CN105349485A - 改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改进的徒手切割水牛囊胚的方法，并将切割液和培养滴合二为一，即将添加一定量牛磺酸的含有颗粒细胞的成熟培养液做成切割滴，命名为切割单层。该法主要包括制备切割单层、固定胚胎、切割胚胎、剥离切割胚，其中切割单层时直接采用添加牛磺酸的成熟培养液作为切割滴以取代传统切割液和培养滴；同时，该法对切割手法和切割载体进行了规范和简化，方法操作简便、无需处理透明带、切割后无需转移，可提高半胚的复原率(二分胚复原率达90％以上)，防止污染，保证切割效率，为此项技术能够真正进入实用和普及阶段，更好地为畜牧业服务奠定了基础。

Description

改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液

技术领域

本发明属于胚胎分割技术领域，尤其涉及一种改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液。

背景技术

胚胎分割技术是20世纪70年代末逐渐发展起来的一项生物工程新技术，通过将2-8细胞期、桑葚胚、囊胚阶段的胚胎一分为二、一分为四或者更多的分割，经过体外复苏培养后重新复活发育，用以扩增可用的优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的克隆动物，可为遗传疾病的检查和性别鉴定等提供一种活体组织采样和检查的手段，也可用于濒危动物的保护。对于2-8细胞期的胚胎的切割方法主要有机械法和化学辅助机械法，机械法主要是使用显微操作仪，采用玻璃针使在培养液中的胚胎的细胞团从透明带中脱出，用毛细管吸住单个卵裂球，将卵裂球装入准备好的透明带中；化学辅助机械法是指使用链霉蛋白酶将透明带消化掉，使卵裂球裸露，再用吸管吹打分离卵裂球，以此获得单个卵裂球。一般情况下，哺乳动物的胚胎分割主要是在桑葚胚、囊胚阶段进行，这两个阶段报道的切割方法较多，包括Willadsen分割法、Williams分割法、TSuzuki分割法、显微吸管分离法、酶软化透明带显微玻璃针分割法、徒手分割法等。其中，徒手分割法多用于晚期桑葚胚或囊胚期胚胎的分割，分割时只需手持显微手术刀或玻璃针将整个胚胎分割为二，这种方法简便易行，在现场条件下即可进行。

胚胎分割最先在家兔的胚胎二分割中获得成功，自20世纪70年代以来，胚胎分割技术相继在小鼠、绵羊、山羊、猪、牛、马等哺乳动物的同胚双生中获得成功，有的已经用于生产。胚胎切割技术在我国也取得了比较喜人的进展，我国科研工作者先后在奶牛胚胎、山羊胚胎等中进行1/2、1/4切割，均获得了成功。虽然胚胎分割技术已经取得了一定的成就和进展，但是仍然有许多方面需要进一步完善和发展，尤其对于徒手切割胚胎，需要注意掌握切割手法和防止胚胎污染。

牛磺酸，也称2-氨基乙磺酸，因最先从牛磺中提取而命名，是一种游离的含硫半必需氨基酸，广泛存在于动物体内。牛磺酸具有特殊的药理作用和生理功能，研究发现在细胞发育过程中，线粒体是活性氧(ROS)产生的主要部位，活性氧对细胞有很大的损伤作用，而牛磺酸通过发挥抗脂质过氧化作用和膜稳定作用，可以保护线粒体免受脂质体过氧化的危害，同时保持线粒体膜的完整，维持线粒体结构和功能的稳定。同时，牛磺酸还可以对过氧化物起到拈抗作用，保护细胞膜，减少细胞死亡，促进胚胎发育，还可起到渗透压调节的作用，通过抑制细胞膜上Na⁺-K⁺ATP酶，有效防止因胚胎内K⁺浓度过高引起的胚胎损害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改进的徒手切割水牛囊胚的方法及切割液，该法对切割手法和切割载体进行规范和简化，可提高半胚的复原率，防止污染，保证切割效率。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：改进的徒手切割水牛囊胚的方法，包括以下步骤：

<1>制备切割单层

<2>固定胚胎

在体式显微镜下，将胚胎放入单层中，将切割刀的刀尖固定在胚胎的9点钟、12点钟、15点或18点方向，距离胚胎2-3倍胚胎直径的距离，以此为支点，然后在胚胎的左右两边将切割刀压下做两根射线切痕，分别与胚胎左右两边相切；

<3>切割胚胎

将胚胎固定在所画射线内，以原支点作为切割射线的原点，沿着胚胎的1/2处压下切割线进行切割，然后以原点为受力点，将切割刀缓慢立起，保持与刚放入单层滴时一样的状态，如果不需要再进行切割操作，将切割刀从切割单层中缓慢抽离；

