CN104371969A - 一种改良的干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良的干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法。将NICCs用完全培养基培养至第三天，以每NICCs(IEQ)：EPCs(P3-P5)(个)：MSCs(P3-P5)(个)为1:8:8-1：12:12的细胞比例，用完全培养基重悬三种细胞，并置于不贴壁培养皿或者培养瓶内，37℃恒温箱共培养8-12小时，期间无需摇荡，最后将细胞移入装有培养基的面积约为前培养皿或者培养瓶6倍的培养皿或培养瓶中继续培养，隔天换液一次。本发明方法的MSCs、EPCs包被NICCs效率增加；降低了细胞凋亡率，增加了细胞活率，提高了培养细胞的产量；建立了简单、稳定、高效的干细胞与新生猪胰岛细胞共培养改良方法。
Description
技术领域
本发明涉及人脐带来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、人脐血来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)简易、高效包被经分离、纯化、培养3天后的新生猪胰岛细胞共培养的改良方法。
背景技术
在新生猪胰岛体外培养环节中，减少胰岛的丢失并获得高质量胰岛是保证猪胰岛移植治疗糖尿病成功的前提和基础。关于对胰岛细胞移植物的保护研究，目前的主要方法集中在如何减少在胰岛分离、纯化过程中机械损伤、酶损伤和缺血缺氧的损害。胰岛本身具有丰富的血管及血管网络，在胰岛细胞消化、分离提纯过程中，这种血管网络明显遭到破坏，分离后胰岛细胞团的血管网络重建需要12-14天[Emamaullee JA,Rajotte RV,Liston P,et al.XIAP overexpression in human islets prevents early posttransplant apoptosis and reduces the islet mass needed to treat diabetes[J].Diabetes.2005,54(9):2541.]，在此期间，胰岛细胞团遭受缺氧的损害导致胰岛细胞坏死发生凋亡。因此早期能促进胰岛细胞团血管化能减少胰岛细胞的丢失。
内皮祖细胞(EPCs)是一种来源于骨髓、外周血或脐带血且能分化成血管内皮细胞的干细胞，它具有促进移植细胞移植物如胰岛细胞的再血管化的作用。它能分泌多种体液因子如促进血管形成以及血管再塑的因子[Penko D,Mohanasundaram D,Sen S,et al.Incorporation of endothelial progenitor cells into mosaic pseudoislets[J].Islets.2011,3:3,73-79.]；另外，EPCs通过招募邻近内皮细胞能促进新生血管的形成以及血管修复，并能自身分化成内皮细胞来促进血管生成。因此EPCs与胰岛细胞共移植能提高胰岛细胞移植物的存活率以及胰岛细胞的功能。
间充质干细胞(MSCs)是一种具有多分化潜能、免疫调节功能以及能自我更新的成体祖细胞。MSCs可通过局部免疫抑制效应以及释放可溶性营养因子在邻近组织细胞修复中起着重要的作用，使其成为提高胰岛移植物生存的首选。最新研究显示[Johansson U,Rasmusson I,Niclou SP,et al.Formation of composite endothelial cell-mesenchymal stem cell islets:a novel approach to promote islet revascularization[J].Diabetes.2008,57:2393-2401.]，胰岛细胞与MSCs联合移植的效果明显比单独胰岛细胞移植好。在提高胰岛细胞生存及功能方面，这些效果很大程度上归因于MSCs的直接或间接作用，其主要是通过促进胰岛细胞移植物的再血管化[Sordi V,Melzi R,Mercalli A,et al.Mesenchymal cells appearing in pancreatic tissue culture are bone marrow-derivedstem cells with the capacity to improve transplanted islet function[J].Stem Cells.2010,28:140-151.]，抑制免疫反应及抗炎症反应[Scuteri A,Donzelli E,Rodriguez-Menendez V,et al.A double mechanism for the mesenchymal stem cells'positive effect on pancreatic islets.PLoS One.2014,9(1):e84309.]。
