CN109112096A - 一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，主要包括以下步骤：步骤1：提取小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白做细胞支架；步骤2：将成纤维及上皮细胞分批种植于细胞支架中；步骤3：将步骤2中的基质胶与细胞混合物分批置于Transwell上室和下室中；步骤4：向Transwell上室、下室分别添加上皮专用培养基和普通的DMEM培养基；步骤5：利用气液平面形成角化上皮层，完成体外三维口腔黏膜的建模。既能够形成稳定的细胞分布均匀的体外口腔黏膜模型，且该模型具有良好的可复制性及稳定性，另外降低了建模的技术敏感性，简化了培养材料的种类，节约了资金，缩短了建模周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种实验模型，特别涉及一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型。
背景技术
口腔粘膜是覆盖在口腔表面的粘膜，组织学上由上皮和固有层组成，并借粘膜下层与深部组织相连。口腔粘膜的前方与唇部皮肤相连，后面与咽部粘膜相延续，是消化道的最前端，因此其结构和功能具有皮肤和消化道粘膜的某些特点。口腔粘膜的上皮为复层扁平上皮，除少数部位的皮脂腺外，没有其他的皮肤附属器。口腔粘膜的主要功能是屏障保护功能和感觉功能。不同部位口腔粘膜的形态与结构依其功能特点而有所差异。
当在进行口腔黏膜实验时，为了便于实验和观察，往往会建立口腔黏膜体外三维培养模型，方法为分别培养牙龈上皮细胞及成纤维细胞备用，胶原溶液与成纤维细胞按比例混合后置于Transwell小室培养两天或，于胶原-细胞混合体表面接种上皮细胞，共同增殖培养三天后，升至液气平面继续培养十天，可得三维模型的组织学结构。但这种方式步骤繁琐。且复制率不高、材料复杂、技术敏感性高、成本高昂，不利于大样本实验研究，并且整个建模周期花费时间较长。
因而在此我们提供一种制备步骤简单的体外三维口腔黏膜实验模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，主要包括以下步骤：
步骤1：提取小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白做细胞支架；
步骤2：将成纤维及上皮细胞分批种植于细胞支架中；
步骤3：将步骤2中的基质胶与细胞混合物分批置于Transwell上室和下室中；
步骤4：向Transwell上室、下室分别添加上皮专用培养基和普通的DMEM培养基；
步骤5：利用气液平面形成角化上皮层，完成体外三维口腔黏膜的建模。
作为优选，所述步骤4中，分别添加培养基和普通的DMEM培养基后放置在细胞培养箱中培养6-8天。
作为优选，所述步骤5中，放置5-7天后形成角化上皮层。
作为优选，将步骤5中形成的口腔黏膜模型用刀片从Transwell上室上切下，并使其吸附在玻片上，完整保存。
作为优选，将吸附在玻片上完整保存的口腔黏膜模型依次经过脱水、浸蜡后包埋。
作为优选，预先将基质胶与培养基在冰面上以体积比1:1混合形成支架材料，再与小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白一同形成细胞支架。
作为优选，所述步骤2中的成纤维细胞密度为1.2x106/孔。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.能够形成稳定的细胞分布均匀的体外口腔黏膜模型；
2.提高了该模型的可复制性及模型的稳定性；
3.降低了建模的技术敏感性，简化了培养材料的种类，节约了资金；
4.缩短了建模周期。
附图说明
图1是实施例中整体结构示意图。
图中，1、培养基；2、微孔膜；3、DMEM完全培养基；4、Transwell下室；5、Transwell上室；6、上皮层；7、结缔组织层。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1：
一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，主要包括以下步骤：
步骤1：将基质胶与培养基在冰面上以体积比1：1混合形成支架材料，再将支架材料与小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白混合形成细胞支架。
步骤2：成纤维细胞以1.2x106/孔的细胞密度与支架材料混合接种于Transwell12孔板上室，每孔注入混有成纤维细胞的支架材料300微升。
步骤3：在上室和下室分别加入完全培养基，置于细胞培养箱中培养7天。