<4>剥离切割胚。

步骤<1>中以添加牛磺酸的成熟培养液作为切割滴。

步骤<1>按以下操作进行：在体外成熟培养22-24h后的水牛卵丘-卵母细胞复合体，用玻璃吸管多次吹打后，挑选出卵母细胞后剩余的含有颗粒细胞的成熟培养液用来制作切割滴，同时向切割滴中添加牛磺酸；直接用枪吸取20-5μl的已添加牛磺酸的成熟培养液在培养皿上做成滴，覆盖石蜡油，在39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行培养，24小时后待颗粒细胞长满整个滴的底部，即可使用。

牛磺酸的浓度为7×10^-3-9×10^-3mol/L。

步骤<4>按以下操作进行：用玻璃圆头分针将切割后的胚胎从非切割面轻轻拨动，将切割胚彼此剥离，并将各个切割块拨动到该单层滴中没有射线切痕的部位。

用于上述改进的徒手切割水牛囊胚的方法的切割液，该切割液为添加牛磺酸并含有颗粒细胞的成熟培养液。

牛磺酸的浓度为7×10^-3-9×10^-3mol/L。

针对目前传统胚胎切割方法存在的问题，发明人建立了一种改进的徒手切割水牛囊胚的方法，并将切割液和培养液合二为一，即将添加一定量牛磺酸的含有颗粒细胞的成熟培养液做成切割滴，命名为切割单层。该法主要包括制备切割单层、固定胚胎、切割胚胎、剥离切割胚，其中切割单层时直接采用添加牛磺酸的成熟培养液作为切割滴以取代传统切割液和培养滴；同时，该法对切割手法和切割载体进行了规范和简化，方法操作简便、无需处理透明带、切割后无需转移，可提高半胚的复原率(二分胚复原率达90％以上)，防止污染，保证切割效率，为此项技术能够真正进入实用和普及阶段，更好地为畜牧业服务奠定了基础。

具体实施方式

实施例1

<0>囊胚的收集

采集当地屠宰场的废弃水牛卵巢，置于35℃的生理盐水的保温瓶中6h内送回实验室，去除多余的卵巢周边组织后，用18号注射器吸取2-3ml的洗卵液，抽取卵巢上2-8mm的卵泡中的卵泡液，在体式显微镜下，从卵泡液中挑选胞质均匀、包裹着3层以上的颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养。

卵母细胞成熟培养22-24h后，轻轻吹打去除卵丘-卵母细胞复合体(COCs)周围的颗粒细胞，将裸露的MII期卵母细胞用体外受精液洗涤2次后放入40μl的受精滴中，每滴约放入15-20个卵母细胞，同时每滴注入处理好的精液12μl，使精子浓度达到1-2×10⁶个/ml，放入培养箱中进行受精培养；受精后第二天轻轻吹打假定受精卵，去除附着的精子后移入单层颗粒细胞中共培养，隔天更换一遍培养液，受精后第7-9天收集水牛囊胚。

其中，

洗卵液的组成为TCM199+5mmol/LNaHCO₃+20mmol/LHepes+0.004ug/ml肝素钠+3％新生牛血清+600mg/L青霉素+100mg/L链霉素，pH7.2-7.4；

成熟培养液的组成：TCM199+5mmol/LNaHCO₃+20mmol/LHepes+10％胎牛血清+0.026％乳酸钠+0.5ug/mlFSH+5ug/mlLH，pH7.2-7.4；

体外受精液的组成：Tyrode’s液+20ug/mlHeparinSodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mlBSA，PH7.5-7.8；

胚胎培养液组成：54％体外受精液+36％成熟培养液+10％胎牛血清。

<1>制备切割单层

在体外成熟培养22-24h后的水牛卵丘-卵母细胞复合体，用玻璃吸管多次吹打后，挑选出卵母细胞后剩余的含有颗粒细胞的成熟培养液用来制作切割滴，同时向切割滴中添加牛磺酸(浓度为7×10^-3-9×10^-3mol/L)；直接用枪吸取20-5μl左右的已添加牛磺酸的成熟培养液在培养皿上做成滴，覆盖石蜡油，在39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行培养，24小时后待颗粒细胞基本长满整个滴的底部，即可使用。

<2>固定胚胎

在体式显微镜下，将收集到的囊胚放入单层中，每个切割滴放入一个囊胚，将切割刀的刀尖固定在胚胎的9点钟、12点钟、15点或18点方向，距离胚胎2-3倍胚胎直径的距离，以此为支点，然后在胚胎的左右两边将切割刀压下做两根射线切痕，分别与胚胎左右两边相切，必要时可以多做几根射线，以便更好地固定胚胎。

<3>切割胚胎

将胚胎固定在所画射线内，确保胚胎不移动后，仍然以原支点作为切割射线的原点，根据实验需要，沿着胚胎的1/2处压下切割线进行切割，确认切割线已经将胚胎有效切割后，然后以原点为受力点，将切割刀缓慢立起，保持与刚放入单层滴时一样的状态，如果不需要再进行切割操作，将切割刀从切割单层中缓慢抽离即可。

