外受精(IVF)的方法，所述方法涉及将含有OSC线粒体和生物能剂的组合物转移至自体卵母细胞中，因而制备该卵母细胞以用于体外受精，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。在一个实施例中，含有OSC线粒体的组合物是从OSC获得的线粒体的纯化制备物。
在又一个方面，本发明提供根据前述方面或本文描述的本发明的任何其他方面的方法制备的卵母细胞。
在又一个方面，本发明提供一种体外受精的方法，所述方法涉及的步骤(a)将来自雌性受试者的OSC与生物能剂孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种；(b)获得含有来自该OSC的OSC线粒体的组合物；(c)将该组合物转移至分离的自体卵母细胞中；并且(d)使该自体卵母细胞体外受精以形成合子。在一个实施例中，该方法进一步涉及将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。在一个实施例中，步骤a)是任选的并且步骤b)进一步涉及将含有OSC线粒体与生物能剂的组合物孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在又一个方面，本发明提供一种制备卵母细胞以用于体外受精的方法，所述方法涉及将含有卵母细胞线粒体和生物能剂的组合物转移至自体卵母细胞中，因而制备该卵母细胞以用于体外受精，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。在一个实施例中，含有卵母细胞线粒体的组合物是无胞核的卵母细胞胞质。在另一个实施例中，含有卵母细胞线粒体的组合物是从卵母细胞获得的线粒体的纯化制备物。在一个实施例中，该方法进一步涉及使卵母细胞体外受精以形成合子并将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。在另一个实施例中，将合子和植入前期胚胎与生物能剂孵育，所述生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、SIRT1激活物、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
在又一个方面，本发明提供根据前述方面或本文描述的本发明的任何其他方面的方法制备的卵母细胞。
在又一个方面，本发明提供一种体外受精的方法，所述方法涉及的步骤(a)将来自雌性受试者的卵母细胞与生物能剂孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种；(b)获得含有来自该卵母细胞的线粒体的组合物；(c)将该组合物转移至分离的自体卵母细胞中；并且(d)使该自体卵母细胞体外受精以形成合子。在一个实施例中，该方法进一步涉及将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。在另一个实施例中，步骤a)是任选的并且步骤b)进一步涉及将含有卵母细胞线粒体与生物能剂的组合物孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在又一个方面，本发明提供一种体外受精的方法，所述方法涉及的步骤(a)将来自雌性受试者的卵母细胞与生物能剂孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种；并且使该卵母细胞体外受精以形成合子。
在又一个方面，本发明提供一种含有溶液和生物能剂的组合物，所述溶液选自下组，该组由以下各项组成：细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、胚胎培养基、卵裂培养基、玻璃化溶液、冷冻保存溶液和胚胎解冻培养基，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在又一个方面，本发明提供一种改善雌性受试者中受精能力的方法，所述方法包括将生物能剂以有效改善卵母细胞和／或OSC品质、从头产生和／或排卵的卵母细胞产率的量施用至所述受试者，因而改善所述雌性受试者中的受精能力，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。在一个实施例中，将生物能剂全身性施用至雌性受试者。在另一个实施例中，将生物能剂局部施用至雌性受试者的卵巢。在又一个实施例中，与参比标准物相比，雌性受试者的妊娠结局改善。
在又一个方面，本发明提供一种体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将生物能剂以有效改善卵母细胞和／或OSC从头产生、品质和／或排卵的卵母细胞产率的量施用至女性受试者，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种；
(b)从该雌性受试者获得卵母细胞；并且
(c)使该卵母细胞体外受精以形成合子。在一个实施例中，将生物能剂全身性施用至雌性受试者。在另一个实施例中，将生物能剂局部施用至雌性受试者的卵巢。在另一个实施例中，步骤a)在步骤b)和c)之前和／或在步骤b)和c)后实施。在另一个实施例中，该方法进一步涉及步骤d)：将源自该合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中并且继续向该雌性受试者施用所述生物能剂。在另一个实施例中，步骤b)和／或步骤c)进一步包括将卵母细胞与生物能剂孵育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在另一个实施例中，与参比标准物相比，雌性受试者的妊娠结局改善。
在又一个方面，本发明提供一种维持对其有需求的怀孕雌性受试者中胚胎发育的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的生物能剂，因而维持怀孕雌性受试者中的胚胎发育，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。在一个实施例中，将生物能剂全身性施用至雌性受试者。在另一个实施例中，将生物能剂局部施用至雌性受试者的卵巢。
在又一个方面，本发明提供一种恢复对其有需求的雌性受试者中卵巢功能的方法，所述方法包括施用治疗有效量的生物能剂，因而恢复雌性受试者中的卵巢功能，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在一个实施例中，将生物能剂全身性施用至雌性受试者。在另一个实施例中，将生物能剂局部施用至雌性受试者的卵巢。在另一个实施例中，雌性受试者具有卵巢功能早衰。
在又一个方面，本发明提供一种从雌性受试者制备用于收获的组织或其细胞的方法，所述方法包括施用有效量的生物能剂至雌性受试者，因而从雌性受试者制备该用于收获的组织或其细胞，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。在一个实施例中，该组织是卵巢、卵泡、骨髓或外周血。
在又一个方面，本发明提供一种产生卵母细胞的方法，所述方法包括将干细胞在生物能剂存在的情况下、在足以使干细胞分化成卵母细胞的条件下培养，所述干细胞是OSC、胚胎干细胞、胰干细胞、皮肤干细胞或诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)，所述生物能剂是一种或多种NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的任一种或多种。
在另一个方面，本发明特征在于一种含有分离的细胞和用于体外受精的生物能剂的组合物，所述分离的细胞是卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代。
在另一个方面，本发明特征在于一种相对于参比具有增强的线粒体功能的分离的细胞，其中该细胞是卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代，并且其中该细胞已经与用于体外受精的生物能剂接触。
在另一个方面，本发明特征在于一种生物能剂，所述生物能剂是色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物，用于以下一项或多项中：改善女性的受精能力、维持怀孕女性中的胚胎发育、恢复或增加女性中的卵巢功能、从女性制备用于收获的组织或其细胞或制备卵母细胞。
在前述任一方面或本文描述的本发明任何方面的多种实施例中，生物能剂是NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、SRT-1720、SIRT1激活物、具有式I-XV中任一者的化合物或其功能衍生物中的一种或多种。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，生物能剂是图29中显示的化合物。
在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，本发明的组合物进一步含有选自细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、玻璃化溶液和冷冻保存溶液中一种或多种的溶液。在多种实施例中，该组合物含有卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血。在其他实施例中，OSC是一种分离的非胚胎干细胞，所述分离的非胚胎干细胞能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选地阶段特异性胚胎抗原中的一种或多种。在其他实施例中，OSC从卵巢组织获得。在多种实施例中，OSC从非卵巢组织获得。在具体的实施例中，非卵巢组织是血液或骨髓。在多种实施例中，细胞是卵巢干细胞，其中细胞已经与生物能剂接触。在其他实施例中，接触的细胞具有增加的线粒体DNA拷贝数和／或增加的ATP生成能力。在另外的实施例中，线粒体的数目是增加约10％、20％、30％、40％、50％或60％。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，增加的线粒体功能通过验定mtDNA含量、ATP、NAD+／NADH、线粒体质量、膜电位、和已知的线粒体质量(mitochondrial mass)调节物和电子传递链组分的基因表达进行检测。
在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，细胞处于溶液中，所述溶液是细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、玻璃化溶液和冷冻保存溶液中的任一种或多种。在其他实施方例中，线粒体处于细胞中，所述细胞是卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代中的一种或多种。在具体的实施例中，细胞处于含有卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血的混合物中。
在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，含有OSC线粒体的组合物是无胞核的OSC细胞质。在多种实施例中，含有卵母细胞线粒体的组合物是无胞核的卵母细胞胞质。在多种实施例中，含有OSC线粒体的组合物是从OSC获得的线粒体的纯化制备物。在其他实施例中，含有卵母细胞线粒体的组合物是从卵母细胞获得的线粒体的纯化制备物。
在前述任一方面或本文描述的任何方面的其他实施例中，线粒体处于细胞和生物能剂中，所述细胞是卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC后代中的一种或多种。在前述任一方面或本文描述的任何方面的多种实施例中，细胞处于含有卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血的混合物中。在另外的实施例中，与参比标准物相比，雌性受试者的妊娠结局改善。在另外的实施例中，将生物能剂全身性施用至雌性受试者或局部施用至雌性受试者的卵巢。
本发明的其他特征和优点将从详细描述并且从权利要求书中显而易见。因而，本发明的其他方面在以下披露内容中描述并且处于本发明的范围内。
附图简述
以下详细说明可以结合通过引用方式结合在此的后续附图一起来理解，所述详细说明通过举例给出但不意在将本发明限于所描述的具体实施例。
图1描述了用于OSC分离的、基于荧光激活细胞分选术(FACS)的验证方案。在图1a中，显示使用针对VASA的NH2或COOH端的抗体时，成年小鼠卵巢中VASA表达的免疫荧光分析(用蓝色DAPI复染情况下的绿色)(比例尺，50μm)。在图1b中，显示使用针对VASA的NH2或COOH端的抗体时，分散的小鼠卵巢或分离的卵母细胞的免疫磁性分选。部分1含有分离之前的细胞加珠，部分2是洗涤或通流部分(无免疫反应性)并且部分3是珠部分(VASA阳性细胞，由白色箭头突出显示)。在图1c中，显示使用针对VASA的NH2或COOH端的抗体时，来自分散的小鼠卵巢的活细胞或透化细胞的FACS分析。VASA阳性活细胞是仅用COOH抗体(红色虚线框)检测到，而透化使得利用NH2抗体(蓝色虚线框)分离VASA阳性细胞成为可能。在图1d中，透化用COOH抗体所获得的VASA阳性活细胞(红色虚线框)使得利用NH2抗体(蓝色虚线框)，通过FACS再分离相同的细胞成为可能。在图1e中，显示了使用VASA-COOH抗体分离活的OSC时，所用的FACS方案的示意图。图1f描述了使用VASA-COOH抗体(+ve，FACS后VASA阳性活细胞部分；-ve，FACS后VASA阴性活细胞部分；无RT，无逆转录情况下RNA样品的PCR；β-肌动蛋白，样品内参对照)，在卵巢分散过程期间为获得细胞以便基于FACS分离OSC而产生的每个细胞部分中种系标记Blimp1(也称作具有ZNF结构域的含有PR结构域1或Prdm1)、Stella、Fragilis(也称作干扰素诱导的跨膜蛋白3或Ifitm3)、Tert(端粒酶逆转录酶)、Vasa、Dazl(无精子症样中缺失)和卵母细胞标记Nobox(新生儿卵巢同源框)、Zp3(透明带糖蛋白3)、Gdf9(生长分化因子9)的基因表达分析。
图2描述了通过免疫磁珠分选从含有掺杂性卵母细胞的成年小鼠卵巢分离的OSC部分。显示了种系标记(Blimp1、Stella、Fragilis、Tert、Vasa、Dazl)和卵母细胞特异性标记(Nobox、Zp3、Gdf9)在年轻成年小鼠卵巢(阳性对照)或基于VASA-COOH抗体的免疫磁珠分选分散的年轻成年小鼠卵巢后所获得的最终细胞部分中的基因表达分析(无RT，无逆转录情况下分选细胞的RNA样品的PCR；β-肌动蛋白，样品内参对照)。
图3描述使用FACS从成年小鼠和人卵巢分离VASA阳性细胞。在图3a和3b中，显示用于分离人(a)和小鼠(b)OSC的成年卵巢组织的代表性组织学外观。比例尺，100μm。在图3c和3d中，显示基于VASA的细胞表面表达，通过FACS分离的活细胞的形态。比例尺，10μm。图3e提供起始卵巢材料和新鲜分离的OSC的基因表达谱，显示3位不同患者作为人组织分析的实例的评估结果(无RT，无逆转录情况下RNA样品的PCR；β-肌动蛋白，样品内参对照)。在图3f至图3k中，显示畸胎瘤形成测定法，所述测定法显示与注射小鼠胚胎干细胞(ESC)后3周的小鼠中肿瘤的发展相比，在接受小鼠OSC注射后24周的小鼠中不存在肿瘤(3f)，(图3g至图3j；小图3h至3j显示来自全部三个胚层的细胞的实例，小图3h插图中突出显示神经花环结构(neural rosette))，连同实验结果的概述(3k)。
图4描述在卵巢内移植后从小鼠OSC获得的功能性卵子。在图4a和4b中，显示在5-6个月之前注射过表达GFP的OSC的野生型小鼠的卵巢中含有GFP阴性和GFP阳性(棕色，对比蓝色苏木精复染)卵母细胞的正在生长的卵泡的实例。在图4c中，显示在5-6个月之前接受卵巢内移植表达GFP的OSC的野生型雌性小鼠的诱导排卵后，通过IVF产生的排卵的GFP阴性卵子(在卵丘-卵母细胞复合体中)和所得到的胚胎(作为实例，显示2细胞期、4细胞期、致密桑葚胚(CM)期和早期胚泡(EB)期胚胎)的实例。在图4d和4e中，显示在5-6个月之前接受卵巢内移植表达GFP的OSC的野生型雌性小鼠的诱导排卵后，从输卵管获得的GFP阳性卵子(在卵丘-卵母细胞复合体中)的实例。使用野生型精子使这些卵子体外受精，产生2细胞胚胎，所述2细胞胚胎经历植入前发育推进(显示处于2细胞期、4细胞期、8细胞期、致密桑葚胚(CM)期、扩张桑葚胚(EM)期、胚泡(B)期和孵化胚泡(HB)期的GFP阳性胚胎的实例)以在受精后5-6日形成孵化胚泡。
图5描述小鼠和人OSC体外生殖细胞集落形成。在图5b和5d中显示在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上体外建立后，由小鼠OSC(5a、5b)和人OSC(5c，5d)形成的典型生殖细胞集落中基于免疫荧光的VASA表达分析(绿色伴以蓝色DAPI复染)(典型集落由白色虚线突出显示)。
图6描述特定培养物中源自小鼠卵巢和人卵巢的VASA阳性细胞的评价。图6a至图6d显示通过在无MEF培养物内维持的小鼠OSC(6a、6b)和人OSC(6c、6d)中对VASA表达(绿色)和BrdU掺入(红色)的双重检测，评估OSC增殖。图6e显示在24孔培养板中传代和接种2.5×104个细胞／孔后，小鼠OSC的无MEF培养物的常见生长曲线。图6f显示使用COOH抗体检测增殖数月后的小鼠OSC中VASA的细胞表面表达的FACS分析(显示的实例，第45代)。图6g显示起始卵巢材料和在4个月或更多个月的体外增殖后培养的小鼠OSC和人OSC的基因表达谱(无RT，无逆转录情况下RNA样品的PCR；β-肌动蛋白，样品内参对照)。显示从两位不同患者建立的两个不同的人OSC系(OSC1和OSC2)作为实例。图6h和图6i显示无MEF培养物中小鼠OSC(h)和人OSC(i)的BLIMP1、STELLA和FRAGILIS表达(绿色)的代表性免疫荧光分析。细胞用DAPI(蓝色)和罗丹明-鬼笔环肽(红色)复染以分别显现核DNA和胞质F-肌动蛋白。
图7描述来自培养的小鼠OSC和人OSC的自发卵子发生。图7a至7c提供由培养下的小鼠OSC形成的不成熟卵母细胞的实例，如通过形态(7a)、卵母细胞标记蛋白VASA和KIT表达(7b；注意VASA的胞质定位)和编码卵母细胞标记基因Vasa、KIT、Msy2(也称作Y盒蛋白2或Ybx2)、Nobox、Lhx8、Gdf9、Zp1、Zp2和Zp3(7c；无RT、无逆转录情况下RNA样品的PCR；β-肌动蛋白、样品内参对照)的mRNA的存在进行评估。比例尺，25μm。图7d显示在24孔培养板中传代和接种2.5×104个细胞／孔后24、48和72小时，由小鼠OSC形成的不成熟卵母细胞的数目(在每个时间点收集培养上清液以用于测定，并且因此，这些值代表每个24小时时间段内生成的数目，而非累积数目；均值±SEM，n=3份独立培养物)。图7e至7g显示来自人OSC的体外卵子发生，显示了由培养下的人OSC形成的不成熟卵母细胞(7f，形态；7g，卵母细胞标记蛋白VASA、KIT、MSY2和LHX8的表达)和在24孔培养板中传代并接种2.5×104个细胞／孔后所形成的数目(7e；均值±SEM，n=3份独立培养物)的实例。在小图C中显示人OSC衍生的卵母细胞中编码卵母细胞标记基因(Vasa、Kit、Msy2、Nobox、Lhx8、Gdf9、Zp1、Zp2、Zp3)的mRNA的存在、连同小鼠OSC衍生的卵母细胞的结果。比例尺，25μm。在图7h中，在培养的人OSC的胞核中显示基于免疫荧光对减数分裂重组标记DMC1(mck1同源物的剂量阻抑蛋白)和SYCP3(联会复合体蛋白质3)(对比蓝色DAPI复染的红色)的检测；人卵巢基质细胞充当阴性对照。在图7i中，在传代后72小时显示基于FACS对培养的人OSC的倍性分析。在图9中展示来自培养的人成纤维细胞(阴性对照)和培养的小鼠OSC的倍性分析结果。
图8描述对成年人类卵巢中卵母细胞特异性标记的检测。显示了成年人类卵巢皮层组织中的卵母细胞内表达的VASA(8a，红色)、KIT(8b，绿色)、MSY2(8c，红色)和LHX8(8d，绿色)的免疫荧光分析(也见图10h)。切片用DAPI(蓝色)复染以便显现胞核。比例尺，25μm。
图9描述培养下的人成纤维细胞和小鼠OSC的倍性分析。图9a和图9b显示基于FACS的对分裂活跃的人胎肾成纤维细胞培养物中(9a)和传代后48小时收集的小鼠OSC中(9b)倍性状态的代表性评估。仅在种系培养物中检测到单倍体(1n)细胞，与来自体外维持的人OSC的分析的结果一致(见图7i)，而全部培养物均含有二倍体(2n)和四倍体(4n)细胞群。
图10描述从来自人卵巢组织中的人OSC产生卵母细胞。显示在分散、与GFP-hOSC(10a)再聚集和体外培养24-72小时(10b、10c)后人卵巢皮层组织的直接(活细胞)GFP荧光分析。注意在类似于卵泡的致密结构中由较小GFP阴性细胞包围的巨大单一GFP阳性细胞的形成(图10b和图10c；比例尺，50μm)。显示成年人类卵巢皮层组织中含有GFP阳性卵母细胞的不成熟卵泡(棕色，由黑色箭头突出显示，对比蓝色苏木精复染)的实例，所述成年人类卵巢皮层组织用GFP-hOSC注射并且异体移植至NOD／SCID雌性小鼠中(图10d，移植后1周；图10f，移植后2周)。注意相同移植体中具有GFP阴性卵母细胞的可比较卵泡。作为阴性对照，在随上文显示的样品一起平行处理以便进行GFP检测后，在GFP-hOSC注射并异体移植之前(10e)或在异体移植之前接受溶媒注射(无GFP-hOSC)(10g)的人卵巢皮层组织中的全部不成熟卵泡均含有GFP阴性卵母细胞。图10h显示接受GFP-hOSC注射的异体移植物中GFP表达(绿色)和双线期卵母细胞特异性标记MSY2(红色)或卵母细胞转录因子LHX8(红色)的双重免疫荧光分析。注意，在GFP-hOSC注射之前，在移植体中检测不到GFP，而在全部卵母细胞中检测到MSY2和LHX8。切片用DAPI(蓝色)复染以便显现胞核。比例尺，25tm。
图11描述了基于形态测量对GFP-hOSC移植后人卵巢异体移植物中卵母细胞形成的评估。显示在注射GFP-hOSC并异体移植到NOD／SCID小鼠中7日后，3份随机选择的人卵巢皮层组织样品(标记为1、2和3)中原始卵泡和初级卵泡的总数，所述样品含有GFP阴性(宿主衍生的)或GFP阳性(OSC衍生的)卵母细胞(例如，见图10d至10g)。
图12描述人卵巢皮层组织和新鲜分离的人OSC的冷冻保存和解冻。图12a和12b显示成年人类卵巢皮层组织在玻璃化之前和之后的组织学外观，突出显示维持组织完整性和幸存于冻融方法的大量卵母细胞(黑色箭头)。在图12c中，显示在新鲜分离的人OSC冻融后的细胞损失百分比(来自两位不同患者的结果)。
图13描述在2011年4月14日提交的名为“用于自体种系线粒体能量转移的组合物和方法”的美国专利申请序列号61／475,561中描述的自体种系线粒体能量转移方法的概述。注意，用作线粒体来源以便转移的OSC和将接受线粒体的待受精的卵子获得自相同的受试者。
图14描述了在雌性生殖周期的动情期期间，利用Vasa的细胞表面表达来分离细胞，基于荧光激活细胞分选(FACS)从成年雌性小鼠的骨髓制备物纯化的生殖细胞。
图15描述了在雌性生殖周期的动情期期间，利用Vasa的细胞表面表达来分离细胞，基于荧光激活细胞分选(FACS)从成年雌性小鼠的外周血制备物纯化的生殖细胞。
图16描述作为限制热量摄入量(“CR”)的结果，防止衰老相关的排卵的卵母细胞数目下降。(A)在诱导3月龄(3M)随意(AL)膳食(AL)采食(n=6)、12月龄(12M)随意采食(n=12)和12M CR-随意采食(n=6)的小鼠排卵后获得的卵母细胞的产率和形态(均值±SEM；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠)。(B)每个雌性每个诱导排卵周期，发育至胚泡的体外受精中期II(MII)的卵母细胞的数目(n=11-16只小鼠组；均值±SEM；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠)。(C)在3M随意采食、12M随意采食和12M AL-CR采食的小鼠中每个卵巢的非闭锁不成熟卵泡的数目(均值±SEM，n=9-14只小鼠／组；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠；**，P<0.05)。
图17描述在IVF后对植入前胚胎发育缺少CR影响。(A和B)从3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的雌小鼠小鼠采集的在体外受精后发育成至2细胞期胚(2CE)的去卵丘细胞的MII卵母细胞(A)或卵丘包围的卵母细胞(B)的百分比，和分别发育成胚泡期(B)胚的2CE或授精的总卵母细胞(TIO)的百分比[分别是B(2CE)和B(TIO)]。数据是以下项的均值±SEM：(A)使用每组总计6-9只小鼠，n=来自3个独立实验的55-140个无卵丘MII卵母细胞；(B)使用每组总计5-7只小鼠，n=来自3个独立实验的38-144个卵丘-卵母细胞复合体。
图18描述卵母细胞产率和体重之间的关系。(A和B)在3M随意采食(A)、12M随意采食(B)和12M CR-随意采食(C)的雌小鼠中基于逐只小鼠，相对于超数排卵的卵母细胞产率评估体重。
图19描述通过CR防止MII卵母细胞中衰老相关的非整倍性。(A)含有21条染色体的超倍体MII卵母细胞的实例(DNA的DAPI染色以蓝色显示)的实例。(B)在3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的雌小鼠的MII卵母细胞中超倍性、亚倍性和姐妹染色单体过早分离(和来自全部3个合并终点的总染色体缺陷)的发生率(均值±SEM，在每个实验中，n=每组分析的18-23个成熟卵母细胞，重复4次，使用总计20-34只小鼠／组；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠；nd，未检测到)。
图20描述通过CR防止衰老女性的卵母细胞中的纺锤体和染色体排列缺陷。(A和B)在3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的小鼠的MII卵母细胞中纺锤体异常(A)和赤道板上染色体错排列(B)的发生率(均值±SEM，在每个实验中，n=每组分析的3-20个卵母细胞，重复4-7次，使用总计4-8只小鼠／组；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠)。(C)在用α-微管蛋白抗体(绿色)标记并用PI(红色)复染DNA后，来自所示小鼠的MII卵母细胞中减数分裂纺锤体的代表性实例(n=每组分析的22-72个卵母细胞)。
图21描述通过CR在衰老雌性的卵母细胞中维持正常线粒体动力学。(A)来自3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的小鼠的MII卵母细胞中的代表性线粒体分布(Mito Tracker染色以红色显示)。(B)在来自3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的小鼠的MII卵母细胞中异常线粒体聚集的发生率(均值±SEM，n=来自3个独立实验的每组分析的23-46个卵母细胞，使用4-11只小鼠／组；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠)。(C)在来自3M随意采食、12M随意采食和12M CR-随意采食的小鼠的各个MII卵母细胞中的胞质ATP水平(均值±SEM，n=来自5-7个独立实验的每组分析的总计38-145个卵母细胞，使用总计5-21只小鼠／组；*，P<0.05，相对于3M随意采食的雌小鼠)。
图22描述衰老雌性中卵母细胞产率和品质因过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1α(PGC-1α)丢失导致的改善。(A)3M随意采食野生型(wt)小鼠、12M随意采食或CR-随意采食野生型小鼠或12M随意采食或CR-随意采食Pgc-1α-无效小鼠的分离的MII卵母细胞中Pgc-1α和Pgc-1βmRNA水平的RT-PCR分析(肌动蛋白，样品载量的对照基因；大小，分子大小标记；Ov，用作阳性对照的成年卵巢RNA；-RT，无逆转录酶作为阴性对照的情况下对卵巢RNA的RT-PCR分析)。(B-E)显示了随意采食和CR-随意采食的雌小鼠中PGC-1α缺乏对超数排卵后卵母细胞产率(B)、减数分裂纺锤体形成(C)、赤道板上的染色体排列(D)和线粒体分布(E)的影响。(D)和(E)的图注与(C)相同。数据是均值±SEM(n=对每个终点而言来自3个独立实验的每组分析的20-117个卵母细胞，使用总计3-14只小鼠／组；*，P<0.05，相对于全部其他组)。
图23描述PGC-1在卵母细胞中的表达。年轻成年小鼠卵巢中对PGC-1的免疫组织化学检测(对比蓝色苏木精复染的棕色反应产物)。插图显示典型阳性卵母细胞的放大图像。
图24描述在缺少PGC-1α的小鼠中随年龄而削弱的卵巢储备。在3M随意采食、12M随意采食或12M AL-CR采食的野生型(wt)或PGC-1α缺陷(无效)雌性小鼠中每个卵巢的非闭锁静息(原始)和早期生长(初级、窦前期)不成熟卵泡数目。数据是均值±SEM(n=4-12只小鼠／组；*，P<0.05，相对于任一种基因型的3M随意采食的雌小鼠)。
图25描述年轻和衰老雌性小鼠的卵巢中PGC-1的可比较水平。(A)年轻(3M)随意采食、衰老(12M)的随意采食和衰老(12M)的CR-随意采食的雌小鼠的卵巢中内源PGC-1蛋白水平的蛋白质印迹分析(每个组显示从3只不同小鼠制备的样品)。使用泛肌动蛋白(肌动蛋白)作为内参对照。(B)在用来获得PGC-1蛋白质印迹法(A)的样品的相同雌小鼠的卵巢中PGC-1的免疫组织化学检测(对比蓝色苏木精复染的棕色反应产物)的实例。
