CN102978154A

CN102978154A - 一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法

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Publication number: CN102978154A
Application number: CN2012105642509A
Authority: CN
Inventors: 王志钢; 刘东军; 旭日干
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2012-12-23
Filing date: 2012-12-23
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-12-23
Also published as: CN102978154B

Abstract

本发明公开了一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：(1)采样；(2)内蒙古白绒山羊耳尖皮肤组织原代培养；（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化。本发明经过一次原代培养同时获得了高活力的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株,为深入开展内蒙古白绒山羊转基因研究、分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了试验材料与技术支持。

Description

一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体而言，涉及以取自活体内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织块为材料，同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法。

背景技术

内蒙古白绒山羊是经过长期自然选育形成的优良地方性绒肉兼用型品种，所产羊绒具有径细绒长、综合品质优良的特点。然而，由于近年来草场退化，种群数量增加，舍饲比例加大，导致内蒙古白绒山羊的产绒量降低。通过转基因技术导入促进毛囊发育和绒毛生长的功能基因，培育高产绒量新品系是解决这一问题的有效手段。

在高产绒量转基因绒山羊新品系的研究中，构建功能基因的皮肤特异性表达载体是关键步骤之一，而实现功能基因在皮肤特异性表达的关键在于构建载体时在功能基因上游引入皮肤特异性表达的启动子元件，以驱动功能基因的表达。在实际操作中，选择的皮肤特异性启动子的功能首先需得到验证，具体包括两个方面：一方面是这个启动子在皮肤细胞中的有效性，即是否工作及工作效率如何；另一方面是启动子的特异性，即应该是只在皮肤细胞中表达，在其它细胞中不表达或表达微弱。要实现启动子功能的验证，唯一简单的办法是将含有皮肤特异性启动子的载体同时转染皮肤细胞和其它非细胞，进而检测其有效性和特异性。鉴于此,通过试验研究获得内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株及表皮细胞株，这显得尤为重要。

细胞培养技术是生命科学研究领域的重要手段，细胞的生长需要一定的营养环境,包括温度、湿度、气体及培养液。用于维持细胞生长的营养基质称为培养液。目前商品化的细胞培养液较多，有MEM系列，DMEM，RPMI-1640系列，199系列等。迄今，在众多培养液中，哪种培养液可以用于绒山羊皮肤成纤维细胞及表皮细胞的培养尚未见报道。另外，通过一次原代培养同时获得绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的方法亦在现有技术中未见报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过研究同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，从而获得内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株，为开展内蒙古白绒山羊分子生物学和细胞生物学的相关研究及转基因研究提供了试验材料。

本发明的目的是这样实现的：

一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：

（1）采样:从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70-75%（v/v）酒精中浸泡约45-60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中，剪碎；

（2）内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养:将皮肤组织块均匀接种在培养瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液，拧紧瓶盖，以组织块在上、培养液在下的方式放入培养箱，静置3～4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，在培养箱内静置培养，每2-4d更换一次新鲜培养液，培养11-17d后，得到皮肤成纤维细胞与上皮细胞的混合原代细胞培养物；

（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化：将步骤（2）所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用1-2mL含0.25%（w/v）胰蛋白酶和0.02%EDTA（w/v）的D-Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2～3次选择传代，得纯化的皮肤成纤维细胞株；吸取所述细胞悬液后的培养瓶用PBS洗涤，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液继续放入培养箱培养，待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2～3次选择传代，得纯化的表皮细胞株。

本发明的目的还可以这样实现：

所述的双抗是终浓度为100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素。

所述的PBS由8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH=7.4。

步骤（2）和（3）中所述含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液是含10%（v/v）胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素及15ng/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液。

步骤（2）和（3）中所述培养箱为37℃、含5%CO₂，的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。

与现有技术相比，本发明涉及的分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法具有以下优点和显著进步:

