CN108642001B - 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 - Google Patents

一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力方面的用途，并提出了添加花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液。本发明在牛性控冻精解冻、获能过程中，向洗精液和受精液中分别都加入花青素和吡咯喹啉醌，来处理牛性控冻精，而后进行体外受精。结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。

Description

一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法
技术领域
本发明涉及人工体外受精领域，具体涉及一种提高性控冻精体外受精能力的方法。
背景技术
在养殖业中，性别控制技术能够使人们获得预期性别的后代，进而提高养殖业效益和育种进度，因此该技术具有十分重要的意义。Johnson等在1989 年开发的精子流式细胞仪分离技术，已经被成功用于奶牛X、Y精子的分离。目前，在奶牛人工授精过程中采用性控冻精，可控制母牛出生率在90％以上(Mikkola M,Andersson M,Taponen J.Transfer ofcattle embryos produced with sex-sorted semen results in impaired pregnancyrate and increased male calf mortality[J].Theriogenology,2015,84(7):1118-22.)。然而，青年牛采用奶牛性控冻精人工授精后受胎率约为40％，远低于常规冻精(70％左右)(郝海生, 赵明礼,朱化彬等.性控冷冻精液人工授精对青年奶牛繁殖性能的影响[J]. 畜牧与兽医,2016,48(8):52-54.)。同时，奶牛性控冻精用于体外受精时，卵裂率通常为40％、囊胚率为10％左右，而常规冻精体外受精后卵裂率通常在80％、30％以上(Zhao XM,Ren J J,Zhao S J,et al.Apoptosis-like events and in vitro fertilizationcapacity of sex-sorted bovine sperm[J].Reprod Domest Anim,2014,49(4):543-549.)。
研究表明，在性控精子分离过程中，需要经过稀释、染色、激光照射、冷冻等步骤，导致性控精子受精能力降低。因此，如何提高性控冻精活力和受精能力，已经成为该领域的研究热点。
发明内容
本发明针对现有技术中性控冻精受精能力降低的问题，提供一种在性控冻精解冻、获能过程中的保护措施，以保护性冻精免受ROS的影响，进而提高牛性控冻精活力和体外受精的方法。本发明的一个目的是提供花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力的用途。
本发明的另一个目的是提供一种受精液，该受精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
本发明的另一个目的是提供一种洗精液，该洗精精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
最后，本发明还提供一种利用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的方法。
具体的说，本发明所述的性控冻精是牛性控冻精。
进一步的，本发明所述的洗精液可采用本领域常用的各种洗精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；
优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
进一步优选的，所述洗精液是BO液+3.38mg/mL咖啡因，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌。
更进一步优选的，所述洗精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
另外，本发明所述的受精液可采用本领域常用的各种受精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中，花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；
优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
进一步优选的，所述受精液为：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mL BSA，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌；
更进一步优选的，所述受精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
本发明还提供一种提高性控冻精体外受精能力的方法，特别的，该方法包括将性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理的步骤。
具体的说，本发明所述的方法，包括如下步骤：
(1)取性控冻精，解冻；
(2)将步骤(1)中的解冻的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液洗涤；
(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的受精液处理后备用。
其中，步骤(2)中洗涤次数为2次。
其中，步骤(3)中的处理时间为1.5小时。
一般来说，所述处理是将性控冻精放置在所需溶液中静置即可。
牛性控精液采用洗精洗涤2次，进而在受精液中获能1.5小时，而后进行体外受精。
应用结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
1.基础液体配制
(1)卵母细胞洗涤液
3.58g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)+10％TCM199(10×)+0.22g/L 丙酮酸钠+10mg/L肝素+0.168g/L NaHCO3+20mL/L FBS+146mg/L谷氨酰胺。
(2)卵母细胞体外成熟液
TCM199(1×)+0.01IU/mL FSH+10μg/mL肝素钠+40ng/mL IGF+ 50ng/mL EGF+0.01IU/mL LH+1μg/mL E2+10％FBS。
(3)体外受精液
参照Brackett和Oliphant(1975)描述的方法进行配制。
基础液(BO液)：0.3mg/mL KCl+6.55mg/mL NaCl+0.33mg/mL CaCl2·2H2O+106mg/mL MgCl2·6H2O+99μg/mLNaH2PO4+3.10mg/mL NaHCO3+2.5mg/mL葡萄糖+138μg/mL丙酮酸钠+3mg/mL BSA。
洗精液：BO液+3.38mg/mL咖啡因。
受精液：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mL BSA。