图26描述饮食操控对体重的影响。就在启动CR膳食(3M)之前、当完成CR方案(11M)时和恢复随意采食(12M)后1个月的雌性小鼠体重。所示的数据是来自分析5-23只小鼠／组的均值±SEM(*，P<0.05，相对于每个相应组中3M随意采食的雌小鼠)。JAX，C57BL／6小鼠来自Jackson Laboratories；NIA，C57BL／6小鼠来自NIA；Pgc-1α，突变小鼠品系从B.M获得。Spiegelman(Lin(林)等人，Cell(细胞)2004119：121-135)。
图27描述通过CR防止衰老相关的雌性生殖周期破坏。显示典型4-5日动情周期或持续超过5日的非典型动情周期的衰老(12M)的随意采食和CR-随意采食的雌小鼠的比例。数据来自30天时间内通过每日阴道抹片平行分析的10-15只小鼠／组。
图28描述线粒体DNA拷贝数(相对于核基因组)。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估线粒体DNA(mtDNA)含量。
图29描述线粒体膜电位。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat CellBiol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估线粒体膜电位(MMP)。
图30描述线粒体DNA拷贝数(相对于核基因组)。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估线粒体DNA拷贝数。
图31描述作为线粒体活性量度的ATP水平。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估线粒体活性。
图32描述如染料NAO所计量的线粒体密度增加百分比。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估线粒体密度。
图33描述已知驱动线粒体生物生成和能量学的基因的mRNA水平。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估已知驱动线粒体生物生成的基因的表达水平。
图34描述编码线粒体电子传递链组分的基因的mRNA水平。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估编码线粒体电子传递链组分的基因的表达水平。
图35描述用线粒体增强剂处理的OSC中NAD+(A)和NADH(B)的水平。在培养下维持的小鼠OSC(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)暴露于所指明的测试化合物24小时并且随后评估NAD+和NADH的水平。
图36描述用线粒体示踪剂(mitotracker)M7514染色和裂解细胞后的线粒体。将人OSC与M7514孵育并随后使用渗透休克法裂解以释放染色的线粒体。通过FACS分析整个群体(来自裂解细胞和残余的未裂解的染色细胞的线粒体)。左小图显示来自裂解细胞的线粒体，所示线粒体基于大小可容易地与包含于残余的未裂解的细胞中的线粒体区分(前向散射；FSC-A)。荧光强度(FITC-A)揭示来自裂解细胞的两个不同线粒体群体，一者具有高强度(Mito MT高)并且另一个具有低强度(Mito MT低)。已知功能性线粒体具有较大的染料摄取和停留，并且因此在更高强度时发荧光(Invitrogen(英杰公司)技术人员)。
图37是描述哺乳动物细胞中NAD+合成和降解的途径的示意图(Hassa，P.(哈萨，P.)等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev.(微生物学与分子生物学评论)2006年，第70卷，第3期，789-829)。
图38显示示例性NAD+的可溶性前体的结构。这些药剂可以用来在受损和／或衰老的细胞中升高细胞NAD+水平并且增强细胞能量学。
图39A-39C是显示烟酰胺单核苷酸升高鼠卵原干细胞(OSC)中细胞NAD+和NAD+／NADH的图。基于纯化不合掺杂性卵母细胞的OSC的分选方案，使用FACS从解离的卵巢分离卵原干细胞(见实例1)。在培养基中维持细胞，所述培养基由极限基本培养基α(MEMα)、10％FBS、1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma(西格玛公司))，10ng／m1-1LIF(Millipore(密理博公司))、1X N-2MAX培养基补充物(R&D)、10ng／mL EGF(人重组表皮生长因子；Gibco(吉博科公司))，40ng／mL人GDNF(源自神经胶质细胞系的神经营养因子；R&D Systems(R&D系统公司))、1ng／mL人bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；Gibco(吉博科公司))组成。
图40是显示烟酰胺单核苷酸增加鼠OSC中线粒体DNA含量的图。在指示的时间点使用DNeasy血液及组织试剂盒(Qiagen(凯杰公司))，根据制造商的说明书从细胞分离细胞总DNA。使用LightCycler480SYBR Green I Master(Roche AppliedScience(罗氏应用科学公司))，使用Roche480PCR仪，将Mt DNA拷贝数定量。
图41是显示烟酰胺单核苷酸增加培养的鼠卵原干细胞中自发性卵母细胞形成的图。为评估自发性卵母细胞形成，将24孔平板的每个孔用25,000个OSC接种，并且在接种后第二日以及NMN处理后的指定时间点评估每孔形成并释放入培养基的卵母细胞的数目。
图42是显示NAD+前体NMN升高年轻和年老小鼠中体内NAD+水平的图。心[NAD+]随年龄而下降并且被NMN处理逆转(n=3；200mg.kg.d.腹内，持续1周)。
图43A-D是显示NAD+前体(NMN)对体内线粒体功能的恢复作用的图。在仅1周处理后，24月龄小鼠的骨骼肌中线粒体功能的下降被NMN(烟酰胺单核苷酸)彻底逆转(图43A、B)。NMN通过腹膜内(I.P.)注射递送并且升高脑、心脏和骨骼肌中的NAD+水平约30-100％。NMN以SIRT1依赖性方式增加C2C12细胞中的线粒体功能(图43C，D)，sh Ctl=乱序shRNA，ShSIRT1=针对SIRT1的shRNA。
图44是显示芹菜素、木犀草素和SRT-1720影响来自衰老雌性小鼠的卵母细胞产率的柱状图。
图45是与衰老的雌性小鼠相比，显示芹菜素、木犀草素和SRT-1720影响超数排卵后采集的成熟、中期II卵母细胞的百分比的柱状图。
图46是与衰老的雌性小鼠相比，显示芹菜素、木犀草素和SRT-1720改善衰老小鼠中的卵母细胞品质的柱状图。
本发明的详细说明
定义
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在矛盾的情况下，本申请(包括定义)将居主导。
术语“施用(administration)”或“施用(administering)”包括向受试者引入一种或多种化合物以执行其预期功能的途径。可以使用的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹内、鞘内)、口服和经皮。当然，通过合适每种施用途径的形式给予药物制品。例如，将这些制品以片剂或胶囊剂形式、通过注射或吸入施用。优选口服施用。注射可以是快速浓注(bolus)或可以是连续输注。取决于施用途径，化合物可以用选择的材料包衣或分布在选择的材料中，以便保护它免受天然条件影响，所述天然条件可能有害地影响它执行其预期功能的能力。
该药剂可以单独施用，或结合另一种如上文所述的药剂(例如另一种生物能剂)或药学上可接受的载体或这二者一起施用。化合物可以在施用另一种药剂之前、与之同时或在施用该药剂之后施用。另外，化合物也可以按原形式(proform)施用，所述原形式在体内转化成其有活性的代谢物或更有活性的代谢物。
如本文所用，在涉及人类时，术语“高育龄”指年龄34岁或更大的女性。如本文所用，在涉及人类时，术语“卵母细胞相关的不育”指无保护的性交1年后不能受孕，所述不能受孕不由解剖畸形(例如，阻塞的输卵管)或病理状况(例如，子宫纤维瘤、严重子宫内膜异位症、II型糖尿病、多囊性卵巢疾病)引起。
术语“烷基”指饱和脂族基团的原子团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环基团)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。该术语炕基进一步包括这些烷基，所述烷基还可以包括替换烃主链的一个或多个碳的氧、氮、硫或磷原子，例如，氧、氮、硫或磷原子。在优选的实施例中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链，C1-C30；对于支链，C3-C30)、优选地26个或更少的并且更优选地20个或更少的碳原子。同样，优选的环烷基在它们的环结构中具有3-10个碳原子并且更优选地在环结构中具有3、4、5、6或7个碳。
另外，如本说明书和权利要求书通篇范围所用的术语烷基意在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者指在烃主链的一个或多个碳上具有替换氢的取代基的烷基部分。这类取代基可以包括，例如卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧化物、烷基羰基、烷氧羰基、氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酰基(phosphonato)、次膦酰基(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷氨基、二烷氨基、芳氨基、二芳氨基和烷芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰氨基、芳基羰氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、硫氢基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯(sulfonato)、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将理解，烃链上取代的部分可以根据需要本身被取代。环烷基可以进一步例如用上文描述的取代基取代。“烷基芳基”部分是用芳基(例如，苯基甲基(苄基))取代的烷基。术语“烷基”也包括在长度上类似并且可能取代上述烷基，但分别含有至少一个双键或叁键的不饱和脂族基团。
除非另外指定碳的数目，否则如本文所用的“低级烷基”意指如上文定义，但是在其主链结构中具有从1至10个碳原子、更优选地从1个至10个和最优选地从1个至4个碳原子的烷基，所述烷基可以是直链或支链的。低级烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、己基、庚基、辛基等。在优选的实施例中，术语“低级烷基”包括在其主链中具有4个或更少碳原子的直链烷基，例如，C1-C4烷基。
如本文所用，术语“烷氧基”指经氧原子与另一个部分连接的烷基或环烷基。烷氧基可以任选地由一个或多个取代基取代。
术语“烷氧基烷基”、“聚氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”指如上文所述的烷基，所述烷基还包括替换烃主链的一个或多个碳的氧、氮或硫原子，例如，氧、氮或硫原子。
术语“链烯基”和“炔基”指在长度上类似并且可能取代上述烷基，但分别含有至少一个双键或叁键的不饱和脂族基团。例如，本发明构思氰基和炔丙基。
术语“芳基”指芳基原子团，包括可以包含从0至4个杂原子的5元和6元单环芳基，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳基也包括多环稠合的芳基如萘基、喹啉基、吲哚基等。那些在环结构中具有杂原子的芳基也可以称作“芳基杂环”、“杂芳基”或“杂芳族化合物”。芳环可以在一个或多个环位置被如上文所述的这类取代基取代，例如卤素、羟基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧化物、烷基羰基、烷氧羰基、氨基羰基、烷硫基羰基、磷酸酯、膦酰基、次膦酰基、氰基、氨基(包括烷氨基、二烷氨基、芳氨基、二芳氨基和烷芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰氨基、芳基羰氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、硫氢基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。芳基也可以与不是芳族的脂环或杂环稠合或桥接，从而形成多环(例如，四氢萘)。
术语“卤素”或“卤代”指-F、-Cl、-Br或-I。
术语“卤代烷基”意在包括由卤素单取代、双取代或多取代的如上文定义的烷基，例如，氟甲基和三氟甲基。
术语“羟基”意指-OH。
如本文所用的术语“杂原子”意指除碳或氢之外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧、硫和磷。
术语“杂芳基”指芳族5-8元单环、8-12元双环、或11-14元三环系统，所述环系统如果是单环则具有1-4个环杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原予，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O，N，或S，并且剩余环原子是碳。杂芳基可以任选地由一个或多个取代基取代。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、呋喃基、苯并二氧杂环戊烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基噻唑基、异噁唑基、喹啉基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、三唑基、噻二唑基、异喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、和吲哚基。
如本文所用，术语“杂环的”指在环结构内部含有除碳之外的至少一个原子(例如，S，O，N)的有机化合物。这些有机化合物中的环结构可以是芳族或非芳族的。杂环部分的一些实例包括，不限于吡啶、嘧啶、吡咯烷、呋喃、四氢呋喃、四氢噻吩和二噁烷。如本文所用，“生物能剂”指在卵母细胞、OSC和／或植入前胚胎中，在实施体外受精方法之前和／或在体外受精方法后或在卵巢、卵母细胞、OSC和／或植入前胚胎体内暴露后增强线粒体数目、线粒体活性、细胞能量水平或细胞产能潜力(统称为“生物能状态”)的药剂。具体而言，通过增强线粒体数目或活性，本发明的生物能剂改善卵母细胞或OSC产生和品质，例如，通过防止或减少衰老相关的卵母细胞非整倍体增加、赤道板上染色体错排列、减数分裂纺锤体异常和／或线粒体功能障碍(聚集，受损的ATP产生)。生物能剂包括Sirt1激活物。表1中列出示例性Sirt1激活物(下文)。
表1：Sirt1激活物
Figure BDA0000466883790000301
CD38抑制剂也可用作生物能剂。表2A和2B中列出示例性CD38抑制剂(下文)。
表2A：CD38抑制剂
1-[(2-乙酰氧基乙氧基)甲基]-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-[(2-苄氧乙氧基)甲基]-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(4-甲氧基-苯氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(4-苯氧基-苯氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(4-硝基-苯氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(3-三氟甲基-苯氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(8′-喹啉基氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1，2-二甲氧基-乙烯-双-N，N′-3-(氨基羰基)-二氯化吡啶嗡
1，4-二甲氧基-丁烯-双-N，N′-3-(氨基羰基)-二氯化吡啶嗡
1，4-二甲氧基-丁炔-双-N，N′-3-(氨基羰基)-二氯化吡啶嗡
1，4-二甲氧基-六亚甲基-双-N，N′-3-(氨基羰基)-二氯化吡啶嗡
(E)-1-{[4-(8′-喹啉基氧基)丁-2-烯基氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-氯化吡啶嗡
1-{[2-(4-苯氧基-苯氧基)乙氧基]甲基}-6-(氨基羰基)-氯化喹啉鎓
1-{[2-(4-苯氧基-苯氧基)乙氧基]甲基}-3-(氨基羰基)-4-氨基-氯化吡啶嗡
表2B中列出额外的CD38抑制剂。
Figure BDA0000466883790000321
用于此类用途的优选生物能剂包括但不限于NAD+的可溶性前体(例如，色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷和烟酸)、漆树黄酮、槲皮素、羟基酪醇(4-(2-羟乙基)-1，2-苯二醇)、吡咯并喹啉醌(PQQ)、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱CD38抑制剂和SRT-1720、具有式I-XV中任一者的化合物及功能衍生物。
DOI(2，5-二甲氧基-4-碘-苯基异丙胺)是已经表征为5-HT2-选择性激动剂的苯基烷基胺。
漆树黄酮(2-(3，4-二羟苯基)-3，7-二羟基色烯-4-酮)例如由Herzig(赫齐格)，Monatshefte für Chemie(化学月刊)189112：177-90；Gábor(格博)等人，Nature(自然)1966212(5067)：1273；和Maher(马赫)等人，PLoS ONE20116(6)：e21226描述，所述的每篇文献通过引用的方式并入。槲皮素例如由Bentz(本茨)，The Journal of Young Investigators：Appalachian State University.[Online](青年研究者杂志：阿巴拉契亚州立大学[在线版])2009年4月1日描述，所述文献通过引用方式结合在此。
白藜芦醇(3，5，4′-三羟基-反-芪)例如由Takaoka(高岗)，Nippon Kagaku Kaishi(日本化学学会杂志)193960：1090-1100；Hathway(海瑟薇)等人，BiochemicalJournal(生物化学杂志)195972：369-374；和Nonomura(野野村)等人，YakugakuZasshi(日本药学学会杂志)196383：988-990描述，所述的每篇文献通过引用的方式并入。
吡咯并喹啉醌(4，5-二氢-4，5-二氧代-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸)例如由描述Hauge(豪格)J Biol Chem(生物化学杂志)1964239：3630-9；Anthony(安东尼)等人，Biochem J(生物化学杂志)1967104：960-9；Salisbury(索尔兹伯里)等人，Nature(自然)1979280：843-4；Westerling(韦斯特铃)等人，Biochem BiophysRes Commun(生物化学和生物物理研究通讯)197987：719-24；Ameyama(阿梅亚麻)FEBS Lett(欧洲生化学会联合会快报)1981130：179-83，所述的每篇文献通过引用的方式并入。
二甲双胍(N，N-二甲基亚胺基二碳酰亚胺二酰胺)是例如由Werner.(维尔纳)JChem Soc，Transactions(化学学会杂志，汇报)1921121：1790-5；Shapiro(夏皮罗)等人，J Am Chem Soc.(美国化学学会杂志)195981：2220-5；法国专利FR23228601975；和Pharmaceutical Manufacturing Encyclopedia(制药百科全书)(Sittig′sPharmaceutical Manufacturing Encyclopedia(西蒂希制药百科全书))，第3版，第3卷，Norwich(诺维奇)，NY：William Andrew(威廉安德鲁)；2007描述，所述的每篇文献通过引用的方式并入。
芹菜素(5，7-二羟基-2-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮)例如由Merck Index(默克公司索引)，第11版，763描述，所述文献通过引用方式结合在此。
木犀草素(2-(3，4-二羟苯基)-5，7-二羟基-4-色烯酮)例如由Mann SecondaryMetabolism(曼氏次生代谢)1992(第2版)，Oxford(牛津)，UK：牛津大学出版社(Oxford University Press)，第279-280页；和López-Lázaro(洛佩斯-拉萨罗)Mini RevMed Chem(药物化学微评)20099：31-59描述。
酪氨酸磷酸化抑制剂8(2-[(4-羟苯基)亚甲基]丙二腈)例如由Martin(马丁)，Biochem.Pharmacol.(生化药理学)199856：483；Wolbring(沃波林)等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)1994269：22470；Stanley(斯坦利)等人，J.Immunol.(免疫学杂志)1990145：2189和Gazit(加齐特)等人，J. Med.Chem.(药物化学杂志)198932：2344描述。
小檗碱(9，10-二甲氧基-5，6-二氢[1，3]二氧杂环戊烯并[4，5-g]异喹啉并[3，2-a]异喹啉-7-鎓)例如由描述Dewick(德维克)Medicinal Natural Products.：ABiosyntheticApproach(天然药物产物：生物合成法)(第3版)，West Sussex(西苏塞克斯)，England(英格兰)：Wiley.(威利出版社)2009第357-358页。
SRT-1720(N-[2-[3-(哌嗪-1-基甲基)咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-6-基]苯基]喹噁啉-2-甲酰胺)例如由Milne(米尔恩)等人，Nature(自然)2007450：712-6描述。
“卵原干细胞”(OSC)，也称作雌性种系干细胞，衍生自出生后来源并且表达包括Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选地SSEA在内的标记。OSC能够有丝分裂(即，具有有丝分裂能力)并且不表达卵母细胞标记，包括生长／分化因子-9(“GDF-9”)和透明带糖蛋白(例如，透明带糖蛋白-3，“ZP3”)或减数分裂重组标记如联会复合体蛋白质-3(“SYCP3”或“SCP3”)。OSC可以从出生后卵巢获得。OSC是本领域已知的并且在2005年5月17日作为代理人案号51588-62054提交并且作为美国专利公开号20060010508公开的美国专利申请系列号11／131,114中描述，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。OSC额外地由Zou(邹)(天然细胞生物学)200911：631-636和Pacchiarotti(巴葛亚洛蒂)等人，Differentiation(分化)201079：159-170描述，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。优选地，本发明的OSC是人OSC。
如本文所用，“OSC后代”涉及源自本发明OSC的维持生卵潜能(即，形成卵母细胞的能力)的全部后代细胞，包括祖细胞和分化的细胞。优选地，本发明的OSC后代是人OSC后代。
OSC可以额外地从骨髓、外周血或脐带血获得。骨髓衍生的、本发明的OSC也可以遍及身体循环，并且最优选地可以定位于骨髓、外周血和卵巢中。骨髓衍生的OSC表达包括Oct4、Vasa、Dazl、Stella、Fragilis以及任选地Nobox、KIT和Sca-1在内的标记。骨髓衍生的OSC能够有丝分裂(即，具有有丝分裂的能力)并且不表达GDF-9、透明带蛋白质(例如，ZP3)或SCP3。关于骨髓衍生的OSC的额外细节，见2005年5月17日作为代理人案号51588-62060提交并且作为美国专利公开号20060010509公开的美国专利申请系列号11／131,153，所述文献的描述骨髓中OSC的内容通过引用的方式结合在此。关于外周血和脐带血衍生的OSC的额外细节，见2005年5月17日作为代理人案号51588-62065提交并且作为美国专利公开号20060015961公开的美国专利申请系列号11／131,152，所述文献的描述外周血中OSC的内容通过引用的方式结合在此。
Oct-4，也称作POU结构域等级5转录因子1或Pou5f1，是在雌性种系干细胞及其祖细胞中表达的基因。Oct-4基因编码参与哺乳动物种系建立并在早期生殖细胞特化中发挥显著作用的转录因子(综述于Scholer(肖勒)，Trends Genet.(趋势遗传学)19917(10)：323-329中)。在正在发育的哺乳动物胚胎中，Oct-4在外胚层分化期间下调，最终变得局限于生殖细胞谱系。在该种系中，与外胚层表达相隔离地调节Oct-4表达。Oct-4的表达是全能性的表型标记(Yeom(页姆)等人，Development(发育)1996122：881-888)。
Stella，也常称作发育多能性相关3或Dppa3，是在雌性种系干细胞及其祖细胞中表达的基因。Stella是在原始生殖细胞及其后代(包括卵母细胞)中特异性表达的新基因(Bortvin(包特文)等人，BMC Developmental Biology(BMC发育生物学)20044(2)：1-5)。Stella编码具有SAP样结构域和剪接因子基序样结构的蛋白质。Stella表达缺陷的胚胎在植入前发育中受损并且很少达到胚泡期。因而，Stella是涉及早期胚胎发生的母源因子。
Dazl是在雌性种系干细胞及其祖细胞中表达的基因。常染色体基因Dazl是含有共有RNA结合结构域并且在生殖细胞中表达的基因家族的成员。小鼠中完整Dazl蛋白表达的丧失与生殖细胞不能完成减数分裂前期相关。具体而言，在Dazl失效的雌性小鼠中，生殖细胞的丢失在胎儿期期间在生殖细胞经过减数分裂前期进展的同时发生。在Dazl失效的雄性小鼠中，生殖细胞不能进展超出减数分裂前期I的细线期。因而，在不存在Dazl的情况下，经减数分裂前期的进展被中断(Saunders(桑德斯)等人，Reproduction(繁殖)2003126：589-597)。
Vasa，也称作DEAD框多肽4或Ddx4，是在雌性种系干细胞及其祖细胞中表达的基因。Vasa是种质的编码DEAD-家族ATP依赖性RNA解旋酶的组分(Liang(梁)等人，Development(发育)1994120：1201-1211；Lasko(拉斯科)等人，Nature(自然)1988335：611-167)。Vasa的分子功能涉及结合参与生殖细胞建立(例如Oskar(奥斯卡尔)和Nanos(纳诺斯))、卵子发生(例如Gruken(格鲁肯))以及翻译起始(Gavis(嘉维)等人，Development(发育)1996110：521-528)的靶mRNA。Vasa是极细胞形成所需要的，并且在整个发育中仅局限于生殖细胞谱系。因此，Vasa是大多数动物种类中生殖细胞谱系的分子标记(Toshiaki(俊明)等人，Cell Structure and Function(细胞结构和功能)200126：131-136)。
阶段特异性胚胎抗原任选地在雌性种系干细胞中表达并且在本发明的雌性种系干细胞祖先中表达。阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)是其功能与细胞黏附、移行和分化相关的细胞表面胚胎抗原。在下胚层形成期间，SSEA-1阳性细胞可以在囊胚腔和下胚层中并稍后在生殖新月中鉴定到。SSEA-1在早期生殖细胞和神经细胞发育中发挥作用。(D′Costa(D′科斯塔)等人，Iht J. Dev.Biol.(发育生物学国际杂志)199943(4)：349-356；Henderson(亨德森)等人，Stem Cells(干细胞)200220：329-337)。在特定的实施例中，SSEA在雌性种系干细胞中的表达可以随细胞分化而发生。可用于本发明中的SSEA包括SSEA-1、SSEA-2、SSEA-3和SSEA-4。
如本文所用的，术语“自体”指从相同受试者获得的生物组合物。在一个实施例中，生物组合物包括OSC、OSC衍生的组合物和卵母细胞。因此，在实施本发明的方法时，从相同的受试者获得用于转移的女性生殖细胞细胞质或线粒体和向其中转移前述组合物的受体卵母细胞。
如本文所用的，术语“增加”通常意指增加至少5％，例如与参比水平相比增加至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包括100％增加(即基本上高于检测水平)，或在5％-100％之间的任何增加，如该术语在此定义那样并且如通过实现统计显著性(p<0.05)的方法所确定的。
