CN107418926B - 一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，包括基础培养基、胎牛血清、人血清白蛋白、牛脑垂体提取物、胰岛素、维生素C、生物素、胰岛素样生长因子和表皮生长因子，并且按照1ml：0.0125ml‑0.05ml：0.005ml‑0.025ml：80μg‑423μg：7μg‑18μg：22μg‑60μg：37μg‑214μg：1μg‑20μg：0.1μg‑1μg的比例混合；所述基础培养包括DMEM培养基和F12培养基。本发明的优点在于对成纤维细胞具有选择性，提高成纤维细胞的纯度，避免杂细胞污染，有效缩短细胞传代数，细胞增殖速度快。本发明的选择性培养基还能够降低血清使用量，节约成本。

Description

一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基及其制备方法。
背景技术
皮肤的成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，成纤维细胞通过分泌多种物质构成细胞外基质，从而形成结缔组织，对机体发挥结构性功能。成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持，促进损伤部位结构与功能的修复等。因此，体外培养自体皮肤成纤维细胞在组织工程，美容，医疗等领域具有很广泛的应用。
目前，体外培养成纤维细胞方法中使用的培养基基本由基础培养基和20％胎牛血清配置而成，而此类培养基的具有以下缺点：
1、对成纤维细胞没有选择性，需要对原代组织进行各种复杂的操作获得较纯的真皮组织。如采用胰酶消化原代组织，从而分离表皮和真皮，再将真皮切碎后用胶原酶消化成单细胞，最后放入培养基中培养，该操作过程中酶会对细胞造成不可逆的损伤，使细胞得率低，同时还具有成本高、消化时间久，操作复杂等缺点。
2、由于没有成纤维细胞选择性，前3代往往很难获得纯化的成纤维细胞，需要多次传代才能获得高纯度的细胞，然而传代越多会使得细胞的原代活性越来越差，疗效显著降低，同时存在致瘤风险。另外，每次传代时使用胰酶消化也会对细胞造成严重的损伤。
3、传代操作时，为了保证细胞活力和增值速度无法大数量扩瓶培养，往往选择1瓶传3瓶或者更少，导致培养时间久，传代数多，细胞原代活性差。
4、胎牛血清价格昂贵，批次差异大，并且使用剂量限制大，降低动物血清对人体的安全隐患。
如申请号为201710018241.2的中国发明专利，公开了一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，包括：基础培养基：H-DMEM(High Glucose-Dulbecco minimumessential medium，高血糖-杜尔伯科极限必需培养基)或者DMEM-F12(Dulbecco minimumessential medium-Ham＇sF 12nutrient medium，杜尔伯科极限必需培养基-动物细胞培养基)；(2)添加组分：维生素C50-100μg/ml，EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生长因子)3-20ng/ml，(3)血清5-15％。该培养基虽然血清用量较少，但是其不具有成纤维细胞选择性，培养基中的杂细胞对于成纤维细胞的生长有很大的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有成纤维细胞选择性，对于血清依赖性小的选择性培养基。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，包括基础培养基、胎牛血清、人血清白蛋白、牛脑垂体提取物、胰岛素、维生素C、生物素、胰岛素样生长因子和表皮生长因子，并且按照1ml：0.0125ml-0.05ml：0.005ml-0.025ml：80μg-423μg：7μg-18μg：22μg-60μg：37μg-214μg：1μg-20μg：0.1μg-1μg的比例混合；
所述基础培养包括DMEM培养基和F12培养基。
优选地，所述基础培养基、胎牛血清、人血清白蛋白、牛脑垂体提取物、胰岛素、维生素C、生物素、胰岛素样生长因子和表皮生长因子的比例为1ml：0.125ml：0.01ml：180μg：10μg：44μg：80μg：5μg：0.1μg。
为了减少成纤维细胞对血清的依赖性，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为2:1。