用0.22μm滤膜对配好的洗精液和受精液进行过滤灭菌后，4℃冰箱保存。
2.精液处理
冻精从液氮中取出后，快速运动使其表面液氮挥发完毕，而后投入37℃温水中解冻。精液先用洗精液1800r/min离心洗涤2次，每次5min。弃掉上清后，精子沉淀再加入受精液重悬，调整精子密度5×106个/mL。吸取20μL 精液放入提前预热的80μL受精中。放入恒温培养箱孵育1.5h后用于后续检测。
3.精子ROS水平分析
精子采用10μmol/L 1μL DCFH-DA避光孵育20min，1500r/min离心洗涤5min后，加入100μL PBS重悬沉淀。吸取部分精子悬浮液，压片后置于荧光显微镜下照相。采用图像分析软件Image J分析精子头部ROS水平。
4.精子凋亡检测
按照Annexin V-FITC/PI试剂盒(Roche公司，瑞士)说明书方法检测精子 PS外翻。先取处理好的精液，1500r/min离心3min，弃上清，FITC结合液重悬，调整精液密度为2.5×105个/mL。将精液分4组试验：(1)对照组：200μL FITC 结合液重悬精液，不染色；(2)Annexin V-FITC单染组：取195μL结合液重悬的精液，加入5μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育 10min；(3)PI单染组：190μL结合液重悬精液，加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；(4)Annexin V-FITC/PI双染组：精液按照Annexin V-FITC 单染组处理后，1500r/min离心3min，弃上清，加入190μL结合液重悬精液，按照PI单染组方法处理精子。根据染色结果，按以下方法将精子进行分类： (1)未凋亡精子(AN-/PI-)，(2)早期凋亡精子(AN+/PI)，(3)早期坏死精子(AN+/PI+)，(4)坏死精子(AN-/PI+)。
5.精子MDA含量测定
精子MDA含量测定试剂盒购买自南京建成生物工程研究所，操作步骤按说明书进行。操作步骤为，精液加入试剂盒中试剂1，混匀后加入3ml试剂盒中试剂2、1ml试剂盒中试剂3。混合物混匀后，采用沸水浴反应40min，随后取出流水冷却，4 000r/min离心洗涤10min。而后，取上清利用分光光度计在532nm处，1cm光径，双蒸水调零后，通过测定各管吸光度值计算MDA 含量。
6.精子顶体完成性分析
精子采用2mg/mL FITC-PNA避光孵育10min，而后采用1mg/mL PI避光孵育5min，随后1 500r/min离心5min，洗去多余染料。精子沉淀采用PBS重悬压片后，置于荧光显微镜下检测精子顶体完整性。根据染色结果，将精子分为四类：顶体完整的活精子(PI-/PNA-)、顶体不完整的活精子(PI-/PNA+)、顶体完整的死精子(PI+/PNA-)、顶体不完整的死精子(PI+/PNA+)。
7.精子获能检测
精子采用75nM YoPro-1和2μM M540在38.5℃、避光条件下染色 15min，而后1500r/min离心5min，洗去多余染料。离心后的精子采用PBS 重悬压片后，置于荧光显微镜下观察。根据染色结果，将精子分为四类：未获能的活精子(YoPro-1-/M540-)、获能的活精子(YoPro-1-/M540+)、未获能的死精子(YoPro-1+/M540-)、获能的死精子(YoPro-1+/M540+)。
8.卵母细胞采集和体外成熟
从屠宰场获取的卵巢反复洗净后，采用真空泵吸取卵巢表面直径为2～8 mm的卵丘卵母细胞复合体(COCs)。抽卵液充分沉积后，在显微镜下将含有3层或以上卵丘细胞的COCs捡出。COCs在卵母细胞成熟培养液中洗2遍后，移入含有成熟液的4孔板中(750μL/孔，每孔50枚COCs)、在38.5℃、5％CO2 和100％湿度的CO2培养箱中培养。体外成熟22～24h后，将COCs放入0.1％的透明质酸酶中消化1～2min脱除卵丘细胞。最后，挑选出具有第一极体和胞质均匀的卵母细胞用于体外受精实验。
9.体外受精
按步骤2精液处理中描述的方法解冻精子，并调整精子浓度至5×106个/ ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液中，在38.5℃、 5％CO2条件下进行体外受精。受精18～20h后，置于CR1aa中培养，培养 48h后更换培养液(CR1aa+10％FBS)，统计卵裂率。体外培养7d后，获得体外受精囊胚，统计囊胚率。
10.数据统计
采用SAS软件对实验数据进行分析，百分数比较时经反正旋转化后采用方差分析，结果以平均数依标准差表示，P<0.05为差异显著性标准。各处理组至少重复3次以上。
实施例1抗氧化处理对牛性控冻精ROS水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精ROS水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精ROS水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表1所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，处理组性控精液ROS水平均显著低于未处理组性控精液，但均显著高于同头公牛未分离冻精。
如表2所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，处理组性控精液ROS水平均显著低于未处理组性控精液(P<0.05)，但均显著高于同头公牛未分离冻精。
如表3所示，10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精 ROS水平显著低于未处理组，也显著低于同头公牛未分离冻精(P<0.05)。 10-3M花青素处理组、500μM吡咯喹啉醌处理组ROS水平，显著低于未处理组(P<0.05)，但显著高于同头公牛未处理冻精。
表1花青素对性控冻精ROS水平的影响
Figure BDA0001654153980000071
a,b,c,d,e同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)，下表同。
表2吡咯喹啉醌对性控冻精ROS水平的影响
Figure BDA0001654153980000072
Figure BDA0001654153980000081
表3花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精ROS水平的影响
Figure BDA0001654153980000082
实施例2抗氧化处理对牛性控冻精凋亡水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精凋亡水平水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精凋亡水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表4所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组性控精液未凋亡精子比例(68.00±6.14％)比例显著高于未处理组性控精液(57.89±5.61％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(71.83± 6.82％)。同时，10-3M花青素处理组性控精液早期凋亡精子比例(18.86± 1.63％)比例显著低于未处理组性控精液(30.28±2.95％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(17.61％±1.64％)。