如本文所用，术语“分离的”指已经从其天然生物环境物理分离或取出的OSC、源自OSC的线粒体或组合物(例如，细胞质、线粒体制备物)。分离的OSC、线粒体或组合物不需要纯化。生物样品可以包括例如骨髓、外周血、脐带血、卵巢或脾或者从骨髓、外周血、卵巢或脾获得的细胞。优选地，相对于其他细胞类型或细胞器，组合物包含至少50％、75％、85％、90％、95％或100％的感兴趣的细胞类型或细胞器。
如本文所用，在涉及人类时，术语“低卵巢储备”指女性，该女性在一个“3日FSH测试”中显示出大于15miu／ml的循环型促卵泡激素(FSH)水平，如Scott(斯科特)等人，Fertility and Sterility(生育与不育)，198951：651-4中所述，或小于0.6ng／ml的循环型抗缪勒氏管激素(AMH)水平或如通过超声法测量小于7的窦卵泡计数。
如本文所用的，术语“外源”指转移的细胞物质(例如，线粒体)，所述细胞物质从一个细胞取出并转移至另一个细胞中。优选地，细胞和转移的物质是自体的。例如，已经转移至卵母细胞的、OSC衍生的线粒体将是外源的，即便二者均源自相同的受试者。
术语“前药”包括具有可以在体内代谢的部分的化合物。通常，前药在体内由酯酶或由其他机制代谢成活性药物。前药及其用途的实例是本领域熟知的(见，例如，Berge(贝格)等人，(1977)“Pharmaceutical Salts(药物盐)”，J.Pharm.Sci.(药物科学杂志)66：1-19)。前药可以在化合物的最后分离和纯化期间原位制备，或者使处于其游离酸形式的纯化化合物或羟基与合适的酯化剂单独反应来制备。羟基可以通过用羧酸处理转化成酯。前药部分的实例包括取代的和未取代、分支或不分支的低级烷基酯部分(例如，丙酸酯)、低级链烯基酯、二低级烷基氨基低级烷基酯(例如，二甲基氨基乙基酯)、酰氨基低级烷基酯(例如，乙酰氧基甲基酯)、酰氧基低级烷基酯(例如，新戊酰氧基甲基酯)、芳基酯(苯基酯)、芳基-低级烷基酯(例如，苄酯)、取代的(例如，具有甲基、卤素或甲氧基取代基)芳基和芳基-低级烷基酯、酰胺、低级烷基酰胺，二低级烷基酰胺和羟基酰胺。优选的前药部分是丙酸酯和酰基酯。也包括通过其他机制在体内转化成活性形式的前药。
增加sirtuin(例如，SIRT1)活性的化合物称作“SIRT1激活物”。示例性化合物在表1、2A和2B中列出并且例如在WO05／002672、WO05／002555、US20050136537、US20060025337、WO2005／065667和WO2007／084162中描述，并且包括多酚，例如植物多酚。
如本文所用的，术语“降低的(reduced)”或“降低(reduce)”或“减少(decrease)”通常意指减少至少5％，例如与参比水平相比减少至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包括100％减少(即基本上缺少或低于检测水平)，或在5％-100％之间的任何减少，如该术语在此定义那样并且如通过实现统计显著性(p<0.05)的方法所确定的。
“受试者”是脊椎动物，包括哺乳动物纲的任何成员，包括人，家养动物和农场动物，和动物园动物、体育动物或宠物动物，如小鼠、兔、猪、羊、山羊、牛和高等灵长类。
在本披露中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”以及“具有(having)”等可以具有美国专利法中向它们所赋予的含义，并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由...组成(consisting essentially of)”或“基本上由...组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许超过所列举的内容的存在，只要所列举的内容的基础或新颖特征不会因超过所列举的内容的存在而改变即可，但将现有技术实施例排除在外。
如本文所用的，术语“降低的”或“降低”或“减少”总体上意指统计显著的量减少。然而，为避免疑问，如该术语在本文中所定义的，“降低”意指与参比水平相比减少至少5％，例如与参比水平相比减少至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包括100％减少(即基本上缺少或低于检测水平)，或在5％-100％之间的任何减少。
如本文所用的，术语“增加”总体上意指统计显著的量增加。然而，为避免疑问，如该术语在本文中所定义的，术语“增加”意指与参比水平相比增加至少5％，例如与参比水平相比增加至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多到并且包括100％增加(即显著高于检测水平)，或在10％-100％之间的任何增加。
如本文所用，术语“标准”或“参比”指与另一份样品比较的已知样品中测量的生物参数，包括但不限于缺陷如非整倍体、突变、染色体错排列、减数分裂纺锤体异常和／或线粒体功能障碍(聚集、ATP产生受损)或这类缺陷的减少或消除；可替代地，标准可以简单地是代表测量的生物参数的量的参比数字，所述量定义用于比较的基线。该参比数字可以衍生自样品，所述样品取自一位个体或多位个体或从中获得的细胞(例如，卵母细胞、OSC)。即，“标准”不需要是受测试的样品，但是可以是接受的参比数字或值。可以形成一系列标准，这些标准考虑个体的状态，例如，就年龄、性别、重量、高度、种族背景等而言。标准水平可以例如从来自不同个体(例如，不是正在受测试的个体)的已知样品获得。也可以通过以下方式获得已知样品：汇集来自多位个体(或从中获得的细胞)的样品以在平均化群体范围内产生标准。另外，可以如此合成标准，从而一系列标准物用来对个体的样品中的生物参数进行定量。来自待测试的个体的样品可以在较早的时间点(假定在处理开始之前)获得，并且充当与处理开始之后从相同体取得的样品相比的标准或参比。在这类情况下，该标准可以提供治疗功效的量度。
将本文中提供的范围理解为对所述范围内全部值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，所述组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
其他定义呈现在本披露全篇的上下文中。
本发明的组合物和方法
用于本发明中的生物能剂
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是具有式I的化合物或具有式II的化合物：
其中
Figure BDA0000466883790000412
是芳基杂环双基；
Figure BDA0000466883790000413
是杂芳基；
X是卤素；
R1是羟基、烷氧基或氨基；并且
R2是羟基、烷氧基或氨基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000414
是以下项的双基：氮杂吲哚、苯并(b)噻吩、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并噻二唑、苯并三唑、苯并噁二唑、呋喃、咪唑、咪唑并吡啶、吲哚、二氢吲哚、吲唑、异吲哚啉、异噁唑、异噻唑、异喹啉、噁二唑、噁唑、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、吡咯、吡咯并[2，3-d]嘧啶、吡唑并[3，4-d]嘧啶、喹啉、喹唑啉、三唑、噻唑、硫苯、四氢吲哚、四唑、噻二唑、噻吩、硫代吗啉或三唑。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000421
是以下项的双基：呋喃、咪唑、异噁唑、异噻唑、噁二唑、噁唑、吡咯、三唑、噻唑、四唑、噻二唑、噻吩或三唑。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000422
是咪唑的双基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000423
是氮杂吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、二氢吲哚基、吲唑基、异二氢吲哚基、异噁唑基、异噻唑基、异喹啉基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、噻吩基、四氢吲哚基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、硫代吗啉基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000424
是呋喃基、咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、三唑基、噻唑基、四唑基、噻二唑基、噻吩基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000425
是咪唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是溴。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是烷氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是甲氧基。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式III的化合物：
Figure BDA0000466883790000431
其中对于每次出现而言独立地，
是杂芳基；
X是卤素；
R2是羟基、烷氧基或氨基；并且
Y是-O-或-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000433
是氮杂吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、二氢吲哚基、吲唑基、异二氢吲哚基、异噁唑基、异噻唑基、异喹啉基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、噻吩基、四氢吲哚基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、硫代吗啉基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中是呋喃基、咪唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、三唑基、噻唑基、四唑基、噻二唑基、噻吩基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000442
是咪唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是溴。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是烷氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是甲氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y是-O-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式IV的化合物：
Figure BDA0000466883790000443
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；并且
Y1是-S-、-O-或-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R的一个例子是羟基。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、卵母细胞或方法的任一种，其中R的剩余实例是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y1是-O-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式V的化合物：
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；并且
R1是羟基、烷氧基或氨基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式VI的化合物：
Figure BDA0000466883790000461
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；
R3是-H、氰基、-CO2R4或-C(O)N(R4)2；和
R4是-H或烷基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3的至少一个例子是氰基。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3至少两个实施例是氰基。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式VII的化合物：
Figure BDA0000466883790000462
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；并且
R1是羟基、烷氧基或氨基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式VIII的化合物：
Figure BDA0000466883790000471
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
X是卤素；
Y1是-O-、-S-或-NH-；并且
Y2是=N-或=CR-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是氯。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y1是-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y2是＝N-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式IX的化合物：
Figure BDA0000466883790000481
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000482
是5元不饱和的杂环双基；
Figure BDA0000466883790000483
是杂芳基；
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；并且
Y2是=N-或=CR-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中是氮杂吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、二氢吲哚基、吲唑基、异二氢吲哚基、异噁唑基、噻唑基、异喹啉基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、噻吩基、四氢吲哚基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、硫代吗啉基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y2的一个例子是＝N-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式X的化合物：
Figure BDA0000466883790000491
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000492
是杂芳基；
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
Y1是-S-、-O-或-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中
Figure BDA0000466883790000493
是氮杂吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、二氢吲哚基、吲唑基、异二氢吲哚基、异噁唑基、异噻唑基、异喹啉基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、噻吩基、四氢吲哚基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、硫代吗啉基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y1是-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是式XI的化合物：
Figure BDA0000466883790000501
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000502
是芳基杂环双基；
是杂芳基；
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；并且
Y2是=N-或=CR-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中是氮杂吲哚基、苯并(b)噻吩基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、呋喃基、咪唑基、咪唑并吡啶基、吲哚基、二氢吲哚基、吲唑基、异二氢吲哚基、异噁唑基、异噻唑基、异喹啉基、噁二唑基、噁唑基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、吡咯并[2，3-d]嘧啶基、吡唑并[3，4-d]嘧啶基、喹啉基、喹唑啉基、三唑基、噻唑基、噻吩基、四氢吲哚基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、硫代吗啉基或三唑基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y2的一个例子是＝N-。
__在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是具有式XII的化合物：
Figure BDA0000466883790000511
其中对于每次出现而言独立地，
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；并且
Y1是-S-、-O-或-NH-。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R的至少一个例子是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y1的至少一个例子是-S-。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是具有式XIII的化合物：
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000513
是芳基或杂芳基；
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；
R2是羟基、烷氧基或氨基；
R3是-H、氰基、-CO2R4或-C(O)N(R4)2；
X是卤素；
Y3是键、-C(O)-d、-C(O)NH-d、-NH-C(O)-d或-C(O)NH-CH2-d；并且
d是与以下的键：
Figure BDA0000466883790000521
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是烷氧基。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、卵母细胞或方法的任一种，其中R2是甲氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3的一个例子是氰基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是溴。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是键。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-C(O)-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-C(O)NH-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-NH-C(O)-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-C(O)NH-CH2-d。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是具有式XIV的化合物：
Figure BDA0000466883790000531
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000532
是5元杂环基；
R是-H、卤索、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；
R2是羟基、烷氧基或氨基；并且
X是卤素。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是烷氧基。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、卵母细胞或方法的任一种，其中R2是甲氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是溴。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是具有式XV的化合物：
Figure BDA0000466883790000541
其中对于每次出现而言独立地，
Figure BDA0000466883790000542
是芳基或杂芳基；
R是-H、卤素、芳基、硝基、烷基、羟基、烷氧基、或氨基；
R1是羟基、烷氧基或氨基；
R2是羟基、烷氧基或氨基；
R3是-H、氰基、-CO2R4或-C(O)N(R4)2；
X是卤素；
Y3是键、-C(O)-d、-C(O)NH-d、-NH-C(O)-d或-C(O)NH-CH2-d；并且
d是与以下的键：
Figure BDA0000466883790000543
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R1是羟基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R2是烷氧基。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、卵母细胞或方法的任一种，其中R2是甲氧基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3的一个例子是氰基。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中R3是-H。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中X是溴。
在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是键。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、卵母细胞或方法的任一种，其中Y3是-C(O)-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-C(O)NH-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-NH-C(O)-d。在某些实施例中，本发明涉及前述组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中Y3是-C(O)NH-CH2-d。
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂是
Figure BDA0000466883790000551
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：：
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：：
Figure BDA0000466883790000562
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：：
Figure BDA0000466883790000571
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：：
Figure BDA0000466883790000572
在某些实施例中，本发明涉及本文所述的组合物、组织、细胞(例如，OSC、卵母细胞)或方法的任一种，其中生物能剂选自下组，该组由以下各项组成：α-亚麻酸、亚麻酸、硬脂酸、反油酸、花生四烯酸、油酸和棕榈油酸。
在替代实施例中，从本发明的方法特别排除一种或多种以下生物能剂：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌(PQQ)、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、SRT-1720和
Figure BDA0000466883790000581
也可以使用本文所述的生物能剂的药学上可接受的盐和前药。
卵母细胞和OSC的分离
使用多种程序如经阴道超声引导的卵母细胞采集术从人受试者分离卵母细胞的标准方法是本领域熟知的。见Fabbri(法布里)等人，Hum Reprod(人类繁殖)200116：411-416。
在分离OSC之前，成年卵巢皮层组织可以使用本领域已知采集小(例如，3x3x1mm)卵巢活组织检查样品的小型腹腔镜手术获得，随后加工所述成年卵巢皮层组织用于OSC分离。见Gook(古科)等人，Hum Reprod(人类繁殖)200420：72-78。可以如实例1，图1中所述或如先前所描述从成年卵巢皮层组织分离人OSC。见，例如，作为美国申请系列号11／131，114在2005年5月17提交的美国专利公开号20060010508第0116段和Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636。OSC也可以从非卵巢来源(如骨髓或外周血)获得。骨髓和外周血衍生的OSC可以通过本领域已知的用于从例如髓或血液分离干细胞的标准手段(例如，细胞分选法)分离。任选地，分离方案包括产生耗尽造血细胞的kit+／lin-部分。基于独特基因表达谱的额外选择手段(例如，Vasa、Oct-4、Dazl、Stella、Fragilis)可以用来进一步纯化细胞群体至这样的程度，其中它们变得基本上不含从中获得它们的生物样品(例如骨髓、外周血、脐带血)。例如，实例1，图1中所描述的方法已应用于血细胞和骨髓细胞的单核细胞部分以从非卵巢来源获得纯化的OSC简而言之，将细胞与免抗-VASA抗体(COOH-抗体577-716)孵育20分钟(abl3840；Abcam(艾博抗公司)，Cambridge(坎布里奇)，MA)，洗涤，并且与偶联于别藻蓝蛋白(APC)的山羊抗兔IgG孵育20分钟，并再次洗涤。通过荧光激活细胞分选术(FACS)，使用BD Biosciences FACSAria II流式细胞仪(Harvard Stem Cell Institute(哈佛干细胞研究所)，Boston(波士顿)，MA))，针对阴性(未染色和无第一抗体)对照进行门控，分离洗脱物中的标记细胞。就在分选之前，将碘化丙啶添加至细胞悬液中以排除死细胞。在图14和15中提供了利用Vasa的细胞表面表达从非卵巢来源分离OSC所获得的结果，其中显示在雌性生殖周期的动情期间基于FACS的、从成年雌性小鼠的骨髓和外周血制备物中纯化生殖细胞。用于分离方法中的其他抗体包括在美国专利号7,884,193、7,226,994和6,875,854中描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。
卵母细胞和OSC衍生的组合物的制备和转移的方法
用于制备和转移纯化的线粒体的方法是本领域已知的并且可以如先前所描述那样实施。见，例如，Perez(佩雷兹)等人，Cell Death Differ(细胞死亡和分化)200714：524-533和Perez(佩雷兹)等人，Nature(自然)2000，403：500-1，所述文献的内容通过引用的方式明确结合在此。简而言之，OSC和／或卵母细胞可以如上文所述那样分离和培养。任选地，OSC和／或卵母细胞可以在提取或制备线粒体之前在一种或多种生物能剂存在的情况下分离并培养。为了从OSC，OSC后代和／或卵母细胞获得线粒体，将2ml线粒体裂解缓冲剂(0.3M蔗糖，1mM EDTA，5mMMOPS，5mM KH2PO4，0.1％BSA)添加至每块平板，并且如果需要，使用细胞刮刀取出细胞。将细胞悬液转移至小型玻璃组织捣碎器(bouncer)中并均化直至光滑(大约10次上下冲击)，并且将裂解物在4℃以600x g离心30分钟。将上清液取出并在4℃以10,000x g离心12分钟，并且将所产生的粗制线粒体沉淀物重悬于0.2ml0.25M蔗糖中。随后将这份样品铺在用0.25M蔗糖稀释的25％-60％Percoll密度梯度上并且在17℃以40,000x g离心20分钟。将界面条带从梯度中提取并在2体积0.25M蔗糖中洗涤，随后在4℃以14,000x g离心10分钟以产生线粒体沉淀物。
