CN104312971A - 促进水牛卵母细胞体外成熟的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，在水牛卵母细胞体外成熟培养液中添加一定浓度的EGCG进行成熟培养。研究表明，成熟22～24h后，卵母细胞第一极体排出率为59.31％；成熟卵母细胞经体外受精处理后，囊胚发育率高达24.68％；成熟卵母细胞经孤雌激活处理后，囊胚发育率高达31.69％。可见，水牛体外成熟培养液中添加EGCG有利于卵母细胞体外成熟和成熟后早期胚胎发育，本发明可以显著提高卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率。因此，应用本发明能显著促进卵母细胞的成熟，提高卵母细胞成熟率和成熟质量，从而能提高水牛体外胚胎生产效率。

Description

促进水牛卵母细胞体外成熟的方法

技术领域

本发明属于水牛繁殖技术领域,尤其涉及一种促进水牛卵母细胞体外成熟的方法。

背景技术

EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)是绿茶主要的活性和水溶性成分，是茶多酚的主要功能物质，因为具有特殊的立体化学结构，具有非常强的抗氧化性和清除自由基的功能。目前，EGCG在医学上的应用主要是抗癌防癌。有学者研究证明，EGCG能抑制癌细胞生存需要的信号传递，与其他抗氧化剂相互作用降低某些致癌物质的活性，清除有害自由基；有利于维持线粒体膜电位的稳定、保护线粒体基因和功能的完整性，还能够发挥抗肿瘤、降血脂、抗炎、抗衰老、防辐射等一系列生物活性。细胞的新陈代谢和培养环境中产生一系列活性氧基团(reactive oxygen species，ROS)，如O₂-、H₂O₂及HO₂-、-OH等，它们会造成DNA和细胞膜损伤，诱导细胞凋亡，使早期胚胎发育停滞。在细胞培养中，EGCG能增强谷胱甘肽、过氧化物酶、过氧化氢酶、酯还原酶、谷胱甘肽-S-转移酶的活性。在卵母细胞中，谷胱甘肽(GSH)的功能主要是参与抗氧化作用并保护细胞免受活性氧(ROS)的毒性。细胞中GSH的含量通常作为评估卵母细胞成熟质量的重要指标之一。GSH在细胞发育中的主要功能是参与抗活性氧族毒害作用保护卵母细胞。它能促进卵母细胞成熟、受精过程雄原核的产生和早期胚胎发育。现有的研究表明，EGCG促进卵母细胞成熟，以及对早期胚胎发育所起的促进作用，可能与提高卵母细胞内GSH的浓度有关。

近年来，哺乳动物卵母细胞体外成熟技术取得了巨大进展，形成了一套较成熟的卵母细胞体外成熟技术体系，但与体内成熟相比，仍有许多差距，特别是囊胚率和囊胚质量较低。其可能原因之一就是卵母细胞在体外成熟过程中较体内成熟产生更多的ROS，并且细胞或胚胎离开供体后得不到母体抗氧化剂的保护，过高的ROS破坏细胞培养环境的平衡。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，以提高卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，在水牛卵母细胞体外成熟培养液中添加EGCG。

EGCG在成熟培养液中的浓度为10μmol/L。

成熟培养液的组成为TCM199+26.2mmol/L NaHCO₃+5mmol/L Hepes+10％发情牛血清+3％黄牛卵泡液+0.5μg/mL FSH+5μg/mL LH+10μmol/L EGCG，pH为7.2～7.4。

上述促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，包括以下步骤：

(1)卵母细胞的收集

采集屠宰水牛后的废弃卵巢，置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L链霉素的生理盐水的保温瓶中，温度保持在35℃，并于6h内送回实验室；用手术剪将卵巢周围的其它组织剪去，生理盐水洗涤2～3遍，用18号针头注射器抽取2～8mm卵泡的卵母细胞卵泡液复合物，洗卵液中挑选胞质均匀、周围有3层以上颗粒细胞完全包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；

洗卵液的组成为TCM199+5mmol/L NaHCO₃+20mmol/L Hepes+600mg/L青霉素和100mg/L链霉素；

(2)卵母细胞的成熟

用预先平衡好的含10μmol/L EGCG的成熟培养液做若干个培养滴，每个滴55μL，将收集到的卵母细胞用含10μmol/L EGCG的成熟培养液中清洗2～3遍，后置于成熟培养液微滴中，每个滴放20个的卵母细胞，覆盖矿物油置于培养箱中培养,培养条件为39℃，5％ CO₂和100％湿度；成熟培养后检查第一极体排出情况，统计成熟率；

