CN114958711A - 一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用 - Google Patents

一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用，方法包括将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。培养结束后，将上层小室整个浸入固定液中，待固定完成，移除底部，此时上层小室就变成一个两端开口的筒，可以轻松将培养完成的培养物推出，得到完整的细胞三维培养物。后续可以采用组织切片等方法获得细胞培养物的切片，再对切片进行常规的免疫组化、免疫荧光等染色操作步骤，操作大大简化。

Description

一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种获得完整细胞三维培养物的方法及应用。
背景技术
细胞三维培养技术是指将细胞在材料载体所提供的三维空间中培养，材料载体支持细胞存活和特定功能发挥，最终可构建成一种三维细胞-材料载体复合物。与二维细胞培养相比，三维环境中的细胞往往更容易受到形态和生理变化的影响，更能反应细胞在体内的真实生长情况和细胞间的相互作用。因此，三维细胞培养在细胞扩增、组织工程、药物筛选、再生医学等生物医学工程领域具有巨大应用潜力。
现有的细胞三维培养，一般是将细胞与基质胶混合，之后培养在培养皿中。为了方便观察，该种培养皿底部设计为玻片，培养基质和细胞球种植在底层的玻片上，培养结束后直接在培养皿里进行固定、染色等操作。在应用过程中，存在如下问题：1. 样本固定效果不好，染色过程中容易脱落、变形；2.染色步骤繁琐，需要特殊的试剂；3.直接对细胞三维培养物进行染色时，内层的细胞染色效果不好；4.染色后观察不方便，要观察Z轴的细胞需要用共聚焦层层扫描，十分耗时，且分辨率不高；5.同一个细胞三维培养物可检测的指标有限，一般只有2-3种。
为了更好地观察、研究，需要从培养器中取下完整的细胞三维培养组织，但是细胞三维培养得到的组织团，本身的强度较低，在较大力的作用下，会破碎，失去原有的仿生结构。这导致人们基本难以对细胞三维培养得到的细胞团进行充分的研究和观察。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种获得完整细胞三维培养物的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：
S1) 将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；
S2) 将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；
S3) 将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。
在一些方法的实例中，所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。
在一些方法的实例中，所述底部卡接在所述小室的侧壁。
在一些方法的实例中，所述底部粘接在所述小室的侧壁。
在一些方法的实例中，所述底部为柔性膜。
在一些方法的实例中，所述柔性膜设有微孔。
在一些方法的实例中，在所述底部的上表面形成基质胶层，将细胞接种于基质胶上方，形成多层细胞的三维培养物；或者将细胞与基质胶的混合物置于所述底部的上表面进行培养，细胞在基质胶里形成类球状三维培养物。
在一些方法的实例中，所述细胞选自肿瘤细胞、干细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、骨细胞中的至少一种。
本发明的第二个方面，提供：
一种细胞三维培养物的染色方法，包括如下步骤：
按本发明第一个方面所述的方法获得完整的细胞三维培养物；
将取出的完整细胞三维培养物切片、染色。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的方法，培养基质和细胞置于上层小室，培养基置于下层皿，因上层小室有空隙，下层的培养基能渗透至上层，使得上层的细胞能吸收培养基中的营养物质。培养结束后，将上层小室整个浸入固定液中，待固定完成，移除底部，此时上层小室就变成一个两端开口的筒，可以轻松将培养完成的培养物推出，得到完整的细胞三维培养物。后续可以采用组织切片等方法获得细胞培养物的切片，再对切片进行常规的免疫组化、免疫荧光等染色操作步骤，操作大大简化。
附图说明
图1是本发明一种细胞三维培养方法的示意图。
图2是本发明另一种细胞三维培养方法的示意图。
图3是本发明方法得到的鼻咽癌细胞三维组织的HE染色照片。
图4是本发明方法得到的鼻咽癌细胞三维组织的IHC染色照片。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：
S1) 将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；
S2) 将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；
S3) 将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。