线粒体沉淀物也可以如Frezza(佛雷扎)等人，Nature Prolocols(自然研究步骤期刊)20072：287-295描述那样制备，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。在本发明的特定实施例中，可以使用基于FACS的方法用荧光探针分离、表征和／或计数在组织、细胞、裂解的细胞或其部分中的OSC衍生的总线粒体群，所述荧光探针与线粒体以线粒体膜电位(MMP)非依赖性方式特异性结合。与线粒体以MMP非依赖性方式特异性结合的荧光探针包括但不限于积累依赖性探针(例如，JC-1(红光谱；Invitrogen T3168)、线粒体示踪剂深红(MitoTracker Deep Red)FM(Invitrogen M22426)和JC-1(绿光谱；Invitrogen T3168))。可以分选并收集功能性(例如，正在呼吸的)线粒体，优选地使用线粒体示踪探针，基于尺寸和荧光强度，排除残余的未裂解的细胞和无功能的线粒体，所述线粒体示踪探针指示线粒体质量，包括但不限于非氧化依赖性探针(例如，线粒体示踪剂绿(Mito Tracker Green)FM(Invitrogen M7514))。下文在实例10中提供用非氧化依赖性探针实施FACS的示例性方案的细节。任选地，基于FACS的方法也可以用来利用与线粒体以MMP依赖性方式特异性结合的线粒体膜荧光探针选择性以产生纯的功能性(例如，正在呼吸)的线粒体群。与线粒体以MMP依赖性方式特异性结合的荧光探针包括但不限于还原型氧化态线粒体示踪剂探针(例如，线粒体示踪剂红CM-H2XRos(InvitrogenM7513)和线粒体示踪剂橙CM-H2TMRos(Invitrogen M7511)。另外，可以实施使用MMP依赖性探针和MMP非依赖性探针的双重标记，以定量组织、细胞、裂解的细胞或其衍生的部分中功能性线粒体对总线粒体的比率。当使用基于MMP、用于差异性筛选的探针时，光谱颜色是指示功能性线粒体的主要决定因子，并且前向散射可以用来区分从裂解的细胞释放的荧光线粒体与仍包含于残余未裂解的细胞中的那些荧光线粒体。
线粒体沉淀物也可以如Taylor(泰勒)等人，Nat Biotechnol.(自然生物技术)2003年3月；21(3)：239-40；Hanson(汉森)等人，Electrophoresis.(电泳)2001年3月；22(5)：950-9；和Hanson(汉森)等人，J Biol Chem.(生物化学杂志)2001年5月11日；276(19)：16296-301所述那样制备。在本发明的特定实施例中，可以使用如本文实例11所述的差速离心法或使用如本文实例12所述的蔗糖梯度分离法分离、表征和／或计数在组织、细胞、裂解的细胞或其部分中的OSC衍生的总线粒体群。
在分离后，可以根据本领域已知的方法实施对线粒体DNA(mtDNA)完整性(例如，突变和缺失)的评估(Duran(杜兰)等人，Fertility and Sterility(生育与不育)201196(2)：384-388；Aral(亚拉)等人，Genetics and Molecular Biology(遗传和分子生物学)201033：1-4；Chan(钱)等人，Molecular Human Reproduction(人类繁殖分子学)200511(12)：843-846；Chen(陈)等人，BMCMedical Genetics(BMC医学遗传学)201112：8)。现在可以根据本发明的方法获得根据功能参数(例如，MMP依赖性／活性或MMP非依赖性／活性加无活性)所分选的线粒体或来自较不优选的OSC来源的线粒体(包括大小有限的样品)的群体。
任选地，可以在线粒体从细胞中提取、线粒体从细胞提取物中分离或线粒体注射之前，将一种或多种生物能剂添加至线粒体制备物。微量注射针和固定吸管可以使用Sutter拉制仪制得(Sutter Instruments(萨特仪器公司)，Novato(诺瓦托)，CA，USA)和De Fonbrune显微控制仪(EB Sciences(EB科学公司)，East Granby(东格兰比)，CT，USA)。微量注射针具有5tm内径，钝尖。通过负压抽吸，将待注射的材料吸入针头。可以注射约1×103个至约5×104个之间，来自OSC或其后代的线粒体(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8至9×103；约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9至约5×104个线粒体)。使用Piezo显微操作器，可以将蔗糖中的材料(例如，线粒体悬液)(例如，5-7pl含有大约1×103个至5×104个来自OSC或其后代的线粒体)注射至卵母细胞中。将幸存于微量注射法的卵母细胞转移用于培养并且任选地，在体外受精或子宫内授精之前评估或冷冻保存。任选地，线粒体悬液可以在体外受精期间在称作胞质内精子注射(ICSI)的过程中随单个精予一起共注射。任选地，卵母细胞可以在冷冻保存、体外受精或子宫内授精之前在一种或多种生物能剂存在的情况下培养。冷冻保存卵母细胞的方法是本领域熟知的。详见Porcu(坡库)等人，MolCell Endocrinol(分子和细胞内分泌)2000169：33-37；Mandelbaum(曼德巴姆)，Hum Reprod(人类繁殖)200015：43-47；Fabbri(法布里)等人，Mol CellEndocrinol(分子和细胞内分泌)2000169：39-42，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。
用于制备和转移无胞核的胞质部分的方法是本领域已知的并且可以如先前所描述那样实施。见例如，Cohen(科亨)等人，MolHum Reprod(人类繁殖分子学)19984：269-280，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。简而言之，在卵子采集后大约4小时，受体卵子暴露于0.1％透明质酸酶并且选择成熟卵子用于注射。用细口径吸管移除全部冠细胞。卵胞质转移可以通过OSC卵质体与完整的MII卵母细胞的电融合来进行。在暴露于0.1％透明质酸酶后，使用显微枪(microspear)机械地打开带区(zonae)。OSC和／或卵母细胞在37℃暴露于含有松胞菌素B(CCB；SigmaChemical Co(西格玛化学品公司)，St Louis(圣路易斯)，MO，USA)的hHTF培养基10分钟。取决于其敏感性(约2.5mg／ml)，人MII卵母细胞的分配涉及可变性松胞菌素B浓度。通过抽出质膜中所封闭的一部分卵质，从OSC和／或卵母细胞分离多种大小的卵质体。卵质体可以任选地与生物能剂组合。将卵质体插入从中取出极体的受体卵子的卵周隙后，在甘露醇溶液中进行对齐和电融合。这可以用直径约30-40μm的阔口抛光显微工具进行。将卵质体吸至该显微工具中并且一旦将该工具深度置入卵周隙则释放。将幸存于电融合法的卵母细胞转移用于培养并且任选地，在体外受精或子宫内授精之前评估或冷冻保存。任选地，卵母细胞可以在冷冻保存、体外受精或子宫内授精之前在一种或多种生物能剂存在的情况下培养。
可替代地，常规的胞质内精子注射(ICSI)法可以在具有或没有生物能剂的情况下，与转移无胞核的胞质部分或分离的线粒体相联系地使用。见例如，Cohen(科亨)等人，Mol Hum Reprod(人类繁殖分子学)19984：269-280，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。作为一个实例，使用显微枪(microspear)在极体区域上机械地打开受体卵子的带区。在固定吸管上再定位卵母细胞后以如此方式移除极体，从而可以使用封闭的显微枪切开带区。相同位置用来在该区域左侧约90°插入卵质体，所述卵质体已经含有极体。使用相同的工具，紧密闭合带区。在ICSI之前，将电融合的细胞洗涤并在HTF中孵育40-90分钟。将精子在10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中固定用于ICSI。该方法在HTF中进行，同时孔口的短边处于大约3点钟。将ICSI工具移动通过人为间隙，以便避免在标准ICSI期间带区凹陷时挤出卵质。合子可以在子宫转移之前在一种或多种生物能剂存在的情况下培养。
体外受精的标准方法是本领域熟知的。通常首先评价夫妇以诊断他们的一种或多种特定的不育问题。这些问题范围可以从夫妇双方无法解释的不育至严重的女性问题(例如，导致输卵管非开放的子宫内膜异位症，伴随月经周期不规律或多囊性卵巢疾病)或男性问题(例如，精子计数低伴随形态学异常，或正常情况下与脊髓损害一样的不能射精、逆行射精或反向输精管切除术)。这些评价的结果也决定对每对夫妇待进行的特定方法。
多种方法经常以施用药物以下调下丘脑／垂体系统(促性腺素释放激素或GnRH激动剂)开始。这个过程降低促性腺激素的血清浓度，并且正在发育的卵泡降解，因而提供处于较早发育期的一组新卵泡。在不存在下丘脑垂体轴影响的情况下通过施用外源促性腺激素，这允许更精确控制这些新卵泡的成熟。通过使用超声法和血清雌二醇测定每日观察监测成熟的进程和正在生长的卵泡的数目(通常每个卵巢4至10个刺激的卵泡)。当卵泡达到排卵前尺寸(18-21mm)并且雌二醇浓度继续线性上升时，通过外源施用人绒毛膜促性腺素激素(hCG)启动排卵反应。
在移植程序之前，可以形态地评价单个卵母细胞并将其转移至含有培养基和热灭活血清的皮式培养皿中，并且任选地，卵母细胞可以在一种或多种生物能剂存在的情况下培养。精液样品由男性配偶提供并且使用“上游”法处理，由此将获得最具活性的活动精子用于授精。如果女性的输卵管存在，那么此时可以进行称为GIFT(配子输卵管内移植)的方法。通过这种方案，在具有或没有生物能剂的情况下，通过腹腔镜检查术将精予包围的卵母细胞-卵丘复合物直接置入输卵管中。这种方法最好地模拟正常事件顺序并允许在输卵管内部受精。不令人惊讶地，GIFT具有最高成功率，在1990年接受卵子采集的3,750位患者中有22％分娩活胎。一种替代性方法ZIFT(合子输卵管内移植)允许在卵巢采集后当日，在具有或没有生物能剂的情况下选择源自体外受精合子的待转移至输卵管的植入前胚。额外的合子和／或植入前胚胎可以在这个时间冷冻保存用于未来转移或用于捐赠给无雌配子的夫妇。然而，具有更严重的不育问题的大部分患者将需要在培养下孵育额外1至2日，从而可以选择处于早期卵裂状态的植入前胚胎转移至子宫。这种IVF-UT(体外受精子宫移植)法需要若干2-6细胞(第2日)或8-16细胞(第3日)的植入前胚胎经子宫颈转移到子宫的宫底(4-5个植入前胚胎提供最佳的成功)。
用于体外受精的程序也在美国专利号6,610,543、6,585,982、6,544,166、6,352,997、6,281,013、6,196,965、6,130,086、6,110,741、6,040,340、6,011,015、6,010,448、5,961,444、5,882,928、5,827,174、5,760,024、5,744,366、5,635,366、5,691,194、5,627,066、5,563,059、5,541,081、5,538,948、5,532,155、5,512,476、5,360,389、5,296,375、5,160,312、5,147,315、5,084,004、4,902,286、4,865,589、4,846,785、4,845,077、4,832,681、4,790,814、4,725,579、4,701,161、4,654,025、4,642,094、4,589,402、4,339,434、4,326,505、4,193,392、4,062,942和3,854,470中描述，所述文献就描述这些方法的内容特别地通过引用方式结合。
可替代地，患者可以选择将卵母细胞(任选地包含外源自体OSC线粒体)再植入并且利用子宫内授精(IUI)在体内受精。IUI是熟知方法，它涉及制备高度浓缩量的活性活动精子并且将其通过子宫颈直接递送到子宫中。存在可用于制备精子用于IUI的几项技术。首先，从精液分离精子。一种分离精子的方法称作“密度梯度分离”。在这项技术中，通过使用粘稠溶液，将活动精子与死精子和其他细胞分离。在制备之后，将精予浓缩物通过使用一根薄的柔性导管穿过予官颈置入予宫中，并且接着再植入的卵母细胞进行受精。
培养基
生理相容性溶液可以与有效量的生物能剂或其功能衍生物一起配制或用其补充以便实施本发明的方法(例如，IVF、冷冻保存、配子制备、细胞和／或胚胎洗涤或培养)。例如，细胞培养基、胚胎培养基和冷冻保存溶液是本领域熟知的并且可以根据需要使用本领域已知用于制备生理溶液的标准方法配制或进行补充。用于制备和处置配予以便体外受精的市售培养基包括从Invitrolife公司可获得的G-IVFTM PLUS，其是重碳酸盐缓冲的培养基，含有人血清白蛋白和作为抗细菌剂的庆大霉素。用于卵母细胞的SAGE MediaTM成熟培养基含有氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、酚红、庆大霉素、非必需氨基酸和必需氨基酸、硫酸镁、磷酸钠、氯化钙、D-泛酸钙、氯氯化物、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、吡多醇、HCL、核黄素和硫胺素，补充有终浓度75mIU／ml的FSH和75mIU／ml LH。用于冷冻和控制人胚泡的培养基产品包括从SAGE In Vitro Fertilization，Inc.公司可获得的SAGE MediaTM平衡溶液和玻璃化溶液。卵泡成熟培养基也是本领域熟知的并且例如由Telfer(特尔弗)等人，HumReprod(人类繁殖)200823：1151-1158描述，所述文献的内容通过引用的方式明确结合在此。SAGE MediaTM平衡溶液是改良的HTF的MOPS缓冲溶液，其含有非必需氨基酸和必需氨基酸、硫酸庆大霉素(0.01g／L)、DMSO和乙二醇各自7.5％(v／v)和12mg／mL的人白蛋白。玻璃化溶液是改良的人输卵管液(HTF)的MOPS缓冲溶液，其含有非必需氨基酸和必需氨基酸、硫酸庆大霉素(0.01g／L)、DMSO和乙烯各自15％(v／v)。配制SAGE胚泡培养基用于涉及培养从发育第3日致密期至胚泡期的人胚胎的体外受精方法，并且该培养基由氯化钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、牛磺酸、谷胱甘肽、丙氨酰-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟酰胺、吡多醇、核黄素、硫胺素、庆大霉素和酚红组成。配制SAGE卵裂培养基用于涉及培养卵裂期人胚胎的体外受精方法，并且该培养基由氯化钠、氯化钾、硫酸镁、乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、柠檬酸钠、EDTA、庆大霉素和酚红组成。配制SAGE受精培养基用于涉及人卵母细胞受精的体外方法并且该培养基由氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸钾、乳酸钙、碳酸氢钠、葡萄糖、丙酮酸钠、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、柠檬酸钠、EDTA、庆大霉素和酚红组成。几种产品从LifeGlobal公司可商业地获得，包括用于胚胎洗涤和处置的溶液(由氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠盐、丙酮酸钠、氨基酸、EDTA、庆大霉素、酚红和Hepes组成，任选地富含选择的非必需氨基酸)；用于卵母细胞采集和洗涤的溶液(由氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠盐、丙酮酸钠、庆大霉素、酚红和HEPES组成)；用于培养从第1日至胚泡期的胚胎的溶液(由氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠盐、丙酮酸钠、氨基酸、edta、庆大霉素和酚红组成)；用活组织检查过程期间维持胚胎的溶液(由氯化钠、氯化钾、磷酸钾、碳酸氢钠、葡萄糖乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、edta、酚红、硫酸庆大霉素、HEPES、蔗糖和人血清白蛋白组成)；用于胚胎冷冻的溶液(由氯化钠、氯化钙、氯化钾、磷酸钾、氯化镁、磷酸钠和人血清白蛋白组成)和用于胚胎解冻的溶液(由氯化钠、氯化钙、氯化钾、磷酸钾、氯化镁、磷酸钠、人血清白蛋白和任选地1，2-丙二醇和蔗糖组成)。Early Cleavage MediaTM(早期卵裂培养基)
Figure BDA0000466883790000671
从Irvine Scientific(欧文科学公司)可获得的并且意在用于培养受精(IVF)期间的人配子和生长胚胎至发育第3日。这个溶液由葡萄糖钠、丙酮酸钠、乳酸盐(d／l)、氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠、丙氨酰-谷氨酰胺、牛磺酸、柠檬酸钠、脱水edta二钠(edta，disodium，dehy drate)、酚红、庆大霉素和硫酸盐组成。用于受精期间人配子和胚胎以及胚胎生长至多到发育第5／6目的培养基也从Irvine Scientific(欧文科学公司)可获得并且由氯化钠、氯化钾、磷酸钾、氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、丙酮酸钠、葡萄糖、乳酸钠、EDTA、二肽、丙氨酰-谷氨酰胺、酚红、庆大霉素、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸组成。
因此，用于实施辅助生殖技术(例如，IVF)中的培养基的适宜选择或配制常规地由医师和临床实验室实施。可以将有效量的任一种或多种生物能剂或其功能衍生物在与本领域熟知的辅助生殖技术相关所实施的方案之前、期间或之后添加至感兴趣的培养基。将优化浓度、时间和其他条件以实现生物能剂或其功能衍生物对所希望的组织或感兴趣细胞的最大暴露，所希望的组织或感兴趣细胞包括但不限于卵巢组织、卵母细胞、OSC或其衍生物(例如，细胞质或分离的线粒体)或植入前胚胎。感兴趣的组织和／或细胞可以在与本领域熟知的辅助生殖技术相关所实施的方法之前或期间，使用包含生物能剂或其功能衍生物的培养基离体处理，所述方法包括但不限于卵母细胞或OSC成熟和采集、卵泡成熟、卵巢组织或卵巢细胞嫁接、卵巢组织或卵巢细胞移植、冷冻保存、体外受精，以及培养人卵母细胞、合子和植入前胚胎。
本发明也提供产生卵母细胞的方法，所述方法包括在生物能剂或其功能衍生物存在的情况下，在足以使干细胞分化成卵母细胞的条件下培养干细胞，包括但不限于OSC、胚胎干细胞、皮肤干细胞、胰干细胞和诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)。
干细胞可以发生自我更新性细胞分裂以产生表型和基因型相同的后代，持续不定时间，并且最终可以分化成至少一种终末细胞类型。将干细胞定义为具有广泛和或许无限增殖潜力的细胞，所述细胞分化成几个细胞系并且可以在移植时重建组织。典型的干细胞是胚胎干细胞(ES)，因为它具有不受限制的自我更新和多能分化潜能。这些细胞衍生自胚泡的内部细胞团，或可以衍生自源于植入后胚胎的原始生殖细胞(胚胎生殖细胞或EG细胞)。ES和EG细胞已经衍生自小鼠、非人灵长类和人。当引入小鼠胚泡或其他动物的胚泡时，ES细胞可以为小鼠(动物)的全部组织做出贡献。在新生后动物中移植时，ES和EG细胞产生畸胎瘤，这再次展示出它们的多潜能性。
已经在大多数器官组织中鉴定体细胞干细胞。因此，在一些实施例中，可用于本文所述的卵母细胞分化和／或成熟培养方法的干细胞包括但不限于OSC、间充质干细胞、骨髓衍生的干细胞、造血干细胞、软骨细胞祖细胞、皮肤干细胞(例如，表皮干细胞)、胃肠道干细胞、神经干细胞、肝干细胞、脂肪衍生的间充质干细胞、胰腺祖细胞和／或干细胞、毛滤泡干细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。
“诱导的多潜能干细胞(iPS)”是显示与胚胎干细胞(ESC)相似的特征的细胞，所述特征包括例如不受限制的体外自我更新、正常核型、特征性基因表达模式，包括干细胞标记基因如Oct3／4、Sox2、Nanog、碱性磷酸酶(ALP)和干细胞特异性抗原3和4(SSEA3／4)和分化成特化细胞类型的能力(Hanna(汉纳)等人，Science(科学)2007318：1920-1923；Meissner A.(迈斯纳A.)等人，Nat Biotechnol(天然生物技术)200725(10)：1177-81，Okita K.(冲田K.)等人，Nature(自然)2007448(7151)：313-7，Takahashi K.(高桥K.)等人，Cell(细胞)2007131(5)：861-72，Wernig M.(维尼戈M.)等人，Nature(自然)2007448(7151)：318-24，Yu J.(于J.)等人，Science(科学)2007318(5858)：1917-20；和Park，I.H.(帕克，I.H.)等人，Nature(自然)2008451(7175)：141-6)。从成纤维细胞培养物产生iPS细胞的现有技术状态已经在Takahashi(高桥)，Okita(冲田)，Nakagawa(中川)，Yamanaka Nature Protocols(山中自然研究步骤期刊)(2007)2(12)中描述。
用于使细胞(包括干细胞、祖细胞和再编程细胞)分化和／或成熟为卵母细胞的条件是本领域已知的并且例如由Danner S.(丹纳S.)等人，MolHum Reprod.(人类繁殖分子学)2007年1月；13(1)：11-20，Dyce P.W.(戴斯P.W.)等人，PLoS One.2011；6(5)，Dyce P.W.(戴斯P.W.)等人，Stem Cells Dev.(干细胞与发育)2011年5月；20(5)：809-19，Linher K.(林和K.)等人，PLoS One.2009年12月14日；4(12)，Dyce P.W.(戴斯P.W.)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学).2006年4月；8(4)：384-90，Panula S.(普努拉S.)等人，Hum Mol Genet.(人类分子遗传学)2011年2月15；20(4)：752-62，Park T.S.(帕克T.S.)等人，Stem Cells(干细胞)2009年4月；27(4)：783-95，Hua J.(华J.)等人，Stem Cells Dev.(干细胞与发育)2008年6月；17(3)：399-411，Aflatoonian B.(奥法图尼安)等人，Reproduction(繁殖)2006年11月；132(5)：699-707，Ko K.(高K.)等人，Semin Reprod Med.(生殖医学研讨会)2006年11月；24(5)：322-9，Ko K.(高K.)等人，Front Biosci.(生物科学前沿)2010年1月1日；15：46-56，Psathaki O.E.(帕萨斯阿克)等人，Stem Cells Dev.(干细胞与发育)2011年3月8日[电子出版先于印刷版]，和Hübner K.(休博纳K.)等人，Science(科学)2003年5月23日；300(5623)：1251-6描述，所述文献的内容通过引用的方式明确结合在此。具体而言，由Telfer E.(特尔弗E.)等人，HumReprod.(人类繁殖)2008；23(5)：1151-8所述的方法可以与生物能剂或其功能衍生物一起使用，Telfer E.(特尔弗E.)等人描述了一个在活化素存在的情况下支持来自原始卵泡的人卵母细胞发育的两步骤无血清培养系统。可以将有效量的任一种或多种生物能剂或其功能衍生物在与本领域熟知的卵母细胞分化和／或成熟方案之前、期间或之后添加至感兴趣的培养基。将优化浓度、时间和其他条件以实现生物能剂或其功能衍生物对干细胞及其卵母细胞衍生物的最大暴露。
改善受精能力和／或恢复生殖功能的方法
生物能剂及其功能衍生物可以在多种治疗性应用中用于治疗雌性受试者中的不育、生殖障碍或生殖衰老症状。在一些情况下，绝经雌性受试者可以处于围绝经期或绝经后阶段，其中所述绝经由正常(例如，衰老)或病理(例如，手术、疾病、卵巢损伤)过程引起。生殖(例如，卵巢)功能的恢复可以减轻与绝经相关的不良症状和并发症，包括但不限于身体失调如骨质疏松症、心血管疾病、躯体性功能障碍、热潮红、阴道干燥、睡眠障碍、抑郁、易激惹、性欲丧失、激素失衡等以及认知障碍，如健忘、情绪紊乱、抑郁等。
因而，本发明提供用于改善雌性受试者中受精能力的方法，包括以有效改善卵母细胞和／或0SC从头产生、品质和／或排卵的卵母细胞产率的量施用生物能剂或其功能衍生物。
本发明也提供用于体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
a)向雌性受试者以有效改善卵母细胞和／或OSC从头产生、品质和／或排卵的卵母细胞产率的量施用生物能剂或其功能衍生物；
b)从该雌性受试者获得卵母细胞(包括从雌性受试者的OSC或组织获得卵母细胞、例如，体外衍生或成熟的卵母细胞)；和
c)使该卵母细胞体外受精以形成合子。
步骤b)和／或步骤c)还可以包括将卵母细胞或其来源与生物能剂或其功能衍生物孵育。生物能剂的施用可以在收获卵母细胞、OSC或卵巢组织之前进行并且在整个过程期间继续，包括在转移合子或植入前期胚胎至雌性受试者(或代理雌性受试者)的子宫后中，并且继续或启动向怀孕雌性受试者的施用该生物能剂。
本发明也提供恢复对其有需求的雌性受试者中卵巢功能的方法，所述方法包括施用治疗有效量的生物能剂或其功能衍生物，因而恢复雌性受试者中的卵巢功能。通常而言，恢复卵巢功能提供恢复生殖健康益处，包括但不限于正常激素产生、月经周期和足够的卵母细胞和OSC储备。需要卵巢功能恢复的雌性受试者可以患有例如卵巢功能早衰。
本发明也提供维持、维护和／或延长对其有需求的怀孕雌性受试者中胚胎发育的方法，所述方法包括施用治疗有效量的生物能剂或其功能衍生物。
在一些实施例中，本发明的方法对妊娠结局产生有益作用，所述有益作用包括但不限于与参比标准相比时，更大数目的活胚胎移植、受精率和妊娠率增加(例如，植入的胚胎数目相应减少)、多胞胎率降低和改善的植入、妊娠和胚胎发生，本文中统称为“妊娠成功”。标准可以允许本领域技术人员通过评价一项或多项参数(例如，活胚胎移植、受精率和妊娠率、植入的胚胎数目、多胞胎率、植入、以及妊娠和胚胎发生时长)的相对增加和／或下降确定妊娠成功的量。标准充当用于比较的参比水平，从而结果可以针对适宜的标准归一化，以便推断妊娠成功的存在、不存在或其程度。在一个实施例中，标准在较早时间点(即，在启动用生物能剂或其功能衍生物治疗之前)从与正在测试的相同的个体获得。因此，来自患者的有助于妊娠成功的一项或多项参数与相关于相同参数的充当参比的先前病史比较。对于诊断、预后和功效监测目的而言，这种类型的标准通常是最精确的，因为大部分因素将随时间推移在一位个体中仍是相对相似的。该标准应当理想地在开始治疗之前获得。然而，标准可以在治疗后从个体获得，因为它可以仍提供关于治疗改善或逆转的信息。标准也可以从另一位个体或多位个体获得，其中标准代表在治疗存在或不存在的情况下个体人群当中的平均妊娠成功水平。因而，在以这种方式获得的标准中的妊娠成功水平是给定群体(如育龄女性的一般群体)中平均水平的代表。
本发明也提供从雌性受试者制备用于收获的组织或其细胞(例如，从身体取出)的方法，所述方法包括施用有效量的生物能剂或其功能衍生物至雌性受试者，因而从雌性受试者制备用于收获的所述组织或其细胞。该组织可以是例如卵巢、卵泡、骨髓和外周血并且该细胞可以是例如卵母细胞或OSC。收获的感兴趣的组织和／或细胞可以任选地在与本领域熟知的辅助生殖技术相关所实施的方法之前或期间，使用包含生物能剂或其功能衍生物的培养基离体处理，所述方法包括但不限于卵母细胞或OSC成熟和采集、卵泡成熟、嫁接、移植、冷冻保存、体外受精，以及培养人胚胎和合子。
“有效量”或“治疗有效量”意指为相对于未治疗的患者改善病症(例如，不育、年龄相关性生殖衰退)症状所需要的生物能剂或其功能衍生物或包含该药剂的组合物的量。用来实施本发明以便治疗性治疗的药剂的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和总体健康变动。最终，主治医师将决定适宜的量和剂量方案。这种量称作“有效量”或“治疗有效量”。
通常，本发明化合物的剂量将是从每日约0.01mg／kg至每日约2000mg／kg。在一个实施例中，将0.01、0.05、0.1、0.5、1、3、5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、1700、1800、1900、2000mg生物能剂(例如，Sirt1激活物、CD38抑制剂)施用至受试者。有效剂量范围从每日约0.01mg／kg至每日约2000mg／kg，其中该范围的下限是0.01和1999之间的任何整数，并且该范围的上限是0.02和1000之间的任何整数。预期取决于所用的具体生物能剂，范围从约5至约2000mg／kg的剂量将是合适的。较低剂量将因某些形式的施用(如静脉内施用)和药物而产生。当受试者中的反应在施加的初始剂量不充分时，可以使用更高的剂量(或借助一种不同的更为局限化的递送途径所致的有效更高剂量)至患者耐受性允许的程度。构思每日多剂量以实现本发明组合物的适宜全身水平。
