CN105624100A - 水牛卵母细胞体外成熟培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于包括卵母细胞准备、IVM培养小滴制备以及体外成熟培养三个步骤，其采用的体外成熟培养液由TCM199、FBS、oFSH、17β-E2、GSH组成。本发明的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，能显著促进卵母细胞的细胞质成熟，解决了目前水牛体外成熟的卵母细胞受精后胚胎体外发育率低的问题；本发明的成熟培养液能促进水牛卵母细胞成熟发育，且对维持卵母细胞和早期胚胎形态有良好作用。

Description

水牛卵母细胞体外成熟培养方法
技术领域
本发明属于胚胎工程技术领域，尤其是水牛卵母细胞体外成熟培养方法。
背景技术
作为胚胎生物工程技术研究的基础只有的牛卵母细胞体外成熟培养技术，自上世纪30年代至今，许多科学研究人员在牛卵母细胞体外生长、发育领域做了大量工作，对牛卵母细胞培养条件进行了广泛而深入地研究，并取得了较大的进展。
近年来，水牛卵母细胞体外成熟技术取得了巨大进展，形成了一套较成熟的卵母细胞体外成熟技术体系，但与体内成熟相比，仍有许多差距，特别是囊胚率和囊胚质量较低，导致受精后的水牛卵母细胞发育率低下。现有的水牛卵母细胞体外成熟培养液为TCM199+10%FBS，此培养液下桑葚率和囊胚率都比较低。生殖激素oFSH能够促进颗粒细胞扩散，有利于卵母细胞成熟及后续发育；适当浓度的生殖激素17β-E2能促进卵母细胞成熟分裂的复始，显著提高卵母细胞的受精能力及早期胚胎的发育能力；抗氧化剂GSH能够促进水牛卵母细胞成熟、卵裂向桑葚胚及囊胚方向发育。组合添加用于水牛卵母细胞成熟培养，具有相互协同促进卵母细胞成熟的作用。
发明内容
针对现有方法受精后的水牛卵母细胞发育率低下的问题，本发明提出一种水牛卵母细胞体外成熟培养方法。
本发明的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于包括下列步骤：
步骤一，卵母细胞准备：收集水牛卵巢，用含双抗生理盐水进行清洗，将卵巢上的血液洗净，消毒纱布吸干，吸取卵巢上的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中恒温保存；
步骤二，IVM培养小滴制备：在培养皿中放入体外成熟培养液，制备IVM小滴，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡2h；
步骤三，体外成熟培养：将步骤一中收集的液体倒入有洗卵液的培养皿中，显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移至加有DPBS的培养皿中洗涤，然后在体外成熟培养液中洗涤，将洗涤后的卵母细胞放入步骤二制备的IVM培养小滴中进行成熟培养24～26h，倒置显微镜下观察，卵丘细胞扩散、卵周隙扩大并有第一极体（PBI）排出、胞质均一的为成熟卵母细胞。
步骤一中，选择直径2～8mm的有腔卵泡；将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中，试管试管放置在30～35℃的恒温水浴锅中。
步骤二中，在吸取卵母细胞前至少2h制备IVM小滴；制备好IVM小滴的培养皿放入CO2培养箱中平衡至少2h，平衡条件为39℃，5％CO2的饱和空气。
步骤三中所有操作必须在39℃的显微镜恒温台上进行，并保持室温在25～30℃，在培养皿中加入洗卵液后，将洗卵液的试管收集的液体置入培养皿中并用洗卵液冲洗试管2次，然后在显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移置加有DPBS的直径35mm培养皿中。
可选用的体外成熟培养液为：
A液：TCM199+80-120mL/LFBS
B液：A液+0.008-0.012u/mLoFSH
C液：A液+0.8-1.2μg/mL17β-E2
D液：A液+1.5-2.5mmol/LGSH
E液：A液+0.008-0.012u/mLoFSH+0.8-1.2μg/mL17β-E2+1.5-2.5mmol/LGSH
上述体外成熟培养液对水牛卵母细胞成熟率、卵裂率、8-cell率、桑葚率及囊胚率影响见表1。
表一。
组别 COCs数 COCs成熟率/% 卵裂率/% 8-cell率/% 桑葚率/% 囊胚率/%
A液 72 51.7±3.46a 17.8±0.69a 8.9±0.40a
B液 83 62.2±1.33b 57.7±4.30b 24.1±2.98b
C液 83 67.4±1.27c 53.2±3.59c 29.6±4.44c
D液 94 68.2±1.87c 70.3±3.12d 60.0±5.10d 45.5±2.20a 28.3±4.68a
E液 89 79.7±1.77d 69.5±4.01d 60.4±5.41d 47.6±4.10b 28.8±1.12a
最优的，所述的体外成熟培养液为：TCM199+100mL/LFBS+0.01u/mLoFSH+1.0μg/mL17β-E2+2.0mmol/LGSH。
在卵母细胞成熟培养液中添加生殖激素oFSH、17β-E2和抗氧化剂GSH均能够促进水牛卵母细胞体外成熟及卵裂，特别是GSH能够促进卵裂向桑葚及囊胚方向发育。成熟培养液采用生殖激素oFSH、17β-E2和抗氧化剂GSH组合，与单独添加对比，组合添加总体效果更好，更能促进水牛卵母细胞成熟发育。
本发明的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，能显著促进卵母细胞的细胞质成熟，解决了目前水牛体外成熟的卵母细胞受精后胚胎体外发育率低的问题；本发明的成熟培养液能促进水牛卵母细胞成熟发育，且对维持卵母细胞和早期胚胎形态有良好作用。
具体实施方式
实施例1：步骤一，卵母细胞的准备：收集水牛卵巢，所有卵巢用保温瓶在25～35℃的含双抗生理盐水中3～4h内运回。用肥皂清洗双手，将卵巢转换到广口保温瓶中，倒入含双抗生理盐水至浸没卵巢，用手清洗卵巢，尽量将卵巢上的血液洗净，消毒纱布吸干，吸取卵巢上直径2mm的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中（试管放置在30～35℃的恒温水浴锅中）。
步骤二，IVM培养小滴制备：在吸取卵母细胞前至少2h制备IVM小滴。IVM小滴的制备必须在超净工作台操作。用微量移液器吸取50μLIVM培养液，滴于直径35mm的培养皿中，每个培养皿制备7个IVM小滴。小滴制备完毕后，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡2h。平衡条件为39℃，5％CO2的饱和空气；
步骤三，体外成熟培养：所有操作必须在显微镜恒温台上（39℃）进行，并保持室温在25～30℃左右，在大培养皿中加入洗卵液后，将吸卵液的试管收集的液体置入培养皿中并用洗卵液冲洗试管2次。然后在显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移置加有DPBS的直径35mm培养皿中。将卵母细胞再在DPBS的培养皿中洗涤2次，体外成熟培养液中洗涤2次，立即将卵母细胞转移至IVM培养小滴中（10个卵母细胞／小滴）进行成熟培养。培养条件为39℃，5％CO2的饱和空气，培养时间为24h，在倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散、卵周隙扩大并有第一极体（PBI）排出、胞质均一来判断卵母细胞成熟。
本例采用的成熟培养液为TCM199++100mL/LFBS+2.0mmol/LGSH
实施例2：步骤一，卵母细胞的准备：收集水牛卵巢，所有卵巢用保温瓶在25～35℃的含双抗生理盐水中3～4h内运回。用肥皂清洗双手，将卵巢转换到广口保温瓶中，倒入含双抗生理盐水至浸没卵巢，用手清洗卵巢，尽量将卵巢上的血液洗净，消毒纱布吸干，吸取卵巢上直径8mm的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中（试管放置在30～35℃的恒温水浴锅中）。
步骤二，IVM培养小滴制备：在吸取卵母细胞前至少2h制备IVM小滴。IVM小滴的制备必须在超净工作台操作。用微量移液器吸取50μLIVM培养液，滴于直径35mm的培养皿中，每个培养皿制备7个IVM小滴。小滴制备完毕后，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡2h。平衡条件为39℃，5％CO2的饱和空气。
步骤三，体外成熟培养：所有操作必须在显微镜恒温台上（39℃）进行，并保持室温在25～30℃左右，在大培养皿中加入洗卵液后，将吸卵液的试管收集的液体置入培养皿中并用洗卵液冲洗试管2次。然后在显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移置加有DPBS的直径35mm培养皿中。将卵母细胞再在DPBS的培养皿中洗涤2次，成熟培养液中洗涤2次，立即将卵母细胞转移至IVM培养小滴中（10个卵母细胞／小滴）进行成熟培养。培养条件为39℃，5％CO2的饱和空气，培养时间为24h，在倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散、卵周隙扩大并有第一极体（PBI）排出、胞质均一来判断卵母细胞成熟。
本例采用的成熟培养液为TCM199+100mL/LFBS+0.01u/mLoFSH+1.0μg/mL17β-E2+2.0mmol/LGSH。

