CN102258004B - 一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法 - Google Patents
一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法。本发明提供的方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，在20至30℃之间在体外保存/培养卵母细胞，以抑制卵母细胞生发泡破裂。这种方法可以大大的提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为科研上利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；生发泡期卵母细胞常温保存/培养有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法。猪卵泡液易于制取，能够制成商品化制剂。这种方法对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生殖生物学领域，是一种利用生理性成分维持生发泡期(Germinal Vesicle，GV)卵母细胞减数分裂停滞、抑制卵母细胞生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)的方法，是猪卵泡液的一种新用途的开发利用。
背景技术
体外成熟的卵母细胞发育能力显著低于体内成熟的卵母细胞。卵母细胞在进行核成熟的同时发生胞质成熟，从而支持随后成功发育到期。体内卵母细胞发生一系列的事件包括减数分裂前期的转录和翻译胞质逐渐成熟，然而体外从卵泡中获取的卵母细胞在转入培养液中后还没获得胞质成熟就提前发生减数分裂恢复。
为了提高体外成熟卵母细胞的质量，目前主要采取药理学的方法维持减数分裂停滞，主要包括使用蛋白合成抑制剂或者磷酸化抑制剂(Fulka等，Mol Reprod Dev，29：379-384(1991)；Lonergan等，J Reprod Fertil，109：355-365(1997)；Avery等，Mol Reprod Dev，50：334-344(1998)；Li等，Acta Zoologial Sinica，47(6)：684-690(2001)；Le Beux等，Theriogenology，60：1049-1058(2003))以及cAMP转导抑制剂(Sirard等，Theriogenology，49：483-497(1998))。然而，药物虽然能够有效抑制卵母细胞GVBD发生，却往往对卵母细胞有一定的毒性。理论上低温下培养可以维持卵母细胞减数分裂停滞。然而较低温显著降低正常减数分裂纺锤体的形成(Wu等，MolReprod Dev，54：388-395(1999))并且低温保存的卵母细胞经体外受精显著降低受精率。由此我们需要寻找一个适度的温度条件来保存卵母细胞，并且能够维持其减数分裂停滞状态。有报道在培养液中添加部分卵泡液(Leibfried和First，Bio reprod，23：699-704(1980))可以用来维持减数分裂停滞，但维持时间很短。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种体外保存/培养卵母细胞以抑制卵母细胞生发泡破裂的方法及其应用。本发明的另一个目的是提供卵泡液在卵母细胞体外保存/培养中的应用。本发明又一个目的是提供包含卵泡液的制剂及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种体外保存/培养卵母细胞的方法，所述方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂即维持卵母细胞减数分裂。
优选地，所述抑制卵母细胞生发泡破裂的保存/培养温度为20-30℃，优选为27-28℃。
优选地，所述方法中每10～100μl卵泡液保存/培养1～10个卵母细胞；优选为每10μl卵泡液保存/培养1个卵母细胞。
优选地，所述方法还包括在用卵泡液保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液漂洗卵母细胞，并用卵泡液清洗卵母细胞的步骤。
优选地，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液；进一步优选地，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤：1)抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2)离心，取上清；3)过滤除菌。优选地，在制备保存卵泡液时，可在步骤2)之后和步骤3)之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。上清液优选在0℃～-20℃冻融，进一步优选在-20℃冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。