本发明提供了施用包含生物能剂或其功能衍生物的药物组合物和制剂的方法。在可替代的实施例中，本发明的组合物随药学上可接受的载体一起配制。在可替代的实施例中，本发明的药物组合物和制剂可以肠胃外、局部、经口或通过局部施用法如通过气溶胶或经皮施用。药物组合物可以按任何方式配制并且可以取决于病状或疾病(例如，生殖障碍的类型)和病情程度、每位患者的总体医学状况、因而所致的优选施用方法等，以多种单位剂量形式施用。关于配制和施用药物的技术的细节在科学文献和专利文献中充分描述，见，例如，最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿氏药物科学)，Maack Publishing Co(马克出版公司)，Easton(伊斯顿)PA(“Remington′s(雷明顿氏)”)。
生物能剂或其功能衍生物可以单独施用或作为药物制剂(组合物)的组分施用。这些化合物可以按用于人类或兽医学中的任何便利方式配制以便施用。润湿剂、乳化剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
本发明组合物的制剂包括适于皮内、吸入、口服／经鼻、局部、肠胃外、直肠和／或阴道内施用的那些。制剂可以方便地以单位剂量形式呈现，并且可以由制药领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分(例如，生物能剂或其功能衍生物)的量将根据正在治疗的宿主、具体施用模式(例如，皮内或吸入)变动。可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量通常将是化合物的这样的量，所述量产生治疗效果，例如改善的卵母细胞或OSC产生和品质和／或增加的排卵的卵母细胞产量。
可以根据药物制造领域已知的任何方法制备本发明的药物制剂。这类药物可以含有甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂。制剂可以与适合制造的、无毒、药学上可接受的赋形剂混合。制剂可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等并且可以按诸如以下的形式提供：液体、粉剂、乳剂、冻干粉剂、喷雾剂、乳膏剂、洗剂、控释制剂、片剂、丸剂、凝胶剂、在贴剂中、在植入物内等。
用于口服施用的药物制剂可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体以适宜和合适的剂量配制。这类载体使得药物以适于患者摄入的单位剂量形式(例如片剂、丸剂、粉剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、糖锭剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等)配制成为可能。可以将用于口服用途的药物制品配制为固体赋形剂，任选地碾磨所产生的混合物并且如果所需，在添加合适的额外的化合物后加工颗粒混合物以获得片芯或锭芯。合适的固体赋形剂是糖类填料或蛋白质填料，所述填料例如包括糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素，或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括阿拉伯树胶及黄蓍胶；以及蛋白质，例如，明胶和胶原蛋白。可以添加崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如藻酸钠。推入配合胶囊可以含有与填料或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选地稳定剂混合的活性药剂。在软胶囊剂中，活性药剂可以在具有或没有稳定剂的情况下溶解于或悬浮于合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。
水质混悬剂可以含有与适于制造水质混悬剂(例如适于制造水质皮内注射剂)的赋形剂混合的活性药剂(例如，生物能剂或其功能衍生物)。此类赋形剂包括助悬剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；以及分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，十七碳乙烯氧鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol)、环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。该水质混悬剂也可以含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。可以对制剂调节克分子渗透压浓度。
在一个实施例中，油基药物用于本发明核酸序列的施用。油基混悬剂可以通过在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或矿物油(例如液体石蜡)或这些油的混合物中混悬活性药剂进行配制。见，例如，描述使用精油或精油组分增加生物利用率和减少口服施用的疏水性药物化合物的个体间或个体内变异性的美国专利号5,716,928(还见美国专利号5,858,401)。油混悬剂可以含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制品，如甘油、山梨糖醇或蔗糖。可以通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来保存这些制剂。作为可注射用油溶媒的实例，见Minto(明托)等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.(药理学和实验治疗学杂志)1997281：93-102。
本发明的药物制剂也可以处于水包油乳剂的形式。油相可以是上文描述的植物油或矿物油或这些油混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，如阿位伯树胶和黄蓍胶，天然存在的磷酯，如大豆卵磷脂，酯或源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯，如山梨糖醇酐单油酸酯，和这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂和矫味剂，如在配制糖浆剂和酏剂中那样。此类制剂还可以含有缓和剂、防腐剂或着色剂。在可替代的实施例中，本发明的这些可注射用水包油乳剂包含石蜡油、山梨糖醇酐单油酸酯、乙氧基化山梨糖醇酐单油酸酯和／或乙氧基化山梨糖醇酐三油酸酯。
在实施本发明时，药物化合物也可以通过鼻内、眼球内和阴道内途径施用，包括栓剂、吹入、粉剂和气溶胶制剂(例如类固醇吸入剂，见例如，Rohatagi(罗哈他吉)J.Clin.Pharmacol.(临床药理学杂志)199535：1187-1193；Tjwa(特瓦)等人，Ann.Allergy Asthma Immunol.(过敏、哮喘和免疫学年鉴)199575：107-111)。栓剂制剂可以通过药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，其中所述赋形剂在普通温度为固态，但是在体温为液态，并且因此将在身体中融化以释放药物。这类材料是可可脂和聚乙二醇。
在实施本发明时，药物化合物可以经皮、通过局部途径递送、配制为敷药棒、溶液、混悬剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、油膏剂、糊剂、胶浆剂、涂剂(paint)、粉剂和气溶胶剂。
在实施本发明时，也可以将药物化合物作为用于身体内缓慢释放的微球体递送。例如，可以将微球体通过经皮内注射缓慢皮下释放的药物施用；见Rao(饶)J.Biomater Sci.Polym.Ed.(生物材料科学，高分子版)19957：623-645；作为生物可降解及可注射用凝胶制剂使用，见例如Gao(高)Pharm.Res.(药物研究)199512：857-863；或作为口服施用的微球体施用，见，例如Eyles(埃里斯)J.Pharm.Pharmacol.(药学与药理学杂志)199749：669-674。
在实施本发明时，药物化合物可以按肠胃外方式施用，如通过静脉内(IV)施用或施用至体腔中或直接至卵巢中。这些制剂可以包含溶解于药学上可接受的载体中的活性药剂的溶液。可使用的可接受溶媒和／溶剂是水、林格氏(Ringer′s)溶液(一种等渗氯化钠溶液)。此外，无菌的固定油可以用作溶剂或助悬介质。出于这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油(fixed oil)，包括合成性甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可以同样用于注射剂的制备中。这些溶液是无菌的并且通常不含不想要的物质。这些制剂可以通过常规的熟知消毒技术消毒。这些制剂可以含有如所要求以接近生理条件的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中有效药剂的浓度可以广泛地变动，并且将主要基于流体体积、粘度、体重等，根据选择的特定施用模式和患者的需求选择。对于静脉内施用，制剂可以是无菌可注射制品，如无菌可注射水质或油质混悬剂。可以使用那些合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂配制这种混悬剂。该无菌注射制剂也可以是肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的混悬剂，如1，3-丁二醇中的溶液。此外，施用可以是通过快速浓注或连续输注进行(例如，基本上不间断地引入血管中持续指定的时间段)。
可以冻干本发明的药物化合物和制剂。本发明提供包含本发明组合物的稳定冻干制剂，其中可以冻干包含本发明药物和填充剂(例如，甘露醇、海藻糖、蜜三糖和蔗糖或其混合物)溶液产生所述的稳定冻干制剂。
可以通过使用脂质体递送本发明的组合物和制剂。通过使用脂质体，尤其在脂质体表面携带对靶细胞特异的配体或否则偏好地针对特定器官的情况下，可以在体内使有效药剂的递送聚焦至靶细胞中。见，例如，美国专利号6,063,400；6,007,839；Al-Muhammed(奥-穆罕默德)J.Microencapsul.(微胶囊化杂志)199613：293-306；Chonn(周)Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术新见)19956：698-708；Ostro(奥斯托)Am.J.Hosp.Pharm.(美国医院药房杂志)198946：1576-1587。
可以施用本发明的制剂用于预防性和／或治疗性治疗。在可替代的实施例中，对于治疗性应用，将组合物按足以治愈、减轻或部分停滞生殖障碍或其并发症(例如，不育、绝经、卵巢功能早衰)的临床表现的量施用至需要改善卵母细胞或OSC产生和品质和／或增加排卵的卵母细胞产率的受试者；这种量可以称作治疗有效量。
足够实现这个目的的药物组合物的量是“治疗有效剂量”。有效用于这种用途的剂量方案和量，即，给药方案，将取决于多种因素，所述因素包括疾病或病状的分期、疾病或病状的严重性、患者健康的总体状态、患者的身体状况、年龄等。在为患者计算剂量方案时，还考虑施用模式。
剂量方案也考虑本领域熟知的药物代谢动力学参数，即，活性药剂的吸收率、生物利用率、代谢、清除率等(见，例如，Hidalgo-Aragones(伊达尔戈-阿拉贡内斯)J.Steroid Biochen.Mol.Bio1.(类固醇生物化学与分子生物学杂志)199658：611-617；Groning(戈宁)Pharmazie(药学)199651：337-341；Fother.by(弗瑟比)Contraception(避孕)199654：59-69；Johnson(约翰逊)J.Pharm.Sci.(药物科学杂志)199584：1144-1146；Rohatagi(罗哈他吉)Pharmazie(药学)199550：610-613；Brophy(布罗菲)Eur.J.Clin.Pharmacol.(欧洲临床药理学杂志)198324：103-108；最新Remington′s(雷明顿氏)，同上。现有技术允许临床医生针对每位个体患者、活性药剂和所治疗的疾病或病状确定剂量方案。为作为药物使用的相似组合物所提供的指导原则可以用作确定剂量方案(即给药方案和剂量水平)的指导，施用实施本发明的方法是正确和适宜的。
制剂的单次或多次施用可以例如根据如所要求并且患者所耐受的剂量和频率、每次施用后产生的胆固醇体内平衡的程度和量等给定。制剂应当提供足够量的活性药剂以有效治疗、预防或改善病状、疾病或症状，例如，改善卵母细胞或OSC产生和品质和／或增加排卵的卵母细胞的产率。
在可替代的实施例中，用于口服施用的药物制剂处于每日每千克体重约1mg至100mg或更多mg之间的每日量。相反，较低剂量可以用于口服施用至血流中、至体腔中或至器官的管腔中。实质上更高的剂量可以用于局部或口服施用或通过粉剂、喷雾剂或吸入施用。用于制备肠胃外可施用或非肠胃外可施用的制剂的实际方法将是已知的或是本领域技术人员显而易见并且在此类出版物如上文的Remington′s(雷明顿氏)中更详细地描述。
通过以下说明性、非限制性实例额外地描述本发明，所述实例提供对本发明及其众多优点的更好理解。
实例
在实例1-6中，使用验证的方案以证实OSC可以可靠地从健康年轻女性的组织分离并且体外增殖用于后续临床方法中。在实例7中，显示成年期期间的CR在因渐高育龄而处于生殖失败边缘的雌性小鼠中改善卵母细胞品质和产生。在实例8中，类似于CR，显示生物能学因素增加OSC中的线粒体参数。以下的实例仅出于说明目的而提供并且不意在限制发明人视为其发明的范围。
实例1：基于FACS的OSC分离方案
由Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636使用以通过免疫磁性分选法分离小鼠OSC的VASA抗体是针对人VASA的COOH端最后25个氨基酸(DDX4)的兔多克隆抗体(ab13840；Abcam(艾博抗公司))。这个区域与小鼠VASA的相应区域(MVH)共有96％总体同源性。为了比较研究，使用了针对人VASA的NH2端前145个氨基酸的山羊多克隆抗体(AF2030；R&D Systems(R&D系统公司))，所述区域与小鼠VASA的相应区域共有91％总体同源性。
使用任一种抗体对年轻成年(2月龄)小鼠卵巢的免疫荧光分析显示如所预期那样限于卵母细胞的相同VASA表达模式(图1a)。然后，每种抗体随后用于分散的年轻成年小鼠卵巢组织的免疫磁性分选(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)。对于每种细胞制备物，汇集来自4只小鼠的卵巢并且通过切碎，随后进行一个两步骤酶消化法来解离它们，所述两步骤酶消化法涉及与800U／ml胶原酶[IV型；在不含钙和镁的汉克氏(Hank’s)平衡盐溶液(HBSS)中制备]孵育15分钟，接着与0.05％胰蛋白酶-EDTA孵育10分钟。消化在1μg／ml DNA酶I(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))存在的情况下实施以最小化细胞制备物内部的粘度，并且通过添加10％胎牛血清(FBS；Hyclone公司)中和胰蛋白酶。卵巢分散物经70μm尼龙筛网过滤并且在冰上在HBSS中的下述溶液内封闭20分钟，所述溶液由1％无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))连同1％正常山羊血清(Millipore(密理博公司)；对于使用针对VASA-COOH的ab13840的后续反应)或1％正常驴血清(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司)；对于使用针对VASA-NH2的AF2030的后续反应)组成。细胞随后在冰上与识别COOH端(ab13840)或NH2端(AF2030)的VASA抗体的1：10稀释物反应20分钟。此后，将细胞在HBSS中洗涤2次并且在冰上与山羊抗兔IgG缀合的微珠(Miltenyi(美天旎公司)；ab13840检测)或生物素缀合的驴抗山羊IgG(SantaCruz Biotechnology(圣克鲁斯生物技术公司)；AF2030检测)的1：10稀释物孵育20分钟，随后与链霉亲和素缀合的微珠(Miltenyi(关天旎公司))孵育。在HBSS中额外洗涤1次之后，将细胞制备物加载到MACS柱上并且根据制造商的说明书(Miltenyi(关天旎公司))分离。对于显现抗体珠与单个卵母细胞潜在相互作用的实验，通过注射孕马血清促性腺激素(PMSG，10IU；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))，接着46-48小时后注射人绒毛膜促性腺素激素(hCG，10IU；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))，使成年雌性小鼠超数排卵。在hCG注射后15-16小时从输卵管采集卵母细胞，使用透明质酸酶(Irvine Scientific(欧文科学公司))剥离卵丘细胞并用补充有BSA的人输卵管液(HTF；Irvine Scientific(欧文科学公司))洗涤。将分散的卵巢细胞或分离的卵母细胞封闭并且与如上文所述的针对VASA的第一抗体孵育。在HBSS中洗涤后，细胞与物种适宜的缀合于2.5-μm Dyna珠的第二抗体(Invitrogen(英杰公司))反应。将悬液置于1.5ml微量离心管(Eppendorftube)中以便用Dynal-S磁性颗粒浓缩器分离。
当使用VASA-NH2抗体时在珠部分中没有获得细胞；然而当使用VASA-COOH抗体时观察到与磁珠结合的5-8μm细胞(图1b)。对这些细胞的分析揭示出与针对Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636使用免疫磁性分选法先前分离的OSC所报道一致的种系基因表达模式(图2)。虽然在非免疫反应性洗涤部分中总是检测到使用VASA-COOH抗体平行评估的分离卵母细胞(图1b)，对通过免疫磁性分选法获得的VASA阳性细胞部分的额外标记分析揭示出几种卵母细胞特异性mRNA，包括Nobox、Zp3和Gdf9(图2)。这些研究结果表明，尽管作为独立实体分析时卵母细胞不显示VASA的细胞表面表达(图1b)，但是在免疫磁性分选来自分散的卵巢组织的OSC后，卵母细胞是掺杂的细胞类型。这种结果最可能反映在珠离心步骤期间卵母细胞的非特异性物理携带或质膜受损(损害)的卵母细胞中的胞质VASA与COOH抗体的反应性。通过使用FACS将缓解任一种情况。
接着通过FACS评估每种抗体与分散的小鼠卵巢细胞的反应性。对于每个实验，将卵巢组织(小鼠：4个汇集的卵巢；人：10×10×1mn厚，仅皮层)解离，封闭并且与如上文所述的第一抗体反应(对于VASA-COOH，abl3840或对于VASA-NH2，AF2030)。在用HBSS洗涤后，将细胞在冰上与Alexa Fluor488缀合的山羊抗兔IgG(Invitrogen(英杰公司)；ab13840检测)或与Alexa Fluor488缀合的驴抗山羊IgG(Invitrogen(英杰公司)；AF2030检测)的1：500稀释物孵育20分钟，并且用HBSS洗涤。随后使用BD Biosciences FACSAria II流式细胞仪(马萨诸塞州波士顿的哈佛干细胞研究所(Harvard Stem Cell Institute，Boston，MA))针对阴性(未染色和无第一抗体)对照进行门控，将标记的细胞再次过滤(35-μm孔直径)并由FACS分选。就在分选之前，将碘化丙啶添加至细胞悬液中以排除死细胞。采集新鲜分离的VASA阳性活细胞用于基因表达概况分析、评估畸胎瘤形成能力或体外培养。对于一些实验，将细胞在2％中性缓冲的多聚甲醛(PFA)中固定并且用0.1％Triton-X100透化，之后与针对VASA的NH2端的第一抗体(AF2030)反应并且与Alexa Fluor488缀合的驴抗山羊IgG反应后由FACS检测。对于再分选实验，使活细胞与VASA-COOH抗体(ab13840)反应并且与别藻蓝蛋白(APC)缀合的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch(杰克逊免疫研究公司))反应后由FACS分选。所得到的APC阳性(VASA-COOH阳性)活细胞随后保持完整或固定并透化，之后与VASA-NH2抗体(AF2030)孵育，随后与缀合至Alexa Fluor488的驴抗山羊IgG孵育并由FACS分析。
与磁珠分选结果一致，仅在使用COOH抗体时获得VASA阳性活细胞(图1c)。然而，如果卵巢细胞在FACS之前透化，使用NH2抗体获得VASA阳性细胞群体(图1c)。另外，如果利用COOH抗体将通过FACS分离的VASA阳性活细胞透化并再分选，则相同细胞群体由VASA-NH2抗体识别(图1d)。作为证实这种OSC分离方法的有效性的最终手段，使用生殖细胞标记(Blimp1/Prdm1、Stella／Dppa3、Fragilis／Ifitm3、Tert、 Vasa、Dazl)和卵母细胞标记(Nobox、Zp3、Gdf9)的组合通过基因表达分析评估在该方案每个步骤中的细胞部分。为了获得用于FACS的细胞，将卵巢组织切碎并使用胶原蛋白酶和胰蛋白酶进行酶促消化，通过70μm滤器以除去大组织团块，并随后通过35μm滤器以获得最终细胞部分。经过该方案每个步骤的每个细胞部分均表达全部种系标记和卵母细胞标记，例外是通过FACS获得的VASA阳性活细胞部分(图1f)。尽管FACS分选的VASA阳性细胞部分表达全部种系标记，但是没有检测到卵母细胞标记(图1f)。因而，不同于使用VASA-COOH抗体通过免疫磁性分选法分离OSC时观察到的卵母细胞污染(见图2)，使用这个相同抗体连同FACS提供了优越的策略以获得成年卵巢衍生的不含卵母细胞的OSC部分。
实例2：从人卵巢分离OSC
在提供书面知情同意书情况下，在琦玉(Saitama)医学中心，为性别重置，以手术方式从6位年龄在22-33(28.5±4.0)岁之间的患有性别认同障碍病症的女性患者取出卵巢。将外皮层小心地移除、玻璃化并冷冻(Kagawa(相川)等人，Reprod.Biomed.(生殖生物医学)2009Online(在线版)18：568-577；图12)。简而言之，将1mm厚的皮层片段切割成100-mm2(10×10mm)小片，在26℃于含有7.5％乙二醇(EG)和7.5％二甲基亚砜(DMSO)的平衡溶液中孵育25分钟，并且随后在26℃于含有20％EG、20％DMSO和0.5M蔗糖的玻璃化溶液中孵育15分钟，之后浸入液氮中。对于实验分析，将冷冻保存的卵巢组织利用冷冻组织解冻试剂盒(Kitazato Biopharma(北里生物制药公司))解冻并且立即处理用于组织学、异体移植或OSC分离。使用COOH抗体，也通过FACS从年龄在22-33岁之间的全部患者的人卵巢皮层组织活组织检查样品中一致地分离出直径在5-8μm之间的VASA阳性活细，产率百分比(1.7％±0.6％分选的VASA阳性细胞对总活细胞；均数±SEM，n=6)可比于来自平行处理的年轻成年小鼠卵巢的0SC的产率(1.5％±0.2％分选的VASA阳性细胞对总活细胞；均数±SEM，n=15)。这种产率百分比是这些细胞在FACS所分选的单个活细胞的最终汇集物中的出现率，所述出现率代表在处理之前的卵巢中存在的总细胞数的分数。为评估每个卵巢的OSC出现率，确定1.5-2月龄小鼠的每个卵巢的基因组DNA含量(1,774.44±426.15μg；均数±SEM，n=10)并且分成每个卵巢中每个分选的活细胞部分的基因组DNA含量(16.41±4.01μg；均数±SEM，(n=10))。假定每个细胞的基因组DNA含量相等，确定多少卵巢细胞总汇集物由处理后获得的总的分选的活细胞部分代表。使用这种修正系数，估计每个卵巢的OSC出现率是0.014％±0.002％[0.00926×(1.5％±0.2％)]。关于OSC产率，这个数值在各重复之间变动，但是在最初从4个卵巢的汇集物制备的分散物的FACS后，一致地获得每个成年卵巢介于250个至略微超过1,000个之间的VASA阳性活细胞。
分析来自小鼠卵巢和人卵巢的新鲜分离的VASA阳性细胞(图3a，3b)，揭示出相似的尺寸和形态(图3c，3d)和富含早期生殖细胞标记的、匹配的基因表达谱(Saitou(斋藤)等人，Nature(自然)2002418：293-300；Ohinata(大日向)等人，Nature(自然)2005436：207-213；Dolci(多尔奇)等人，CellSci.(细胞科学)2002115：1643-1649)(Blimp1、Stella、Fragilis和Tert；图3e)。这些结果与科学文献中报道的小鼠OSC的形态和基因表达谱相符(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636，Pacchiarotti(巴葛亚洛蒂)等人，Differentiation(分化)201079：159-170)。
为了进一步定义从成年卵巢获得的VASA阳性细胞的特征性特征，使用体内畸胎瘤形成测定法测试小鼠OSC。这是重要的，因为最近一项研究已经报道从成年小鼠卵巢分离拥有胚胎干细胞(ESC)和诱导的多潜能干细胞(iPSC)的畸胎瘤形成能力的Oct3/4阳性干细胞(Gong(龚)等人，Fertil.Steril.(生育与不孕)201093：2594-2601)。如上文所述，从总计100只年轻成年雌性小鼠采集卵巢、解离并经历FACS以便分离VASA-COOH阳性活细胞。将新鲜分离的小鼠OSC在NOD／SCID雌性小鼠的后腰部附近皮下注射(每小鼠注射1x105个细胞)。作为对照，将小鼠胚胎干细胞(mESC v6.5)平行地注射至年龄匹配的雌性小鼠中(每只受体小鼠注射1x105个细胞)。每周监测小鼠持续至多到6月以便肿瘤形成。
如所预期，100％用小鼠ESC移植的用作阳性对照的小鼠在3周内形成畸胎瘤；然而，用分离自成年小鼠卵巢的VASA阳性细胞平行移植的小鼠中没有观察到畸胎瘤，甚至在移植24周后也是如此(图3f-k)。因而，尽管OSC表达众多干细胞标记和原始生殖细胞标记(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636，Pacchiarotti(巴葛亚洛蒂)等人，Differentiation(分化)201079：159-170；还见图1f和图3e)，这些细胞明显区别于迄今描述的其他类型的多潜能干细胞。
实例3：从FACS纯化的小鼠OSC产生卵母细胞
评估借助逆转录病毒转导被工程化以表达GFP的FACS纯化的小鼠OSC(在它们作为活跃分裂的唯一生殖细胞培养物体外建立后)在移植入成年雌性小鼠卵巢后产生卵母细胞的能力。为了确保所获得的结果反映移植的细胞稳定整合到卵巢中并且还不并发移植前诱导的生殖腺损伤，将1×104个表达GFP的小鼠OSC注射到2月龄的未经化疗法条件化的野生型受体的卵巢中，并且将动物维持5-6个月，随后进行分析。在7-8月龄之间，将移植的动物用外源促性腺激素(单次腹膜内注射PMSG(10IU)，接着在46-48小时后注射hCG(10IU))诱导排卵，之后收集它们的卵巢和释放至输卵管中的任何卵母细胞。将排卵的卵丘-卵母细胞复合体转移到补充有0.4％BSA的HTF中，并且通过直接荧光显微术评估GFP表达。在接受最初通过FACS纯化的表达GFP的小鼠OSC的雌小鼠的卵巢中，轻易地可检测正在发育的包含GFP阳性卵母细胞的卵泡以及含有GFP阴性卵母细胞的卵泡(图4a)。
在输卵管冲洗之后，观察到包含扩大的卵丘细胞的复合体，所述扩大的卵丘细胞包围位于中央的缺乏GFP和表达GFP的卵母细胞。这些复合体与来自野生型雄小鼠的精子混合导致受精和植入前胚胎发育。对于体外受精(IVF)，将附睾尾和输精管从成年野生型C57BL／6雄性小鼠中移出并且置于补充有BSA的HTF培养基中。通过用镊子温和地挤压组织获得精子，在37℃下将其催熟1小时，并且随后与卵丘-卵母细胞复合体混合(在补充有BSA的HTF培养基中1-2×106个精子／ml)4-5小时。随后将授精的卵母细胞洗去精子并转移至新鲜的培养基。在授精后4-5小时，将(受精和未受精的)卵母细胞转移到50μl的滴状KSOM-AA培养基(Irvine Scientific(欧文科学公司))中，并且用矿物油覆盖这些液滴以支持进一步植入前胚胎发育。每24小时进行光学显微镜检查和荧光显微镜检查，持续总计144小时，以监测胚胎发育至孵化胚泡期(Selesniemi(斯莱斯尼米)等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国科学院院刊)2011108：12319-12324)。固定并且处理在采集排卵的卵母细胞时从输卵管收获的卵巢组织，以便使用针对GFP的小鼠单克隆抗体(sc9996；Santa CruzBiotechnology(圣克鲁斯生物技术公司))连同MOMTM试剂盒(Vector Laboratories(载体实验室公司))以免疫组织化学方式检测GFP表达，如先前详述(Lee(李)等人，J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)200725：3198-3204)。分别使用来自未移植的野生型雌性小鼠和来自TgOG2转基因雌性小鼠的卵巢作为用于GFP检测的阴性对照和阳性对照。