目前亟需解决移植后缺氧对移植物的损害，如对移植物的保护性研究、移植物的再血管化、提高移植物的耐缺氧能力等方法也越来越受到研究者的青睐。鉴于分离后胰岛细胞血管网络的破坏，血管网络的重建及再塑可以保护胰岛细胞，而MSCs及EPCs均能促进胰岛细胞的再血管化。所以目前NICCs与血管内皮祖细胞(EPCs)、间充质干细胞(MSCs)等各种细胞共培养培养的研究越来越受到关注，而人脐血、脐带来源广泛、无创伤性、免疫原性低，使得脐血、脐带来源的EPCs、MSCs较其他成体组织来源的干/祖细胞在细胞治疗过程中具有更多的优势。但目前文献报道多为MSCs及EPCs与人胰岛细胞、成年猪胰岛细胞、鼠胰岛细胞间的共培养研究，未涉及新生猪胰岛细胞研究，且传统的干细胞包裹胰岛细胞方法程序复杂、效率不高。因此，从对新生猪胰岛细胞团移植前保护入手，如何在体外培养中建立一种简单、高效的MSCs、EPCs与NICCs的共培养方法对保护NICCs的生物学活性和功能至关重要。
发明内容
本发明旨在建立一种简单、稳定、高效的干/祖细胞(MSCs、EPCs)与新生猪胰岛细胞(NICCs)共培养的改良方法以促进其再血管化从而提高新生猪胰岛细胞移植物的存活率以及生物学功能。
一种改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，包括以下步骤：
1)新生猪胰岛细胞培养至少至第三天；
2)浓缩培养：用培养基重悬新生猪胰岛、内皮祖细胞和间充质干细胞三种细胞，根据每2万IEQ新生猪胰岛重悬至6-10ml培养基中，再放入6cm培养皿的比例，将细胞混合液置 于培养皿或不贴壁的培养瓶内共培养至少8小时；
3)然后将细胞移入装有新配制的培养基的培养皿或不贴壁的培养瓶中继续培养，使用的培养皿或者培养瓶面积是步骤2)浓缩培养时使用的至少6倍，培养基为4-6倍。
步骤2)浓缩培养时以新生猪胰岛：内皮祖细胞：间充质干细胞为1IEQ:8个:8个-1IEQ:12个:12个的细胞比例，用培养基重悬三种细胞。
步骤2)浓缩培养时优选以每2×104IEQ的新生猪胰岛细胞：2×106IEQ的内皮祖细胞和间充质干细胞，内皮祖细胞和间充质干细胞按照1:1的细胞比例混合。优选用培养基重悬三种细胞至总体积6ml，并将细胞混合液置于直径为6cm的培养皿中共培养。优选共培养后将细胞移入装有30ml培养基的直径为15cm的培养皿中继续培养。
步骤2)的浓缩培养是置于37℃恒温箱共培养8-12小时。优选是置于37℃恒温箱共培养8小时。
步骤3)隔天换液一次，37℃恒温箱培养至5-6天。
步骤2)和3)使用的培养基配方均为：1L FAMS/F-10基础培养基，加入10％的猪血清、链霉素100U/mL、青霉素100U/mL、0.1％谷氨酰氨。
本发明需要取用培养至第3代-第5代的内皮祖细胞和间充质干细胞。
本发明使用过程是，室温无菌条件下，在37℃、5％CO2、95％空气培养箱内培养。
经本发明改良方法共培养后，MSCs、EPCs包被NICCs效率增加；降低了细胞凋亡率，增加了细胞活率，提高了培养细胞的产量；建立了简单、稳定、高效的干细胞与新生猪胰岛细胞共培养体系。
与以往技术相比的有益效果：
1、改良方法培养后，细胞凋亡下降、活性增加，产量稳定；
2、改良方法培养的混合细胞团的基底膜膜完整，破碎细胞少；
3、干细胞包被效率高于对照组，更适于移植。
附图说明
图1为P3的MSCs细胞和P3的EPCs细胞融合后的显微镜图像，放大倍数为40×；
图2为使用改良方法和普通方法共培养3天后MSCs，EPCs包被NICCs的效果图，放大倍数为100×；
图3为使用改良方法和普通方法共培养3天后经AO-PI染色反映混合细胞团活性，活性胰岛为箭头A所指示,箭头B所指示的为凋亡胰岛；
图4为使用改良方法和普通方法共培养3天后经Annexin V-PI染色、流式分析混合细胞凋亡活性。
具体实施方式