优选地，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，进一步优选为生发泡期的猪卵母细胞。
另一方面，本发明提供了上述的方法在卵母细胞的体外保存/培养或者在卵母细胞体外成熟的控制和优化中的应用。
优选地，所述应用中的卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，优选为猪卵母细胞，进一步优选为生发泡期的猪卵母细胞。
此外，本发明还提供了卵泡液在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂中的应用；优选地，所述卵泡液选自猪或牛的卵泡液；进一步优选地，所述卵泡液选自猪的卵泡液。
优选地，所述应用中的猪卵泡液的制备方法包括以下步骤：1)抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2)离心，取上清液；3)过滤除菌。优选地，在制备保存卵泡液时，可在步骤2)之后和步骤3)之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。上清液优选在0℃～-20℃冻融，进一步优选在-20℃冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。
优选地，所述猪卵泡液通过以下方法制备：1)选取直径为2-6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；2)15000转/分钟离心15min，取上清，-20℃冻融后再15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3)收集上清，过滤除菌。
又一方面，本发明提供一种用于保存卵母细胞的制剂，所述制剂包含猪或牛的卵泡液；优选包含猪的卵泡液。
优选地，所述猪卵泡液采用以上方法制备。
本发明还提供所述制剂在保存卵母细胞中的应用。
优选地，所述制剂用于保存猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，进一步优选保存猪卵母细胞，更优选为保存生发泡期的猪卵母细胞。
综上所述，本发明首次尝试了完全采用卵泡液制备的保存液结合不同的温度来保存和培养哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞，得到了非常令人满意的结果，全卵泡液能够有效抑制猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞GVBD的发生。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供一种维持猪卵母细胞减数分裂停滞的方法，该方法包括将猪卵母细胞在适宜的温度下保存和培养在保存培养液中。优选地，所述猪卵母细胞为处于生发泡期的猪卵母细胞。
优选地，用于保存和培养猪卵母细胞的保存培养液通过以下步骤制备：1)抽取猪卵泡液，自然沉降；2)离心，取上清液；3)过滤除菌。优选地，在制备保存培养液时，可在步骤2)之后和步骤3)之前将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。优选地，上清液在0℃～-20℃冻融，优选为-20℃冻融。优选地，进行冻融、再次离心取上清液的步骤可以根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。
优选地，在本发明提供的维持猪卵母细胞减数分裂停滞的方法中，将猪卵母细胞在20-30℃的温度下保存和培养。进一步优选地，猪卵母细胞在27-28℃的温度下保存和培养。
另一方面，本发明提供上述方法在保存和培养卵母细胞或卵母细胞体外成熟研究、生产中的应用。优选地，所述卵母细胞为猪卵母细胞。进一步优选地，该猪卵母细胞为处于GV期的猪卵母细胞。
又一方面，本发明提供包含以上方法所述的保存培养液的制剂。
再一方面，本发明提供包含以上方法所述的保存培养液的制剂在保存和培养卵母细胞或卵母细胞体外成熟研究、生产中的应用。优选地，所述卵母细胞为猪卵母细胞。进一步优选地，所述猪卵母细胞为处于GV期的猪卵母细胞。
与现有技术相比，本发明的方法将猪卵泡液制备的保存培养液来保存和培养生发泡期(GV)的猪卵母细胞，在将温度控制在20到30℃之间时，该方法能够有效抑制部分卵母细胞在GV期，温度控制在27-28℃时抑制效果最好，保存三天超过60％的卵母细胞停滞在GV期，且成熟培养后排出第一极体，略低于新鲜卵母细胞的成熟率。该方法采用的保存培养液高效、廉价、方便、以及来源容易，取得很好的临床效果，实验结果可重复性强。采用本发明的步骤制备的保存培养液可以制成商品化的制剂，用于猪卵母细胞及其他动物类型卵母细胞的常温保存和提高体外成熟效果。具体而言，本发明至少具有以下优点：
1、本发明的方法可以大大提高卵巢卵母细胞在科研和畜牧业生产上的利用率，为利用屠宰场卵巢解除了时间上的限制，便于体外操作时间的安排；