源自GFP阳性受精卵子的植入前胚胎在孵化胚泡期自始至终保持GFP表达(图4b-d)。从5-6个月前用表达GFP的OSC移植的5只成年野生型雌性小鼠，从输卵管采集总计31个卵丘-卵母细胞复合体，其中23个成功受精以产生胚胎。卵丘细胞在每个卵母细胞周围的存在导致不可能精确测定GFP阴性排卵的卵母细胞相对于GFP阳性排卵的卵母细胞的数目。然而，评估体外受精(IVF)后产生的23个胚胎揭示8个胚胎是GFP阳性的，同时所测试的全部5只小鼠在排卵时释放至少一枚受精以产生GFP阳性胚胎的卵子。这些研究结果表明通过基于VASA-COOH抗体的FACS纯化的OSC，如同先前报道的通过免疫磁性分选法分离的其对应物那样(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)，体内产生功能性卵母细胞。然而，我们的数据还显示不同于先前报道(Zou(邹)等人，Nat CellBiol(天然细胞生物学)200911：631-636)，对于OSC在成年卵巢组织中移植并产生功能性卵母细胞而言，在移植之前不需要化疗条件化。
实例4：候选的人OSC的体外表征
使用先前描述用于体外增殖小鼠OSC的参数(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)，将成年小鼠及人卵巢衍生的VASA阳性细胞置于以缺少有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养细胞的特定培养物中。简而言之，将细胞在MEMα(Invitrogen(英杰公司))中培养，所述MEMα补充有10％FBS(Hyclone公司)、1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸、1X浓缩的青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Invitrogen(英杰公司))、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma(西格玛公司))、1X浓缩的N-2补充物(R&D Systems(R&D系统公司))，白血病抑制因子(LIF；103单位／ml；Millipore(密理博公司))，10ng／mL重组人表皮生长因子(rhEGF；Invitrogen(英杰公司))、1ng／mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Invitrogen(英杰公司))和40ng／mL神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF；R&D Systems(R&D系统公司))。通过每隔1日添加40-80μl新培养基来更新培养物，并且每两周将细胞在新鲜MEFS上再接种。为了评估增殖，将无MEF的OSC培养物用10μM BrdU(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))处理48小时，之后在2％PFA中固定，以便基于双重免疫荧光检测BrdU掺入(有丝分裂活性细胞)和VASA表达(生殖细胞)，如(Zou(邹)等人，Nat Cell Biol(天然细胞生物学)200911：631-636)所述。如果将第一抗体省略或替换为相同稀释度的正常兔血清(未显示)，则检测不到信号。
新鲜分离的OSC可以作为无性系建立，并且未接种到MEF上的人OSC的集落形成效率处于0.18％至0.40％的范围内。不能使用MEF作为初始饲养细胞精确评估集落形成效率，其中所述初始饲养细胞大大有助于小鼠和人OSC的体外建立。在10-12周(小鼠)或4-8周(人)培养后，活跃分裂的生殖细胞集落变得显而易见(图5)。一旦建立并增殖，可以将这些细胞在MEF不存在的情况下再建立为仅有生殖细胞的培养物，而不丧失增殖潜能。在无MEF培养物中对VASA表达和溴脱氧尿苷(BrdU)掺入的双重分析揭示出大量双阳性细胞(图6a-d)，证实成年小鼠及人卵巢衍生的VASA阳性细胞正在活跃地分裂。在这个阶段，小鼠细胞需要每4-5日在汇合时传代，培养物按1∶6-1∶8分瓶(估计的倍增时间是14小时；图6e)。小鼠OSC增殖的速率比平行维持的人生殖细胞高大约2-3倍，人生殖细胞需要每7日在汇合时传代，培养物按1∶3-1∶4分瓶。VASA的细胞表面表达在增殖数月后仍在超过95％的细胞的表面上可检测到(图6f)。使用VASA-COOH抗体通过FACS检测不到的剩余细胞是培养期间由小鼠和人类OSC自发产生的庞大(直径为35-50μm)球状细胞，所述球状细胞显示出VASA的胞质表达并且在实例5中详细描述。
对培养细胞的基因表达分析证实早期种系标记的维持(图6g)。在这些培养物中也检测到几个卵母细胞特异性标记。使用
Figure BDA0000466883790000861
VILOTMcDNA合成试剂盒(Invitrogen(英杰公司))和Platinum Taq聚合酶(Invitrogen(英杰公司))通过RT-PCR评估mRNA的水平。对全部产物测序以证实身份。表3(小鼠)表4(人)中提供所用的正向引物和反向引物的序列，连同相应基因的GenBank登录号。
表3.用来分析小鼠细胞和组织样品中基因表达的PCR引物
Figure BDA0000466883790000871
表4.用来分析人细胞和组织样品中基因表达的PCR引物
Figure BDA0000466883790000881
为了扩展Blimp1、Stella以及Fragilis的mRNA分析，对这三种经典原始种系标记进行免疫荧光分析(Saitou(斋藤)等人，Nature(自然)2002418：293-300；Ohinata(大日向)等人，Nature(自然)2005436：207-213)。为了分析培养的OSC，将细胞用1X浓度的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤，在20℃于2％PFA中固定45分钟，用PBS-T(含有0.01％Triton-X100的PBS)洗涤3次，并且在20℃于封闭缓冲液(含有2％正常山羊血清和2％BSA的PBS)中孵育1小时。随后将细胞在20℃与以下第一抗体之一的1∶100稀释物孵育1小时：生物素酰化的针对BLIMP1的小鼠单克隆(ab81961，Abcam(艾博抗公司))、针对STELLA的兔多克隆抗体(ab19878；Abcam(艾博抗公司))或针对FRAGILIS的兔多克隆抗体(小鼠：ab15592，人：ab74699；Abcam(艾博抗公司))。将细胞洗涤并且在20℃与链霉亲和素缀合的Alexa Fluor488(Invitrogen(英杰公司)；BLIMP1检测)或缀合至Alexa Fluor488的山羊抗兔IgG(STELLA和FRAGILIS检测)的1∶500稀释物在罗丹明-鬼笔环肽(Invitrogen(英杰公司))存在的情况下孵育30分钟。将细胞洗涤，与二盐酸4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))孵育并且在成像之前洗涤额外3次。如果将第一抗体省略或替换为正常血清，则检测不到信号(未显示)。
为评估由小鼠和人OSC体外产生的卵母细胞，将单个卵母细胞从培养上清液采集，洗涤，在37℃用含有0.5％BSA的2％PFA固定45分钟，洗涤并在20℃于含有0.5％BSA和5％正常山羊血清(VASA或LHX8检测)或1％正常驴血清(c-KIT检测)的PBS中封闭1小时。在封闭后，将卵母细胞在20℃与以下第一抗体之一的1∶100稀释物(含有0.5％BSA的PBS中)孵育2小时：针对c-KIT的山羊多克隆抗体(sc1494，Santa Cruz Biotechnology(圣克鲁斯生物技术公司))、针对VASA的兔多克隆抗体(ab13840，Abcam(艾博抗公司))或针对LHX8的兔多克隆抗体(ab41519，Abcam(艾博抗公司))。随后将细胞洗涤并且与缀合至Alexa Fluor568(Invitrogen(英杰公司)；VASA检测)或Alexa Fluor488(LHX8检测)的山羊抗兔IgG的1∶250稀释物或缀合至Alexa Fluor488(c-KIT检测)的驴抗山羊IgG的1∶250稀释物孵育。将细胞洗涤，与DAPI孵育并且在成像之前洗涤额外3次。如果将第一抗体省略或替换为正常血清，则检测不到信号。
对于稍后的这些实验，检测VASA的卵母细胞特异性表达，卵巢组织切片中的c-KIT和(对于人卵巢)LHX8充当阳性对照。将小鼠卵巢组织及人卵巢组织在4％PFA中固定，石蜡包埋并切片(6μm)，之后使用0.01M柠檬酸钠缓冲剂(pH6.0)进行高温抗原修复。在冷却后，使用含有1％正常山羊血清(VASA-COOH或LHX8检测)或1％正常驴血清(VASA-NH2或c-KIT检测)的TNK缓冲液(磷酸盐缓冲盐水中的0.1M Tris-HCl、0.55M NaCl、0.1mM KCL、0.5％BSA和0.1％Triton-X100)，将切片洗涤并在20℃封闭1小时。随后将切片在4℃与第一抗体(在含有1％正常血清的TNK缓冲液中)的1∶100稀释物孵育过夜，在PBS中洗涤并且在20℃与缀合至Alexa Fluor568的山羊抗兔IgG(VASA-COOH检测，人卵巢中)、缀合至Alexa Fluor488的山羊抗兔IgG(VASA-COOH检测，小鼠卵巢中；或LHX8检测)或缀合至Alexa Fluor488的驴抗山羊IgG(c-KIT或VASA-NH2检测)的1∶500稀释物孵育30分钟。用PBS洗涤后，使用含有DAPI(Vector Labs(载体实验室公司))的Vectashield，用盖片覆盖切片。如果将第一抗体省略或替换为正常血清，则检测不到信号。
在体外维持的小鼠OSC(图6h)和人OSC(图6i)中轻易和一致地检测到全部三种蛋白质。值得注意地，在这些细胞中检测到FRAGILIS符合一项最近研究，该研究报道这种蛋白质也可以通过免疫磁珠分选法用来从鼠卵巢分离OSC(Zou(邹)等人，Stem CellsDev.(干细胞与发育)2011doi：10.1089／scd.2011.0091)。
实例5：候选的人OSC的体外生卵能力
与来自其他人的结果(Pacchiarotti(巴葛亚洛蒂)等人，Differentiation(分化)201079：159-170)一致，体外培养的小鼠OSC自发地产生巨大(直径35-50μm)的球状细胞，所述球状细胞就形态(图7a)和基因表达分析(图7b，c)而言类似于卵母细胞。在每次传代后24-48小时内观察到来自小鼠OSC的体外卵子发生的峰值水平(图7d)，接着在每次OSC恢复汇合时进行性下降到几乎不可检测的水平。平行分析从人成年卵巢分离并且在体外维持的VASA阳性细胞揭示，与小鼠OSC一样，这些细胞也自发地产生卵母细胞，如从形态学(图7f)和基因表达(图7c、g)分析两者中所推断。来自人OSC的体外卵子发生的动力学与小鼠OSC的动力学差异微小，在于每次传代后在72小时观察到卵母细胞形成的峰值水平(图7e)。除检测许多广泛接受的卵母细胞标记(Vasa、c-Kit、Nobox、Lhx8、Gdf9、Zp1、Zp2、Zp3；(Suzumori(素组莫瑞)等人，Mech.Dev.(发育机制)2002111：137-141；Rajkovic(拉伊科维奇)等人，Science(科学)2004305：1157-1159；Pangas(潘格思)等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国科学院院刊)2006103：8090-8095；Elvin(埃尔文)等人，Mol.Endocrinol.(分子内分泌学)199913：1035-1048；Zheng(郑)等人，Semin.Reprod.Med.(生殖医学研讨会)200725：243-251)之外，小鼠和人OSC衍生的卵母细胞也表达卵母细胞双线期特异性标记Msy2(图7c)。MSY2是爪蟾FRGY2的哺乳动物同源物，一种对两种性别中减数分裂进展和配子发生必需的生殖细胞特异性结合核酸的Y框蛋白(Gu(古)等人，Biol.Reprod.(繁殖生物学)199859：1266-1274；Yang(杨)等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国科学院院刊)2005102：5755-5760)。通过使用人成年卵巢皮层组织作为阳性对照经验性检验市售抗体，鉴定出4种针对卵母细胞标记(VASA、c-KIT、MSY2、LHX8；图8)的这类抗体，所述抗体与人成年卵巢中存在的不成熟卵母细胞特异性反应；还在由人OSC体外产生的卵母细胞中检测到全部4种这些蛋白质(图7g)。
编码减数分裂标记MSY2的mRNA在体外从人OSC中新形成的卵母细胞中的存在促使我们接着探索这些培养物中进入减数分裂的前景。在传代后72小时对粘附的(非卵母细胞种系)细胞的免疫荧光分析鉴定出具有减数分裂特异性DNA重组酶DMC1和减数分裂重组蛋白联会复合体蛋白3(SYCP3)的点状核定位的细胞(图7h)。两种蛋白质均是生殖细胞特异的并且是减数分裂重组所需要的(Page(帕杰)等人，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.(细胞和发育生物学年鉴)200420：525-558；Yuan(袁)等人，Science(科学)2002296：1115-1118；Kagawa(相川)等人，FEBS J.2010277：590-598)。
测定传代后72小时的人OSC培养物的染色体DNA含量分析。通过胰蛋白酶消化法收集培养的小鼠OSC(传代后48小时)或人OSC(传代后72小时)，在冰冷的PBS中洗涤并重悬并用血细胞计数板计数。在冰冷的70％乙醇中固定1小时后，将细胞在冰冷的PBS中洗涤并且在37℃与0.2mg／ml RNA酶A孵育1小时。随后添加碘化丙啶(10μg／ml终浓度)，并且使用BD Biosciences FACSAria II流式细胞仪确定多倍状态。作为对照体细胞系，使用人胎肾成纤维细胞(KEK293，Invitrogen(英杰公司))重复这些实验。这项分析揭示了预期的二倍体(2n)细胞群体的存在；然而，检测到与4n和1n细胞群体相对应的峰，后者指示已经达到单倍体状态的生殖细胞(West(韦斯特)等人，Stem Cells Dev.(干细胞与发育)201120：1079-1088)(图7i)。在活跃分裂的作为对照平行分析的人胎肾成纤维细胞培养物中，仅检测到2n和4n细胞群体(图9a)。在基于FACS对小鼠OSC培养物的染色体分析后观察到可比结果(图9b)。
实例6：人OSC在体内在人卵巢皮层组织中产生卵母细胞
为证实和扩展来自候选的人OSC的推定性卵子发生的体外观察结果，在两个最终实验中，从人成年卵巢分离的VASA阳性细胞用GFP表达载体(GFP-hOSC)稳定转导以促进细胞追踪。对于细胞追踪实验，使用逆转录病毒转导人OSC以获得具有稳定GFP表达的细胞(GFP-hOSC)。简而言之，将1μg pBabe-Gfp载体DNA(Addgene质粒存储号#10668)按照制造商的方案(Lipofectamine，Invitrogen(英杰公司))转染至Platinum-A逆转录病毒包装细胞系(Cell Biolabs)中。转染后48小时收集病毒上清液。使用新鲜的病毒上清液进行人OSC的转导，因聚凝胺的存在(5μg／ml；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))而促进。在48小时后，移去病毒并替换为新鲜的hOSC培养基。在最初1周的扩充后，通过FACS纯化表达GFP的人OSC，并且将纯化的细胞扩充另外2周，随后进行第二轮FACS纯化以获得GFP-hOSC，用于人卵巢组织再聚集或异体移植实验。
在第一个实验中，然后使大约1×105个GFP-hOSC与分散的人成年卵巢皮层组织再聚集。将人卵巢皮层如上文所述那样解离并洗涤，并且在37℃用35μg／ml植物血凝素(PHA；Sigma(西格玛公司))加1×105个GFP-hOSC孵育10分钟。通过离心(在20℃，9,300x g，持续1分钟)使细胞混合物沉淀以产生组织聚集物，将所述组织聚集物置于Millicell0.4μm插入式培养板(Millipore(密理博公司))上，所述插入式培养板于6孔培养皿内含有1ml OSC培养基。在37℃在5％CO2-95％空气中孵育聚集物，并且在24、48和72小时后进行活细胞GFP成像。
如预期，在再聚集的组织各处观察到许多GFP阳性细胞(图10a)。随后将聚集物置于培养物中并且24-72小时后通过直接(活细胞)GFP荧光评估。在24小时内，也在聚集物中观察到几个非常大(≥50μm)的单细胞，其中许多由更小的GFP阴性细胞在类似卵泡的紧固致密结构中包围；这些结构经过72小时仍可检测到(图10b，c)。这些研究结果表明，表达GFP的人OSC自发地产生卵母细胞，这些卵母细胞由人成年卵巢分散物中存在的体细胞(前粒层细胞／粒层细胞)包围。
接下来，将GFP-hOSC注射到人成年卵巢皮层组织活组织检查样品中，然后将该样品异体移植到NOD／SCID雌性小鼠中(n=总计40个移植体)。使用带35号斜面针的10μl NanoFil注射器(World Precision Instruments(世界精密仪器公司))，将卵巢皮层组织小片(2×2×1mm)单独地注射大约1.3×103个GFP-hOSC。将受体NOD／SCID雌性小鼠麻醉，并且沿背侧面造小切口以便皮下插入人卵巢组织，基本上如文献所述(Weissman(斯曼)等人，Biol.Reprod.(繁殖生物学)199960：1462-1467；Matikainen(马蒂凯南)等人，Nature Genet.(自然遗传学)200128：355-360)。将异体移植物在移植后7或14天之后取出，在4％PFA中固定，用石蜡包埋并且连续切片(6μm)，以便利用针对GFP的小鼠单克隆抗体(sc9996；Santa Cruz Biotechnology(圣克鲁斯生物技术公司))进行免疫组织化学分析(Lee(李)等人，J. Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)200725：3198-3204)。简而言之，首先使用0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)进行高温抗原修复。在冷却后，将切片与甲醇中的3％过氧化氢孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，洗涤，并且按照制造商的方案(Vector Laboratories(载体实验室公司))在链霉亲和素-生物素预封闭溶液中孵育。然后，将切片在20℃用含有1％正常山羊血清的TNK缓冲液封闭1小时，并且在4℃与含有1％正常山羊血清的TNK缓冲液中制备的GFP抗体的1∶100稀释物孵育过夜。随后将切片洗涤，在20℃与山羊抗小鼠生物素酰化的第二抗体的1∶500稀释物孵育30分钟，洗涤并且在20℃与Vectastain ABC试剂(Lab Vision(实验室视觉))反应30分钟，之后使用二氨基联苯胺(DAKO)检测GFP阳性细胞。切片用苏木素略微复染以显示细胞和组织构造。总是平行地处理阴性对照(在接受溶媒注射的异体移植的组织上的完整免疫组织化学染色方案)并且它们不显示阳性信号。为了证实并扩展这些观察结果，在异体移植的人卵巢组织中用DAPI复染进行基于双重免疫荧光对GFP和MSY2(双线期卵母细胞特异性标记)或LHX8(早期阶段卵母细胞转录因子)的检测，如前文在免疫分析的说明中详述那样。
7日或14日后收集移植体用于评估GFP表达。全部人卵巢移植体均含有轻易识别的原始卵泡和初级卵泡，伴以位于中央的GFP阴性卵母细胞。交错分散在这些卵泡之中并且经常与其毗邻(这些卵泡假定在GFP-hOSC注射之前存在于该组织中)是含有GFP阳性卵母细胞的其他不成熟卵泡(图10d、f)。对注射有GFP-hOSC的3个随机选择的人卵巢组织活组织检查样品的连续切片组织形态测定分析揭示，在异体移植入小鼠后7日，每个移植物中存在15-21个GFP阳性卵母细胞(图11)。作为对照，在GFP-hOSC注射前的人卵巢皮层组织中(图10e)或在移植入NOD／SCID小鼠之前接受模拟注射(没有GFP-hOSC的溶媒)的异体移植物中(图10g)从未检测到GFP阳性卵母细胞。基于双重免疫荧光对GFP连同双线期卵母细胞特异性标记MSY2(Gu(古)等人，Biol.Reprod.(繁殖生物学)199859：1266-1274；Yang(杨)等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国科学院院刊)2005102：5755-5760)或卵母细胞特异性转录因子LHX8(Pangas(潘格思)等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国科学院院刊)2006103：8090-8095)的检测鉴定出分布遍及以GFP-hOSC注射的异体移植物的许多双阳性细胞(图10h)。如预期，在GFP-hOSC注射之前的卵巢组织中在或在未接受GFP-hOSC注射的异体移植物中未检测到GFP阳性卵母细胞(未显示)；见图10e、g)；然而，这些卵母细胞对于LHX8和MSY2一致地呈阳性(图10h；图8)。
实例7：OSC在自体种系线粒体能量转移(“AUGMENT”)中的用途
图13描述OSC作为雌性生殖细胞的自体来源用于衍生生卵性细胞质或线粒体部分的概述，所述生卵性细胞质或线粒体部分随后可以转移至体外受精(IVF)之前或期间从相同受试者获得的卵母细胞或卵子中。在AUGMENT之后所得到的在卵子中线粒体DNA拷贝数和ATP产生能力的增强确保卵子具有充足的ATP储备用于成功受精和胚胎发育所需要的能量驱动事件。通过AUGMENT向卵子提供的额外线粒体源自身体用来产生卵子细胞的天然前体细胞。另外，基于下述数据，额外的线粒体将不在卵子中产生副作用，所述数据显示，健康胚发生继续进行，甚至当超过胚胎发育所需要的最小线粒体阈值数目接近4倍时时也是如此(见Wai(瓦伊)，Biology ofReproduction(繁殖生物学)201083：52-62，图6)。较早由Cohen(科亨)等人，Mol HumReprod(人类繁殖分子学)19984：269-80报道的异源卵胞质移植(一种对人类使用受限的方法，原因是它在胚胎／后代中导致种系遗传操作和线粒体异质性)的有益作用表明卵子受益于额外的线粒体。
用于AUGMENT的示例性临床方案如下。在标准IVF开始之前，受试者将在月经周期第1-7日期间接受腹腔镜检查术，以便从一个卵巢采集多达三片(每片大约3×3×1mm)卵巢上皮(卵巢皮层活组织检查样品)。在这个方法期间，在腹部内造成2-3个切口并将插入仪器以使用无菌方法从卵巢取出组织。采集的组织将置于无菌溶液中并在冰上转运至符合GTP的实验室，在那里它将冷冻保存直至AUGMENT／ICSI时间为止。组织将保持冷冻直至酶促解离为止。这将充当将从中纯化出线粒体的自体OSC来源。
接下来，将分离OSC并且将从OSC收获线粒体。在解冻卵巢皮层活组织检查的组织后，将组织切碎并置于含有重组胶原蛋白酶和重组DNA酶1的溶液中并均化成单细胞悬液。将使该悬液通过细胞滤网以制备单细胞的溶液。单细胞悬液将与抗-VASA抗体孵育。随后将通过荧光激活细胞分选法(FACS)分离标记的细胞。将使用冷冻OSC等分试样的标准缓慢冷却冷冻保存程序。
受试者将接受标准IVF方案，所述标准IVF方案包括基线评价、GnRH拮抗剂下调和促性腺激素刺激。将在施用hCG后34-38小时内进行卵母细胞采集并且将对卵母细胞进行品质和成熟状态评估。将通过ICSI对成熟卵母细胞授精。
在卵子采集当日，将使用标准方法解冻用于该受试者的冷冻OSC小瓶。将处理OSC以产生线粒体沉淀物(Frezza(佛雷扎)等人，Nature Protocols(自然研究步骤期刊)20072：287-295或Perez(佩雷兹)等人，Cell Death and Differentiation(细胞死亡和分化)20073：524-33.Epub(电子出版物)2006年10月13日)或如下文实例10中描述，其中基于FACS的方法用来分离组织中的总线粒体群体并且任选地，进一步分离活跃呼吸的线粒体群体或对组织中活跃线粒体对总线粒体的比率定量。将评估并记录线粒体制备物的评估结果和活性。线粒体沉淀物将相对于改善卵母细胞品质的标准化线粒体活性浓度而重悬于培养基中。将吸出含有线粒体的这种培养基至含有待递送精子的微量注射针中。线粒体和精子将通过ICSI一起递送至卵母细胞中。
在受精和胚胎培养后，在基于胚胎发育的评估结果培养3日或5日后，可以将最多三个1等或2等级(SART评级系统(50))胚胎在超声指导下转移。如果通过βhCG测试证实妊娠，则受试者将在大约6周和20周胎龄时进行后续观察。
实例8：CR诱导的线粒体刺激作用在年龄渐增的雌性中改善卵母细胞品质和产率
在许多物种中，在无营养不良情况下限制热量摄入量延长寿命并减弱衰老相关的健康并发症的严重性(Masoro(马索罗)等人，Mech Ageing Dev(衰老与发育机制)2005126：913-922；Mair(麦尔)等人，Annu Rev Biochem(生物化学年鉴)200877：727-754；Fontana(丰塔纳)等人，Science(科学)2010328：321-326)。CR反应的共同特征似乎是改变随年龄影响器官中线粒体动力学和积累的氧化应激的代谢调节物(Sohal(梭哈)等人，Mech Ageing Dev(衰老与发育机制)199474：121-133，Barja(巴尔哈)等人，2002Ageing Res Rev(衰老研究评论)1：397-411，Barja(巴尔哈)等人，Biol Rev Camb Philos Soc(剑桥哲学学会生物学评论)200479：235-251)。例如，生长激素／胰岛素／胰岛素样生长因子-1轴、雷帕霉素的哺乳动物靶标、AMP激活的蛋白激酶和去乙酰化酶已经作为CR的介体参与(Fontana(丰塔纳)等人，Science(科学)2010328：321-326，Sinclair(辛克莱)等人，Mech Ageing Dev(衰老与发育机制)2005126：987-1002，Rodgers(罗杰斯)等人，FEBSLett(欧洲生化学会联合会快报)2008582：46-53，Finley(芬利)等人，Ageing Res Rev(衰老研究评论)20098：173-188)。这些途径的几种据报道在过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1α上(PGC-1α)(一种高度响应于营养线索的转录调节物)汇合。在其作用当中，PGC-1α通过调制参与线粒体呼吸的基因表达促进适应于能量缺乏(Fontana(丰塔纳)等人，Science(科学)2010328：321-326，Sinclair(辛克莱)等人，Mech AgeingDev(衰老与发育机制)2005126：987-1002，Rodgers(罗杰斯)等人，2008FEBS Lett(欧洲生化学会联合会快报)582：46-53，Finley(芬利)等人，Ageing Res Rev(衰老研究评论)20098：173-188，Rodgers JT(罗杰斯JT)，等人，Nature(自然)2005434：113-118，Lin(林)等人，Cell Metab(细胞代谢)20051：361-370)。令人惊讶地，在小鼠中缺失PGC-1α仅产生难以察觉的表型，不过在攻击如急性禁食时，几种代谢异常更稳定地表现(Lin(林)等人，Cell(细胞)2004119：121-135，Arany Z(阿兰尼Z)等人，Cell Metab(细胞代谢)20051：259-271，Leone TC(里昂TC)等人，PLoS Biol20053：672-687)。然而，尚无研究已经通过使Pgc-1α-无效小鼠接受降低热量膳食，测试随年龄的任何组织中PGC-1α和CR之间的功能关系。因此，实施一项为期4年的研究以阐明在操纵或不操纵PGC-1α的情况下，成年期间的CR是否在因渐高育龄而处于生殖失败边缘的雌性小鼠中影响卵母细胞品质。
首先评价了从12月龄(衰老)雌性小鼠获得的卵母细胞的产率、成熟状态和受精后发育能力，所述雌性小鼠在3.5月龄以逐步方式引发的7.5个月膳食CR(CR-随意采食)后恢复成随意(AL)采食持续1个月。这个方案基于先前研究，所述先前研究显示在成年期期间以CR维持的雌性小鼠在恢复自由采食后继续繁殖并分娩后代至高龄(Selesniemi(斯莱斯尼米)等人，2008Aging Cell(细胞老化)7：622-629)。通过注射孕马血清促性腺激素(PMSG，10IU；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司)，St.Louis(圣路易斯)，MO)，接着46-48小时后注射人绒毛膜促性腺素激素(hCG，10IU；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))，使小鼠超数排卵。在hCG注射后15-16小时从输卵管采集卵母细胞，使用透明质酸酶(Irvine Scientific(欧文科学公司)，Santa Ana(圣安娜)，CA)剥离卵丘细胞并用补充有BSA(级分V，无脂肪酸；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))的人输卵管液(HTF；Irvine Scientific(欧文科学公司))洗涤，并且划归为MII(卵周隙中的第一极体)，成熟停滞(生发泡分解，无极体挤出，或生发泡完整)或退化。
在整个研究期期间允许随意采食的对照雌小鼠中，每只雌小鼠排卵的卵母细胞总数和完全成熟的卵母细胞(达到减数分裂中期II的卵母细胞；命名为MII)的数目在3月龄和12之间显著下降(图16A)。然而，总卵母细胞产率和成熟卵母细胞产率的年龄相关性下降在按CR维持的12月龄雌性小鼠中消失(图16A)。