为了进一步促进成纤维细胞生长所述选择性培养基还包括成纤维生长因子和血小板衍生生长因子，所述成纤维生长因子、所述血小板衍生生长因子和所述基础培养基的比例为2ng-9ng：2ng-9ng：1ml。
优选地，所述成纤维生长因子、所述血小板衍生生长因子和所述基础培养基的比例为2ng：5ng：1ml。
为了提供成纤维细胞必要的氨基酸，所述选择性培养基还包括色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和乙酰半胱氨酸；
所述色氨酸与所述基础培养基的比例为43μg-168μg：1ml；
所述组氨酸与所述基础培养基的比例为1.1μg-11.5μg：1ml；
所述异亮氨酸与所述基础培养基的比例为2.4μg-23.2μg：1ml；
所述苯丙氨酸与所述基础培养基的比例为100μg-176μg：1ml；
所述蛋氨酸与所述基础培养基的比例为87μg-351μg：1ml；
所述酪氨酸与所述基础培养基的比例为31μg-222μg：1ml；
所述乙酰半胱氨酸与所述基础培养基的比例为1.3μg-22.2μg：1ml。
优选地，所述色氨酸与所述基础培养基的比例为71μg：1ml；
所述组氨酸与所述基础培养基的比例为3.9μg：1ml；
所述异亮氨酸与所述基础培养基的比例为9.2μg：1ml；
所述苯丙氨酸与所述基础培养基的比例为100μg：1ml；
所述蛋氨酸与所述基础培养基的比例为170μg：1ml；
所述酪氨酸与所述基础培养基的比例为82μg：1ml；
所述乙酰半胱氨酸与所述基础培养基的比例为8μg：1ml。
为了满足成纤维细胞快速增殖时合成细胞膜需要，所述选择性培养基还包括胆固醇，其与所述基础培养基的比例均为2.7μg-14μg：1ml。
优选地，所述胆固醇与所述基础培养基的比例均为5μg：1ml。
一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的制备方法，包括下述步骤：
1)配置所述基础培养基；
2)将所述人血清白蛋白、牛脑垂体提取物、胰岛素、维生素C、生物素、胰岛素样生长因子和表皮生长因子分别溶解后依次加入步骤1)中的基础培养基中；
3)在所述步骤2)中配置的培养基中加入所述胎牛血清并混合均匀。
与现有技术相比，本发明的优点在于对成纤维细胞具有选择性，提高成纤维细胞的纯度，避免杂细胞污染，有效缩短细胞传代数，细胞增殖速度快。本发明的选择性培养基还能够降低血清使用量，节约成本。
附图说明
图1为本发明实施例3的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的对比实验的生长曲线示意图。
图2-A为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的B组的细胞爬出的示意图。
图2-B为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的B组的细胞融合的示意图。
图3-A为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的C组的细胞爬出的示意图。
图3-B为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的C组的细胞融合的示意图。
图4-A为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的B组在原代成纤维细胞培养步骤中使用选择性培养基的细胞生长情况示意图。
图4-B为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的C组在原代成纤维细胞培养步骤中使用普通培养基的细胞生长情况示意图。
图5-A为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的B组在第23天时细胞增殖情况示意图。
图5-B为本发明实施例1的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的C组在第23天时细胞增殖情况示意图。
图6-A为本发明实施例2的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色结果示意图。
图6-B为本发明实施例2的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的波形蛋白荧光染色结果示意图.