在以下实施例中，我们所用试剂购自全球各大生物试剂公司；所用试验用猪，为3-5天的新生猪，重约0.75～1.25kg，由湖南赛诺生物科技有限责任公司提供，该动物实验得到了中南大学湘雅三医院伦理委员会的批准。进行实验时，所采用的操作方法和操作步骤等，都是依据本技术领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对本发明的范围无任何限制。
实施例1.新生猪胰岛细胞分离、纯化
1.实验按照科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求进行。出生3-5d的新生猪用3％的戊巴比妥充分麻醉后，消毒剖腹取胰腺。将取出的胰腺组织置于装有预冷的D-Hanks液玻璃皿中，剔除胰腺组织块周围的包膜、脂肪及血管后称重，再将胰腺组织块剪成约0.5～1mm3的组织小块。
2.加入适量的V型胶原酶，置于37℃水浴箱中振荡消化，获得胰岛细胞悬液。
3.将胰岛细胞悬液加入至完全培养基(FAMS/F-10，含10％的猪血清、链霉素100U/mL、青霉素100U/mL、0.1％谷氨酰氨)的培养皿后置于37℃、5％CO2及95％湿度的培养箱内进行培养。培养基及培养皿于胰岛细胞分离纯化后第1天更换，之后每隔1天换一次至第三天备用。
实施例2.MSCs的培养及鉴定
1.MSCs的传代培养
从液氮罐中将已分离纯化的脐带来源的间充质干细胞进行复苏，用MSC培养基进行培养，每三天进行全量换液，连续培养至4-5d，可见细胞融合90％以上，按1x104cells/cm2(2.5x105cells/T25培养瓶)的密度进行传代培养，取P3-5代MSCs进行实验。
2.MSCs的鉴定
取P3-5代的脐带源性间充质干细胞，去培养基，用PBS洗涤两遍，并用胰酶消化，用含血清的培养基终止消化，用PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL单细胞悬液，取流式管向每管加入0.1ml细胞悬液，分别加入鼠抗人单克隆抗体FITC-CD34、FITC-CD73、FITC-CD90、PE/Cy5-CD11b、PE/Cy5-CD45、PE-HLA-DR、PE-CD105，PE-CD79α各5μL，另设阴性对照组及同型对照组，充分混匀，避光4℃下培养30min，PBS洗涤细胞，离心(1000rpmin，5min)去上清，重复2遍，加PBS重新制成细胞悬液0.3mL进行FACS检测。
结果：P3-5代脐带源性间充质干细胞成纺锤体型、旋涡状集落分布，FACS检测高表达基质细胞抗原CD90、CD105、CD73，而基本不表达造血干细胞抗原CD34、白细胞共同抗原CD45、巨噬细胞标记CD11b、B细胞标记CD79α和白细胞相关抗原HLA-DR(图1)。
实施例3.EPCs的培养及鉴定
1.EPCs的传代培养
从液氮罐中将已分离纯化的脐血源性的内皮祖细胞进行复苏，接种到铺有特殊铺层(如纤维连接蛋白)的培养皿进行培养，采用添加特殊生长因子(如血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等)的EGM-2培养基进行培养，培养4-5d，贴壁细胞出现细胞集落。8-10天可见细胞融合90％以上，按5x104cells/cm2(106cells/T25培养瓶)的细胞密度进行传代培养，取P3-5代EPCs进行实验(图1)。
2.EPCs的鉴定
取P3-5代的脐血源性的内皮祖细胞，去培养基，用PBS洗涤两遍，并用胰酶消化，用含血清的培养基终止消化，用PBS洗涤、重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL单细胞悬液，取流式管向每管加入0.1ml细胞悬液，分别加入鼠抗人单克隆抗体FITC-CD34、FITC-CD133、FITC-CD309(VEGFR-2)各5μL，另设阴性对照组及同型对照组，充分混匀，避光4℃下培养30min，PBS洗涤细胞，离心(1000rpm，5min)去上清，重复2遍，加PBS重新制成细胞悬液0.3mL进行FACS检测。
结果：P3-5代脐血源性的内皮祖细胞FACS检测高表达造血干细胞抗原CD34，表达内皮祖细胞抗原CD309、低表达干细胞相关抗原CD133(图1)。
实施例4.细胞混合共培养
按实验分组方案将细胞按一定比例混合
改良组：在NICCs分离培养的第3天，以每2×104IEQ的NICCs：2×106IEQ的EPCs和MSCs的细胞比例，EPCs和MSCs的细胞比例为1:1；将总体积6ml的混合液置于直径为6cm的培养皿内，入37℃恒温箱共培养8小时，期间无需摇荡，最后将细胞移入装有30ml培养基的直径为15cm的培养皿中继续培养，隔天换液一次，培养5-6天。