接着，评估体外受精率(IVF)和植入前胚胎发育率。将精子从雄性小鼠的附睾尾采集至补充有BSA的HTF中并随后催熟。将无卵丘MII卵母细胞或完整的卵丘-卵母细胞复合体与1-2x106个精子／ml在补充有BSA的HTF中混合持续6-9小时，洗涤并转移至新鲜的培养基。2细胞胚胎的数目用来度量IVF成功率，并且记录来自这些胚胎的胚泡发育率。在分析284个(3月龄随意采食)、93个(12月龄随意采食)和198个(12月龄CR-随意采食)卵母细胞后，对于体外受精率(IVF)或植入前胚胎发育率(图17)没有观察到差异。然而，因为CR在12月龄受诱导的排卵周期后改善每只雌小鼠的MII卵母细胞产率(图16A)，所以从每只衰老的CR-随意采食的小鼠获得的卵母细胞体外受精后所获得的胚泡的数目类似于使用年轻小鼠所获得的胚泡数目并且显著地高于使用衰老的随意采食的小鼠所获得的胚泡数目(图16B)。
为了确定CR对维持来自衰老雌小鼠的卵母细胞产率的有益作用是否与体重的差异相关，基于逐只小鼠在年轻随意采食、衰老的随意采食的雌小鼠和衰老的CR-随意采食的雌小鼠中评估超数排卵率。观察到卵母细胞产率／小鼠的差异与三组小鼠之间体重的变异不相关，所述差异在衰老的随意采食组中最大(图19)。还值得注意的是，与3月龄小鼠相比，在12月龄随意采食的和CR-随意采食的雌小鼠的卵巢中，含有卵母细胞的卵泡储备均严重削弱(图16C)。因此，CR维持来自衰老雌小鼠的MII卵母细胞的高产率的能力似乎与体重的变化或维持在规模上等同于年轻雌小鼠的卵泡储备不相关。
接下来，研究了从衰老的随意采食的和CR-随意采食的雌小鼠采集的MII卵母细胞的品质。选择完全成熟的(MII)卵母细胞用于分析，原因在于卵母细胞中的衰老相关性缺陷在这个成熟期明确易见并且MII卵母细胞代表受精-能育卵子池。为此目的，评估染色体动力学、纺锤体完整性和线粒体动力学，它们是涉及确保卵子发育能力的重要事件。使用Tarkowski(塔考斯基)法(Tarkowski(塔考斯基)等人，Cytogenetics(细胞遗传学)19665：394-400，Muhlhauser(米尔豪泽)等人，BiolReprod(繁殖生物学)200980：1066-1071)，分别固定从3月龄随意采食(n=20只小鼠)、12月龄随意采食(n=34只小鼠)和12月龄CR-随意采食(n=20只小鼠)的雌小鼠采集的总计795个成熟(MII)卵母细胞用于染色体分析。制备物用二盐酸4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色(DAPI；Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))并且在荧光显微镜下评定非整倍体率。在从连续随意采食的雌小鼠采集的MII卵母细胞中，超倍性(>20染色体／细胞；图10A)的发生率从3月龄时不可检测水平显著增加至12月龄时几乎5％。相比之下，在来自以CR维持的12月龄小鼠的MII卵母细胞中未检测到超倍性(图10B)。亚倍性的发生率(<20染色体／细胞)在来自12月龄随意采食的雌小鼠的MII卵母细胞中相对于3月龄随意采食的雌小鼠也显著地升高，并且通过CR完全阻止这一点(图10B)。在3组小鼠之间的成熟卵母细胞中观察到姐妹染色单体过早分离(PSCS)的发生率的相似模式，虽然这些变化不是统计显著的(图10B)。
检查α-微管蛋白和DNA分布的共聚焦分析结果。将超数排卵的卵母细胞剥离卵丘细胞，在酸化的台式液(Tyrode’s Solution)(Irvine Scientific(欧文科学公司))中短暂孵育以软化透明带，并且使用小鼠抗-α-微管蛋白抗体(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))，随后使用与Alexa Fluor-488缀合的山羊抗小鼠IgG(LifeTechnologies(生命技术公司)，Carlsbad(卡尔斯拜德)，CA)免疫染色。利用含有碘化丙啶的Vectashield(PI；Vector Laboratories(载体实验室公司))封装卵母细胞并且通过共聚焦显微术分析它们。α-微管蛋白和DNA分布的共聚焦分析揭示，在超过90％从3月龄随意采食或12月龄CR-随意采食的雌小鼠采集的MII卵母细胞中，减数分裂纺锤体在形状和大小上正常，伴以特征性微管形态；然而，小于39％的从12月龄随意采食的小鼠采集的MII卵母细胞显示出正常减数分裂纺锤体(图20A和C)。另外，64％来自12月龄随意采食的小鼠的MII卵母细胞显示染色体在赤道板上的不完整或异常排列，而25％或更少的从3月龄随意采食或12月龄CR-随意采食的雌小鼠采集的MII卵母细胞显示出染色体错排列(图20B和C)。
评估线粒体聚集是否受热量摄入量影响，所述线粒体聚集已经与卵母细胞品质随年龄渐增而下降相关(Tarín(塔林)等人，BiolReprod(繁殖生物学)200165：141-150)。将卵母细胞剥离卵丘细胞，在线粒体示踪剂Red CMRox(LifeTechnologies(生命技术公司))中孵育并且处理用于显微分析。使用市售生物发光分析试剂盒按照制造商的说明书(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))测定单个MII卵母细胞中ATP的水平。用线粒体示踪剂染色的MII卵母细胞的共聚焦显微镜分析揭示，超过90％从3月龄随意采食的雌小鼠采集的MII卵母细胞显示线粒体的均匀和弥散胞质分布(图21A和B)。相比之下，接近50％从12月龄随意采食的雌小鼠获得的MII卵母细胞显示出广泛的线粒体聚集。然而，多于90％的从12月龄CR-随意采食的雌小鼠采集的成熟卵母细胞显示出均匀和弥散的线粒体分布，类似于从年轻雌小鼠采集的MII卵母细胞中所观察到的情况(图21A和B)。平行于线粒体中的这些变化，通过成年开始的CR类似地阻止了衰老的随意采食的雌小鼠的卵母细胞中ATP含量的衰老相关性下降(图21C)。
最后，利用基因突变体小鼠来探索PGC-1α的缺失是否影响CR随年龄增长维持卵母细胞品质的能力，其中所述PGC-1α的缺失已经与CR在其他细胞类型的作用关联(Finley(芬利)等人，2009Ageing Res Rev(衰老研究评论)8：173-188，Corton(高登)等人，J Gerontol A Biol Sci Med Sci(老年医学系列期刊A：生物科学与医学)200560A：1494-1509，Anderson(安德森)等人，Biochim Biophys Acta(生物化学与生物物理学学报)20091790：1059-1066，López-Lluch(洛佩斯-路迟)等人，ProcNatl Acad Sci(美国科学院院刊)2006103：1768-1773)并且在卵母细胞中表现出来(图21A和图23)。使用RNeasy Plus Micro试剂盒(Qiagen(凯杰公司)，Valencia(瓦伦西亚)，CA)或Tri试剂(Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇公司))分别分离来自5个MII卵母细胞或1个卵巢的总RNA，并且用随机引物(Promega(普洛麦格公司)，Madison(麦迪逊)，WI)逆转录(Superscript II；Life Technologies(生命技术公司))。采用基因特异性引物通过PCR扩增cDNA：
表5.用来检测卵母细胞和卵巢中Pgc-1α、Pgc-1β和β-肌动蛋白mRNA的引物的序列信息(提供GenBank登录号)
Figure BDA0000466883790001011
与过去的研究(Lin(林)等人，Cell(细胞)2004119：121-135)一致，PGC-1α的缺少在突变后代中增加死亡(在第21日将借助杂合子繁殖产生的总计696个幼仔中的90个幼仔基因分型为敲除)。对存活到12个月的无效雌小鼠(总计47只中36只)的评估显示，在随意采食的小鼠中的PGC-1α缺乏概况了CR对排卵的卵母细胞产率(图22B)、胞质内减数分裂纺锤体形成(图22C)、染色体排列(图22D)和线粒体分布(图22E)的有益作用。在12月，缺少PGC-1α的随意采食的雌小鼠显示比其野生型对应物略微较大的卵泡储备，但是与任一种基因型的年轻成年动物相比，卵泡数目仍严重削减(图24)。当缺少PGC-1α的小鼠经历CR时，没有观察到卵母细胞数目／卵巢(图24)或卵母细胞产率或品质(图22B-D)的进一步变化。
使用兔抗-PGC-1抗体(Calbiochem(卡尔生化公司))，如所描述那样(Matikainen(马蒂凯南)等人，Nat Genet(自然遗传学)200128：355-360)，在多聚甲醛固定的石蜡包埋的组织切片中定位PGC-1蛋白。使用针对PGC-1的抗体(Calbiochem(卡尔生化公司))和泛肌动蛋白(Neomarkers(尼尔马克公司)，Fremont(弗里蒙特)，CA)作为内参对照，通过免疫印迹法评估蛋白质样品(10μg)。由于PGC-1蛋白的水平在随意采食的或CR-随意采食的小鼠的卵巢中随年龄保持基本上不变(图25)，所以CR似乎并不直接改变这个器官中的PGC-1基因表达。然而，CR和PGC-1α在排卵的卵母细胞中独立地产生相同结果的发现表明，在这两个模型中激活的信号传导途径在对确保卵子品质重要的共同下游点处汇合。
总之，这项研究已经揭示出成年开始的CR对雌性小鼠的成熟卵母细胞中染色体、纺锤体和线粒体动力学的令人惊人的有益作用，其中所述雌性小鼠处于正常情况下与不良生育参数相关的年龄。本研究不仅确立CR通过显著改善在卵母细胞染色体动力学维持雌性随年龄增长的能育潜能，还鉴定PGC-1α为卵母细胞品质的调节物。因而，通过施用生物能剂(例如，包括CR模拟物)防止卵母细胞非整倍体和纺锤体缺陷提供了改善高育龄女性中受精能力和妊娠结局的手段。
关于CR分析的实验方法的额外信息：
使用由美国国家衰老研究所(National Institute on Aging)在其衰老生物标记研究中所形成的成年开始的CR方案(Turturro(塔托罗)等人，J Gerontol A Biol SciMed Sci(老年医学系列期刊A：生物科学与医学)199954A：B492-B501)，其中在3.5月龄在2周时间范围内以逐步方式启动CR以便在4月龄实现40％限制。每只雌性小鼠在常规(不通风)笼舍内单独放养并每日以定额量的强化啮齿类日粮喂食一次(美国国家衰老研究所)。强化啮齿类日粮补充有维生素和矿药剂，以使得这些微量营养物的每日摄入量可比随意(AL)取得非强化(标准)啮齿类日粮的对照动物的每日摄入量。否则日粮组成相同。CR方案继续直至11月龄，此时允许先前按CR维持的小鼠随意取得标准啮齿类日粮1个月。为了证实CR方案如预期那样发挥作用，就在开始CR方案(3月龄)之前、在完成CR方案时(11月龄)和CR小鼠恢复随意采食后一个月(12月龄)取得每只小鼠的重量(图26))。此外，使用交替禁食日和采食日以在雌性小鼠中实现CR的以往研究报道，衰老相关的动情周期破坏因食物限制而延迟(Nelson(纳尔逊)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)198532：515-522)。这些数据，连同以下的最近观察结果：成年开始的CR延迟雌性小鼠中生殖失败的时程，如天然交配试验中所测试(Selesniemi(斯菜斯尼米)等人，Aging Cell(细胞老化)20087：622-629)，支持该方法维持周期性产生正常45日动情周期所需要的生殖激素。为了在此处用来实现CR的喂食方案下进一步证实这一点，如所描述那样评估每日阴道细胞学涂片(Felicio(菲利西奥)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)198634：849-858)，以在30日时间范围内比较衰老的随意采食的小鼠和CR-随意采食的小鼠中的动情周期(图27)。在小鼠中充分确立，雌性生殖衰老与常见的45日动情周期变动至周期延长持续超过5日相关(Gosden(戈斯等)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)198328：255-260)。例如，显示周期持续45日对周期持续超过5日的年轻成年C57BL／6小鼠的比例分别是大约80％至20％；然而，截止12月龄，几乎三分之二的雌性小鼠显示指示卵巢功能衰竭即将来临的动情周期延长(Felicio(菲利西奥)等人，Biol Reprod(繁殖生物学)198634：849-858，Gosden(戈斯等)等人，BiolReprod(繁殖生物学)198328：255-260；还见图27)。全部实验独立地重复至少3次。将来自实验重复的定量数据合并并作为均数±SEM展示。使用ANOVA和学生t-检验(Student's t-test)进行均值之间的统计比较。小于0.05的P值视为显著。
实例9：生物能学因素增加OSC中的线粒体参数
因化疗、衰老和卵巢功能早衰(POF)所致的雌性不育部分归咎于卵母细胞和OSC中线粒体功能的下降。因此，来自小鼠的OSC用来筛选增强雌性种系细胞中线粒体功能(“生物能状态”)的小化合物。用于增强线粒体功能的测定法包括mtDNA含量、ATP、NAD+／NADH、线粒体质量、膜电位和已知的线粒体质量调节因子和电子传递链组分的基因表达。
这些化合物均溶解于DMSO中。出于筛选目的，将细胞用溶媒(0.001％DMSO)或用25μM或50μM每种化合物(例外在于小檗碱，其用于筛选的浓度是5μM和25μM)处理24小时。为验证前6个命中，将细胞用溶媒(0.001％DMSO)或用5μM或25μM每种化合物处理24小时。对于基因表达谱，将细胞用认为在事先验证测定法中工作更好的浓度处理。
线粒体膜电位用荧光探针-四甲基罗丹明甲基酯(TMRM)(Sigma(西格玛公司))测量，如之前描述(Rolo A.P.(罗洛A.P.)Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)20031637：127-132)。简而言之，将细胞在37℃于黑暗下用HBSS缓冲液中的6.6μM TMRM加载15分钟。随后吸出上清液，并且用KHH使细胞返回初始体积。TMRM是以电泳方式在线粒体中与线粒体膜电位成比例积累的膜可透性阳离子荧光团(EhrenbergB.V.(艾伦贝格B.V.)等人，Biophys.J.198853：785-794)。将细胞悬液(含有105个细胞的200μl)加载至96孔板中并且分别使用激发波长485nm和发射波长590nm测量荧光。考虑碳酰氰对-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)引起的完全去极化，估计线粒体膜电位。
为了分析mtDNA，用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN(凯杰公司))提取总DNA。使用线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(COX2)基因特异性引物扩增mtDNA并且针对通过扩增核糖体蛋白s18(rps18)核基因所得的基因组DNA归一化。使用IDT软件(IDT公司)设计引物。
使用基于萤光素酶的测定法，用商业试剂盒根据制造商的说明书(Roche(罗氏公司))测量ATP含量，并且将它针对每份样品中的蛋白质含量归一化。
使用荧光探针N-壬基吖啶橙(NAO)评价线粒体质量，简而言之，使细胞在37℃于黑暗下在含有10nM NAO的培养基中孵育30分钟。将细胞随后用胰蛋白酶消化并重悬于不含NAO的培养基中。随后通过流式细胞术在FACSCalibur(BDBiosciences(BD生物科学公司))上使用488nm激光确定NAO荧光强度。
对于基因表达分析，用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN(凯杰公司))根据说明书，从骨骼肌组织和C2C12细胞提取RNA并使用NanoDrop1000分光光度计(Thermo Scientific(赛默飞世尔科技公司))定量。使用200ng RNA，用iSCRIPcDNA合成试剂盒(BioRad(伯乐公司))合成cDNA。使用1μM引物和
Figure BDA0000466883790001051
480SYBR Green Master(Roche(罗氏公司))在480检测系统(Roche(罗氏公司))上进行定量性RT-PCR反应。通过比较方法(2-ΔΔCT)使用肌动蛋白作为内对照进行计算。使用IDT软件(IDT公司)设计引物。
已知抑制CD38的几种生物能剂产生高于基线(仅DMSO)的活性并且评定为阳性结果，所述生物能剂包括芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱和SRT-1720。因此，显示这些生物能剂以有益方式增加线粒体参数。
显示包括芹菜素、木犀草素、小檗碱和酪氨酸磷酸化抑制剂8在内的生物能剂以有益方式升高NAD+水平并增加线粒体参数。在一个实施例中，这类药剂可用于增强雌性生殖细胞生物能学以治疗与化疗、衰老和卵巢功能早衰相关的雌性不育。
实例10：基于FACS的线粒体分离
如这个实例中所述，基于FACS的方法可以用来分离组织中的总线粒体群体。另外，基于FACS的用于分离线粒体的方法可以采用双重标记，所述双重标记利用两种不同的荧光染料(线粒体膜电位(MMP)依赖性和MMP非依赖性)以分离仅功能性(例如，活跃地呼吸的)线粒体群体或定量组织、细胞、裂解的细胞或其衍生的部分中功能性线粒体对总线粒体的比率。
如下文所述制备并利用非氧化依赖性线粒体示踪剂Green FM(InvitrogenM7514)(指示线粒体质量的线粒体追踪探针)。线粒体示踪剂母液(溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)中的1-5mg／ml)稀释于无血清生长培养基中以实现25-500nM之间的工作浓度。通过以300×g离心5分钟使新鲜分离的或解冻的OSC沉淀。吸出上清液并且将细胞沉淀物重悬于200μl稀释的线粒体示踪剂母液中。
将细胞在37℃孵育45分钟，在预温(37℃)的无血清生长培养基中洗涤并且通过以300x g离心5分钟沉淀(可替代地，细胞可以在与感兴趣的探针孵育之前裂解)。吸出上清液并且将细胞重悬于100μl线粒体裂解缓冲液中并且转移至FACS分选管以便使用快速渗透休克法通过机械透化进行裂解。在裂解后，细胞在冰上平衡15-30分钟，在200μl(最小体积)冰冷的PBS中孵育并涡旋混合。如图36中所示，观察到三个不同群体：残余M7514阳性细胞(细胞MT+)、高荧光线粒体(功能性，Mito MT高)和低表达线粒体(无功能，Mito M低)。裂解后功能性线粒体对无功能线粒体的比率是大约1：1(1552个线粒体中，743个线粒体门选为有功能的并且716个线粒体门选为无功能的；图36中在群体周围画出积累门)。因此，可以分选并收集功能性线粒体，同时基于尺寸和荧光强度排除残余的未裂解的细胞和无功能的线粒体。使用多种探针或JC-1探针(红光谱；Invitrogen T3168)的双重标记可以有助于进一步区分功能性线粒体与无功能的线粒体。用于双重标记的探针包括但不限于还原型氧化态线粒体示踪剂探针(例如，线粒体示踪剂红CM-H2XRos(InvitrogenM7513)和线粒体示踪剂橙CM-H2TMRos(InVitrogen M7511)和积累依赖性探针：JC-1(红光谱；Invitrogen T3168)、线粒体示踪剂深红FM(Invitrogen M22426)和JC-1(绿光谱；Invitrogen T3168))。
实例11：使用差速离心分离线粒体
如这个实例中所述，差速离心法可以用来分离组织中存在的线粒体或对其分级。从任何组织或细胞分离线粒体时，关键步骤是：(i)通过机械和／或化学手段破碎细胞，(ii)以低速度进行差速离心以移去残片和极大的细胞器(SPIN1)，和(iii)以更高的速度离心以分离并采集线粒体(SPIN2)。
将组织称重并且用1.5ml市售洗涤缓冲液(MitoSciences(线粒体科学公司))洗涤两次。将组织切碎并且置于预冷的杜恩斯(Dounce)均化器中。添加多达2.0ml市售分离缓冲剂(MitoSciences(线粒体科学公司))。使用杜恩斯均化器(20-40个冲程)破碎细胞，并将匀浆转移至微量离心管。每只管用分离缓冲液填充至2.0ml。将匀浆在4℃以1,000g离心10分钟。保留上清液并将其转移至新管中，每只新管用分离缓冲液填充至2.0ml。将所述管在4℃以12,000g离心15分钟。保留沉淀物。如果需要，分析上清液的品质。通过在1.0ml补充有10μl市售蛋白酶抑制剂混合物的分离缓冲剂(MitoSciences(线粒体科学公司))中重悬，将沉淀物洗涤2次。将所述管在4℃以12,000g离心15分钟。在洗涤后，将沉淀物合并并重悬于500μl补充有蛋白酶抑制剂混合物的分离缓冲液中。如果需要，将等分试样贮存在-80℃直至使用。
在一种方法中，使用市售抗体，如MitoSciences(线粒体科学公司)的抗体MSA06、MSA03和MSA04，通过蛋白质印迹法检验线粒体完整性，所述蛋白质印迹法相对于上清液部分筛选分离的线粒体中的细胞色素c、孔蛋白(porin)或亲环蛋白D。在另一个方法中，例如，使用市售的OXPHOS复合物检测混合物(MitoSciences(线粒体科学公司))，通过蛋白质印迹法探测线粒体样品以检测线粒体复合物的组分。
实例12：使用蔗糖梯度分离法分离线粒体
该方案使用可商业获得的以下试剂：正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(月桂基麦芽糖苷；MitoSciences MS910)，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，15％、20％、25％、27.5％、30％和35％的蔗糖溶液，双蒸水，蛋白酶抑制剂混合物(MitoSciences(线粒体科学公司))和13x51mm异质同晶聚合物管(Beckman326819)。
蔗糖梯度分离法是优化用于线粒体的蛋白质亚分离方法。这种方法将样品拆分成至少10个级分。可能将溶解的完整细胞分离成复杂性低得多的级分，但是当分析已经分离的线粒体时，所述级分甚至更简化。蔗糖梯度分离技术设计用于5mg／ml蛋白质时多达0.5ml的初始样品体积。因此应当使用2.5mg或更少的总蛋白。对于较大的量，可以制备多个梯度或产生更大规模的梯度。
将样品溶解于非离子型去垢剂中。已经确定在这个蛋白质浓度，线粒体被20mM正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷(1％w／v月桂基麦芽糖苷)完全溶解。这种溶解过程的关键在于膜被破碎，同时先前膜包埋的多亚基OXPHOS复合物保持完整(本文所述的基于密度的蔗糖分离法所必需的步骤)。一个重要例外是丙酮酸脱氢酶(PDH)。为了在5mg／ml线粒体的蛋白质浓度下分离PDH，要求的去垢剂浓度仅是10mM(0.5％)月桂基麦芽糖苷。PDH酶还应当以较低的速度离心，对于PDH复合体，16000g离心力是最大值。
向PBS中处于5mg／ml的蛋白质的线粒体膜悬液添加月桂基麦芽糖苷至终浓度1％。将这种混合物充分混合并在冰上孵育30分钟。将混合物随后以72,000g离心30分钟。推荐贝克曼Optima台式超速离心机(Beckman Optima benchtopultracentrifuge)用于小样本体积。然而，至少处于最大速度(例如，约16000g)台式微量离心机应当够用。在离心后，收集上清液并且弃去沉淀物。将蛋白酶抑制剂混合物添加至样品，所述样品在冰上维持直至进行离心。在线粒体非常富集的样品中，复合物III和IV中的细胞色素可以赋予上清液棕色，当检验以下分离的有效性时，这是有用的。
通过在彼此顶上分层放置蔗糖密度连续递减的溶液，制备不连续蔗糖密度梯度。下文详细描述含有15％-35％蔗糖溶液的不连续梯度的制备和离心。这种梯度导致良好分离线粒体OXPHOS复合物(质量范围从200kDa至1000kDa)。然而，可以修改这种设置用于分离特定复合物或用于分离较大量的材料。
通过以下方式制备该梯度：在彼此顶上分层放置密度递减的蔗糖溶液；因此施加的第一溶液是35％蔗糖溶液。稳定施加该溶液产生了最大可重复的梯度。为有助于本申请，在管架中竖直固定贝克曼异质同晶聚合物管。接下来，将200μl吸管尖头置于1000μl吸管尖头的末端上。两个紧密配合的尖头由钳夹座稳固保持，并且使黄色尖头的末端与所述管的内壁接触。现在，将蔗糖溶液置于蓝色尖端中并缓慢且稳定地输入管内，以35％溶液(0.25ml)开始。
一旦将35％溶液排入管中，则将30％溶液(0.5ml)加载到管中35％溶液溶液的顶部上。这个过程分别用27.5％(0.75ml)、25％(1.0ml)、20％(1.0ml)和15％(1.0ml)溶液继续。在该管顶部留下足够空间以添加0.5ml溶解的线粒体样品。
一旦倾注蔗糖梯度，则不连续蔗糖层是可见的。已经将样品施加至梯度的顶部后，将该管非常小心地加载到转子中，并且开始离心。全部离心方法均需要平衡转子，因此产生精确含有相同质量的另一个管。在实践中，这意味必须制备2个梯度，虽然第二梯度不需要含有实验样品，但是可以含有0.5ml水代替0.5ml蛋白质样品。
异质同晶聚合物管应当采用加速曲线7和减速曲线7，在4℃于SW50.1吊篮型转子(Beckman(贝克曼公司))中以37,500转／分钟(RCF av132,000x g)离心16小时30分钟。在运行后管应当马上从转子取出，非常小心切勿扰动蔗糖层。当分离富含线粒体的样品时，可以观察到不连续有色的蛋白质层。最经常地，这些是距管底部大约10mm的复合体III(500kDa-栋色)和距管底部25mm的复合体IV(200kDa-绿色)。在一些情况下，可以观察到额外的条带。这些是其他OXPHO复合体。
为收集级分，使用钳夹座稳固并且直立地夹住管。使用细针在管的最底部引入微小孔。该孔刚好大到足以允许蔗糖溶液以1滴／秒滴出。将等体积的级分收集于刺穿的孔下方的微量离心管中。总共10×0.5ml级分是适当的，然而也可能收集更多级分，这些级分因此体积也更小(例如20×0.25ml级分)。级分贮存在-80℃直至分析。使用本文(例如，在实例10、11中)所述的任一方法或本领域已知的任一方法，分析收集的级分以确定线粒体完整性。
实例13：增加NAD+水平的药剂增加卵母细胞产生
如图37中所示，NAD+经3条主要途径合成：(i)NAD补救途径(通过NAMPT和NMNAT1-3从烟酰胺、NAM至NMN至NAD+)；(ii)经从头途径从色氨酸、经喹啉酸(图38)合成；和(iii)从烟酰胺核糖核苷，一种在乳和其他食品中存在的分子)(图38)合成。直至最近，仍将NAD+单纯地视作携带来自一个反应的电子至另一个反应的辅酶。现在已经发现NAD+是低热量摄入的主要信号，协调主要代谢途径的活动，大多通过刺激去乙酰化酶的活性来协调。两类关键的下游介体是SIRT1(核去乙酰化酶)和SIRT3(线粒体去乙酰化酶)，它们协同地发挥作用以响应于禁食和锻炼增加心脏和骨骼肌中的呼吸和脂肪酸氧化。在卵原干细胞中，SIRT1控制调节卵原干细胞向卵母细胞分化的关键转录因子的表达。
然而，在衰老期间，胞核和线粒体中的NAD+水平下降，降低这两类去乙酰化酶的活性并严重损害线粒体功能。NAD+水平可以通过将细胞与NAD前体如NMN孵育(例如图39)，通过体内注射或否则递送NAD前体至细胞(图42)，通过增加合成NAD+的基因(例如NAMPT、NMNAT1-3)的表达；或通过抑制NAD降解、通过抑制PARP或CD38来增加(见图37CD38抑制剂包括但不限于上文在表2A和2B中列出并且由DongM.(董M.)等人，Org.Biomol.Chem.(有机和生物分子化学)2011(9)：3246-3257和KellenbergerE.(克林伯格E.)等人，Bioorg Med ChemLett.(有机和药物化学通讯)201121(13)：3939-42描述的那些，所述文献的内容通过引用的方式结合在此。可以通过其他方法实现增加细胞中的NAD+，如施加TCA循环的底物(例如丙酮酸、脂肪酸)。实施以下实验以确定升高NAD+水平和／或激活去乙酰化酶的基因和小分子在体内和体外是否延迟或逆转衰老和细胞应激／损伤对雌性受精能力的影响。
基于纯化不含掺杂性卵母细胞的OSC的分选方案，使用FACS从解离的卵巢分离卵原干细胞(详见实例1)。在培养基中维持细胞，所述培养基由极限基本培养基α(MEMα)、10％FBS、1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸、2mM L-l-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma(西格玛公司))，10ng／ml-1LIF(Millipore(密理博公司))、1X N-2MAX培养基补充物(R&D公司)、10ng／mLEGF(人重组表皮生长因子；Gibco(吉博科公司))，40ng／mL人GDNF(源自神经胶质细胞系的神经营养因子；R&D Systems(R&D系统公司))、1ng／mL人bFGF(碱性成纤维细胞生长因子；Gibco(吉博科公司))组成。
对于全部实验，将25,000个细胞铺种在24孔平板的每个孔中。允许细胞贴壁24小时并且随后用NMN(β-烟酰胺单核苷酸；Sigma(西格玛公司))处理细胞。除非另外声明，否则向细胞2次添加NMN，第一次在分析之前12小时并随后再次在分析之前6小时(12+6小时)。如下分析线粒体DNA拷贝数。在指示的时间点使用DNeasy血液及组织试剂盒(Qiagen(凯杰公司))，根据制造商的说明书从细胞分离细胞总DNA。在Roche480PCR仪上使用LightCycler480SYBR绿色I(Green I)Master(Roche Applied Science(罗氏应用科学公司))使用以下引物，将线粒体DNA拷贝数定量。
MT-ND2：
F：AAGGGATCCCACTGCACATA
R：AGTCCTCCTCATGCCCCTAT
RPS18核
F：CCAGAGGTTGCATTTTCCCAAG
R：TAAGGCCGATAAGGCAAACGAA