图7-A为本发明实施例2的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色结果示意图。
图7-B为本发明实施例2的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的波形蛋白荧光染色结果示意图。
图8为本发明实施例5的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的表面CD90标记物的流式分析结果图。
图9为本发明实施例5的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的实验组第二代成纤维细胞的表面CD73标记物的流式分析结果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基包括基础培养基、胎牛血清、血清替代物、激素、细胞因子和氨基酸。
基础培养基包括DMEM培养基和F12培养基，不包括血清。基础培养基利用F12培养基里的多种成分和DMEM培养基的高浓度营养成分的优点，使成纤维细胞增殖速率快并且对血清需求量显著降低。DMEM培养基和F12培养基优选按照体积比2:1的比例混合配置基础培养基，当DEME培养基所占体积比过高时会导致细胞对血清的依赖性提高从而不得不使用更高浓度的胎牛血清，当F12培养基所占体积比过高时导致细胞缺乏营养而降低细胞生存和增值能力。
在选择性培养基中，胎牛血清所占体积百分比为5％-20％，为用于提供成纤维细胞增殖时所需的营养物质，促进成纤维细胞增殖。选择性培养基优选体积百分比为5％的胎牛血清，降低成本。
血清替代物包括人血清白蛋白和牛脑垂体提取物，用于代替部分胎牛血清的功能，减少胎牛血清的用量，并且能够促进成纤维细胞的生长增殖。其中人血清白蛋白的体积为(0.5％-2.5％)*Xml(Xml为基础培养基的体积,下同)，优选为1％*Xml；牛脑垂体提取物的添加量为(80μg-423μg)*Xml，优选为180μg*Xml。选择性培养基通过添加血清替代物，可以大大减少胎牛血清的使用量，并且不影响成纤维细胞的生长繁殖和细胞活性，经济节省。
激素包括胰岛素、维生素C和生物素。胰岛素用于促进细胞生长，维持细胞形态，使得成纤维细胞不会分化，其添加量为(7μg-18μg)*Xml，优选为10μg*Xml。维生素C用于维持成纤维细胞的功能，使其保持原代活性，其中若添加地塞米松，可以与维生素C共同发挥作用，其中维生素C和地塞米松的添加量分别为(22μg-60μg)*Xml和(3ng-11ng)*Xml，优选浓度为44μg*Xml和3.9ng*Xml。生物素用于防止成纤维细胞老化突变，增加成纤维细胞的低血清耐受能力，其添加量为(37μg-214μg)*Xml，若与(5μg-23μg)*Xml的亚油酸和(3.7ng-9.9ng)*Xml的亚油酸钠共同使用，效果更佳，生物素、亚油酸和亚油酸钠三者的优选添加量为80μg*Xml、8.4μg*Xml和5.2ng*Xml。
细胞因子包括其作用与胰岛素发挥的作用相同的胰岛素样生长因子，用于抑制表皮细胞生长、促进成纤维细胞生长的成纤维生长因子，用于促进细胞分裂增值的血小板衍生生长因子，和用于抑制杂细胞增殖、促进成纤维细胞生长的表皮生长因子。其中胰岛素样生长因子的添加量为(1μg-20μg)*Xml，优选为5μg*Xml；成纤维生长因子的添加量为(2ng-9ng)*Xml，优选为2ng*Xml；血小板衍生生长因子的添加量为(2ng-9ng)*Xml，优选为5ng*Xml；表皮生长因子的添加量为(0.1μg-1μg)*Xml，优选为0.1μg*Xml。高浓度的胰岛素样生长因子和表皮生长因子除了发挥各自的作用外，共同使用还能够产生抑制杂细胞生长、加快成纤维细胞的增值速率的协同作用，大大提高选择性培养基的成纤维细胞选择性。
