CN111280163B - 牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途，具体的，本发明的抽卵液包含：丙酮酸钠15～25mg、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸300～400mg、TCM199为5～15mL、L‑谷氨酰胺10～20mg、碳酸氢钠10～20mg、肝素0.5～1.5mg、青霉素5～7mg、链霉素10～15mg、胎牛血清1～3mL、水适量至100mL。本发明还涉及抽卵液在用于牛活体取卵的试剂中的用途。进一步的，本发明还涉及处理牛活体取卵采集的卵泡的方法，该方法包括使通过牛活体取卵采集的卵泡与本发明抽卵液混合的操作。本发明采卵回收液即抽卵液具有优异的生物学效果，例如有助于维持卵丘卵母细胞复合体(COCs)的生物学结构特征，这对于提高牛活体采卵的工作效率具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域涉及一种活体采卵的方法，尤其是涉及一种用于牛活体采卵的采卵回收液，该采卵回收液亦称为抽卵液，本发明还涉及该等采卵回收液在牛活体采卵中的用途。本发明采卵回收液具有优异的生物学效果，例如有助于维持卵丘卵母细胞复合体(COCs)的生物学结构特征，这对于提高牛活体采卵的工作效率具有重要意义。
背景技术
胚胎培养技术对于家畜的繁殖潜力挖掘、快速扩繁以及种质资源保护具有重要的价值。影响胚胎体外培养和体外胚胎保存的因素有很多，其中卵母细胞体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养以及胚胎冷冻是体外胚胎生产过程中的四个个主要环节。
牛活体取卵(OPU)是继体外受精(IVF)和胚移植(ET)之后的用于牛胚胎实验操作和生产繁殖的一项非常实用的胚胎工程技术。在20世纪80年代报道在B超监视下施行牛活体取卵操作以来，这项技术已被广泛用于牛胚胎体外生产。牛活体取卵这项技术具有应用广泛、操作便利、高效和可重复性以及损伤小等优点。通过联合应用牛活体取卵和体外受精这两种技术，可充分提高良种牛的繁殖潜力和大量生产高质量的胚胎。
牛活体取卵为体外生产高品质牛胚胎提供了一个有价值的方法。随着牛基因组测序的完成，以及新的数量性状位点的绘制，通过牛活体取卵回收具有清晰遗传背景的卵母细胞，将为在分子水平上研究牛胚胎发育提供宝贵的实验材料，并最终为生产优质牛胚胎产生显著的经济和实用价值。
体外受精(In Vitro Fertilization)或(external fertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。
随着现代农业科技的发展，为了更充分利用良种母牛的繁殖潜力，加速遗传育种进程，在生产实践中应用高效的繁殖新技术成为必然。活体采卵(Ovum pick UP，OPU)和体外受精技术(In Vitro Fertilization，IVF)是二十世纪八十年代快速发展起来的胚胎工程新技术，二者相结合可获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而缩短世代间隔。目前，这两种技术已经成为欧美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群而采用的重要繁殖技术。然而，采用常规的牛胚胎培养体系(CR1aa和SOF液)，牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。
早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术。但直到1951年，美籍华人张民觉和Austin分别发现精子体外获能现象后，体外受精技术才获得了突破性进展。牛体外受精技术受到卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、受精卵的体外培养环境等多个方面的影响。
胚胎的体外培养是IVF技术的一个关键环节，亦是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。基于Rosenkrans等(Rosenkrans，C.F.，Jr.and N.L.First，Effect of freeamino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotesin vitro.J Anim Sci，1994.72(2):p.434-7)开发的Charles Rosenkrans 1(CR1)培养液和Tervit等(Tervit，H.R.，D.G.Whittingham，and L.E.Rowson,Successful culture invitro of sheep and cattle ova.J Reprod Fertil,1972.30(3):p.493-7)开发的合成输卵管液(Synthetic Oviductal Fluid，SOF)，经多年不断改进逐步形成了两种培养体系。据Hakan Sagirkaya等(Sagirkaya,H.,et al.,Developmental potential of bovineoocytes cultured in different maturation and culture conditions.Anim ReprodSci,2007.101(3-4):p.225-40)和Somfai等(Somfai,T.,et al.,Development of bovineembryos cultured in CR1aa and IVD101media using different oxygen tensions andculture systems.Acta Vet Hung,2010.58(4):p.465-74)研究成果表明，CR1aa培养液用于牛胚胎培养有较好的效果，可以广泛应用于牛的胚胎培养；Thompson,J.G.等(Thompson,J.G.,et al.,Effect of inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylationduring compaction and blastulation of bovine embryos cultured in vitro.JReprod Fertil,2000.118(1):p.47-55)和Jean M.Feugang等(Feugang,J.M.,O.Camargo-Rodriguez,and E.Memili,Culture systems for bovine embryos.Livestock Science,2009.121(2-3):p.141-149)的研究结果显示，SOF培养液也是一种适合于牛胚胎培养的培养体系。张志平等(张志平,安志兴,张锈,张涌,牛胚胎培养体系的优化.西北农林科技大学学报,2006.34)和桑国俊等(桑国俊,牛卵母细胞及体外胚培养技术研究.2008)研究结果也显示，经过优化的CR1aa和SOF培养液均适合于牛的体外胚胎培养，均取得良好的培养效果。哺乳动物早期胚胎发育是一个高度协调且精确调节的过程。在进化过程中，配子细胞逐步形成了一系列的分子级联网络，以保证胚胎发育周期系统地进行。在发育过程中，胚胎的内外活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)与抗氧化剂的平衡对早期胚胎发育起着决定性作用。