（1）本发明通过研究同时获得了内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，进而获得了内蒙古白绒山羊的皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株,为开展内蒙古白绒山羊转基因研究及分子生物学和细胞生物学的相关研究提供了试验材料。

（2）本发明在进行组织块贴壁法原代培养时,根据上皮细胞与成纤维细胞对TE液（含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D-Hanks液）消化敏感性的不同及二者贴壁强度的差异，将二者分离、纯化。具体而言，通过控制合适的消化时间使成纤维细胞脱壁,而上皮细胞因脱壁较慢仍贴在培养瓶壁上，分瓶培养后，只需经过几次传代就可以得到纯化的皮肤成纤维细胞（参见图2）、表皮细胞(参见图3)，通过一次原代培养同时获得了高活力的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞两种细胞株。

附图说明

图1为本发明内蒙古白绒山羊耳尖皮肤组织经培养前消毒处理及剔毛处理后,采用组织块贴壁法进行原代培养,经8天培养组织块周围有成纤维细胞和表皮细胞长出,环绕于组织块周围；A为皮肤成纤维细胞，B为表皮细胞，C为皮肤组织块。

图2为本发明原代培养的皮肤细胞经过3次传代以后得到的较纯的皮肤成纤维细胞,细胞呈梭型。

图3为本发明原代培养的皮肤细胞经过3次传代以后得到的较纯的表皮细胞,细胞呈圆形。

图4为本发明获得的皮肤成纤维细胞的染色体数量分析图，染色体数量为2n=60。

图5为本发明获得的表皮细胞的染色体数量分析图，染色体数量为2n=60。

图6为本发明获得的皮肤成纤维细胞的生长曲线图。

图7为皮肤特异性表达载体pDsR-K14p转染本发明获得的皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞48小时红色荧光表达情况照片；A、B为胎儿成纤维细胞，C、D为皮肤成纤维细胞；A、C为光镜照片，B、D为荧光照片；皮肤成纤维细胞中红色荧光蛋白的表达量较胎儿成纤维细胞为多。

图8为表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsRK14p转染绒山羊胎儿成纤维细胞48h的VEGF表达实时定量PCR分析图，转染组细胞中VEGF表达量与对照组差别不大。

图9为表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染绒山羊皮肤成纤维细胞48h的VEGF表达实时定量PCR分析图，转染组细胞中VEGF表达量与对照组差别较大。

图10为表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染绒山羊皮肤成纤维细胞或胎儿成纤维细胞48h，转染细胞及对照组细胞中VEGF的表达量比较图；K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp转染绒山羊皮肤成纤维细胞中VEGF表达量较高，表明K14启动子特异性地在皮肤细胞中高表达。

具体实施方式

通过下面的实施例对本发明作进一步解释和说明，但这并不限制本发明的保护范围。以下实施例中采用试剂的配制方法如下：

PBS：在800ml蒸馏水中溶解氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，用盐酸调pH值至7.4，加水定溶至1L。灭菌后室温保存备用。

培养液：含10%FBS（胎牛血清）、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL及15ng/mLEGF（表皮生长因子）的DMEM/F12培养液。

D-Hanks液：在800mL蒸馏水中溶解氯化钾(KCl)0.4g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.06g，氯化钠(NaCl)8.0g，碳酸氢钠（NaHCO₃）0.35g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)0.132g，D-葡萄糖1.0g，酚红（0.1%）1mL，上述试剂依次加入，溶解后定容至1L。10磅，10min高压灭菌，室温储存。

冷冻液：由占总溶液体积20%的胎牛血清(FBS)和10%二甲基亚矾(DMSO)及70%的DMEM/F12液和双抗（终浓度为100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素）组成。