氨基酸包括多种成纤维细胞生长增殖所必需的氨基酸，如色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和乙酰半胱氨酸等。其中色氨酸的终浓度为(43μg-168μg)*Xml，优选为71μg*Xm；组氨酸的添加量为(1.1μg-11.5μg)*Xml，优选为3.9μg*Xml；异亮氨酸的添加量为(2.4μg-23.2μg)*Xml,优选为9.2μg*Xml；苯丙氨酸的添加量为(100μg-176μg)*Xml，优选为100μg*Xml；蛋氨酸的添加量为(87μg-351μg)*Xml，优选为170μg*Xml；酪氨酸的添加量为(31μg-222μg)*Xml，优选为82μg*Xml；乙酰半胱氨酸的添加量为(1.3μg-22.2μg)*Xml，优选为8μg*Xml。
另外，为了增加选择性培养基的粘度，避免细胞受到损伤，选择性培养基中还包括终添加量为(18μg-32μg)*Xml的转铁蛋白，优选为25μg*Xml。选择性培养基中还加入胆固醇，以满足细胞快速增殖所需，其添加量为(2.7μg-14μg)*Xml，优选为5μg/ml*Xml。
实施例2
一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)配置基础培养基
将600.0mlDMEM培养基和200.0mlF12培养基混合均匀。
按照表1所示的原料表称取相对应的体积或重量的原料。
2)加入添加物
表1选择性培养基的添加物的终浓度表
添加物 添加物的称取量
牛脑垂体提取物 144000μg
人血清白蛋白 8ml
胰岛素 8000μg
维生素C 35200μg
地塞米松 3120ng
生物素 64000μg
亚油酸 6720μg
亚硒酸钠 4160ng
胰岛素样生长因子 4000μg
表皮生长因子 80μg
成纤维生长因子 1600ng
血小板衍生生长因子 4000ng
组氨酸 3120μg
异亮氨酸 7360μg
蛋氨酸 136000μg
苯丙氨酸 80000μg
酪氨酸 65600μg
色氨酸 56800μg
乙酰半胱氨酸 6400μg
转铁蛋白 20000μg
胆固醇 4000μg
将表1中的添加物分别溶解后依次加入步骤1)中的基础培养基中，并混合均匀。
3)加入胎牛血清
在步骤2)中配置的培养基中加入47.4ml的胎牛血清并混合均匀，即配置完成含有5％胎牛血清的选择性培养基。
实施例3
对比试验
表2对比试验的实验方案
1)实验分组
按照表2所示的实验方案配制A、B、C、D四组实验组所需的选择性培养基和完全培养基等。
2)取样
在四个培养皿中分别加入10个面积约1mm2的来源于自体皮肤的组织块，将10个组织块真皮层向下，均匀贴在培养皿中，往各个组织块上各滴加一滴的已经浓缩的胎牛血清，随后放入培养箱中静置10-30min。
3)原代成纤维细胞培养：
在步骤2)中的培养皿分别加入步骤1)中的四种不同的选择性培养基进行培养，每隔3天培养皿中的选择性培养基半量换液，直至细胞融合。
将细胞融合后的四个培养皿取出，均使用生理盐水清洗二遍后，加入0.25％的胰酶溶液(即浓度为2.5g/L的胰酶溶液，下同)，在37℃下消化3分钟，使细胞从培养皿中脱落。然后相对应地使用完全培养基终止消化，得到四种细胞悬液。将四种细胞悬液分别收集到离心管中离心后，用相对应的完全培养基将重悬细胞接种到四个洁净的培养瓶中，接着放入培养箱中培养。第二天用完全培养基全量换液，直至成纤维细胞密度达90％。
4)绘制成长曲线
将步骤3)中的A、B、C、D四组实验所培养的原代成纤维细胞数量根据培养时间绘制成四条生长曲线，如图1所示。
5)传代成纤维细胞培养：
将步骤3)中的B、C两个培养瓶使用生理盐水清洗二遍后，加入0.25％的胰酶溶液37℃消化3分钟，并用对应的完全培养基终止消化，得到的细胞悬液分别收集到离心管中离心后，在不影响成纤维细胞的增殖速率和活性的条件下，用对应的完全培养基将重悬细胞扩瓶培养，并且每3天用完全培养基全量换液，直至第三代成纤维细胞培养完成
结果及分析：
如图1所示，1-A、1-B、1-C、1-D四条生长曲线分别代表A、B、C、D四个实验组在相对应的选择性培养基下原代成纤维细胞数量随着培养时间的生长变化，X轴表示培养时间，Y轴表示原代成纤维细胞的数量。从1-A、1-B两线和1-C、1-D两线可以看出在相同的培养基下，随着胎牛血清浓度的增加，成纤维细胞增殖速率加快。1-A线的成纤维细胞增殖速率略快于1-B线，1-C、1-D两线的成纤维细胞增殖速率则相差很大，由此可以看出A、B实验组的成纤维细胞对于胎牛血清的依赖性小。由1-B、1-C两线比较看出，含有小剂量胎牛血清的1-B线的成纤维细胞的增殖速率远远大于含有大剂量胎牛血清的1-C线，因此可知，本发明的选择性培养基能够在含有小剂量胎牛血清时，即可达到良好的原代成纤维细胞培养效果。