通过这种培养方式，可以保证细胞可以充分与培养基接触，利于细胞的生长。培养结束后，移除小室的底部，就可以轻易地将细胞三维培养物推出，得到完整的细胞三维培养物，克服了现有技术难以获得完整细胞三维培养物的不足。
在一些方法的实例中，所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。这些孔可以更好地完成物质交换，满足细胞培养的需要。特别的，当底部也设有小孔时，可以更好地保证底部细胞也可以得到充分的营养供给，与传统的细胞三维培养技术相比，底部细胞可以更好地生长。
孔的大小可以根据需要进行相应的调整，只要保证培养基可以交换且细胞能在小室内形成三维培养物即可。
在一些方法的实例中，所述底部卡接在所述小室的侧壁。这样在培养完成后，可以更方便地移除底部。
在一些方法的实例中，所述底部粘接在所述小室的侧壁。这样易于去除底部。
在一些方法的实例中，所述底部为柔性膜。
在一些方法的实例中，所述柔性膜设有微孔。
在一些方法的实例中，在所述底部的上表面形成基质胶层，将细胞接种于基质胶上方，形成多层细胞的三维培养物(图1)；或者将细胞与基质胶的混合物置于所述底部的上表面进行培养(图2)，细胞在基质胶里形成类球状三维培养物。
本发明方法可以应用于各类细胞的三维培养。在一些方法的实例中，所述细胞选自肿瘤细胞、干细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、骨细胞中的至少一种。
本发明的第二个方面，提供：
一种细胞三维培养物的染色方法，包括如下步骤：
按本发明第一个方面所述的方法获得完整的细胞三维培养物；
将取出的完整细胞三维培养物切片、染色。
实验材料：Matrix gel 购自BD公司；transwell 小室购自康宁公司；E-cadherin抗体购自CST公司；
细胞株和培养基：
HONE1（人鼻咽癌细胞株）
培养基：DMEM添加 10% 胎牛血清（FBS）。
37℃，5% CO2 培养，2-3天传代一次。
具体实施步骤：
1. 接种细胞
在24孔的transwell上层小室底部加入100 ul Matrix gel，置于37℃培养箱中30分钟，待Matrix gel凝固后，在Matrix gel上接种1×105 HONE1细胞；在下层皿中加入1ml培养基，再将接种了细胞的上层小室置于下层的皿上（图1）。将上述装置置于37℃，5% CO2培养箱中培养2-3周，每3天更换一次新鲜培养基。
2. 三维组织分离、固定
待上层细胞长成多层三维组织时，将上层小室与下层皿分离，移除小室底部的柔性膜，用棉签从基质胶一侧轻轻将基质胶连同细胞三维组织一起推出，浸入福尔马林固定液中固定。
3. 包埋、切片、染色
将固定好的三维组织进行石蜡包埋，切片，常规HE和免疫组化染色。HE结果显示鼻咽癌细胞在上述三维培养装置中能较好地模拟体内的多层上皮组织结构（图3）；免疫组化结果显示，E-cadherin主要表达在细胞与细胞连接处，与体内组织相似（图4）。
其他的细胞三维培养物也可以采用类似的方法得到。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种获得完整细胞三维培养物的方法，包括如下步骤：
S1)将细胞和培养基质置于小室内，所述小室设有便于培养基穿透的孔，其底部可移除；
S2)将小室悬浮培养在可以容纳所述小室的培养器中，在培养器中加入培养基，培养至获得所需成熟度的细胞三维培养物；
S3)将所述小室取出，在固定液中固定，移除所述小室的底部，推出得到完整的细胞三维培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孔设置在所述小室的侧壁和/或底部。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述底部卡接在所述小室的侧壁。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述底部粘接在所述小室的侧壁。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述底部为柔性膜。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述柔性膜设有微孔。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：在所述底部的上表面形成基质胶层，将细胞接种于基质胶上方，形成多层细胞的三维培养物；或者将细胞与基质胶的混合物置于所述底部的上表面进行培养，细胞在基质胶里形成类球状三维培养物。
8.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：所述细胞选自肿瘤细胞、干细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、骨细胞中的至少一种。
9.一种细胞三维培养物的染色方法，包括如下步骤：
按权利要求1～6任一项所述的方法获得完整的细胞三维培养物；
将取出的完整细胞三维培养物切片、染色。
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