实施例1：内蒙古白绒山羊的皮肤组织采样

从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织。采集耳尖皮肤时，耳尖剃毛，碘酒消毒，70%酒精脱碘，无菌手术剪剪取整个耳尖（约2～3cm²）置37℃，含青霉素(100IU/mL)、链霉素(100IU/mL)生理盐水中，1-2h内带回实验室。羊耳伤口部分用消炎粉止血。带回实验室的耳尖组织再用生理盐水冲洗3遍，于超净工作台中，无菌手术剪剪去耳尖皮肤，用含有青霉素(100IU/mL)、链霉素(100IU/mL)的PBS洗涤皮肤组织3次，清除血迹及其它杂质。用眼科剪仔细去除附着在耳朵皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70%酒精中浸泡约45-60s后，再用含有青霉素(100IU/mL)、链霉素(100IU/mL)的PBS洗涤3次，置含有青霉素(100IU/mL)、链霉素(100IU/mL)的DMEM/F12液中，使用眼科剪将耳朵皮肤剪切成1mm³大小的组织块。

实施例2：内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养及皮肤成纤维细胞和表皮细胞的分离纯化

将皮肤组织块按5mm左右间隔，接种在T₂₅培养瓶的瓶壁，尽量使组织块的切面贴在瓶壁上，这样组织块更容易粘附瓶壁。加5mL培养液（含10%FBS、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL及15ng/mL EGF的DMEM/F12培养液），拧紧瓶盖，以组织块在上，培养液在下的方式放入培养箱，静置3～4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，尽量避免组织块浮起，在37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱内静置培养3d后，换5mL新鲜培养液。以后每3d换培养液一次，8～10d可明显看到组织块周围有细胞长出，首先长出的是梭形的成纤维细胞，生长较快，通常位于连片生长的细胞生长区外缘；随后是圆形的表皮细胞出现，通常位于组织块周围（内缘）。细胞向周围扩展（参见图1），2周左右由组织块长出的细胞汇合，细胞铺满瓶底，取出组织块后可消化传代、分离和纯化。以后细胞每长到70%～80％汇合度时传代一次。

根据上皮细胞与成纤维细胞对TE（含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D-Hanks液）消化敏感性的不同及二者贴壁强度的差异，可以将二者分离。成纤维细胞对TE敏感，贴壁性相对弱，容易消化下来；表皮细胞对TE敏感性查，贴壁性相对强，不易脱壁。在混合生长的原代细胞培养物中，去除培养瓶中的培养液，在培养瓶中加入PBS5mL清洗1次后倒出，再加1mLTE消化液，使之覆盖培养物，室温消化3～4min，倒置显微镜下观察，大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即加入5mL培养液终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，此时成纤维细胞绝大部分可悬浮,而表皮细胞不悬浮。

皮肤成纤维细胞的分离与纯化：吸取细胞悬液装入到15mL离心管中，离心收集细胞(1000r/min,5min)。弃上清，加入5mL培养液使细胞悬浮，计数，接种入新的T25培养瓶中培养。通过2～3次选择传代，可完全纯化成纤维细胞，获得纯净的皮肤成纤维细胞株（参见图2）。

表皮细胞的分离与纯化：上述（3）中所用T₂₅培养瓶在消化、吸出悬浮的成纤维细胞后，吸净培养液，用PBS洗1次，加入5mL培养液继续培养。如还有成纤维细胞长出，重复上述（3）中所述消化步骤，去除成纤维细胞直至消失。待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2～3次选择传递，即可获得纯净的表皮细胞株（参见图3）。

实施例3：内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的冷冻保存

将长至80%～90%汇合的细胞，进行消化（皮肤成纤维细胞消化3～4min，表皮细胞消化5～6min）收集，加入含10%DMSO和20%FBS的DMEM/F12冷冻液，调整细胞密度为2～4×10⁶个细胞/mL分装于1.5mL冻存管中，将冻存管装入冻存盒，－80℃冰箱冻存12h以上，然后直接投入液氮（-196℃）保存。