图2-A为B组在第三天时成纤维细胞生长情况，明显可见成纤维细胞已经大量爬出。图2-B为C组在第十天时成纤维细胞爬出情况，其成纤维细胞爬出数量明显少于图2-A图。图2-A、图2-B两图对比说明B组的选择性培养基能够使成纤维细胞迅速爬出。
图3-A为B组在第十天时成纤维细胞融合示意图。图3-B为C组在第二十天时成纤维细胞融合示意图。图3-A、图3-B两图对比说明B组的选择性培养基能够使成纤维细胞快速有效地完成细胞融合。
图4-A、图4-B两图分别是原代成纤维细胞培养过程中使用B组和C组的选择性培养基后的细胞生长情况。从A图中可以看出B组使用选择性培养基后，成纤维细胞以外的很多原本贴壁的细胞蜷曲外翻，说明杂细胞开始死亡漂浮。从图4-B中可以清晰的看出成纤维细胞和杂细胞共存，并未出现细胞死亡的情况。图4-A、图4-B两图对比说明B组使用的选择性培养基具有成纤维细胞选择性。
图5-A图和图5-B分别为B组、C组在第三代成纤维细胞增殖情况示意图，图5-A中的成纤维细胞数目增值1000倍，图5-B则为30倍。图5-A、图5-B两图对比说明B组的选择性培养基能够使成纤维细胞的增殖速率明显加快。
实施例4
验证实验A
第二代成纤维细胞荧光染色实验
为了验证比较实施例3中的B组(下述实验组)和C组(下述对照组)所培养成纤维细胞的纯度，采取成纤维细胞荧光染色实验，比较两种方法的效果。
因为实验组的选择性培养基具有成纤维细胞选择性，所培养的原代成纤维细胞即具有很高的纯度，而按照对照组的选择性培养基所培养的成纤维细胞随着传代而纯化，因此选择第二代成纤维细胞进行实验，比较两组选择性培养基的培养效果，避免传代过多而导致两组细胞纯度无区别。
1)分别取实施例1中实验组和对照组的第二代成纤维细胞的培养基，用生理盐水清洗二遍。
2)在两个培养皿中均加入浓度为0.25％的胰酶溶液37℃下消化至细胞脱落，然后用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。
3)将两种细胞悬液分别转移至15ml离心管中，加入生理盐水，1200rpm离心5min，弃上清液
4)将步骤3)中得到两种细胞悬液沉淀分别按照每孔1*104cells接种到24孔板的4个反应孔中，其中两个反应孔中接种实验组的细胞，另外两个接种对照组的细胞；另外加入阴性对照2孔。
5)根据标准换液流程进行换液直至细胞融合到100％时，在实验组的两个反应孔中，其中一个加入波形蛋白抗体，另外一个使用DAPI染色，对对照组的两个反应孔重复同样的操作。
7)荧光显微镜观察，结果如图6和图7所示。
结果及分析：
图6-A、图6-B两图分别是实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色及波形蛋白荧光染色情况，其成纤维细胞纯度大于95％。图7-A、图7-B两图分别是实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色及波形蛋白荧光染色情况，其成纤维细胞纯度小于85％。由图6-7可以看出，实验组所培养的第二代成纤维细胞具有很高的纯度。
实施例5
验证实验B
实验组第二代成纤维细胞表面标记物检测实验
1)取实施例1中实验组的第二代成纤维细胞的培养基，用生理盐水清洗二遍。
2)在步骤1)清洗后的培养皿加入0.25％的胰酶溶液37℃消化3分钟，然后使用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。
3)将步骤2)得到的两种细胞悬液放入15ml离心管中，加入生理盐水，1200rpm离心5min；弃上清液，重复上述步骤3次。
4)弃上清液，离心管中加入适量磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution，PBS)调整细胞悬液终浓度为1×107cells/ml。
