CN115369079B - 一种组合物及其在制备细胞薄膜中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种组合物及其在制备细胞薄膜中的应用。本发明首次公开了一种组合物，包含：ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C；采用该组合物可通过普通细胞培养皿制备细胞薄膜，相对于传统的利用温度敏感型培养皿制备细胞薄膜，采用该组合物可以大幅地降低制备细胞薄膜的成本，并且增加细胞数量，提高制备细胞薄膜的成功率，有利于更好地运用在组织工程和再生医学领域(修复损伤的组织和/或器官、构建三维组织和/或器官)，有望实现商业化的大规模生产。

Description

一种组合物及其在制备细胞薄膜中的应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种组合物及其在制备细胞薄膜中的应用。
背景技术
细胞薄膜是一种由细胞和细胞外基质组成的致密组织。细胞薄膜保留了细胞-细胞、细胞-基质间的连接，可有效地维持细胞间相互作用，完整地保留了细胞外基质精密有序的网络结构。细胞外基质负载的生长因子、细胞因子等活性因子可调控细胞行为、影响细胞命运、促进组织修复再生和改善炎症。因此，细胞薄膜常用于组织或器官缺损位置的修复、替代，三维组织或器官的构建等，在组织工程和再生医学领域具有广泛的应用前景。
目前，制作细胞薄膜的主要方法是采用温度敏感型培养皿。温度敏感型培养皿底部涂有聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)，PIPAAm在37℃时具有疏水性，而在20℃时具有亲水性。当温度从37℃降为20℃时，PIPAAm由疏水性变成亲水性，导致细胞脱离培养皿底部，从而获得细胞薄膜。但是，使用温度敏感型培养皿制作细胞薄膜需要有一个低温培养过程，低温培养可导致细胞活力下降，一些脆弱的细胞甚至发生功能上的变化，其次，温度敏感型培养皿价格昂贵。因此，开发一种利用普通细胞培养皿稳定制备细胞薄膜的组合物及方法尤为重要。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供一种组合物。
本发明的第二方面的目的，在于提供一种培养基。
本发明的第三方面的目的，在于提供第一方面的组合物和/或第二方面的培养基在制备细胞薄膜或制备用于细胞薄膜制备的产品中的应用。
本发明的第四方面的目的，在于提供一种制备细胞薄膜的方法。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种细胞薄膜。
本发明的第六方面的目的，在于提供第一方面的组合物、本发明第二方面的试剂盒、本发明第四个方面的方法和/或本发明第五个方面的细胞薄膜的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种组合物，包含：ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C。
优选地，所述组合物还包含：聚蔗糖。
优选地，所述聚蔗糖为聚蔗糖400(Ficoll400)、聚蔗糖70(Ficoll70)中的至少一种；进一步为聚蔗糖400(Ficoll400)。
本发明的第二个方面，提供一种培养基，包含本发明第一个方面的组合物。
优选地，所述培养基的基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基、DMEM低糖培养基中的至少一种；进一步为DMEM高糖培养基。
优选地，所述基础培养基包含胎牛血清和抗生素中的至少一种；进一步优选地，所述基础培养基包含胎牛血清和抗生素。
优选地，所述胎牛血清在所述基础培养基中的浓度为8～12v/v％。
优选地，所述抗生素包含青霉素、庆大霉素、两性霉素B、卡那霉素、四环素、链霉素中的至少一种；进一步包含青霉素、链霉素中的至少一种；更进一步包含青霉素和链霉素。
优选地，所述抗生素在所述基础培养基中的浓度为0.5～1.5v/v％。
优选地，所述ITS细胞培养添加物在所述培养基中的浓度为0.1～2.0v/v％；进一步为1～2.0v/v％。
优选地，所述地塞米松在所述培养基中的浓度为0.001～0.04μg/mL。
优选地，所述维生素C在所述培养基中的浓度为1～500μg/mL；进一步为50～500μg/mL。
优选地，所述聚蔗糖在所述培养基中的浓度为0～100mg/mL，不包含0；25mg/mL～100mg/mL。
本发明的第三个方面，提供第一方面的组合物和/或第二方面的培养基在(1)～(4)中任一项的应用；
(1)制备细胞薄膜；
(2)制备用于细胞薄膜制备的产品；
(3)促进细胞增殖；
(4)制备促进细胞增殖的产品。
优选地，所述细胞包含：皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞中的至少一种；进一步为皮肤成纤维细胞。
本发明的第四个方面，提供一种制备细胞薄膜的方法，包含：采用本发明第一个方面的组合物和/或本发明第二个方面的培养基的步骤。
优选地，所述方法包括如下步骤：将细胞接种至基础培养基中进行第一次培养，然后，更换包含本发明第一个方面的组合物的基础培养基和/或本发明第二个方面的组合物进行第二次培养，得到细胞薄膜。
优选地，所述第一次培养的条件为33～39℃，3～7％ CO2下培养18～30h。
优选地，所述第二次培养的条件为33～39℃，3～7％ CO2下培养4～15天。
优选地，所述第二次培养过程中每1～3天换液一次。
优选地，所述细胞包含：皮肤成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、牙周膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞中的至少一种；进一步为皮肤成纤维细胞。
优选地，所述基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基、DMEM低糖培养基中的至少一种；进一步为DMEM高糖培养基。
优选地，所述细胞的接种密度为3.5～75万/mL。
优选地，所述细胞培养采用普通细胞培养皿培养。
优选地，所述第二次培养结束后，还包括剥离细胞薄膜的步骤。
优选地，所述剥离细胞薄膜的步骤为：用移液枪轻轻吹打培养皿底部边缘。