大多生化反应均产生ROS，其在细胞内、外均有着重要的作用，一部分ROS起着信号分子的作用，但是大多数ROS对机体是有害的。Brooker,R.J.等(Brooker,R.J.,Genetics:analysis and principles(4th ed.).McGraw-Hill Science,2011)报道，ROS可以引起细胞DNA损伤、不饱和脂肪酸的氧化、蛋白质中氨基酸的氧化甚至可以导致某些酶的失活。一般来说，ROS以四种形式存在，其中H2O2氧化作用较强，是引起氧化伤害的最主要因素。
牛活体取卵的一项重要工具是源于人类临床上常用的B超原理设计的兽用B超诊断仪。B超诊断对提高畜牧业的管理水平，促进畜牧业经济发展有重要的意义。使用兽用B超诊断技术来评价水牛繁殖力，可使我们在发情周期和怀孕中了解和认识水牛卵巢与子宫的状态，更好地提高繁殖性能和推进动物遗传进程。
在采用B超诊断仪时，需要使用抽卵液冲洗采卵针及连接胶管并使抽取的卵泡液与抽卵液混合后，进行后续的实验室检卵、分级等操作，然而，由于每取一次卵到取下一次卵、对一头牛取卵到对下一头年取卵，直至完全更多数量的取卵，通常需要较长时间，这就造成，先取的卵与后取的卵在后续统一进行检卵等操作前会有不同的放置时间，卵泡在抽卵液中等待的时长不同会通常会影响活体取卵的效果和效率。
目前常用的抽卵液是以磷酸盐缓冲液或者TCM199液作为基础液添加肝素配制而成。例如，一种典型的抽卵液配方如下：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL。然而已经发现类似上述的抽卵液仍然存在技术上的不足。
因此，提供一种抽卵液使得卵泡在其中存放不同时间后仍然保持不变的生物学状态，仍是本领域技术人员迫切期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抽卵液，期待从牛活体取卵采集的卵泡在此抽卵液中存在足够长的时间后仍然保持不变的生物学状态。本发明人出人意料地发现，采用本发明的抽卵液，可以在显著更长的时间内使存在于该抽卵液中的卵泡保持不变的生物学状态。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种抽卵液，其是用作牛活体采卵的采卵回收液，因此在本文中亦可称为采卵回收液，其包含：丙酮酸钠15～25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸300～400mg、TCM199为5～15mL、L-谷氨酰胺10～20mg、碳酸氢钠10～20mg、肝素0.5～1.5mg、青霉素5～7mg、链霉素10～15mg、胎牛血清1～3mL、水适量至100mL。
根据本发明第一方面的抽卵液，其中包含：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL。
根据本发明第一方面的抽卵液，其中还含有牛磺酸。在一个实施方案中，牛磺酸的浓度为20～30mg/L，例如25mg/L。
根据本发明第一方面的抽卵液，其中还含有乳酸锌。在一个实施方案中，乳酸锌的浓度为0.5～1.5mg/L，例如1mg/L。
已经出人意料地发现，当使抽取的卵泡悬置于本发明包含牛磺酸和乳酸锌二者的抽卵液中时，卵丘卵母细胞复合体(COCs)的卵丘细胞层数和胞质均匀性能够较长时间地保持稳定；而在不包含上述两种试剂中的悬置时，时间一旦较长的话卵丘细胞层数会明显的减少，胞质均匀性会降低。
根据本发明第一方面的抽卵液，其是用于牛活体取卵的抽卵液。
根据本发明第一方面的抽卵液，其是用于包括但不限于下列的牛的活体取卵的抽卵液：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。
根据本发明第一方面的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL。
进一步的，本发明第二方面提供了处理牛活体取卵采集的卵泡的方法，该方法包括使通过牛活体取卵采集的卵泡与抽卵液混合的操作。
根据本发明第二方面的方法，其中所述抽卵液包含：丙酮酸钠15～25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸300～400mg、TCM199为5～15mL、L-谷氨酰胺10～20mg、碳酸氢钠10～20mg、肝素0.5～1.5mg、青霉素5～7mg、链霉素10～15mg、胎牛血清1～3mL、水适量至100mL。
根据本发明第二方面的方法，其中所述抽卵液包含：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL。
根据本发明第二方面的方法，其中所述抽卵液中还含有牛磺酸。在一个实施方案中，牛磺酸的浓度为20～30mg/L，例如25mg/L。
根据本发明第二方面的方法，其中所述抽卵液中含有乳酸锌。在一个实施方案中，乳酸锌的浓度为1～2mg/L，例如1.5mg/L。
根据本发明第二方面的方法，其中所述的牛包括但不限于下列的牛：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。
根据本发明第二方面的方法，其中所述抽卵液，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL。
进一步的，本发明第三方面提供了抽卵液在用于牛活体取卵的试剂中的用途。在一个实施方案中，牛活体取卵采集卵泡时，包括使通过牛活体取卵采集的卵泡与抽卵液混合的操作。
根据本发明第三方面的用途，其中所述抽卵液包含：丙酮酸钠15～25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸300～400mg、TCM199为5～15mL、L-谷氨酰胺10～20mg、碳酸氢钠10～20mg、肝素0.5～1.5mg、青霉素5～7mg、链霉素10～15mg、胎牛血清1～3mL、水适量至100mL。
根据本发明第三方面的用途，其中所述抽卵液包含：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL。