5)离心管中分别取100μL细胞悬液分开转移至两支上样管中，并标记所有的抗体名称和荧光素。
6)按照上样管标记，在两支上样管中分别加入适量对应的荧光抗体：CD90，CD73。冰上避光孵育20分钟。
7)用适量PBS清洗细胞2次，300g离心5min，弃上清液，得到PBS重悬细胞。
8)使用流式细胞仪检测，结果如图7和图8所示。结果及分析：
如图8-9所示，实验组的第二代成纤维细胞通过流式细胞仪器检测表面标记物CD90，CD73都大于99％，说明细胞纯度高原代活性强。
本发明要求保护的范围不限于本文中介绍的实施例，凡基于本发明申请专利范围和说明书内容所作的各种形式的变换和代换、合并等，皆属本发明专利涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：包括下述比例的组分：基础培养基800ml、胎牛血清47.4ml、人血清白蛋白8ml、牛脑垂体提取物144000μg、胰岛素8000μg、维生素C 35200μg、生物素64000μg、胰岛素样生长因子4000μg、表皮生长因子80μg、成纤维生长因子1600ng、血小板衍生生长因子4000ng和氨基酸355280μg；
所述基础培养基由DMEM培养基和F12培养基组成。
2.如权利要求1所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为3:1。
3.如权利要求1所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：所述氨基酸包括色氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和乙烯半胱氨酸；
所述色氨酸与所述基础培养基的比例为43μg-168μg：1ml；
所述组氨酸与所述基础培养基的比例为1.1μg-11.5μg：1ml；
所述异亮氨酸与所述基础培养基的比例为2.4μg-23.2μg：1ml；
所述苯丙氨酸与所述基础培养基的比例为100μg-176μg：1ml；
所述蛋氨酸与所述基础培养基的比例为87μg-351μg：1ml；
所述酪氨酸与所述基础培养基的比例为31μg-222μg：1ml；
所述乙酰半胱氨酸与所述基础培养基的比例为1.3μg-22.2μg：1ml。
4.如权利要求3所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：所述色氨酸与所述基础培养基的比例为71μg：1ml；
所述组氨酸与所述基础培养基的比例为3.9μg：1ml；
所述异亮氨酸与所述基础培养基的比例为9.2μg：1ml；
所述苯丙氨酸与所述基础培养基的比例为100μg：1ml；
所述蛋氨酸与所述基础培养基的比例为170μg：1ml；
所述酪氨酸与所述基础培养基的比例为82μg：1ml；
所述乙酰半胱氨酸与所述基础培养基的比例为8μg：1ml。
5.如权利要求1所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：所述选择性培养基还包括胆固醇，其与所述基础培养基的比例均为2.7μg-14μg：1ml。
6.如权利要求5所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基，其特征在于：所述胆固醇与所述基础培养基的比例均为5μg：1ml。
7.如权利要求1所述的皮肤成纤维细胞培养的选择性培养基的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
1)配置所述基础培养基；
2)将所述人血清白蛋白、牛脑垂体提取物、胰岛素、维生素C、生物素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、血小板衍生生长因子和氨基酸分别溶解后依次加入步骤1)中的基础培养基中；
3)在所述步骤2)中配置的培养基中加入所述胎牛血清并混合均匀。
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