用NMN处理后，使用NAD／NADH定量试剂盒(Biovision(生物视野公司))根据制造商的说明书，测量NAD+／NADH水平。体内升高细胞中的NAD+水平大幅度增加线粒体功能和线粒体含量，这通常被视为雌性受精能力、代谢健康、脑功能、心血管健康和葡萄糖代谢／II型糖尿病的主要决定因素。用NAD前体(例如烟酰胺核糖核苷，即“NMN”，见图38)处理的OSC和卵母细胞已经增加NAD+、NAD+：NADH和线粒体DNA含量(图40)。
为确定增加NAD+水平是否影响卵母细胞产生，分析自发性卵母细胞形成。用25，000个OSC接种24孔平板的每个孔。在接种后第二日以及NMN处理后的指定时间点评估每孔形成并释放入培养基的卵母细胞的数目。NMN处理增加卵子形成率(EFA)(图37、38和41)。基于这些结果，预期体内或体外增加NAD+的化合物和基因减少或逆转雌性受试者中与线粒体损伤、能量学缺陷和卵巢衰老相关的不育。还预期NMN治疗增强卵巢中OCS、卵母细胞、粒层细胞和血管的功能。
增加NAD+水平的NMN和其他化合物可用于增加受精能力或否则减少或逆转雌性受试者中的不育。在一个实施例中，将这类化合物经口、通过腹膜内注射(IP)或皮下递送至受试者以增加受试者将受孕并分娩健康后代的概率。NAD+前体NMN的全身性施用升高年轻小鼠和年老小鼠中的体内NAD+水平。心[NAD+]随年龄下降。NAD+的这种下降由NMN治疗逆转(n=3；200mg.kg.d.I.P.，持续1周)(图42)。NMN治疗也对线粒体功能具有恢复作用(图43)。在另一个实施例中，将NMN和增加NAD+水平的其他化合物递送至体外OSC、卵母细胞、胚泡、精子或分离的线粒体。例如，将这类化合物在IVF之前、期间或之后递送至生殖细胞。在另一个实施例中，本发明的化合物用来增强来自OSC、卵母细胞、胚泡、精子的线粒体或体外分离线粒体的产生或保存。
实例14：口服摄入芹菜素、木犀草素和SRT1720改善衰老雌性中卵母细胞的品质
雌性小鼠(8月龄，品系C57BL／6)以12：12光照：黑暗周期维持并提供随意取得水和食物。室内条件维持在21℃±1℃，伴以50％±20％相对湿度。使小鼠在8.5月龄摄取实验日粮并且按这种日粮维持3个月。全部日粮均为定制，从ResearchDiets(研究性日粮公司)订购：开放标准日粮(OpenStandard Diet)(20kca1％蛋白质、15kcal％脂肪和65kcal％糖)，并且实验组由常规开放标准日粮，0.5g／kg体重的开放标准日粮+芹菜素、0.5g／kg的开放标准日粮+木犀草素和2g／kg的开放标准日粮+SRT-1720组成。每周测量食物摄入量并且每2周评估平均增重。每个实验组由12只随机分配的小鼠组成。当小鼠安乐死时，使用额外一组3-月龄C57BL／6雌性小鼠(3M)作为阳性对照。在全部组中，在激素刺激以便超数排卵后评估卵母细胞数目。
确定这项研究中的11.5月龄对照小鼠排卵非常少(如果有任何卵母细胞)，并且芹菜素、木犀草素和SRT-1720均增加卵母细胞产率(图44)。饲喂开放标准日粮的12月龄对照组未能排出足够数目的卵母细胞用于后续分析(约1.3个卵母细胞／小鼠，n=12只小鼠)。因为来自衰老对照雌小鼠的卵母细胞的产率极低，所以可以使用来自12月龄C57BL／6雌小鼠的卵母细胞产率的历史数据(称作“Hist12M”；来自Selesniemi(斯莱斯尼米)等人，Proc Natl Acad Sci U SA.(美国科学院院刊)2011年7月26日；108(30)：12319-12324)作为衰老对照组的额外参比点。
还确定与年老的适宜对照(Hist12M)相比，芹菜素、木犀草素和SRT-1720不影响超数排卵后采集的成熟、中期II卵母细胞的百分比。在图45A中的，显示了经评估处于中期II的卵母细胞的百分比。在图45B中的，显示了被停滞处于生发泡(不成熟)期的卵母细胞的百分比。在图45C中的，显示了闭锁(死)卵母细胞的百分比。
还确定与年老的适宜对照相比(Hist12M)，芹菜素、木犀草素和SRT-1720改善衰老小鼠中的卵母细胞品质。在图46A中，显示异常线粒体簇集的卵母细胞的百分比在饲喂芹菜素、木犀草素或SRT-1720的小鼠中降低(方法在Selesniemi(斯菜斯尼米)等人，Proc Natl Acad Sci U SA.(美国科学院院刊)2011年7月26日；108(30)：12319-12324中描述)。在图46B和图46C中分别显示，饲喂芹菜素、木犀草素或SRT-1720的小鼠在MII卵母细胞中具有减少的纺锤体异常百分比以及减少的染色体错排列。上文在实例8中描述了用于确定纺锤体异常和染色体错排列的方法。确定异常线粒体分布存在于16.13％来自3M小鼠的卵母细胞中，存在于46％来自Hist12M小鼠的卵母细胞中，存在于7.7％用芹菜素补充后的卵母细胞中，存在于12％用木犀草素补充后的卵母细胞中并且存在于6.9％用SRT-1720补充后的卵母细胞中。确定纺锤体异常存在于3M小鼠中18.3％的卵母细胞内，存在于Hist12M小鼠中60％的卵母细胞内，存在于用芹菜素补充后32％的卵母细胞中，存在于用木犀草素补充后32％的卵母细胞中并且存在于用SRT-1720补充后32.8％的卵母细胞中。确定染色体错排列存在于3M小鼠中18.3％的卵母细胞内，存在于Hist12M小鼠中62％的卵母细胞内，存在于44％来自用芹菜素补充后的小鼠中的卵母细胞中，存在于40％用木犀草素补充后的卵母细胞中并且存在于40.9％用SRT-1720补充后的卵母细胞中。
其他实施例
从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。此类实施例也处于以下权利要求的范围内。
在变量的任何定义中对要素清单的引用在本文中包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。对本文中实施例的描述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合的实施例。
本申请含有可以与2011年4月14日提交的美国临时专利申请系列号61／475,561、2012年2月17日提交的61／600,505和2011年6月29日提交的61／502,588和2012年4月13日提交的PCT申请号PCT／US12／33643相关的主题，所述每份文献的完整披露内容通过引用的方式结合在此。本说明书中提及的全部专利及出版物通过引用方式以相同的程度结合在此，如同专门且个别地指出通过引用的方式结合每份单独的专利和出版物。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
104.细胞培养基，其包含选自CD38抑制剂和NAD前体的试剂。
105.根据权利要求104所述的细胞培养基，
其中所述CD38抑制剂选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮和酪氨酸磷酸化抑制剂8；以及
其中所述NAD前体选自：烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
106.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述试剂以有效增强在所述培养基中培养之细胞的生物能状态的量存在于所述培养基中。
107.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述试剂以有效增加在所述培养基中培养之细胞中线粒体数的量存在于所述培养基中。
108.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述试剂以有效增加在所述培养基中培养之细胞的线粒体能量的量存在于所述培养基中。
109.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述试剂以有效增加在所述培养基中培养之细胞的细胞能量的量存在于所述培养基中。
110.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述CD38抑制剂以≥25μM的浓度存在。
111.根据权利要求104所述的细胞培养基，其中所述NAD前体以≥100μM的浓度存在。
112.组合物，其包含分离的卵母细胞、卵原干细胞或卵原干细胞的后代以及选自CD38抑制剂和NAD前体的试剂。
113.根据权利要求112所述的组合物，其中所述试剂选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮、酪氨酸磷酸化抑制剂8、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述试剂以≥25μM的浓度存在并且选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮和酪氨酸磷酸化抑制剂8。
115.根据权利要求113所述的组合物，其中所述试剂以≥100μM的浓度存在并且选自：烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
116.根据权利要求113所述的组合物，其中所述组合物还包含卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血。
117.组合物，其包含选自卵母细胞线粒体的经纯化制备物和卵母细胞胞质的无胞核制备物的线粒体制备物以及选自CD38抑制剂和NAD前体的试剂。
118.根据权利要求117所述的组合物，其中所述试剂选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮、酪氨酸磷酸化抑制剂8、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
119.根据权利要求118所述的组合物，其中所述试剂以≥25μM的浓度存在并且选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮和酪氨酸磷酸化抑制剂8。
120.根据权利要求118所述的组合物，其中所述试剂以≥100μM的浓度存在并且选自：烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
121.制备用于体外受精的卵母细胞或卵原干细胞的方法，所述方法包括：
在包含选自CD38抑制剂和NAD前体的试剂的培养基中培养所述卵母细胞或卵原干细胞。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述试剂选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮、酪氨酸磷酸化抑制剂8、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。
123.制备用于体外受精的植入前合子的方法，所述方法包括：在包含选自CD38抑制剂和NAD前体的试剂的培养基中培养所述植入前合子。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述试剂选自：芹菜素、木犀草素、漆树黄酮、酪氨酸磷酸化抑制剂8、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、氢化烟酰胺核糖核苷和烟酸。

Claims (103)

1.组合物，其包含分离的细胞和生物能剂，所述分离的细胞选自卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC的后代。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱和CD38抑制剂及其功能衍生物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物能剂是具有式I-XV中任一者的化合物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其还包含溶液，所述溶液选自：细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤溶液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、玻璃化溶液和冷冻保存溶液。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述OSC从卵巢组织获得。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述非卵巢组织是血液。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述非卵巢组织是骨髓。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血。
11.相对于参比具有增强的线粒体功能的分离的细胞，其中所述细胞选自卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC的后代，其中所述细胞已经与生物能剂接触。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述生物能剂选自：漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱和CD38抑制剂及其功能衍生物。
13.根据权利要求11所述的细胞，其中所述生物能剂选自具有式I-XV的化合物。
14.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞具有增加的线粒体DNA拷贝数和／或增加的ATP生成能力。
15.根据权利要求11所述的细胞，其中线粒体数相对于参比细胞增加约10％、20％、30％、40％、50％或约60％。
16.根据权利要求11所述的细胞，其中增加的线粒体功能通过测定mtDNA含量、ATP、NAD+／NADH、线粒体质量、膜电位、和已知的线粒体质量调节因子和电子传递链组分的基因表达进行检测。
17.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞在选自以下的溶液中：细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤溶液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、玻璃化溶液和冷冻保存溶液。
18.根据权利要求11所述的细胞，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
19.根据权利要求11所述的细胞，其中所述OSC从卵巢组织获得。
20.根据权利要求11所述的细胞，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述非卵巢组织是血液。
22.根据权利要求20所述的细胞，其中所述非卵巢组织是骨髓。
23.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞在具有卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血的混合物中。
24.组合物，其包含OSC线粒体或卵母细胞线粒体以及生物能剂，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中包含OSC线粒体的所述组合物是无胞核的OSC胞质。
26.根据权利要求24所述的组合物，其中包含卵母细胞线粒体的所述组合物是无胞核的卵母细胞胞质。
27.根据权利要求24所述的组合物，其中包含OSC线粒体的所述组合物是从OSC获得的线粒体的经纯化制备物。
28.根据权利要求24所述的组合物，其中包含卵母细胞线粒体的所述组合物是从卵母细胞获得的线粒体的经纯化制备物。
29.根据权利要求24所述的组合物，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
30.根据权利要求24所述的组合物，其中所述OSC从卵巢组织获得。
31.根据权利要求24所述的组合物，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述非卵巢组织是血液。
33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述非卵巢组织是骨髓。
34.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细胞是卵巢干细胞，其中所述细胞已经与生物能剂接触。
35.分离的线粒体，其中所述分离的线粒体已经与生物能剂接触，所述生物能剂选自具有式I-XV的化合物。
36.分离的线粒体，其中所述分离的线粒体已经与生物能剂接触，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱和CD38抑制剂及其功能衍生物。
37.根据权利要求35或36所述的线粒体，其中所述线粒体相对于参比具有增加的线粒体DNA拷贝数和／或增加的ATP生成能力。
38.根据权利要求35或36所述的线粒体，其中线粒体数增加约10％、20％、30％、40％、50％或约60％。
39.根据权利要求35或36所述的线粒体，其中增加的线粒体功能通过测定mtDNA含量、ATP、NAD+／NADH、线粒体质量、膜电位、和已知的线粒体质量调节因子和电子传递链组分的基因表达进行检测。
40.根据权利要求35或36所述的线粒体，其中所述线粒体在细胞和生物能剂中，所述细胞选自卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC的后代。
41.根据权利要求40所述的线粒体，其中所述细胞在选自以下的溶液中：细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤溶液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、玻璃化溶液和冷冻保存溶液。
42.根据权利要求40所述的线粒体，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
43.根据权利要求40所述的线粒体，其中所述OSC从卵巢组织获得。
44.根据权利要求40所述的线粒体，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
45.根据权利要求44所述的线粒体，其中所述非卵巢组织是血液。
46.根据权利要求44所述的线粒体，其中所述非卵巢组织是骨髓。
47.根据权利要求40所述的线粒体，其中所述细胞在具有卵巢组织、卵泡、骨髓、脐带血或外周血的混合物中。
48.分离的无细胞组合物，其包含OSC线粒体或卵母细胞线粒体以及生物能剂，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
50.根据权利要求48所述的组合物，其中所述OSC从卵巢组织获得。
51.根据权利要求48所述的组合物，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述非卵巢组织是血液。
53.根据权利要求51所述的组合物，其中所述非卵巢组织是骨髓。
54.制备用于体外受精(IVF)的卵母细胞的方法，所述方法包括将包含OSC线粒体和生物能剂的组合物转移至自体卵母细胞中，从而制备所述用于体外受精的卵母细胞，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述OSC是能够有丝分裂并且表达Vasa、Oct-4、Dazl、Stella和任选的阶段特异性胚胎抗原的分离的非胚胎干细胞。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述OSC从卵巢组织获得。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述OSC从非卵巢组织获得。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述非卵巢组织是血液。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述非卵巢组织是骨髓。
60.根据权利要求54所述的方法，其中包含OSC线粒体的所述组合物是无胞核的OSC胞质。
61.根据权利要求54所述的方法，其中包含OSC线粒体的所述组合物是从OSC获得的线粒体的经纯化制备物。
62.根据权利要求54所述的方法，其还包括使所述卵母细胞体外受精以形成合子，以及将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。
63.根据权利要求62所述的方法，其中将所述合子和植入前期胚胎与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
64.根据权利要求54所述的方法制备的卵母细胞。
65.体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将来自雌性受试者的OSC与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物；
b)获得包含来自所述OSC的OSC线粒体的组合物；
c)将所述组合物转移至分离的自体卵母细胞中；以及
d)使所述自体卵母细胞体外受精以形成合子。
66.根据权利要求65所述的方法，其还包括将源自所述合予的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。
67.根据权利要求65所述的方法，其中步骤a)是任选的，并且步骤b和或步骤c)还包括将包含OSC线粒体的组合物与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱和CD38抑制剂及其功能衍生物。
68.制备用于体外受精的卵母细胞的方法，所述方法包括将包含卵母细胞线粒体和生物能剂的组合物转移至自体卵母细胞中，从而制备用于体外受精的所述卵母细胞，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中包含卵母细胞线粒体的所述组合物是无胞核的卵母细胞胞质。
70.根据权利要求68所述的方法，其中包含卵母细胞线粒体的所述组合物是从卵母细胞获得的线粒体的经纯化制备物。
71.根据权利要求68所述的方法制备的卵母细胞。
72.体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将来自雌性受试者的卵母细胞与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物；
b)获得包含来自所述卵母细胞的卵母细胞线粒体的组合物；
c)将所述组合物转移至分离的自体卵母细胞中；以及
d)使所述自体卵母细胞体外受精以形成合子。
73.根据权利要求72所述的方法，其还包括将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。
74.根据权利要求72所述的方法，其中步骤a)是任选的，并且步骤b)还包括将包含卵母细胞线粒体的组合物与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
75.体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将来自雌性受试者的卵母细胞与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物；以及
b)使所述卵母细胞体外受精以形成合子。
76.组合物，其包含溶液和生物能剂，所述溶液选自：细胞培养基、卵母细胞采集溶液、卵母细胞洗涤溶液、卵母细胞体外成熟介质、卵泡体外成熟介质、卵母细胞体外受精介质、胚胎培养基、卵裂培养基、玻璃化溶液、冷冻保存溶液和胚胎解冻培养基，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
77.改善雌性受试者的受精能力的方法，所述方法包括将生物能剂以有效改善卵母细胞和／或OSC质量、从头产生和／或排卵的卵母细胞产率的量施用至所述受试者，从而改善所述雌性受试者的受精能力，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
78.根据权利要求77所述的方法，其中将所述生物能剂全身性施用至所述雌性受试者。
79.根据权利要求77所述的方法，其中将所述生物能剂局部施用至所述雌性受试者的卵巢。
80.根据权利要求77所述的方法，其中与参比标准物相比，所述雌性受试者的妊娠结果被改善。
81.体外受精的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将生物能剂以有效改善卵母细胞和／或OSC从头产生、质量和／或排卵的卵母细胞产率的量施用至雌性受试者，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物；
b)从所述雌性受试者获得卵母细胞；以及
c)使所述卵母细胞体外受精以形成合子。
82.根据权利要求81所述的方法，其中将所述生物能剂全身性施用至所述雌性受试者。
83.根据权利要求81所述的方法，其中将所述生物能剂局部施用至所述雌性受试者的卵巢。
84.根据权利要求81所述的方法，其中步骤a)在步骤b)和c)之前和／或在步骤b)和c)之后实施。
85.根据权利要求81所述的方法，其还包括步骤d)将源自所述合子的植入前期胚胎转移至所述雌性受试者的子宫中，并且继续向所述雌性受试者施用所述生物能剂。
86.根据权利要求81所述的方法，其中步骤b)和／或步骤c)还包括将所述卵母细胞与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
87.根据权利要求81所述的方法，其中与参比标准物相比，所述雌性受试者的妊娠结果被改善。
88.维持有此需要的怀孕雌性受试者中的胚胎发育的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的生物能剂，从而维持所述怀孕雌性受试者中的胚胎发育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中将所述生物能剂全身性施用至所述雌性受试者。
90.根据权利要求88所述的方法，其中将所述生物能剂局部施用至所述雌性受试者的卵巢。
91.恢复或增加有此需要的雌性受试者中的卵巢功能的方法，所述方法包括施用治疗有效量的生物能剂，从而恢复所述雌性受试者中的卵巢功能，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中将所述生物能剂全身性施用至所述雌性受试者。
93.根据权利要求91所述的方法，其中将所述生物能剂局部施用至所述雌性受试者的卵巢。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述雌性受试者具有卵巢功能早衰、因化疗所致的不育或与衰老相关的降低的受精能力。
95.从雌性受试者制备用于收获的组织或其细胞的方法，所述方法包括向所述雌性受试者施用有效量的生物能剂，从而从所述雌性受试者制备用于收获的所述组织或其细胞，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述组织选自：卵巢、卵泡、骨髓、脐带血和外周血。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述细胞选自卵母细胞、OSC和OSC的后代。
98.产生卵母细胞的方法，其包括在生物能剂的存在下，在足以使干细胞分化成卵母细胞的条件下培养选自OSC、胚胎干细胞、胰干细胞，皮肤干细胞和经诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)的干细胞，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物。
99.根据权利要求75所述的方法，其还包括将源自所述合子的植入前期胚胎转移至雌性受试者的子宫中。
100.根据权利要求66、72和98所述的方法，其中将所述植入前期胚胎与生物能剂一起孵育，所述生物能剂选自：色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、具有式I-XV中任一者的化合物、CD38抑制剂及其功能衍生物。
101.组合物，其包含分离的细胞和生物能剂，所述分离的细胞选自卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC的后代，所述组合物用于体外受精。
102.相对于参比具有增强的线粒体功能的分离的细胞，其中所述细胞选自卵母细胞、卵原干细胞(OSC)或OSC的后代，其中所述细胞已经与生物能剂接触，所述分离的细胞用于体外受精。
103.生物能剂，其选自色氨酸、喹啉酸、烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖核苷、烟酸、漆树黄酮、槲皮素、白藜芦醇、DOI、羟基酪醇、吡咯并喹啉醌、二甲双胍、芹菜素、木犀草素、酪氨酸磷酸化抑制剂8、小檗碱、CD38抑制剂、具有式I-XV中任一者的化合物及其功能衍生物，所述生物能剂用于以下项组成的组中的一项或更多项：改善雌性的受精能力、维持怀孕雌性中的胚胎发育、恢复或增加雌性中的卵巢功能、从雌性制备用于收获的组织或其细胞以及制备卵母细胞。
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