实施例4：内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的解冻与复苏

将所述的冻存皮肤成纤维细胞和表皮细胞从液氮中取出，立即放入37℃水浴中融化,吸出细胞悬液,加入10倍体积的培养液稀释、洗涤，离心收集细胞(1000r/min,5min)。弃上清，加入5mL培养液，37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱内静置培养。

实施例5：染色体制备及计数

在细胞传代时，将一皿细胞以1.60×10⁴个细胞/mL的浓度接种于T₂₅培养瓶中，12h后换液。继续培养48h后，换成含有终浓度为0.05μg/mL秋水仙胺的培养液，培养5h。吸除培养液，加入0.05%胰酶消化细胞。收集细胞悬液，经1600r/min离心5min，弃上清。加0.075mol/L的氯化钾低渗液于室温下低渗40min，以1600r/min离心5min，弃上清。第一次固定，加入甲醇与冰乙酸的体积比为3∶1的混合液5mL(现用现配)固定30min。以1600r/min离心5min，弃上清。再经第二、三次固定，方法同第一次。弃上清，留0.5～1.0mL制成细胞悬液，用100μl的移液器吸取细胞悬液，滴在冰冷洁净的载玻片上。滴与滴之间勿重叠，置于空气中至少干燥24h。再经Giemsa染色20min，流水冲洗，自然干燥后镜检。挑选形态清晰、分散度良好、收缩适中的染色体中期分裂相，在油镜下进行拍照（图4,图5），并统计染色体数目。染色体数目2n=60。

实施例6：细胞生长曲线测定

细胞生长曲线是测定细胞增殖数量和规律的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标。对于通过原代培养获得的细胞株，细胞生长曲线是所培养细胞生物学特性的基本参数之一。实验采用台盼蓝染色--血球计数板法计数。指数生长期的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞以5×10³/孔的数量接种至24孔板（day0）中（按照每日计数3孔的数目接种）培养，自接种后第1d（day1）开始每日用胰酶消化3孔细胞计数，直至第9d。台盼蓝染色后，显微镜下无色细胞为活细胞，蓝色细胞为死细胞。只对活细胞计数。以细胞数量为纵坐标，时间为横坐标作图，即得生长曲线（图6）。

实施例7：脂质体介导皮肤特异性表达载体pDsR-K14p转染绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞

角蛋白(Keratin)是外胚层细胞的结构蛋白，存在于脊椎动物皮肤、毛发和指甲等部位，调控皮肤角蛋白基因表达的启动子是皮肤特异性的。Keratin14主要表达于表皮基底层细胞，对维持细胞形态及防止细胞溶解起着重要的作用。K14基因的启动子具有较强的皮肤特异性，在皮肤细胞中工作效率较高。为了构建用于转基因克隆绒山羊的皮肤特异性表达载体，我们克隆了人K14启动子。为了检测克隆的K14启动子是否工作，我们利用K14启动子构建了皮肤特异性表达载体pDsR-K14p，转染绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。pDsR-K14p载体中，K14启动子驱动红色荧光蛋白基因表达，如果K14启动子工作，则会在细胞内表达红色荧光蛋白；如果K14启动子具有较强的皮肤特异性，红色荧光蛋白在皮肤成纤维细胞中的表达量应该多于胎儿成纤维细胞，红色荧光蛋白在荧光显微镜下可以观察到。

首先利用限制性内切酶BglII（载体中单一酶切位点）在37℃酶切pDsR-K14p载体使其线性化。酶切质粒经过凝胶电泳检测确认酶切完全后，乙醇沉淀、重新以RNasefree dH2O回溶、经紫外分光光度计检测线性化质粒DNA浓度后，调整DNA浓度（～0.5μg/μl）备用。