如表5所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液未凋亡精子比例(69.43±6.41％)比例显著高于未处理组性控精液(58.33±5.32％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(72.88±7.05％)。同时，500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液早期凋亡精子比例(20.38±1.82％)比例显著低于未处理组性控精液(29.55±2.42％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(18.64±1.81％)。
如表6所示，10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精未凋亡精子比例(85.11±7.32％)显著高于未处理组(59.56±5.14％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(73.64±7.32％)、10-3M花青素处理组 (67.31±5.63％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(68.91±5.49％)。同时， 10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液早期凋亡精子(8.51±7.41％)比例显著低于未处理组性控精液(30.15±2.85％)，也显著低于同头公牛未分离冻精(19.38±1.62％)、10-3M花青素处理组(17.31±1.48％)、 500μM吡咯喹啉醌处理组(19.10±1.85％)。
表4花青素对性控冻精早期凋亡水平的影响
Figure BDA0001654153980000091
a,b,c,d,e同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)，下表同。
表5吡咯喹啉醌对性控冻精ROS水平的影响
Figure BDA0001654153980000092
Figure BDA0001654153980000101
表6花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精ROS水平的影响
Figure BDA0001654153980000102
实施例3抗氧化处理对牛性控冻精MDA水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌对牛性控冻精MDA水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精MDA水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表7所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M和10-5M 花青素处理组MDA水平(11.44±1.01nmol/mL、9.41±0.65nmol/mL)均显著低于未处理组性控精液(14.25±1.32nmol/mL)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(5.88±0.43nmol/mL)。
如表8所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM、 50μM吡咯喹啉醌处理组MDA水平(12.60±1.01nmol/mL、8.46±0.68 nmol/mL)均显著低于未处理组性控精液(15.93±1.42nmol/mL)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(5.45±0.51nmol/mL)。
如表9所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精 MDA水平(2.71±0.21nmol/mL)显著低于未处理组(15.19±1.49nmol/mL)，也显著低于同头公牛未分离冻精(5.00±0.42nmol/mL)、10-3M花青素处理组(11.87±1.75nmol/mL)、500μM吡咯喹啉醌处理组MDA水平(12.45 ±1.21nmol/mL)。
表7花青素对性控冻精MDA水平的影响
Figure BDA0001654153980000111
表8吡咯喹啉醌对性控冻精MDA水平的影响
Figure BDA0001654153980000112
表9花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度联合处理对性控冻精MDA水平的影响
Figure BDA0001654153980000113
Figure BDA0001654153980000121
实施例4抗氧化处理对牛性控冻精顶体完整性的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精顶体完整性的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精顶体完整性的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表10所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组活精子顶体完整率(50.00±4.38％)均显著高于未处理组性控精液 (40.00±4.06％)，但均显著低于同头公牛未分离冻精(61.76±6.03％)。
如表11所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM吡咯喹啉醌处理组活精子顶体完整率(53.66±4.24％)显著低于未处理组性控精液(43.59±3.84％)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(63.83±6.17％)。
如表12所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组活精子顶体完整率(76.74±6.41％)显著高于未处理组(44.44±4.15％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(65.85±5.86％)、10-3M花青素处理组(55.26± 4.64％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(53.33±5.28％)。
表10花青素对性控冻精顶体完整性的影响
Figure BDA0001654153980000122
Figure BDA0001654153980000131
表11吡咯喹啉醌对性控冻精顶体完整性的影响
Figure BDA0001654153980000132
表12花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精顶体完整性的影响
Figure BDA0001654153980000133
实施例5抗氧化处理对牛性控冻精获能的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精获能的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精获能的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表13所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组获能活精子比例(52.11±5.03％)均显著高于未处理组性控精液 (41.67±3.95％)，但均显著低于同头公牛未分离冻精(64.06±5.39％)。
如表14所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加500μM吡咯喹啉醌处理组获能活精子比例(53.70±5.31％)显著低于未处理组性控精液(42.31± 3.74％)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(62.00±5.61％)。
如表15所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组获能活精子比例(75.95±7.15％)显著高于未处理组(42.11±4.03％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(63.51±6.12％)、10-3M花青素处理组(54.17±5.03％)、 500μM吡咯喹啉醌处理组(52.94±4.74％)。
表13花青素对性控冻精获能的影响
Figure BDA0001654153980000141
表14吡咯喹啉醌对性控冻精获能的影响
Figure BDA0001654153980000142
Figure BDA0001654153980000151
表15花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度联合处理对性控冻精获能的影响
Figure BDA0001654153980000152
实施例6抗氧化处理对牛性控冻精体外受精效率的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M) 或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精体外受精效率的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精体外受精效率的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表16所示，在性控冻精洗精液、受精液中10-3M花青素，性控冻精 IVF卵裂率、囊胚率(65.28±5.76％，25.53±2.43％)显著高于未处理组(52.56 ±4.98％，17.07±1.58％；P<0.05)，但显著低于同头公牛未分离冻精(75.71 ±7.13％，32.08±3.08％；P<0.05)。
如表17所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加500μM吡咯喹啉醌性控冻精IVF卵裂率、囊胚率(63.53±5.65％，25.93±2.08％)显著高于未处理组(54.95±4.98％，16.00±1.38％；P<0.05)，但显著低于同头公牛未分离冻精(74.42±7.15％，34.38±3.15％；P<0.05)。
如表18所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组的性控冻精IVF卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数(89.27±7.64％，45.06±3.52％，110.36 ±10.53)显著高于未处理组(55.12±5.48％，15.24±1.59％，83.65±7.59； P<0.05)，也显著高于同头公牛未分离冻精(75.62±6.18％，32.24±3.12％， 98.87±8.52；P<0.05)、10-3M花青素组卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数(64.71 ±5.91％，24.24±2.43％，95.71±8.13)、500μM吡咯喹啉醌组(64.14±5.78％， 23.03±2.18％，96.76±9.17)。
表16花青素对性控冻精体外受精能力的影响
Figure BDA0001654153980000161
表17吡咯喹啉醌对性控冻精体外受精能力的影响
Figure BDA0001654153980000162
表18花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精体外受精能力的影响
Figure BDA0001654153980000163
Figure BDA0001654153980000171
上述研究结果表明，在性控冻精洗精液、受精液中添加10-3M花青素和 500μM吡咯喹啉醌，能够显著降低牛性控冻精ROS水平、MDA水平，进而提高其顶体完整率和获能水平，最终显著提高其体外受精后的卵裂率和囊胚率以及囊胚细胞数，且显著高于同头公牛未分离冻精的效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.花青素和吡咯喹啉醌在处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的用途，其是非治疗目的的体外受精，其特征在于，所述性控冻精是牛性控冻精。
2.一种受精液，其特征在于，所述受精液的溶液中含有花青素和吡咯喹啉醌；所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM。
3.如权利要求2所述的受精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为 500μM。
4.一种洗精液，其特征在于，所述洗精液的溶液中含有花青素和吡咯喹啉醌；所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM。
5.如权利要求4所述的洗精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为 500μM。
6.一种提高性控冻精体外受精能力的方法，其是非治疗目的的体外受精，其特征在于，包括将性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取性控冻精，解冻；
(2)将步骤(1)中的解冻的性控冻精采用权利要求4或5所述的洗精液洗涤；
(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的性控冻精采用权利要求2或3所述的受精液处理后备用。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中洗涤次数为2次。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的处理时间为1.5小时。
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