本发明的第五个方面，提供一种细胞薄膜，通过本发明第四个方面的方法得到。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面的组合物、本发明第二个方面的试剂盒、本发明第四个方面的方法和/或本发明第五个方面的细胞薄膜在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)制备修复损伤的组织和/或器官的产品；
(2)构建三维组织和/或器官；
(3)制备构建三维组织和/或器官的产品。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了一种组合物，包含：ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C；采用该组合物可通过普通细胞培养皿制备细胞薄膜，相对于传统的利用温度敏感型培养皿制备细胞薄膜，采用该组合物可以大幅地降低制备细胞薄膜的成本，并且增加细胞数量，提高制备细胞薄膜的成功率，有利于更好地运用在组织工程和再生医学领域(修复损伤的组织和/或器官、构建三维组织和/或器官)，有望实现商业化的大规模生产。
本发明进一步限定组合物还包含：聚蔗糖，从而进一步提高制备细胞薄膜的质量(完整性)，以及增加细胞数量。
附图说明
图1是效果实施例1、效果实施例2、效果对比例1、效果对比例2、效果对比例3、效果对比例4、效果对比例5、效果对比例6、效果对比例7、效果对比例8和效果对比例9制备得到的细胞薄膜的直观图：其中，A为效果对比例2制备得到的细胞薄膜的直观图；B为效果对比例3制备得到的细胞薄膜的直观图；C为效果对比例4制备得到的细胞薄膜的直观图；D为效果对比例5制备得到的细胞薄膜的直观图；E为效果对比例6制备得到的细胞薄膜的直观图；F为效果对比例7制备得到的细胞薄膜的直观图；G为效果对比例8制备得到的细胞薄膜的直观图；H为效果对比例9制备得到的细胞薄膜的直观图；I为效果实施例1制备得到的细胞薄膜的直观图；J为效果实施例2制备得到的细胞薄膜的直观图；K为效果对比例1制备得到的细胞薄膜的直观图。
图2是效果实施例1、效果实施例2、效果对比例2、效果对比例3、效果对比例4、效果对比例5、效果对比例6、效果对比例7、效果对比例8和效果对比例9的细胞活性检测结果图：*表示p<0.05。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中的ITS细胞培养添加物(100×)购自Cyagen，地塞米松购自麦克林，维生素C购自Solarbio Life Science，Ficoll 400购自GE Healthcare，NHDF细胞购自ATCC，直径为35mm普通细胞培养皿购自康宁；直径为35mm温度敏感型培养皿购自CellSeed。
实施例1一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为1v/v％，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
实施例2一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物、地塞米松、Ficoll 400和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为1v/v％，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL，Ficoll 400在该培养基中的浓度为25mg/mL。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物、地塞米松、Ficoll 400和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
实施例3一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为0.1v/v％，地塞米松在该培养基中的浓度为1ng/mL，维生素C在该培养基中的浓度为1μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
实施例4一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为2v/v％，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL，维生素C在该培养基中的浓度为500μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物、地塞米松和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
实施例5一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物、地塞米松、Ficoll 400和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为2v/v％，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL，维生素C在该培养基中的浓度为500μg/mL，Ficoll 400在该培养基中的浓度为100mg/mL。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物、地塞米松、Ficoll 400和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例1一种培养基
一种培养基，该培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基。
对比例2一种培养基
一种培养基，该培养基为包含Ficoll 400的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，Ficoll 400在该培养基中的浓度为25mg/mL。
上述培养基的制备方法为：将Ficoll 400添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例3一种培养基
一种培养基，该培养基为包含维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例4一种培养基