成熟培养液的组成为TCM199+26.2mmol/L NaHCO₃+5mmol/L Hepes+10％发情牛血清+3％黄牛卵泡液+0.5μg/mL FSH+5μg/mL LH+10μmol/L EGCG，pH为7.2～7.4。

上述促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，还包括以下步骤：

(3)成熟卵母细胞的体外受精

体外受精所用精液为冷冻精液，38.5℃水浴解冻，上游法收集活力高的精子；卵母细胞成熟22～24h(MII期)后，吹打去除COCs周围的颗粒细胞，卵母细胞用体外受精液洗涤两次后置于约40μL的受精滴中，每滴约15～20个，每个受精滴注入12μL离心处理好的精液，使其浓度达到1～2×10⁶个/mL，置于培养箱中进行受精培养；受精后第二天将假定受精卵移入单层颗粒细胞中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，受精后48h统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率；

体外受精液的组成为Tyrode’s液+20μg/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA，pH7.5～7.8。

上述促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，还包括以下步骤：

(4)成熟卵母细胞的孤雌激活

采用化学激活法，卵母细胞成熟22～24h(MII期)后，吹打去除COCs周围的颗粒细胞，卵母细胞用添加了5μmol/L离子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培养液中培养6h，6-DMAP培养液为胚胎培养液中添加2mmol/L的6-DMAP；用胚胎培养液洗涤2～3次，置于单层颗粒微滴中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，激活48h后统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率。

上述促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，还包括以下步骤：

(5)胚胎培养

体外受精或孤雌激活后的卵母细胞用胚胎培养液洗涤2～3次后，移入颗粒细胞单层培养液微滴中培养，体外培养时间为8天，共培养24h统计卵裂率，第8d统计囊胚率；

胚胎培养液的组成为54％体外受精液+36％成熟培养液+10％胎牛血清。

卵母细胞体外成熟技术是胚胎体外生产技术的关键，针对目前水牛卵母细胞体外成熟培养囊胚率和囊胚质量较低的问题，发明人建立了一种促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，在水牛卵母细胞体外成熟培养液中添加一定浓度的EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)进行成熟培养。研究表明，成熟22～24h后，卵母细胞第一极体排出率为59.31％；成熟卵母细胞经体外受精处理后，囊胚发育率高达24.68％；成熟卵母细胞经孤雌激活处理后，囊胚发育率高达31.69％。可见，水牛体外成熟培养液中添加EGCG有利于卵母细胞体外成熟和成熟后早期胚胎发育，本发明可以显著提高卵母细胞的体外成熟率和囊胚发育率。因此，应用本发明能显著促进卵母细胞的成熟，提高卵母细胞成熟率和成熟质量，从而能提高水牛体外胚胎生产效率。

附图说明

图1是应用本发明水牛卵母细胞成熟22h后卵丘扩展样图。

图2是应用本发明水牛卵母细胞成熟22h后排出第一极体样图。

图3是应用本发明水牛孤雌激活48h后卵裂样图。

图4是应用本发明水牛体外受精后胚胎发育样图。

具体实施方式

实施例促进水牛卵母细胞体外成熟的方法

(1)卵母细胞的收集

采集当地屠宰场屠宰水牛后的废弃卵巢，置于含有双抗(0.024g/L青霉素和0.02g/L链霉素)的生理盐水的保温瓶中，温度保持在35℃左右，并于6h内送回实验室；用手术剪将卵巢周围的其它组织剪去，然后用35℃左右含有双抗的生理盐水洗涤2～3遍，备用；用18号针头注射器抽取2～8mm卵泡的卵母细胞卵泡液复合物，洗卵液中挑选胞质均匀、周围有3层以上颗粒细胞完全包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；

其中，洗卵液的组成为TCM199+5mmol/L NaHCO₃+20mmol/L Hepes+600mg/L青霉素和100mg/L链霉素，pH为7.2～7.4。

(2)卵母细胞的成熟

用预先平衡好的含10μmol/L EGCG的成熟培养液做若干个培养滴，每个滴55μL，将收集到的卵母细胞用含10μmol/L EGCG的成熟培养液中清洗2～3遍，后置于成熟培养液微滴中，每个滴放20个左右的卵母细胞，覆盖矿物油置于培养箱中培养,培养条件为39℃，5％ CO₂和100％湿度；成熟培养后检查第一极体排出情况，统计成熟率。