<4>剥离切割胚。

用玻璃圆头分针将切割后的胚胎从非切割面轻轻拨动，将切割胚彼此剥离，并将各个切割块拨动到该单层滴中没有射线切痕的部位，不需要转移到新单层中。

切割刀和玻璃圆头分针的清洗：每完成一个胚胎的切割和剥离后，需要对切割刀和玻璃圆头分针进行清洗消毒，避免交叉污染。清洗顺序为：75％酒精——亚沸水——培养液。

<5>复苏培养

操作完毕后，将切割胚放入39℃，5％CO2和最大饱和湿度的培养箱中继续培养8-24h后观察切割胚复原数。13枚囊胚中，除了1个囊胚未复原外，其余切割囊胚均可以重新形成囊胚腔，复原率为92.3％。

实施例2

2015年9月15日，从当地屠宰场收集水牛卵巢，于盛装有生理盐水的保温瓶中5h后运到实验室，到达实验室水温为31℃，参照实施例1的方法收集到180个水牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，放入成熟培养液中进行培养。9月16日，COCs成熟培养23h后，用移液器轻轻吹打去除卵丘细胞，收集到108个排出第一极体的卵母细胞，对这些细胞全部进行体外受精，并制备切割单层。9月17日，将受精24h后的假定受精卵用胚胎培养液洗涤两次，然后移入20μl的单层培养滴中进行体外培养。9月24日至9月26日期间收集囊胚，共收集到21个囊胚，可用于胚胎切割。9月26日按本发明方法进行胚胎切割，切割完成后，将切割滴重新放入39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行培养，9月27日观察切割胚复原数，除了2个囊胚未复原外，其余切割囊胚均可以重新形成囊胚腔，复原率为90.5％。

对照例传统囊胚徒手分割法

1、在直径为100mm的无菌塑料皿的皿盖中做数个200μL的切割滴，用切割液(DPBS+0.2mol/L蔗糖)洗涤胚胎2次；

2、将胚胎移入切割滴中，每个滴放1枚胚胎；

3、借助体视显微镜，使用金属切割刀先在切割滴的底部轻轻划2条直线以固定住胚胎，然后用金属切割刀轻轻地下压即可将囊胚切开，注意把囊胚的内细胞团平均地一分为二。

4、将分割后的成对半胚轻轻地从切割滴中移出，用平衡好的培养液洗2～3次，然后将成对的半胚分别移入颗粒单层中继续培养8～24h，1～3h检查半胚复原数(分割成功数)，24h统计半胚发育率，文献报道的半胚发育率在51％～60％之间。

Claims (7)

1.一种改进的徒手切割水牛囊胚的方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>制备切割单层

<2>固定胚胎

在体式显微镜下，将胚胎放入单层中，将切割刀的刀尖固定在胚胎的9点钟、12点钟、15点或18点方向，距离胚胎2-3倍胚胎直径的距离，以此为支点，然后在胚胎的左右两边将切割刀压下做两根射线切痕，分别与胚胎左右两边相切；

<3>切割胚胎

将胚胎固定在所画射线内，以原支点作为切割射线的原点，沿着胚胎的1/2处压下切割线进行切割，然后以原点为受力点，将切割刀缓慢立起，保持与刚放入单层滴时一样的状态，如果不需要再进行切割操作，将切割刀从切割单层中缓慢抽离；

<4>剥离切割胚。

2.根据权利要求1所述的改进的徒手切割水牛囊胚的方法，其特征在于步骤<1>中以添加牛磺酸的成熟培养液作为切割滴。

3.根据权利要求1所述的改进的徒手切割水牛囊胚的方法，其特征在于步骤<1>按以下操作进行：在体外成熟培养22-24h后的水牛卵丘-卵母细胞复合体，用玻璃吸管多次吹打后，挑选出卵母细胞后剩余的含有颗粒细胞的成熟培养液用来制作切割滴，同时向切割滴中添加牛磺酸；直接用枪吸取20-5μl的已添加牛磺酸的成熟培养液在培养皿上做成滴，覆盖石蜡油，在39℃，5％CO₂和最大饱和湿度的培养箱中进行培养，24小时后待颗粒细胞长满整个滴的底部，即可使用。

4.根据权利要求3所述的改进的徒手切割水牛囊胚的方法，其特征在于：所述牛磺酸的浓度为7×10^-3-9×10^-3mol/L。

5.根据权利要求1所述的改进的徒手切割水牛囊胚的方法，其特征在于步骤<4>按以下操作进行：用玻璃圆头分针将切割后的胚胎从非切割面轻轻拨动，将切割胚彼此剥离，并将各个切割块拨动到该单层滴中没有射线切痕的部位。

6.用于权利要求1所述改进的徒手切割水牛囊胚的方法的切割液，其特征在于该切割液为添加牛磺酸并含有颗粒细胞的成熟培养液。

7.根据权利要求6所述的改进的徒手切割水牛囊胚的方法的切割液，其特征在于：所述牛磺酸的浓度为7×10^-3-9×10^-3mol/L。