一种培养基，该培养基为包含Ficoll 400和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL，Ficoll 400在该培养基中的浓度为25mg/mL。
上述培养基的制备方法为：将Ficoll 400和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例5一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为1v/v％。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例6一种培养基
一种培养基，该培养基为包含地塞米松和维生素C的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，维生素C在该培养基中的浓度为50μg/mL，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将地塞米松和维生素C添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例7一种培养基
一种培养基，该培养基为包含ITS细胞培养添加物的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，ITS细胞培养添加物在该培养基中的浓度为1v/v％。
上述培养基的制备方法为：将ITS细胞培养添加物添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
对比例8一种培养基
一种培养基，该培养基为包含地塞米松的基础培养基，其中，基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，地塞米松在该培养基中的浓度为0.04μg/mL。
上述培养基的制备方法为：将地塞米松添加至基础培养基中，使用0.22μm无菌滤头(购自密理博)过滤，得到培养基。
效果实施例采用不同培养皿和/或培养基制备细胞薄膜
效果实施例1
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL实施例1的培养基，，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中I所示，所得细胞薄膜有轻微破损。
效果实施例2
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入实2mL实施例2的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中J所示，所得细胞薄膜完整无缺损。
效果实施例3
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入实2mL实施例3的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，所得细胞薄膜有轻微破损。
效果实施例4
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入实2mL实施例4的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，所得细胞薄膜有轻微破损。
效果实施例5
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入实2mL实施例5的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，所得细胞薄膜有轻微破损。
效果对比例1
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm温度敏感型培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，即对比例1中的培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养6天，每2天换液1次，6天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中K所示，所得细胞薄膜缺损严重。
效果对比例2
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基，即对比例1中的培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养6天，每2天换液1次，6天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中A所示，不能获得细胞薄膜。
效果对比例3
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例2的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中B所示，不能获得细胞薄膜。
效果对比例4
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例3的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中C所示，不能获得细胞薄膜。
效果对比例5
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例4的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中D所示，细胞薄膜破损。
效果对比例6
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例5的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中E所示，所得细胞薄膜破损严重。
效果对比例7
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例6的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中F所示，所得细胞薄膜破损严重。
效果对比例8
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例7的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中G所示，不能获得细胞薄膜。