其中，成熟培养液的组成为TCM199+26.2mmol/L NaHCO₃+5mmol/L Hepes+10％发情牛血清+3％黄牛卵泡液+0.5μg/mL FSH+5μg/mL LH+10μmol/L EGCG，pH为7.2～7.4。

(3)成熟卵母细胞的体外受精

体外受精所用精液为冷冻精液，38.5℃水浴解冻，上游法收集活力高的精子，用一支15mL的离心管预先平衡2mL受精液，将解冻好的精液注入离心管的底部，于培养箱中45°倾斜放置30min，收集上层1mL，1200×g离心5min，弃掉上清液；卵母细胞成熟22～24h(MII期)后，用移液器在成熟滴中轻轻吹打去除COCs周围的颗粒细胞，将处理好的MII期卵母细胞用体外受精液洗涤两次后置于约40μL的受精滴中，每滴约15～20个，每个受精滴注入12μL离心处理好的精液，使其浓度达到1～2×10⁶个/mL，置于培养箱中进行受精培养；受精后第二天将假定受精卵移入单层颗粒细胞中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，受精后48h统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率。

其中，体外受精液的组成为Tyrode’s液+20μg/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA，pH7.5～7.8。

体外受精22～24h后，在受精滴中轻轻吹打假定受精卵，以去除附着的精子。

(4)成熟卵母细胞的孤雌激活

采用化学激活法，预先平衡好含5μmol/L离子酶素的洗卵液、含2mmol/L 6-DMAP的胚胎培养液以及胚胎培养液；用含5μmol/L离子酶素的洗卵液在一个培养皿中做若干个100μL工作滴，卵母细胞成熟22～24h(MII期)后，用移液器在成熟滴中轻轻吹打去除COCs周围的颗粒细胞，卵母细胞用添加了5μmol/L离子酶素的洗卵液中激活5min；再来一个培养皿做若干个2mmol/L的6-DMAP培养滴，每个滴30μL，覆盖矿物油，激活后的卵母细胞用6-DMAP培养液洗涤两次后移入6-DMAP培养滴中，放入培养箱中培养6h激活培养6h，培养条件为39℃，5％ CO₂和100％湿度；用胚胎培养液洗涤2～3次，置于单层颗粒微滴中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，激活48h后统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率。

(5)胚胎培养

假定受精卵和激活培养后的卵母细胞均用平衡好的胚胎培养液洗涤2～3次后，移入20μL体系的颗粒细胞单层培养液微滴中培养，每滴15～20枚，体外培养时间为8天，培养条件为39℃，5％ CO₂和100％湿度，隔天更换半量胚胎培养液，共培养24h统计卵裂率，第6～9d统计囊胚率。

其中，胚胎培养液成分：54％体外受精液+36％成熟培养液+10％胎牛血清。

上述各步骤中，成熟培养液、体外受精液、胚胎培养液均添加60mg/L青霉素和100mg/L链霉素，所有试剂均用孔径0.22μm的微孔滤器过滤，所用器皿均无菌处理。

结果：如图1至4，在水牛卵母细胞体外培养体系中，成熟率为59.31％，体外受精后，囊胚率为24.68％，孤雌激活后，囊胚率为31.69％。

应用例

2014年6月19日，从当地屠宰场收集卵巢后，于盛装有生理盐水的保温瓶中4h后运到实验室，到达实验室时温度为30℃。按上述实施例的方法收集到200个卵母细胞，于含10μmol/L EGCG的成熟培养液中进行培养，6月20日，卵母细胞成熟22h后，用移液器轻轻吹打去除大部分卵丘细胞。排出第一极体的卵母细胞有123个，成熟率为61.50％，对123个排出第一极体的MII期卵母细胞全部进行体外受精。6月21日，将受精22h的假定受精卵经胚胎培养液洗涤两次后，移入移入20μL体系的颗粒细胞单层培养液微滴中培养，隔天更换半量培养液，48h后检查卵裂情况，共卵裂了75个，卵裂率为60.98％。6月29日统计囊胚率，囊胚数为30个，囊胚率为24.39％。按此方法重复5次，最后成熟率、成熟卵母细胞经体外受精处理后的囊胚发育率为这5次的平均数。