根据本发明第三方面的用途，其中所述抽卵液中还含有牛磺酸。在一个实施方案中，牛磺酸的浓度为20～30mg/L，例如25mg/L。
根据本发明第三方面的用途，其中所述抽卵液中含有乳酸锌。在一个实施方案中，乳酸锌的浓度为1～2mg/L，例如1.5mg/L。
根据本发明第三方面的用途，其中所述的牛包括但不限于下列的牛：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。
根据本发明第三方面的用途，其中所述抽卵液，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL；或者，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明使用的胎牛血清可以容易的从市场购得其标准化商品形式，例如可以从各种代理商处购得Gibco公司的澳洲胎牛血清(货号：10099141)、新西兰胎牛血清(货号：10091148)、北美胎牛血清(货号：16000044)、墨西哥胎牛血清(货号：10437028)等，这些商品化胎牛血清的价格500ml大多在8000元以上，用于本发明牛体外受精胚胎培养液中时胎牛血清是成本主要贡献者。在本发明上下文的试验中，如未特别说明，所用的胎牛血清是Gibco公司的澳洲胎牛血清(货号：10099141)。本发明使用的商品试剂TCM199可以容易的从市售购得。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1、卵母细胞的活体采集和方法
经直肠检查卵巢机能正常的4～8岁母牛作为活体采卵的试验用牛。
采卵设备包括：日本富士平公司生产的HS2000B型超声波显像仪，阿洛卡阴道扇形扫描探头，60cm长采卵针，抽吸负压器和卵泡液收集管恒温装置以及胚胎过滤杯等。
抽卵液的配方组成在具体实例中列出，它们通过过滤的方法除菌。
卵母细胞的采集：按胚胎移植操作规程对供试牛进行保定，清除直肠粪便，清洗、消毒后躯和外阴部。与此同时，将B型超声波仪展开放于操作现场。把预先分装好的抽卵液(每头母牛40ml)和1个50ml卵泡液收集管放入38℃恒温装置中，将采卵针及连接胶管从消毒包中取出，采卵针安放于探头上的卡槽内，胶管的另一端连接收集管，然后用75％酒精擦拭待用。操作者左手伸入直肠固定右侧卵巢，将安装有采卵针的探头缓慢插入阴道，直抵阴道穹窿，把探头放在穹窿的右侧，左手将卵巢牵引紧贴在探头前端，这时B型超声波仪的监视器上显示出卵巢图像，前后左右翻转卵巢，确定卵泡数，调整卵巢和探头位置，使卵泡位于穿刺导引线上，操作者向前推动探头上的采卵针穿刺卵泡，同时用脚踏开关启动真空泵，一般采用40～50mm汞柱压力，从监视器上可观察到被抽吸卵泡的图像缩小，形态变得不规则，直至卵泡液被抽取干净后，卵泡图像消失，退出采卵针，再对第2个卵泡进行穿刺，周而复始，直到该侧卵巢上2mm以上卵泡全部穿刺完后，再换另一侧卵巢用同样方法进行卵泡穿刺抽吸卵泡液。在抽吸卵泡过程中，每抽吸1～2个卵泡，用抽卵液冲洗1次采卵针及连接胶管，防止血液凝固在其中，影响继续穿刺和回收的卵母细胞。最后将卵泡液收集管(卵泡混悬于卵泡液和抽卵液的混合液中，卵泡液和抽卵液的体积比约为1：8.5)在规定时间内送入实验室进行检卵和分级。
卵母细胞的检查：在实验室将卵泡液收集管中的液体倒入过滤杯，用30～35℃的洗卵液(配方参见后续所引用的操作实施例)冲洗收集管2次，也倒入过滤杯。遇到收集管中的卵泡液混入血液时，用洗卵液稀释直至清澈为止，然后将液体从杯壁的过滤网流出，留下10～15ml，用HEPES成熟培养液(配方参见后续所引用的操作实施例)洗涤2次后，在体视镜下检查卵母细胞，进行分级。
卵母细胞分级：根据检查的卵丘卵母细胞复合体(COCs)的卵丘细胞层数分为A、B两级，其中A级的卵丘细胞层数为3层及3层以上(它们通常胞质均匀)；B级：卵丘细胞层数为2层或小于2层(它们通常胞质均匀性差)；A级为可用卵母细胞用于培养。对于一个卵泡液收集管中的样品，以上述检查方法计算30个卵母细胞的卵丘细胞加和层数，该卵丘细胞加和层数可以作为该卵泡液收集管样品的卵母细胞典型状态。
实施例2、使用抽卵液处置采集的卵母细胞
抽卵液配方：
配方1：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、水适量至100mL；
配方2：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、水适量至100mL；
配方3：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、水适量至100mL；
配方4：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、水适量至100mL；
配方5：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、水适量至100mL；
配方6：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL；
配方7：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL；
配方8：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL；
配方9：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL；
配方10：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL；
配方11：分别参照配方6～10，不同的仅是不添加牛磺酸，得到5个配方；
配方12：分别参照配方6～10，不同的仅是不添加乳酸锌，得到5个配方。
根据实施例1的方法，分别使用实施例1～实施例12的抽卵液配方进行中国黄牛卵母细胞采集-检查-分级，各卵泡液收集管在进行检卵和分级前，分别于28℃温度处放置0小时、2小时、4小时、8小时，对于采用某一抽卵液进行的卵母细胞采集-检查-分级试验于28℃放置不同时间后获得的卵丘细胞加和层数的数据，以其0小时为100％，计算2h、4h、8h的卵丘细胞加和层数的相对百分数，例如某抽卵液所得4h时的相对百分数，是4h卵丘细胞加和层数除以0h卵丘细胞加和层数所得商值再乘以100％所得的百分数。