2、本发明的方法可以将GV期卵母细胞在常温下保存和培养，有助于提高卵母细胞体外成熟质量，促进核成熟和胞质成熟同步，是一种最佳的不依赖于抑制剂的生理学控制核成熟进程的方法，对于动物胚胎工程以及人类辅助生殖技术研究和应用都有重要意义；
3、猪卵泡液易于获取，并且通过本发明的方法制备的保存培养液高效、廉价、方便、来源容易以及对细胞没有毒性，可以取得很好的临床效果；
4、通过本发明的方法制备的保存培养液，可以制成商品化的制剂，并可用于猪卵母细胞以及其他动物类型卵母细胞的常温保存或者体外成熟的研究和生产应用。
采用本发明技术制备的保存培养液进行猪卵母细胞常温保存，尤其是在27.5℃保存能够有效抑制卵母细胞GVBD，且保留大部分的发育潜能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法和产品进行说明，而不是为了限制本发明的范围。
如无特殊说明，实施例中所使用的试剂均购自Sigma(St.Louis，MO)公司。
实施例1：用于培养/保存猪卵母细胞的保存培养液的制备
选择北京第五肉联厂刚刚屠宰的3-5个月龄的青年母猪，在宰杀后立即获取卵巢，并确定卵巢上不带有黄体。将卵巢盛于含有75μg/ml青霉素和50μg/ml链霉素的25-30℃生理盐水中，在2h内运到实验室。
在JJ-CJ-1FD型洁净工作台(净化等级为100级，吴江市净化设备总厂生产)上，采用固定有18号针头的20ml一次性注射器(上海米沙瓦伊科工业有限公司生产)从2-6mm直径的猪卵泡中抽取猪卵泡液(porcine follicularfluid，pFF)；此步骤也可采用固定有18号针头的吸液泵在低真空条件下进行，猪卵泡液放入50ml锥形瓶(Falcon公司生产)中自然沉降15min，取上清立刻15000转/分钟离心15min，上清经-20℃冻融后15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀。最后将上清收集，用Millex0.22μm孔径的滤器(Carrighwohill，Co.Cork，Ireland)过滤除菌，分装冷冻保存备用(三个月内使用保存于-20℃，更长时间保存于-70℃)。
实施例2：GV期猪卵母细胞的获取和保存
在JJ-CJ-1FD型洁净工作台上，将实施例1中猪卵泡液自然沉降获得的沉淀用TCM-199清洗两遍，在C-DS型显微镜(Nikon公司生产)下用口吸管选择卵丘细胞包裹紧密、卵母细胞胞质颗粒分布均匀的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，用TCM-199漂洗3遍，然后在猪卵泡液中洗三遍。
A.采用pFF培养滴和TCM-199培养滴在不同温度下保存GV期的猪卵母细胞的对比实验
以200μl制备的保存培养液/滴的量制备pFF培养滴；配制TCM-199，以200μl制备的TCM-199/滴的量制备TCM-199对照培养滴，然后将两种培养滴放在SPX-50型20-30度生化培养箱(宁波江南仪器厂生产)中提前预热2小时。
将准备好的卵丘-卵母细胞复合体分别放入两种培养滴中，每个滴放入约20个COCs。将含有卵丘-卵母细胞复合体的培养滴置于培养皿中，然后放置于Hera Cell 150型细胞培养箱(Thermo公司生产)中，在表1所示的不同温度下保存3天。
保存3天后检测卵丘-卵母细胞复合体减数分裂受到抑制的情况。将卵丘-卵母细胞复合体置于载玻片上并在新配制的固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)中，室温下固定48-72小时，固定后的细胞在1％(w/v)地衣红(溶于45％醋酸)中染色5分钟，然后在400×相差显微镜下观察。根据细胞核膜是否完整，将卵母细胞分为生发泡期(GV)和生发泡破裂期(GVBD)。结果见下表1。
表1：不同温度下保存GV期猪卵母细胞3天
该代表性实验优选出猪卵泡液(porcin follicular fluid，pFF)在20-30℃能够抑制GV期猪卵母细胞生发泡破裂，而且进一步优选出27.5℃抑制率最高，TCM-199为对照组。
B.27.5℃条件下以不同时间保存GV期猪卵母细胞
在27.5℃条件下保存GV期猪卵母细胞，在保存的第1天、第2天和第3天分别取细胞进行GV期检验，结果见表2。
表2：27.5℃条件下保存不同时间GV期猪卵母细胞
用卵泡液保存GV期猪卵母细胞具有时间依赖性，随时间延长效果下降，第二天下降最明显，保存三天仍有一半以上维持在GV期。
实施例3：卵母细胞体外成熟的检验
将实施例2中保存3天的猪卵母细胞复合体取出，和新鲜卵母细胞一起在TCM-199操作液中洗三遍，然后在成熟培养液中洗三遍，放入提前预热(预热温度38.5℃)的成熟培养滴中，在38.5℃、5％CO2和100％湿度的细胞培养箱中培养。其中，成熟培养液为改进的TCM-199(Gibco，Grand Island，NY)添加了75μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，0.57mM半胱氨酸，0.5μg/mlFSH，0.5μg/ml LH和10ng/ml EGF；成熟培养滴为成熟培养液做成的100μl的微滴，每滴培养25枚卵母细胞。