对照组：以每2×104IEQ的NICCs：2×106IEQ的EPCs和MSCs的细胞比例，EPCs和MSCs的细胞比例为1:1；将总体积1-2ml的混合液置于5mlEP管内，入37℃恒温箱共培养两小时，期间每隔20min摇荡1min，最后将EP管内细胞移入装有30ml含猪血清培养基的直径为15cm的培养皿中培养，隔天换液一次，培养5-6天。此种方法查自Diabetes经典文献，但是这种方法因为浓缩体积后培养时间过短，所以不利于内皮祖细胞和间充质干细胞充分贴附于胰岛细胞，形成较好包被，所以覆盖率不高。并且这种方法需要在细胞培养箱中间隔摇荡，容易造成细胞污染。
本发明浓缩培养时使用的6cm培养皿比传统使用的EP管或者离心管具有更大的培养面积有利于细胞的生长存活，8-12小时的较长时间培养能够使细胞充分贴附，但是如果使用传统的EP管或者离心管培养8-12小时，容易造成细胞缺氧。因此更大培养面积更长时间的浓缩培养有利于细胞贴附生长，提高EPCs和MSCs覆盖率和细胞存活率。
实施例5.干细胞包被效果检测
1、染料准备
从﹣20℃冰箱将细胞染料取出，室温下避光放置10min，再将染料放入离心机内离心(1000rpmin，1min)，按说明书操作，用DMSO溶解染料，将两种染料均配成1μmol/L。细胞染料配制过程中需在避光下操作。
2、细胞染色
将不同颜色染料分别与无血清的各种细胞培养基按一定比例(1μl:1ml)混合，EPCs与MSCs培养基去上清、用PBS洗涤两遍，再加入配好的细胞染液进行染色。用红色细胞染料标记间充质干细胞(MSCs)、绿色细胞染料标记内皮祖细胞(EPCs)，NICCss不染色。然后将染色的MSCs及EPCs均移入37℃培养箱染色30-45min。
4、干细胞包被效果检测
按上述实施例4细胞混合共培养的方法对细胞进行分组操作。并分别在共培养后的第3d用荧光显微镜下观察各组中NICCs形态及其周围EPCs及MSCs的包被情况，使用图像处理软件 对数据进行分析。
结果：(图2)显示，改良组混合细胞团较对照组的基底膜完整，破碎细胞少，细胞数量多；干细胞包被效率高于对照组。
实施例6.AO/PI染色检测混合细胞团活性
试剂配置(10ml工作液)
AO/PI染色：吖啶橙AO(acridine orange,AO)能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光，与RNA结合显桔红色荧光，而碘化丙啶PI(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红，从而通过荧光显微镜观察细胞的染色情况来判断胰岛细胞的存活率。
结果：(图3)显示，改良组混合细胞团的细胞活性高于对照组。
实施例7.FACS检测混合细胞总的凋亡率
1.离散胰岛细胞
1)收集各组细胞至流式管内，每组胰岛细胞分别提取1000IEQ细胞，1000rpm离心1min，去上清；
2)用PBS洗涤细胞1遍，Acutase酶消化6-8min，消化时放于37℃水浴箱内，并用吸管轻柔的上下吹打细胞。
3)再用完全培养基离心(1000rpm，3min)，再去上清。
2.染色胰岛细胞
1)收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计算细胞数量。
2)离心(1200rpm，3min)，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液重悬混合细胞或胰岛细胞。
3)然后加入5μl Annexin V-FITC，轻轻重悬混匀。
4)室温下避光培养10min。可以使用铝箔进行避光。
5)加入1mlPBS洗涤细胞，离心(1200rpm，3min)，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液重悬混合细胞或胰岛细胞。
6)加入1μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
7)加入1mlPBS洗涤细胞，离心(1200rpm，3min)，弃上清，每个试管内再加入300μ lPBS液。
8)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
3.胰岛细胞的流式染色
| 试管1 | 阴性对照，里面没有加任何抗体 |