用各种配方抽卵液于各时间点卵丘细胞加和层数的相对百分数的结果：配方1～5和配方11～12抽卵液的2h相对百分数＝89～93％，例如配方1＝90.4％，例如配方11＝92.4％；配方1～5和配方11～12抽卵液的4h相对百分数＝84～87％，例如配方1＝85.6％，例如配方11＝84.3％；配方1～5和配方11～12抽卵液的8h相对百分数＝41～52％，例如配方1＝48.7％，例如配方11＝51.3％；配方6～10抽卵液的2h相对百分数＝97～98％，例如配方6＝97.7％；配方6～10抽卵液的4h相对百分数＝95～97％，例如配方6＝95.9％；配方6～10抽卵液的8h相对百分数＝93～95％，例如配方6＝94.8％。
根据上述结果可见，卵丘卵母细胞复合体存在于配方6～10抽卵液中，能够在显著更长时间内维持结构的完整性，即具有显著更稳定的生物学结构特征，而在未同时添加两种试剂的抽卵液中时卵丘卵母细胞复合体生物学结构在4小时后即发生较大变化，这对于采卵和分检工作带来困难，因为从采集到分检这个过程对于不同的采卵操作会存在不同的时间间隔，配方6～10抽卵液能够有利的维持这种不同时间间隔操作的一致性，尤其是对于OPU生产环节，从第一头采集的牛到最后一头采集的牛会历时一段时间，将使先采集到的卵母细胞与相隔较长时间后采集到的卵母细胞一起进行后续分检分级这将具有非常积极意义。
补充试验21：参照上述实施例2的方法，但是改用荷斯坦牛，用各种配方抽卵液于各时间点卵丘细胞加和层数的相对百分数的结果：配方1～5和配方11～12抽卵液的2h相对百分数＝91～94％，例如配方1＝92.2％，例如配方11＝91.6％；配方1～5和配方11～12抽卵液的4h相对百分数＝82～86％，例如配方1＝84.3％，例如配方11＝83.8％；配方1～5和配方11～12抽卵液的8h相对百分数＝43～51％，例如配方1＝46.7％，例如配方11＝49.6％；配方6～10抽卵液的2h相对百分数＝98～99％，例如配方6＝98.3％；配方6～10抽卵液的4h相对百分数＝95～98％，例如配方6＝96.4％；配方6～10抽卵液的8h相对百分数＝93～95％，例如配方6＝94.4％。
补充试验22：参照上述实施例2的方法，但是改用西门塔尔牛，用各种配方抽卵液于各时间点卵丘细胞加和层数的相对百分数的结果：配方1～5和配方11～12抽卵液的2h相对百分数＝90～92％，例如配方1＝91.1％，例如配方11＝90.8％；配方1～5和配方11～12抽卵液的4h相对百分数＝79～84％，例如配方1＝82.7％，例如配方11＝81.3％；配方1～5和配方11～12抽卵液的8h相对百分数＝38～49％，例如配方1＝44.2％，例如配方11＝43.7％；配方6～10抽卵液的2h相对百分数＝96～98％，例如配方6＝97.3％；配方6～10抽卵液的4h相对百分数＝93～96％，例如配方6＝94.5％；配方6～10抽卵液的8h相对百分数＝90～93％，例如配方6＝92.7％。
补充试验23：参照上述实施例2的方法，但是改用中国水牛，用各种配方抽卵液于各时间点卵丘细胞加和层数的相对百分数的结果：配方1～5和配方11～12抽卵液的2h相对百分数＝92～95％，例如配方1＝94.0％，例如配方11＝93.6％；配方1～5和配方11～12抽卵液的4h相对百分数＝80～84％，例如配方1＝82.3％，例如配方11＝83.1％；配方1～5和配方11～12抽卵液的8h相对百分数＝41～49％，例如配方1＝46.6％，例如配方11＝47.4％；配方6～10抽卵液的2h相对百分数＝96～99％，例如配方6＝97.1％；配方6～10抽卵液的4h相对百分数＝94～96％，例如配方6＝95.7％；配方6～10抽卵液的8h相对百分数＝91～94％，例如配方6＝92.8％。
实施例3：活体采集牛卵母细胞体外受精胚胎的培养方法
参考本发明人研究团队的中国专利申请号2018105768063之实施例4进行试验。
一、试剂
本实施例中，如未另外说明，使用的相关试剂详述如下：
加双抗生理盐水：包含青霉素400IU/mL、链霉素400μg/mL的生理盐水。
洗卵液：添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液。
成熟培养液：添加了100mL/L FBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL E2、20ng/mLEGF的BY基础培养液。
HEPES成熟培养液：添加了15mmol/L HEPES、100mL/L FBS、10μg/mL FSH、10μg/mLLH、1μg/mL E2、20ng/mL EGF的BY基础培养液。
其中，EGF——表皮生长因子，FSH——卵泡刺激素，FBS——胎牛血清，E2——雌二醇，LH——促黄体生成素。
受精培养液：包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。
精液制备培养液：包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。
胚胎培养液：包含：109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、10v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v％、麦芽糖0.02w/v％的水溶液；所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g，所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g。
BY基础培养液是包含如下组分的水溶液：氯化钙200mg/L、九水硝酸铁0.72mg/L、氯化钾400mg/L、硫酸镁97.7mg/L、氯化钠6800mg/L、一水磷酸二氢钠140mg/L、碳酸氢钠2200mg/L、醋酸钠50mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-精氨酸盐酸盐70mg/L、L-天冬氨酸30mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.11mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26mg/L、L-谷氨酸75mg/L、甘氨酸50mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟脯氨酸10mg/L、L-异亮氨酸20mg/L、L-亮氨酸60mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸25mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸30mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠二水合物57.66mg/L、L-缬氨酸25mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、α-D-生育酚磷酸酯0.01mg/L、生物素0.01mg/L、骨化醇0.1mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、叶酸0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、三水合甲萘醌亚硫酸氢钠0.019mg/L、烟酸0.025mg/L、烟酰胺0.025mg/L、p-氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆辛0.05mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A乙酸酯0.14mg/L、硫酸腺嘌呤10mg/L、腺嘌呤0.2mg/L、腺苷三磷酸二钠1mg/L、胆固醇0.2mg/L、2-脱氧-D-核糖0.5mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、核糖0.5mg/L、胸腺素0.3mg/L、吐温805mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.34mg/L、酚红10mg/L、0.25mg/L亚硒酸钠和0.075mg/L无水硫酸铜。
二、牛体外受精和胚胎培养：
步骤(1)、卵母细胞的采集和体外成熟
照本文实施例2方法用抽卵液6对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；
将所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h(实际操作24小时)，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；
步骤(2)、体外受精
将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；
从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；
将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h(实际操作18小时)，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；
步骤(3)、胚胎体外培养及保存
体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)，并进行质量鉴定；
将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。
三、胚胎差异染色的方法
1.选取体外培养第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)洗两次，放入透化液(50μl Triton、5μl吐温80和9.945ml PBS)中，室温放置30min。
3.使用2M盐酸室温处理20min，然后使用100mM的Tris-HCl室温处理10min，使CDX2蛋白能够与一抗结合。
4.使用PBS-BSA清洗三次，将囊胚放入封闭液(1ml山羊血清、5μl吐温80和8.995mlPBS)中，室温封闭1h，然后转入4℃冰箱封闭过夜。
5.弃去封闭液，CDX2一抗用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(购自Cell Signaling Technology公司)用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
7.在避光条件下用封闭液按1:200稀释CDX2特异性二抗(购自Sigma公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。
8.在避光条件下用封闭液按1:200稀释caspase-3特异性二抗(购自LifeTechnologies公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。
9.加入10μg/mL的Hochest 33342染液染细胞核，室温作用5min，在荧光显微镜下观察并拍照。
10.实验重复三次，每次随机选取10个囊胚，计算凋亡率、ICM细胞数/总细胞数来评估囊胚质量。
数据统计方法：实验数据采用统计软件SAS V8中的ANOVA程序进行分析，Duncan’smultiple-range检验方法判定处理间的差异显著性，当p<0.05时认为差异显著。
在本发明中，卵裂率＝受精卵裂数/受精卵数。在本发明中，囊胚率＝囊胚数/卵裂胚胎数。
四、卵母细胞的体外成熟(IVM)效果——成熟率
在本实施例的步骤(1)中，经体外成熟培养完毕后，在倒置显微镜下观察，将卵母细胞有第一极体释放、保持卵丘细胞间分泌粘稠的基质、细胞层显著膨大，细胞以卵子为中心，大体呈放射状向四周扩散者判定为已成熟，记录成熟的卵母细胞数，计算成熟率。
五、结果
本实施例对中国黄牛(南阳牛，役用品种)进行试验。结果，卵裂率88.7％、桑葚胚率为63.1％、囊胚率为53.1％、凋亡率5.2％；另外，在第9天时囊胚孵化率达77.6％。卵母细胞体外成熟的成熟率达879％。
在一个补充试验中，参照本文实施例3的方法，分别针对荷斯坦牛(乳牛品种)、西门塔尔牛(肉牛品种)、中国水牛(役用品种)三种牛进行试验，结果：卵裂率均在85～89％范围内、桑葚胚率均在63～66％范围内、囊胚率均在53～55％范围内、凋亡率均在4～6％范围内、第9天囊胚孵化率均在73～76％范围内；荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛三种牛的卵母细胞体外成熟的成熟率分别为85.3％、81.37％、75.2％。
实施例4：活体采集牛卵母细胞体外受精胚胎的培养方法
参考本发明人研究团队的中国专利申请号2018105768063之实施例2进行试验。
一、试剂
本实施例中，如未另外说明，使用的相关试剂详述如下：
加双抗生理盐水：包含青霉素400IU/mL、链霉素400μg/mL的生理盐水。
洗卵液：添加了3mg/mL牛血清白蛋白的BY基础培养液。
成熟培养液：添加了100mL/L FBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH、1μg/mL E2、20ng/mLEGF的BY基础培养液。
HEPES成熟培养液：添加了15mmol/L HEPES、100mL/L FBS、10μg/mL FSH、10μg/mLLH、1μg/mL E2、20ng/mL EGF的BY基础培养液。
其中，EGF——表皮生长因子，FSH——卵泡刺激素，FBS——胎牛血清，E2——雌二醇，LH——促黄体生成素。
受精培养液：包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。
精液制备培养液：包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。
胚胎培养液：包含：109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、2.5v/v％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v％必需氨基酸、1v/v％非必须氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v％、麦芽糖0.02w/v％的水溶液；所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g，所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加：L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g。
BY基础培养液是包含如下组分的水溶液：氯化钙200mg/L、九水硝酸铁0.72mg/L、氯化钾400mg/L、硫酸镁97.7mg/L、氯化钠6800mg/L、一水磷酸二氢钠140mg/L、碳酸氢钠2200mg/L、醋酸钠50mg/L、L-丙氨酸25mg/L、L-精氨酸盐酸盐70mg/L、L-天冬氨酸30mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.11mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26mg/L、L-谷氨酸75mg/L、甘氨酸50mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟脯氨酸10mg/L、L-异亮氨酸20mg/L、L-亮氨酸60mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70mg/L、L-蛋氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸25mg/L、L-脯氨酸40mg/L、L-丝氨酸25mg/L、L-苏氨酸30mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠二水合物57.66mg/L、L-缬氨酸25mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、α-D-生育酚磷酸酯0.01mg/L、生物素0.01mg/L、骨化醇0.1mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、叶酸0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、三水合甲萘醌亚硫酸氢钠0.019mg/L、烟酸0.025mg/L、烟酰胺0.025mg/L、p-氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆辛0.05mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A乙酸酯0.14mg/L、硫酸腺嘌呤10mg/L、腺嘌呤0.2mg/L、腺苷三磷酸二钠1mg/L、胆固醇0.2mg/L、2-脱氧-D-核糖0.5mg/L、D-葡萄糖1000mg/L、谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、核糖0.5mg/L、胸腺素0.3mg/L、吐温805mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.34mg/L、酚红10mg/L。
二、牛体外受精和胚胎培养：
步骤(1)、卵母细胞的采集和体外成熟
照本文实施例2方法用抽卵液6对牛进行活体采卵，将所得卵泡液在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入包含HEPES的成熟培养液中38.8℃、3h内运回实验室；
将所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次，再转移到新的成熟培养液中培养22-24h(实际操作24小时)，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；
步骤(2)、体外受精
将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次，再转移到受精培养液中，放入培养箱中，备用；
从液氮中取一支冻精细管，37℃水浴解冻；无菌操作剪开细管两端，使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中，328×g离心2次，每次5min，离心后弃上清；将300μL精液制备培养液加入上述离心管，重悬精子沉淀，取适当的精子悬液进行精子计数；
将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中，并将培养盘放入培养箱，使精卵共孵育16-20h(实际操作18小时)，培养条件为38.8℃、5.5-6.5％CO2、饱和湿度；
步骤(3)、胚胎体外培养及保存
体外受精操作完毕后，将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净，放入胚胎培养液中培养，此时记为胚胎培养的第1天，培养条件为38.8℃、6％O2、88％N2、饱和湿度，第3天记录卵裂率；第7天记录囊胚率，至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数)，并进行质量鉴定；
将可用胚胎在保存液中洗涤3次，在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液，按5段装液法装入胚胎，做好标记，再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，将胚胎细管迅速取出，置入液氮中冷冻保存。
三、胚胎差异染色的方法
1.选取体外培养第7天的囊胚，使用2％多聚甲醛固定20min。
2.使用含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS-BSA)洗两次，放入透化液(50μl Triton、5μl吐温80和9.945ml PBS)中，室温放置30min。