在实体显微镜下观察卵母细胞是否排出第一极体。由于猪卵母细胞极体极小，在40×显微镜下用吸管拨动，使卵母细胞旋转到各个表面，从而找到第一极体。结果表明培养44小时卵母细胞排出第一极体，达到成熟。结果见表3。
表3：保存3天后卵母细胞成熟率
该实施例中，卵母细胞在卵泡液中保存三天保留了大部分的发育潜能，能够排出极体，达到成熟。
实施例4：卵母细胞微丝完整率和GSH含量的检测
1、卵母细胞微丝完整率的检测
检测新鲜卵母细胞和实施例2中保存3天的卵母细胞的微丝完整率。卵母细胞用酸性台氏液(pH2.5)去掉透明带，用4％多聚甲醛(pH7.4PBS稀释)室温固定至少30min。1％Triton X-10037℃下透膜过夜，阻断液是含1％BSA的PBS，阻断1小时，接着转入1∶100稀释的FITC偶联的鬼笔环肽(1μg/ml稀释于封闭液中)在室温孵育2小时。含0.1％Tween 20和0.01％Triton X-100的PBS洗三次，每次5min，之后用PI(10μg/ml in PBS)染核10min。最后将充分清洗后卵母细胞封于载玻片上使用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510META)观察。结果见表4。
表4：保存3天后卵母细胞微丝完整率
从表4结果可见，在卵泡液中保存三天后以微丝为代表的细胞骨架保持完好，与新鲜的GV期卵母细胞没有明显的差别，而在对照组TCM-199中保存三天，微丝完整性遭到严重破坏。
2、卵母细胞GSH含量的检测
检测新鲜卵母细胞和实施例2中保存3天的卵母细胞的谷胱甘肽含量。将30个卵母细胞转移至含有5μl蒸馏水的1.5ml离心管中，加入5μl1.25M磷酸。随后样品在-70℃和室温条件下反复冻融三次，然后储存于-70℃直到进行分析。卵母细胞中的GSH含量应用DTNB-GSSG还原酶进行分析。简要阐述如下：将700μl含有0.33mg/ml NADPH的0.2M的磷酸缓冲液(含有10mM EDTA，PH 7.2)，100μl含有6mM 5，5’dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)的磷酸缓冲液及190μl蒸馏水加入含有样品的离心管中，混匀后加入10μl 250IU/ml的GSH还原酶起始反应。样品412nm光吸收值应用可见光分光光度计进行检测，每半分钟记录数据变化，共记录3分钟。不同浓度GSH标准样品(0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0mM)同样进行分析，并依据此决定实验组样品中每个卵母细胞GSH含量。结果见表5。
表5：保存3天后卵母细胞GSH含量
还原型GSH(谷胱甘肽)是细胞中最重要的抗氧化应激物质，是衡量胞质质量的一个最重要指标，该实施例中，在卵泡液中保存三天后卵母细胞胞质中GSH含量显著高于对照组TCM-199中保存三天的卵母细胞。
实施例5：卵泡液在维持GV期小鼠卵母细胞方面的应用
本实施例参照实施例2中的保存方法，用实施例1所制备的卵泡液保存小鼠卵母细胞，结果如表6所示。
表6：GV期小鼠卵母细胞在27.5℃下保存24小时
GV期小鼠卵母细胞在分别在M2(小鼠卵母细胞和胚胎常规培养液)和pFF中保存24小时，pFF中保存的卵母细胞有78.08％维持在GV期，显著高于在M2中保存的，在M2中仅有33.33％还维持在GV期。小鼠卵母细胞由于含脂滴少，生发泡比猪的更容易观察，不需要地衣红染色，直接在体视显微镜下就能够辨别。
Claims (23)
1.一种体外保存/培养卵母细胞的方法，其中，所述方法采用卵泡液作为卵母细胞体外保存/培养的保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂，所述抑制卵母细胞生发泡破裂的保存/培养温度为27.5℃；其中，所述卵泡液为猪的卵泡液。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法中每10～100μl卵泡液保存/培养1～10个卵母细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述方法中每10μl卵泡液保存/培养1个卵母细胞。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在用卵泡液保存/培养卵母细胞之前，用TCM-199培养液漂洗卵母细胞，并用卵泡液清洗卵母细胞的步骤。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤：1）抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2）离心，取上清；3）过滤除菌。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述步骤2）之后和步骤3）之前还包括将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述上清液在0℃～-20℃冻融。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述上清液在-20℃冻融。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述进行冻融、再次离心取上清液的步骤根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述猪卵泡液通过以下方法制备：1）选取直径为2-6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；2）15000转/分钟离心15min，取上清，-20℃冻融后再15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3）收集上清，过滤除菌。