步骤4：7天后将上皮细胞以同样的细胞密度与支架材料混合，加入成纤维细胞所形成的固有层表面，每孔注入200微升，上室加入上皮培养基下室加入完全培养基，同样置于细胞培养箱中培养6天。
步骤5：制造液气平面继续培养该模型5天。
步骤6：将该口腔黏膜模型用刀片从上室上切下，利用特制的玻片与上皮层接触，使组织吸附在玻片上，从而使组织能完整保存不会丢失。
步骤7：脱水、浸蜡、包埋。
建模后的整体结构如图1所示，Transwell上室5位于Transwell下室4之上，且Transwell上室5底部为微孔膜2，表面阵列有若干0.4μm的微孔，Transwell下室4中填充为DMEM完全培养基，Transwell上室5中由上至下依次包括上皮细胞无血清专用培养基1、上皮层6和结缔组织层7。
实施例2：
一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，主要包括以下步骤：
步骤1：将基质胶与培养基在冰面上以体积比1：1混合形成支架材料。
步骤2：成纤维细胞以1.2x106/孔的细胞密度与支架材料混合接种于Transwell12孔板上室，每孔注入混有成纤维细胞的支架材料300微升。
步骤3：在上室和下室分别加入完全培养基，置于细胞培养箱中培养8天。
步骤4：7天后将上皮细胞以同样的细胞密度与支架材料混合，加入成纤维细胞所形成的固有层表面，每孔注入200微升，上室加入上皮培养基下室加入完全培养基，同样置于细胞培养箱中培养7天。
步骤5：制造液气平面继续培养该模型7天。
步骤6：将该口腔黏膜模型用刀片从上室上切下，利用特制的玻片与上皮层接触，使组织吸附在玻片上，从而使组织能完整保存不会丢失。
步骤7：脱水、浸蜡、包埋。
实施例3：
一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，主要包括以下步骤：
步骤1：将基质胶与培养基在冰面上以体积比1：1混合形成支架材料。
步骤2：成纤维细胞以1.2x106/孔的细胞密度与支架材料混合接种于Transwell12孔板上室，每孔注入混有成纤维细胞的支架材料300微升。
步骤3：在上室和下室分别加入完全培养基，置于细胞培养箱中培养7天。
步骤4：7天后将上皮细胞以同样的细胞密度与支架材料混合，加入成纤维细胞所形成的固有层表面，每孔注入200微升，上室加入上皮培养基下室加入完全培养基，同样置于细胞培养箱中培养7天。
步骤5：制造液气平面继续培养该模型6天。
步骤6：将该口腔黏膜模型用刀片从上室上切下，利用特制的玻片与上皮层接触，使组织吸附在玻片上，从而使组织能完整保存不会丢失。
步骤7：脱水、浸蜡、包埋。
Claims (7)
1.一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于，主要包括以下步骤：
步骤1：提取小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白做细胞支架；
步骤2：将成纤维及上皮细胞分批种植于细胞支架中；
步骤3：将步骤2中的基质胶与细胞混合物分批置于Transwell上室和下室中；
步骤4：向Transwell上室、下室分别添加上皮专用培养基和普通的DMEM培养基；
步骤5：利用气液平面形成角化上皮层，完成体外三维口腔黏膜的建模。
2.根据权利要求1所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：所述步骤4中，分别添加培养基和普通的DMEM培养基后放置在细胞培养箱中培养6-8天。
3.根据权利要求2所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：所述步骤5中，放置5-7天后形成角化上皮层。
4.根据权利要求3所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：将步骤5中形成的口腔黏膜模型用刀片从Transwell上室上切下，并使其吸附在玻片上，完整保存。
5.根据权利要求4所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：将吸附在玻片上完整保存的口腔黏膜模型依次经过脱水、浸蜡后包埋。
6.根据权利要求5所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：预先将基质胶与培养基在冰面上以体积比1:1混合形成支架材料，再与小鼠肉瘤细胞中的外基质蛋白一同形成细胞支架。
7.根据权利要求6所述的一种组织工程化体外三维口腔黏膜实验模型，其特征在于：所述步骤2中的成纤维细胞密度为1.2x106/孔。
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