3.使用2M盐酸室温处理20min，然后使用100mM的Tris-HCl室温处理10min，使CDX2蛋白能够与一抗结合。
4.使用PBS-BSA清洗三次，将囊胚放入封闭液(1ml山羊血清、5μl吐温80和8.995mlPBS)中，室温封闭1h，然后转入4℃冰箱封闭过夜。
5.弃去封闭液，CDX2一抗用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
6.caspase-3一抗(购自Cell Signaling Technology公司)用封闭液按1:200稀释，室温孵育2h，弃去一抗稀释液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
7.在避光条件下用封闭液按1:200稀释CDX2特异性二抗(购自Sigma公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。
8.在避光条件下用封闭液按1:200稀释caspase-3特异性二抗(购自LifeTechnologies公司)，室温下避光放置1h。避光条件下弃去二抗稀释液，用PBS清洗3次，每次5min。
9.加入10μg/mL的Hochest 33342染液染细胞核，室温作用5min，在荧光显微镜下观察并拍照。
10.实验重复三次，每次随机选取10个囊胚，计算凋亡率、ICM细胞数/总细胞数来评估囊胚质量。
数据统计方法：实验数据采用统计软件SAS V8中的ANOVA程序进行分析，Duncan’smultiple-range检验方法判定处理间的差异显著性，当p<0.05时认为差异显著。
在本发明中，卵裂率＝受精卵裂数/受精卵数。在本发明中，囊胚率＝囊胚数/卵裂胚胎数。
四、卵母细胞的体外成熟(IVM)效果——成熟率
在本实施例的步骤(1)中，经体外成熟培养完毕后，在倒置显微镜下观察，将卵母细胞有第一极体释放、保持卵丘细胞间分泌粘稠的基质、细胞层显著膨大，细胞以卵子为中心，大体呈放射状向四周扩散者判定为已成熟，记录成熟的卵母细胞数，计算成熟率。
五、结果
本实施例对中国黄牛(南阳牛，役用品种)进行试验。结果，卵裂率85.3％、桑葚胚率为66.1％、囊胚率为49.6％、凋亡率5.4％；另外，在第9天时囊胚孵化率达75.4％。卵母细胞体外成熟的成熟率达75.4％。
在一个补充试验中，参照上文实施例4的方法，分别针对荷斯坦牛(乳牛品种)、西门塔尔牛(肉牛品种)、中国水牛(役用品种)三种牛进行试验，结果：卵裂率均在84～88％范围内、桑葚胚率均在62～65％范围内、囊胚率均在51～55％范围内、凋亡率均在4～6％范围内、第9天囊胚孵化率均在73～75％范围内；荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛三种牛的卵母细胞体外成熟的成熟率分别为67.1％、63.4％、59.5％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (17)
1.抽卵液在用于牛活体取卵的试剂中的用途，所述抽卵液包含：丙酮酸钠15~25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸300~400mg、TCM199为5~15mL、L-谷氨酰胺10~20mg、碳酸氢钠10~20mg、肝素0.5~1.5mg、青霉素5~7mg、链霉素10~15mg、胎牛血清1~3mL、牛磺酸20~30mg/L、乳酸锌0.5~1.5mg/L、水适量至100mL。
2.根据权利要求1的用途，所述抽卵液包含：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL。
3.根据权利要求1的用途，其中所述的牛选自：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。
4.根据权利要求1的用途，其中所述抽卵液的配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL。
5.根据权利要求1的用途，其中所述抽卵液的配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL。
6.根据权利要求1的用途，其中所述抽卵液的配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL。
7.根据权利要求1的用途，其中所述抽卵液的配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL。
8.根据权利要求1的用途，其中所述抽卵液的配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL。
9.一种用于牛活体取卵的抽卵液，其包含：丙酮酸钠15~25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸300~400mg、TCM199为5~15mL、L-谷氨酰胺10~20mg、碳酸氢钠10~20mg、肝素0.5~1.5mg、青霉素5~7mg、链霉素10~15mg、胎牛血清1~3mL、牛磺酸20~30mg/L、乳酸锌0.5~1.5mg/L、水适量至100mL。
10.根据权利要求9的抽卵液，其中包含：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL。
11.根据权利要求9的抽卵液，其是用于选自下列的牛的活体取卵的抽卵液：中国黄牛、荷斯坦牛、西门塔尔牛、中国水牛。
12.根据权利要求9的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠20mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为10mL、L-谷氨酰胺15mg、碳酸氢钠15mg、肝素1mg、青霉素6mg、链霉素13mg、胎牛血清2mL、牛磺酸25mg/L、乳酸锌1mg/L、水适量至100mL。
13.根据权利要求9的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠15mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸400mg、TCM199为5mL、L-谷氨酰胺20mg、碳酸氢钠10mg、肝素1.5mg、青霉素5mg、链霉素15mg、胎牛血清1mL、牛磺酸20mg/L、乳酸锌1.5mg/L、水适量至100mL。