Claims (5)

1.水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于包括下列步骤：
本发明的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于包括下列步骤：
步骤一，卵母细胞准备：收集水牛卵巢，用含双抗生理盐水进行清洗，将卵巢上的血液洗净，消毒纱布吸干，吸取卵巢上的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中恒温保存；
步骤二，IVM培养小滴制备：在培养皿中放入体外成熟培养液，制备IVM小滴，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡2h；
步骤三，体外成熟培养：将步骤一中收集的液体倒入有洗卵液的培养皿中，显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移至加有DPBS的培养皿中洗涤，然后在体外成熟培养液中洗涤，将洗涤后的卵母细胞放入步骤二制备的IVM培养小滴中进行成熟培养24～26h，倒置显微镜下观察，卵丘细胞扩散、卵周隙扩大并有第一极体（PBI）排出、胞质均一的为成熟卵母细胞。
2.如权利要求1所述的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于步骤一中，选择直径2～8mm的有腔卵泡；将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCs）放入事先添加吸卵液的试管中，试管试管放置在30～35℃的恒温水浴锅中。
3.如权利要求1所述的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于步骤二中，在吸取卵母细胞前至少2h制备IVM小滴；制备好IVM小滴的培养皿放入CO2培养箱中平衡至少2h，平衡条件为39℃，5％CO2的饱和空气。
4.如权利要求1所述的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于步骤三中操作在39℃的显微镜恒温台上进行，保持室温在25～30℃，在培养皿中加入洗卵液后，将洗卵液的试管收集的液体置入培养皿中并用洗卵液冲洗试管2次，然后在显微镜下查找卵母细胞，将可用的A、B级卵母细胞移置加有DPBS的直径35mm培养皿中。
5.如权利要求1所述的水牛卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于体外成熟培养液由TCM199、FBS、oFSH、17β-E2、GSH组成。
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