然后参照Lipo2000操作说明和要求进行转染实验。转染前一日，胰蛋白酶消化绒山羊胎儿成纤维细胞并进行细胞计数。离心去上清，以无抗生素DMEM/F12+10%FBS培养液重悬细胞，按照2～3×10⁵细胞/孔密度接种六孔培养板。转染当日，用移液器量取10.2μl（0.39μg/μl）线性化质粒pDsR-K14p至2个1.5mL规格Eppendorf管中，用无血清DMEM/F12调整至终体积为250μl；另外2个1.5mL规格Eppendorf管中分别加入Lipo20008μl，以无血清DMEM/F12调整至终体积为250μl，室温放置10min，将质粒和脂质体对应轻轻混匀，室温下静置20min，吸弃细胞原上清液后将同种载体的混合物分别加入绒山羊皮肤成纤维细胞和绒山羊胎儿成纤维细胞的六孔培养板中、前后摇动培养板混匀，在37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下培养，6h后续加500μl DMEM/F12继续培养至48h。荧光显微镜观察，拍照。

检测结果显示细胞内可以看到红色荧光蛋白的表达，皮肤成纤维细胞内多于胎儿成纤维细胞，表明K14启动子工作并具有组织特异性，在皮肤细胞中驱动红色荧光蛋白基因高表达（图7）。

实施例8：皮肤特异性表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsRK14p转染绒山羊皮肤成纤维细胞后VEGF表达情况的实时定量荧光PCR（real-time PCR）检测

我们首先利用克隆的人K14启动子构建了皮肤特异性表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp，该载体中由K14启动子驱动VEGF基因的表达。然后采用脂质体介导法利用K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染绒山羊皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。载体线性化、转染及细胞培养与实施例7中一致。转染后48小时收集细胞，提取总RNA，反转录后获得cDNA。根据GenBank中山羊β-actin以及我们克隆测序的绒山羊VEGF164cDNA序列，采用Primer5.0软件分别设计了一对用于SYBR Green I real-time PCR的引物。上游引物5ˊ-TGCGGGGGCTGCTGTAAT-3ˊ，下游引物5ˊ-GCCCACAGGGATTTTCTT-3ˊ，预期扩增片段186bp；以β-actin为内参基因，。上游引物5ˊ-TGGCACCACACCTTCTACAACGAGC-3ˊ，下游引物5ˊ-CGTCCCCAGAGTCCATGACAATG-3ˊ，预期扩增片段218bp。

结果表明，表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染胎儿成纤维细胞48小时，与未转染的对照组相比，VEGF表达量差别不大（图8）。表达载体K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染皮肤成纤维细胞48小时，与未转染的对照组相比，VEGF表达量差别较大（图9）。综合K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp和pDsR-K14p转染皮肤成纤维细胞或胎儿成纤维细胞48h，比较转染细胞和对照组细胞中VEGF表达量，转染K14p-VEGF-K14PolyA-Loxp–pCDsR-Loxp的皮肤成纤维细胞中VEGF表达量较高（图10），表明K14启动子在皮肤细胞中特异性地高表达。

根据以上实施例的描述可以看出，本发明利用一次耳尖皮肤组织块的原代培养，可同时构建获得内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株。采用本发明获得的皮肤成纤维细胞可以检测外源皮肤特异性启动子的工作效率和特异性，以及用于绒山羊转基因的研究，也可以用于其他相关细胞生物学和分子生物学的研究。

Claims

1.一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：

（1）采样:从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70-75%酒精中浸泡约45-60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中，剪碎；

（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化：将步骤（2）所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用1-2mL含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D-Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2～3次选择传代，得纯化的皮肤成纤维细胞株；吸取所述细胞悬液后的培养瓶用PBS洗涤，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液继续放入培养箱培养，待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2～3次选择传代，得纯化的表皮细胞株。

2.根据权利要求1所述的同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：所述的双抗是终浓度为100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素。

3.根据权利要求1所述的同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：所述的PBS由8g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH=7.4。

4.根据权利要求1所述的同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中所述含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液是含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素及15ng/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液。

5.根据权利要求1所述的同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中所述培养箱为37℃、含5%CO₂，的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。