14.根据权利要求9的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠25mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸350mg、TCM199为15mL、L-谷氨酰胺10mg、碳酸氢钠20mg、肝素0.5mg、青霉素7mg、链霉素10mg、胎牛血清3mL、牛磺酸30mg/L、乳酸锌0.5mg/L、水适量至100mL。
15.根据权利要求9的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠22.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸325mg、TCM199为12.5mL、L-谷氨酰胺12.5mg、碳酸氢钠17.5mg、肝素0.75mg、青霉素5.5mg、链霉素14mg、胎牛血清1.5mL、牛磺酸27.5mg/L、乳酸锌0.75mg/L、水适量至100mL。
16.根据权利要求9的抽卵液，其配方为：丙酮酸钠17.5mg、4-羟乙基哌嗪乙磺酸375mg、TCM199为7.5mL、L-谷氨酰胺17.5mg、碳酸氢钠12.5mg、肝素1.25mg、青霉素6.5mg、链霉素12mg、胎牛血清2.5mL、牛磺酸22.5mg/L、乳酸锌1.25mg/L、水适量至100mL。
17.处理牛活体取卵采集的卵泡的方法，该方法包括使通过牛活体取卵采集的卵泡与权利要求9-16任一项所述抽卵液混合的操作。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892194A (zh) * | 2010-06-10 | 2010-11-24 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法 |
| CN102703383A (zh) * | 2012-06-14 | 2012-10-03 | 中国农业大学 | 正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用 |
| CN103923878A (zh) * | 2013-01-15 | 2014-07-16 | 河北农业大学 | 一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法 |
| CN104140948A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-12 | 山东威高新生医疗器械有限公司 | 卵子与胚胎处理液及其制备方法 |
| CN105349485A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-24 | 广西大学 | 改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液 |
| WO2018115788A1 (fr) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Patrick Choay Sas | Adjuvants pour milieux de culture cellulaire, notamment pour fecondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons |
| CN108642001A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 |
| CN110709505A (zh) * | 2017-04-12 | 2020-01-17 | 派乔易股份有限公司 | 特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细胞培养基的无细胞因子的佐剂 |
-
2020
- 2020-02-12 CN CN202010089411.8A patent/CN111280163B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892194A (zh) * | 2010-06-10 | 2010-11-24 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心 | 一种提高绵羊卵母细胞体外利用效率的方法 |
| CN102703383A (zh) * | 2012-06-14 | 2012-10-03 | 中国农业大学 | 正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用 |
| CN103923878A (zh) * | 2013-01-15 | 2014-07-16 | 河北农业大学 | 一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法 |
| CN104140948A (zh) * | 2014-08-08 | 2014-11-12 | 山东威高新生医疗器械有限公司 | 卵子与胚胎处理液及其制备方法 |
| CN105349485A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-24 | 广西大学 | 改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液 |
| WO2018115788A1 (fr) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Patrick Choay Sas | Adjuvants pour milieux de culture cellulaire, notamment pour fecondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons |
| CN110709505A (zh) * | 2017-04-12 | 2020-01-17 | 派乔易股份有限公司 | 特别是用于体外受精或用于卵泡、雄性生殖细胞或胚胎的细胞培养基的无细胞因子的佐剂 |
| CN108642001A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "犊牛超数排卵方法的研究";郑自华等;《中国畜牧兽医》;20121231;第39卷(第7期);第183-187页 * |
| 郑自华等."犊牛超数排卵方法的研究".《中国畜牧兽医》.2012,第39卷(第7期),第183-187页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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