2014年7月15日，按实施例的方法收集了168个卵母细胞置于含10μmol/L EGCG的成熟培养液中进行成熟培养，7月16日，体外成熟了22h后，挑选排出第一极体的101卵母细胞进行孤雌激活，当天下午将激活培养好的卵母细胞移入颗粒细胞单层培养液微滴中培养，隔天更换半量培养液。7月18日统计卵裂率，卵裂细胞数为75个，卵裂率为74.26％。7月25日检查囊胚发育情况，囊胚数为32个，囊胚率为31.68％。按此方法重复5次，成熟卵母细胞经孤雌激活处理后囊胚发育率为这5次的平均数。

上述试验证明，水牛卵母细胞体外成熟培养液中添加10μmol/LEGCG，成熟率约60％，体外受精后，囊胚率约25％；孤雌激活后，囊胚率约32％。

Claims (7)

1.一种促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于在水牛卵母细胞体外成熟培养液中添加EGCG。

2.根据权利要求1所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于：所述EGCG在成熟培养液中的浓度为10μmol/L。

3.根据权利要求2所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于：所述成熟培养液的组成为TCM199+26.2mmol/L NaHCO₃+5mmol/L Hepes+10％发情牛血清+3％黄牛卵泡液+0.5μg/mL FSH+5μg/mL LH+10μmol/L EGCG，pH为7.2～7.4。

4.根据权利要求3所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)卵母细胞的收集

采集屠宰水牛后的废弃卵巢，置于含0.024g/L青霉素和0.02g/L链霉素的生理盐水的保温瓶中，温度保持在35℃，并于6h内送回实验室；用手术剪将卵巢周围的其它组织剪去，生理盐水洗涤2～3遍，用18号针头注射器抽取2～8mm卵泡的卵母细胞卵泡液复合物，洗卵液中挑选胞质均匀、周围有3层以上颗粒细胞完全包裹的卵丘-卵母细胞复合体；

所述洗卵液的组成为TCM199+5mmol/L NaHCO₃+20mmol/L Hepes+600mg/L青霉素和100mg/L链霉素，pH为7.2～7.4；

(2)卵母细胞的成熟

用预先平衡好的含10μmol/L EGCG的成熟培养液做若干个培养滴，每个滴55μL，将收集到的卵母细胞用含10μmol/L EGCG的成熟培养液中清洗2～3遍，后置于成熟培养液微滴中，每个滴放20个的卵母细胞，覆盖矿物油置于培养箱中培养,培养条件为39℃，5％CO₂和100％湿度；成熟培养后检查第一极体排出情况，统计成熟率；

所述成熟培养液的组成为TCM199+26.2mmol/L NaHCO₃+5mmol/L Hepes+10％发情牛血清+3％黄牛卵泡液+0.5μg/mL FSH+5μg/mL LH+10μmol/L EGCG，pH为7.2～7.4。

5.根据权利要求4所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于还包括以下步骤：

(3)成熟卵母细胞的体外受精

体外受精所用精液为冷冻精液，38.5℃水浴解冻，上游法收集活力高的精子；卵母细胞成熟22～24h后，吹打去除COCs周围的颗粒细胞，卵母细胞用体外受精液洗涤两次后置于约40μL的受精滴中，每滴约15～20个，每个受精滴注入12μL离心处理好的精液，使其浓度达到1～2×10⁶个/mL，置于培养箱中进行受精培养；受精后第二天将假定受精卵移入单层颗粒细胞中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，受精后48h统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率；

所述体外受精液的组成为Tyrode’s液+20μg/mL Heparin Sodium+2.0mmol/LCaffeine+6.0mg/mL BSA，pH7.5～7.8。

6.根据权利要求4所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于还包括以下步骤：

(4)成熟卵母细胞的孤雌激活

采用化学激活法，卵母细胞成熟22～24h后，吹打去除COCs周围的颗粒细胞，卵母细胞用添加了5μmol/L离子酶素的洗卵液中激活5min，后置于6-DMAP培养液中培养6h，6-DMAP培养液为胚胎培养液中添加2mmol/L的6-DMAP；用胚胎培养液洗涤2～3次，置于单层颗粒微滴中共培养，隔天更换一半胚胎培养液，激活48h后统计卵裂率，第6～9天统计囊胚率。

7.根据权利要求5或6所述的促进水牛卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于还包括以下步骤：

(5)胚胎培养

体外受精或孤雌激活后的卵母细胞用胚胎培养液洗涤2～3次后，移入颗粒细胞单层培养液微滴中培养，体外培养时间为8天，共培养24h统计卵裂率，第8d统计囊胚率；

所述胚胎培养液的组成为54％体外受精液+36％成熟培养液+10％胎牛血清。