效果对比例9
1.将NHDF细胞(购自ATCC)传至第6代，接种到直径为35mm普通细胞培养皿上，接种细胞数为100万；加入2mL基础培养基(基础培养基为包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青链霉素的DMEM高糖培养基)；将细胞置于37℃，5％ CO2培养箱内培养24h；
2. 24h后换液，加入2mL对比例8的培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱内培养5天，每2天换液1次，5天后取出细胞，用移液枪吸取适量基础培养基，轻轻吹打培养皿底部边缘，剥离获得NHDF细胞薄膜，如图1中H所示，不能获得细胞薄膜。
根据效果实施例1、效果实施例2、效果对比例1、效果对比例2、效果对比例3、效果对比例4、效果对比例5、效果对比例6、效果对比例7、效果对比例8和效果对比例9的细胞薄膜制备方法，除去11种方法使用的相同耗材，分别计算11种方法制备NHDF细胞薄膜的成本。各耗材的价格如表1所示。11种方法制备NHDF细胞薄膜的成本如表2所示，可以看出效果对比例1获得NHDF细胞薄膜所产生的费用是效果实施例1的114.4倍，是效果实施例2的57.3倍。在获得细胞薄膜的成功率方面(实施例1～5和效果对比例1～9分别重复10次，成功获得细胞薄膜的定义是剥离细胞薄膜过程中，细胞薄膜没有损失一部分，实施例1的细胞薄膜确实边缘处有破损，但是只是边缘破了或者说裂开了，并没有丢掉一部分碎片。当细胞薄膜在剥离过程中丢掉一部分碎片定义为不能成功获得)，效果实施例1和效果实施例2的成功率都达到100％，但是效果实施例2所得细胞薄膜完整性更好(如图1)。效果对比例5和效果对比例7的成功率为67％，效果对比例6的成功率为50％，效果对比例5～7的成功率相对较低，并且对比例6和对比例7所得细胞薄膜破损严重，完整性远不如实施例2；而采用温度敏感型培养皿的对比例1成功率都只有33％；而对比例2～3、8～9的成功率为0。效果实施例3、4、5的成本、获得细胞薄膜的成功率与效果实施例1、2相似。
对效果实施例1、效果实施例2、效果对比例2、效果对比例3、效果对比例4、效果对比例5、效果对比例6、效果对比例7、效果对比例8和效果对比例9进行细胞活性检测(每种处理重复3次，每个时间点检测重复3次)，具体方法参考CCK-8(购自碧云天)试剂检测说明书，分别在加入步骤2)加入特异性培养基后的24h、72h和120h(效果对比例2则是在加入基础培养基后的48h、96h和144h)检测细胞活性。如图2所示，随着时间推移，效果实施例2的细胞活性与对比例之间差异逐渐增大，即在包含ITS、地塞米松、Ficoll 400和维生素C的基础培养基中培养120h时，细胞活性达到峰值，除了效果对比例6以外，效果实施例2的细胞活性显著高于所有效果对比例和效果实施例1。虽然效果实施例2的细胞活性与效果对比例6无统计学差异，但是从剥离的细胞薄膜效果来看(如图1)，效果实施例2显然完整性更好、成功率更高。效果实施例3、4、5的细胞活性与效果实施例1、2相似。
表1实施例和对比例使用耗材详情
规格 品牌 价格(元)
温度敏感型培养皿 35mm CellSeed 346
维生素C 25g Solarbio Life Science 68
Ficoll 400 100g GE Healthcare 2008
ITS(100×) 10mL Cyagen 269
地塞米松 5g 麦克林 212
普通细胞培养皿 35mm 康宁 1.41
表2成本及制作细胞薄膜的成功率
成功率(％) 成本(元)
效果实施例1 100 3.024826176
效果实施例2 100 6.036826176
效果对比例1 33 346
效果对比例2 0 1.41
效果对比例3 0 4.422
效果对比例4 17 1.410816
效果对比例5 67 4.422816
效果对比例6 50 3.024816
效果对比例7 67 1.410826176
效果对比例8 0 3.024
效果对比例9 0 1.410010176
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种制备细胞薄膜的组合物，由以下组分组成：ITS细胞培养添加物、地塞米松、维生素C和聚蔗糖；
所述聚蔗糖为聚蔗糖400；
所述细胞为皮肤成纤维细胞。
2.一种培养基，包含权利要求1所述的组合物。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：
所述ITS细胞培养添加物在所述培养基中的浓度为0.1～2.0 v/v %。
4.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：
所述地塞米松在所述培养基中的浓度为0.001～0.04μg/mL。
5.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：
所述维生素C在所述培养基中的浓度为1～500μg/mL。
6.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：
所述聚蔗糖在所述培养基中的浓度为0～100mg/mL，不包含0。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的培养基，其特征在于：
所述培养基的基础培养基为DMEM高糖培养基、DMEM-F12培养基、RPMI1640培养基、DMEM低糖培养基中的至少一种。
8.权利要求1所述的组合物和/或权利要求2～7中任一项所述的培养基在（1）～（2）中任一项的应用；
（1）制备皮肤成纤维细胞薄膜；
（2）制备用于皮肤成纤维细胞薄膜制备的产品。
9.一种制备皮肤成纤维细胞薄膜的方法，包含：采用权利要求1所述的组合物和/或权利要求2～7中任一项所述的培养基的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：将细胞接种至基础培养基中进行第一次培养，然后，更换包含权利要求1所述的组合物的基础培养基和/或权利要求2～7中任一项所述的组合物进行第二次培养，得到细胞薄膜。
11.一种细胞薄膜，通过权利要求9～10任一项所述的方法制备得到。
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