11.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述卵母细胞为猪卵母细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述卵母细胞为生发泡期的猪卵母细胞。
14.权利要求1至5中任一项所述的方法在卵母细胞的体外保存/培养或 者在卵母细胞体外成熟的控制和优化中的应用；
其中，所述卵母细胞选自哺乳动物中猪、小鼠、大鼠、兔的卵母细胞。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述卵母细胞为猪卵母细胞。
16.如权利要求14所述的应用，其中，所述卵母细胞为生发泡期的猪卵母细胞。
17.卵泡液在体外保存/培养卵母细胞中作为保存液或培养液，以抑制卵母细胞生发泡破裂中的应用；其中，所述卵泡液选自猪的卵泡液，所述抑制卵母细胞生发泡破裂的保存/培养温度为27.5℃。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述猪卵泡液的制备方法包括以下步骤：1）抽取猪卵泡液，自然沉降，取上清；2）离心，取上清；3）过滤除菌。
19.如权利要求18所述的应用，其中，在制备保存卵泡液时，在步骤2）之后和步骤3）之前还包括将获得的上清液进行冻融、再次离心取上清。
20.如权利要求19所述的应用，其中，所述上清液在0℃～-20℃冻融。
21.如权利要求20所述的应用，其中，所述上清液在-20℃冻融。
22.如权利要求19所述的应用，其中所述进行冻融、再次离心取上清液的步骤根据实际情况重复，并将重复获得的上清液过滤除菌。
23.如权利要求18所述的应用，其中，所述猪卵泡液通过以下方法制备：1）选取直径为2-6mm的猪卵泡，抽取卵泡液，自然沉降15min，取上清；2）15000转/分钟离心15min，取上清，-20℃冻融后再15000转/分钟离心15min，再反复冻融离心两次，每次取上清，弃沉淀；3）收集上清，过滤除菌。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN1242017A (zh) * | 1996-12-20 | 2000-01-19 | 诺沃挪第克公司 | 调节减数分裂的化合物 |
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Non-Patent Citations (6)
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| effect of exposure duration of ovaries and oocytes at ambient temperature on parthenogenetic developmeng of porcine follicular oocytes;Hyun-jong KIM et al.;《journal of reproduction and development》;20061231;第52卷(第5期);第633页摘要以及第637页右栏讨论部分 * |
| Hyun-jong KIM et al..effect of exposure duration of ovaries and oocytes at ambient temperature on parthenogenetic developmeng of porcine follicular oocytes.《journal of reproduction and development》.2006,第52卷(第5期),第633页摘要以及第637页右栏讨论部分. |
| 不同浓度的牛卵泡液对牛卵母细胞体外核成熟率的影响;于进亮等;《安徽农业科学》;20071231;第35卷(第17期);第5166页 * |
| 于进亮等.不同浓度的牛卵泡液对牛卵母细胞体外核成熟率的影响.《安徽农业科学》.2007,第35卷(第17期),第5166页. |
| 哺乳动物的卵母细胞成熟机理;孙青原等;《黑龙江动物繁殖》;19951231;第3卷(第1期);第41-43页 * |
| 孙青原等.哺乳动物的卵母细胞成熟机理.《黑龙江动物繁殖》.1995,第3卷(第1期),第41-43页. |
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