| 试管2 | 单阳对照，只加5μl Annexin V-FITC |
| 试管3 | 单阳对照，只加1μl PI |
| 试管4 | 实验组，加5μl Annexin V-FITC和1μl PI |
4.一些重要的流式检测参数设置
FSC＝P1，SSC＝P2，FL1＝Annexin V-FITC，FL3＝PI，收集数据，用WinMdi2.9软件分析数据。
结果：(图4)显示，改良组混合细胞的细胞凋亡率低于对照组，活性高于对照组。
Claims (10)
1.一种改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)新生猪胰岛细胞培养至少至第三天；
2)浓缩培养：用培养基重悬新生猪胰岛、内皮祖细胞和间充质干细胞三种细胞，根据每2万IEQ新生猪胰岛重悬至6-10ml培养基中，再放入6cm培养皿的比例，将细胞混合液置于培养皿或不贴壁的培养瓶内共培养至少8小时；
3)然后将细胞移入装有新配制的培养基的培养皿或不贴壁的培养瓶中继续培养，使用的培养皿或者培养瓶面积是步骤2)浓缩培养时使用的至少6倍，培养基为4-6倍。
2.根据权利要求1所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤2)浓缩培养时以新生猪胰岛：内皮祖细胞：间充质干细胞为1IEQ:8个:8个-1IEQ:12个:12个的细胞比例，用培养基重悬三种细胞。
3.根据权利要求2所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤2)浓缩培养时以每2×104IEQ的新生猪胰岛细胞：2×106IEQ的内皮祖细胞和间充质干细胞，内皮祖细胞和间充质干细胞按照1:1的细胞比例混合。
4.根据权利要求3所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，用培养基重悬三种细胞至总体积6ml，并将细胞混合液置于直径为6cm的培养皿中共培养。
5.根据权利要求4所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，共培养后将细胞移入装有30ml培养基的直径为15cm的培养皿中继续培养。
6.根据权利要求1-5任一项所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤2)的浓缩培养是置于37℃恒温箱共培养8-12小时。
7.根据权利要求6所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤2)的浓缩培养是置于37℃恒温箱共培养8小时。
8.根据权利要求1-5任一项所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤3)隔天换液一次，37℃恒温箱培养至5-6天。
9.根据权利要求1-5任一项所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，步骤2)和3)使用的培养基配方均为：1L FAMS/F-10基础培养基，加入10％的猪血清、链霉素100U/mL、青霉素100U/mL、0.1％谷氨酰氨。
10.根据权利要求1-5任一项所述的改良的人干/祖细胞与新生猪胰岛细胞共培养的方法，其特征在于，需要取用培养至第3代-第5代的内皮祖细胞和间充质干细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 410600, No. 128 Jinshui East Road, Jinzhou new district, Changsha County, Hunan, Ningxiang Applicant after: HUNAN XENO LIFE SCIENCE CO., LTD. Address before: 410600, No. 128 Jinshui East Road, Jinzhou new district, Changsha County, Hunan, Ningxiang Applicant before: HUNAN XENO LIFE SCIENCE CO., LTD. |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150225 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |