CN110373377A - 一种体外血管化组织的构建方法及其用途 - Google Patents

一种体外血管化组织的构建方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110373377A
CN110373377A CN201910625880.4A CN201910625880A CN110373377A CN 110373377 A CN110373377 A CN 110373377A CN 201910625880 A CN201910625880 A CN 201910625880A CN 110373377 A CN110373377 A CN 110373377A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
smooth muscle
vascular
blood vessel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910625880.4A
Other languages
English (en)
Inventor
曹哲厚
哈里什·基兰·汉德尔
韦俊
吴立前
维克拉姆·帕尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd
Original Assignee
Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd filed Critical Hangzhou Primitive Biology Technology Co Ltd
Priority to CN201910625880.4A priority Critical patent/CN110373377A/zh
Publication of CN110373377A publication Critical patent/CN110373377A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0691—Vascular smooth muscle cells; 3D culture thereof, e.g. models of blood vessels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种体外血管化组织的构建方法及其用途，将人类胚胎干细胞在细胞培养条件下分化诱导培养，获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；然后将其在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；将获得的两种细胞以适宜比例接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织；本发明获得的体外血管化组织相较传统的体外模型更接近生理上的现实，可用于识别参与血管变化的信号通路,并开发药物,以减轻多种疾病中的微血管变化。

Description

一种体外血管化组织的构建方法及其用途
技术领域
本发明涉及细胞体外培养技术领域，具体而言，涉及一种体外血管化组织的构建方法及其应用。
背景技术
人类胚胎干细胞(hESCs)是可以自我更新和分化为任何类型细胞系的多能细胞。分化过程中,hESCs获得特殊细胞类型的属性,如心脏(心肌细胞),肝脏(肝细胞),大脑(神经元),皮肤(角质形成细胞)。hESCs最大的治疗希望是产生专门的细胞,以取代各种退行性疾病患者的受损组织。hESCs是了解细胞分化和器官形成所涉及的复杂机制的宝贵工具。此外,hESCs的无限自我更新能力和可塑性允许在体外生成无限数量的不同细胞类型,并为再生医学开辟了新的途径。
血管生成是一个改造已建立的原始血管网络的过程。EC迁移和增殖,空腔形成,和EC 成熟的功能毛细血管。活化ECs释放各种蛋白酶进入周围地区,使基底膜降解。血管芽从现有的血管成长为间质空间。在萌发过程中,位于血管萌发顶端的ECs在血管内皮生长因子(vegf)等趋化因子的浓度梯度的指导下,延长了长的丝状足。位于血管茎中的ECs在对vegf的反应中增殖。ECs通过胞饮和胞吞形成空泡,这些空泡在毛细血管的长时间延伸中聚集形成腔。通过停止EC的增殖和合成新的基底膜,使毛细血管稳定。血管生成发生在卵黄囊和胚胎发育过程中,以及在后期的器官分化,完全分化的周皮细胞对新形成的毛细血管有许多作用。它们的收缩表型允许EC管收缩和放松,从而调节毛细血管的血液流动。它们还通过基础细胞外基质来稳定新形成的血管。由此产生的多种细胞类型之间的相互作用必须仔细检查,以便通过完整的血管网络再生功能组织。
植入性三维血管工程组织可以通过在大孔支架上共同培养内皮细胞和成纤维细胞来构建。体外模型模拟了细胞外基质中最初人类结缔组织系统的特性。这种仿生已被证明对细胞支架相互作用有积极影响,如细胞附着、迁移、增殖和功能。
现有体外血管生成模型多采用内皮细胞接种至凝胶上进行培养，该血管生成模型过于简化，存在稳定性差，血管网络成熟慢等缺点。另外现有的细胞培养还需要使用源自动物的蛋白质(血清)，显著影响了细胞体外培养的规模，另外由于异源动物血清成分的加入，增加了病原污染及免疫排斥的几率，妨碍其临床使用并且根据使用的血清批次而影响过程的可再现性。目前的模型即昂贵又受批次差异影响。
发明内容
为解决上述问题，本发明一方面提供了一种体外血管化组织的构建方法，包括如下步骤：
1)将人类胚胎干细胞(hESCs)在细胞培养条件下诱导培养，获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；
2)将步骤1)获得的纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；以及
3)将步骤2)获得的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织。
采用人类胚胎干细胞进行增殖培养可获得大量细胞资源，为研究提供了易得且较为廉价的细胞来源；采用分化获得的内皮细胞和血管平滑肌细胞在支架上共培养，提高了体外血管化组织稳定性及生成速度。
优选地，所述诱导培养包括采用无异源无血清培养基。无异源无血清培养基可以避免异源血清的加入导致的病原污染及免疫排斥问题，降低批次间的差异。
优选地，所述诱导培养包括在CHIR9901分子存在的情况下诱导细胞分化，分化过程中,用BMP4和VEGF进行连续处理。
所述支架为包含基于天然或杂化聚合物的支架。进一步优选地，所述支架优选聚乙二醇- 纤维蛋白。聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶具有良好的聚合浓度及生化性能，有利于细胞增殖、迁移和血管化组织的形成。
优选地，步骤3)中所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。
根据另一方面，本发明提供一种体外血管化组织，其采用上述方法构建。
优选地，所述体外血管化组织维持在细胞培养物中。
根据另一方面，本发明提供了一种上述体外血管化组织在药物筛选中的应用。
优选地，所述药物为抗血管生成和/或促血管生成药物。
根据另一方面，本发明提供了一种微流体平台，包括载玻片及连接于其上的由5μm孔径多孔膜分隔的上下两层聚二甲基硅氧烷层，上层聚二甲基硅氧烷层中心具有圆形外壳，外壳内容纳体外血管化组织。
优选地，下层聚二甲基硅氧烷层具有若干个平行微通道，微通道的出口和入口连接了培养基储存腔。
优选地，所述平行微通道高度和宽度均优选为150μm，个数优选为5个。
优选地，所述圆形外壳直径优选6mm；所述上下两层聚二甲基硅氧烷层厚度分别优选为2mm和3mm；所述培养基储存腔容量优选为250μl。
根据另一方面，本发明提供了一种微流体平台的制备方法，包括以下步骤：
1)将下层聚二甲基硅氧烷层粘合到载玻片上，制备微通道及培养基存储腔；
2)将培养基装入培养基储存腔，在微通道出口侧施加负压,将培养基引入微通道；
3)在支架中接种血管内皮细胞和血管平滑肌细胞后转移至上层聚二甲基硅氧烷层外壳内，进行培养，以获得微流体平台。
优选地，所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。
优选地，培养基每24h更新一次。
有益效果：
1.本发明体外血管化组织生成模型具有快速、易操作、重复性高等优点；采用人类胚胎干细胞增殖培养，提供了易得且较为廉价的细胞来源；采用分化获得的内皮细胞和血管平滑肌细胞以适宜比例在支架上共培养，相较只接种内皮细胞或内皮细胞与其他细胞的组合，提高了体外血管化组织密度、稳定性及生成速度。
2.本发明采用无异源无血清培养基，避免异源血清的加入导致的病原污染及免疫排斥问题，降低批次间的差异。
3.本发明采用聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶作为支架，该支架良好的聚合浓度及生化性能，有利于细胞增殖、迁移和血管化组织的形成。
4.本发明体外血管化组织中的细胞保持其表型、活力、增殖和适当的屏障功能，相较现有体外血管化组织更接近生理上的现实，成本更低，为生物物理和生化特性如何影响血管生物学和病理生理学提供了有价值的定量见解,并作为体内动物研究的补充。
5.本发明血管化组织和微流体平台可用于识别参与血管变化的信号通路,并开发药物,以减轻多种疾病中的微血管变化。
附图说明
图1为从hESC分化细胞建立血管化组织的工艺流程图，(A)hESCs；(B)血管平滑肌细胞；(C)血管内皮细胞；(D)3D共培养建立；(E)功能性血管；(F)微流体平台；
图2为hESC分化细胞的相差图像，(A)内皮细胞&(C)血管平滑肌细胞；(B)表达V E-钙粘附分子的内皮细胞和(D)vSMC表达α-sma的免疫荧光染色图像；
图3为MTF试验:在基质胶和血管样网络交界处的半三维环境中培养了hESC分化的内皮细胞；(A)相差图像和(B)钙-AM染色细胞；标尺:100μm；
图4为在聚乙二醇纤维蛋白凝胶中共培养hESC分化的ECs和vSMCs，聚乙二醇化水凝胶支架血管第2天、第5天、第8天及第12天生长图；
图5为组织培养板的概览图像,以突出覆盖组织板生长区域的微血管结构的程度；标尺:100μm；
图6为三维血管化组织床的共聚焦成像图像,(A)显示由hESC-EC和hESC-vSMCs发展的血管网络；(B)将单个微血管分开并进一步分支,产生两个毛细血管。(C)突出血管中的腔形成；(D)在聚乙二醇纤维蛋白水凝胶中培养的体外血管化床的H&E染色；深色虚线表示vSMC的存在,浅色虚线显示了来自hESC-EC的管状血管的形成；
图7利用体外血管化组织床筛选促血管生成和抗血管生成化合物；(A)用VEGF-A治疗4、24和48小时的体外血管，显示血管的促进；(B)用苏拉明治疗4、24和48小时的体外血管，显示了体外血管的抑制；
图8扩大技术，基于重力的微流体平台,以扩大血管化床从hESC分化细胞的体外和体内应用。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
体外血管化组织构建材料及方法
实施例子1：人类胚胎干细胞(hESCs)增殖培养：
将复苏后的hESC细胞(含饲养层细胞)接种于经基质胶包被的细胞培养板上，加入无血清1培养基维持培养，为保持其理想的未分化状态，采用分散酶(1g/L)机械方法按照1∶4比率进行传代。初始的饲养层细胞(来自于原冻存细胞)在传代过程中数目逐渐少，在3～5次传代后完全消失，从而转变为无饲养层细胞培养模式。培养过程中每天观察细胞的形态及生长情况，每天更换培养基，并在体视显微镜下及时去除发生分化的细胞集落。收集hESC集落并通过温和吹打分成小片集落，将其以5至6集落每10cm2铺在基质胶包被的板上。
实施例子2：hESC分化为血管内皮纯祖细胞和血管平滑肌纯祖细胞：
将实施例子1中的在无饲养层条件下增殖的hESC接种在纤连蛋白预包被的板上。允许24小时的hESC集落附着。此后以stemdifTMapelTM2为基础培养基,利用化学成分明确的无异源和无血清分化培养基。通过使用CHIR9901抑制GSK 3(糖原合酶激酶3,glycogensynthase kinase 3)路径导致多能性和外胚层标志物下调，将hESC导向原条。随后，用骨形态发生蛋白4(bmp4)和血管内皮细胞生长因子(vegf)进行连续分化处理5天。在分化的第5天，对细胞进行FACS分选，获得血管内皮纯祖细胞和血管平滑肌纯祖细胞。
实施例子3：纯祖细胞培养获得成熟、功能性细胞群：
将通过实施例子2的FACS分选出的血管内皮纯祖细胞接种在纤连蛋白预包被的板上 (1至5μg/cm2时，通常为1.5μg/cm2)，并在补充有VEGF(20至25ng/ml，通常为0ng/ml)、bFGF(0至50ng/ml，通常为l0ng/ml)和EGF(0至20ng/ml，通常为5ng/ml)的内皮无血清培养基(ESFM、GlBCO)中培养2至5代；FACS分选出的血管平滑肌纯祖细胞，接种在纤连蛋白预包被的板(1至5μg/cm2，通常为1.5μg/cm2)上，并在补充有PDGFbb(1至20ng/ml，通常为l0ng/ml)、bFGF(0至20ng/ml，通常为l0ng/ml)和EGF(0至20ng/ml，通常为5ng/ml) 的平滑肌细胞无血清培养基中培养3至10代。在培养2-4代后，针对内皮细胞和平滑肌细胞标志物的表达分别对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞进行表征，进行功能鉴定，结果如图2所示，获得成熟、有功能的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
实施例子4：体外三维血管化组织构建：
4.1聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶制备：使用来自人的纤维蛋白原、琥珀酰亚胺基戊二酸脂封端的PEG-4-臂、凝血酶和氯化钙。所有四种化学品的工作原液都是通过按照制造商的说明书制备的。简而言之，纤维蛋白原是在0.1M碳酸氢钠(pH 8.3)中以80mg/ml的浓度重构的，并在室温下轻轻摇动混合1小时，在等分后将原液储存在-80℃下。PEG是以 8mg/ml的浓度重构的，将等分试样储存在-20℃下。人凝血酶以100U/ml的浓度等分并储存在-20℃下。考虑到纤维蛋白原和PEG的最终浓度分别为10mg/ml和0.25mg/ml，通过以 10:1至50:1(通常为40:1)的比例混合PEG-纤维蛋白原制造了支架。将该混合物在37℃下孵育20至30分钟。将凝血酶和CaCl2(40mM)以1:3的比例混合，并置于冰上20至30 分钟。
4.2接种：
4.2.1血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种(实施例子3)：将由hESC分化得到的成熟、有功能的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞以10:1的比例添加到PEG-纤维蛋白原溶液中，然后将等体积的凝血酶-CaCl2和添加细胞后的PEG-纤维蛋白原溶液混合，在细胞培养条件下培养，至形成体外三维血管化组织。hESC分化的血管细胞在特定的无血清培养条件下嵌入水凝胶中,经过5天的培养期,观察到了毛细血管的形成。
在另一些实施例中血管内皮细胞和血管平滑肌细胞添加到PEG-纤维蛋白原溶液中的比例为40:1。
4.2.2血管内皮细胞接种：将由hESC分化得到的成熟、有功能的血管内皮细胞以10:1 的比例添加到PEG-纤维蛋白原溶液中(来自4.1制备的)，然后将等体积的凝血酶-CaCl2和添加细胞后的PEG-纤维蛋白原溶液混合，在细胞培养条件下培养，至形成体外三维血管化组织。但是经过了15天才有毛细血管的形成。该细胞的来源为实施例子1，并通过筛选获得纯化单一的血管内皮细胞，这些细胞也经过常规的培养，从而获得成熟的细胞群。具体数据略。
4.2.3血管内皮细胞和成纤维细胞接种：将由hESC分化得到的成熟、有功能的血管内皮细胞及制备的成纤维细胞以10:1的比例添加到PEG-纤维蛋白原溶液中，然后将等体积的凝血酶-CaCl2和添加细胞后的PEG-纤维蛋白原溶液混合，在细胞培养条件下培养，至形成体外三维血管化组织。在12天的时间才观察到毛细血管的形成。具体数据略。
4.2.4血管内皮细胞和外周细胞接种：将由hESC分化得到的成熟、有功能的血管内皮细胞及制备的外周细胞以10:1的比例添加到PEG-纤维蛋白原溶液中，然后将等体积的凝血酶-CaCl2和添加细胞后的PEG-纤维蛋白原溶液混合，在细胞培养条件下培养，至形成体外三维血管化组织。在10天的时间才观察到毛细血管的形成。具体数据略。
从以上实验可以明显看出，本发明采用的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种到聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶中，开始出现微血管的时间最早，均早于其它组合的方式。这可能提示，在进行体外形成血管的实验中，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞培养，可以较早的获得可见的微血管，这为一些商业应用有良好的前景。这是因为，例如在进行组织修改或者伤口修复或者血管再生的过程中，尽可能的早的获得血管的，缩短血管再生的时间，可以加快应用的前景。
实施例子5：血管细胞毛细血管形成能力验证
5.1：金标准人工基质胶管形成(MTF)法：为了探索细胞-材料的相互作用,以了解细胞的功能作为细胞对新材料的适应性，采用金标准人工基质胶管形成(MTF)法,证明了细胞的毛细血管形成能力。如图3所示，在显微镜下观察时,hESC分化的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞(来源于实施例子)在matrigel中表现出和弦状的延伸。使用matrigel作为生物材料,并探索细胞材料的反应。分化的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞被嵌入基质胶中。
在接种细胞36小时后,注意到微毛细血管样的生长(血管内皮细胞和血管平滑肌细胞)。而在基质胶中只接种血管内皮细胞，接种血管内皮细胞和成纤维细胞，或者，接种血管内皮细胞和外周细胞的实验中，毛细血管样的生长被观察到的时间分别为接种细胞后的60小时、48h、50h。可以看出接种hESC分化的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞后毛细血管出现的时间要早于接种其他细胞组合。
5.2聚乙二醇-纤维蛋白法：考虑到基于纤维蛋白的生物降解材料,在体外三维微环境中培养了hESC分化的血管细胞。采用无血清无异源成分的培养基，用纤维蛋白原与PEG结合形成支架，在PEG-纤维蛋白水凝胶中,以最佳配比共培养细胞组合,并将其灌注在12孔板中。细胞悬浮液与聚乙二醇纤维凝胶混合,使细胞嵌入凝胶中。在具有生长添加物的ESFM中培养细胞水凝胶,观察并验证血管化组织结构的形成。
接种了hESC分化的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的聚乙二醇纤维凝胶中7天内形成了成熟稳定的血管化组织结构,并通过组织学切片的免疫荧光染色进行了验证。如图4-6 所示，H&E染色切片显示组织结构内形成了血管网络。随着内皮血管网络的存在,vSMCs的存在也得到了证明。血管结构的组织切片进行免疫染色,以确认EC和vSMC特异性蛋白的存在。在血管化组织切片中观察到纤维连接蛋白、VE-钙粘蛋白、Von Willebrand因子在血管化组织切片中的表达。
而只接种血管内皮细胞，接种血管内皮细胞和成纤维细胞，接种血管内皮细胞和外周细胞的实验中，成熟稳定的血管化组织结构形成时间为接种后的20天、16天、15天，且接种血管内皮细胞和血管平滑肌细胞形成的血管化组织特异性表达蛋白荧光信号明显强于接种其他细胞组合(具体实验数据略)。由此说明，接种血管内皮细胞和血管平滑肌细胞形成成熟稳定血管化组织的时间更短，新生血管的密度更高，具有更好的质量。
实施例子6：体外血管化组织结构的应用
在确认了该技术的可重复性和重现性以后,设计了实验进行体外血管的应用性研究。使用聚乙二醇化水凝胶和形成功能性毛细血管来筛选抗血管生成和促血管生成药物,从而建立一个筛选工具。使用96孔板bidiμ-血管生成板。利用倒置荧光显微镜,观察和记录了腔内毛细血管的形成和生长,形成了功能性网络。如图7所示，用VEGF-A治疗4、24和48 小时的体外血管，显示血管的促进；用苏拉明治疗4、24和48小时的体外血管，显示了体外血管的抑制。
实施例子7：微流体平台及制备方法
利用由5μm孔径多孔膜分离的两层聚二甲基硅氧烷(PDMS)，研制了微流体平台。使用了2毫米厚的PDMS的上层,它的中心有一个直径为6毫米的圆形外壳,以容纳组织结构。一个3毫米PDMS层在底部粘合,并有5个平行微通道(高度和宽度为150μm)。微通道的(入口和出口)两端连接了250μl容量的培养液储罐。在18w的情况下,通过等离子体粘合将底部PDMS层连接到载玻片上,时间为30秒。利用标准光刻技术制备微通道。简单地说，SU-2100光刻胶在500转/分离心10秒,然后1800转/分离心30秒。晶圆在65° c和95°c下分别被烘烤了5分钟和30分钟。表面随后暴露在紫外线下20秒,后烘烤12 分钟,开发15分钟。
聚碳酸酯膜和PDMS层在室温下结合。乙醇和异丙醇冲洗膜在18w进行了风干和等离子清洗1分钟。然后浸泡在1％v/vIJ3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)的去离子水溶液中 20分钟,并用去离子水冲洗。在18w的等离子体下处理的PDMS层,在18w下处理30 秒,然后立即与膜接触。在室温下不到一分钟就形成了不可逆转的结合。设置的所有部件和所需配件都通过高压灭菌。通过将培养基装入进储罐,并在出口侧施加负压,将培养基引入装置。在芯片的细胞隔间进行接种和支架制作之前,将微流体芯片在培养基中保持24 小时,以检查任何泄漏和污染问题。以优化后的比例在聚乙二醇-纤维蛋白凝胶中接种了 hESC-vSMCs与hESC-EC。培养液每24小时更新一次。在10天内达到成熟的血管化结构后, 血管化组织结构在37°c和5％CO2的加湿培养箱中的无菌培养皿中培养。为保持摇杆平台的角度和速度分别为每分钟15度和2圈,进行了重力驱动安排。经过10天的培养期,将血管在载玻片上培养物固定在4％的多聚甲醛中,并进行组织处理和染色，结果如图8所示。
同样，采用只接种血管内皮细胞，接种血管内皮细胞和成纤维细胞，接种血管内皮细胞和外周细胞的实验中，发现并不能有效的具有成熟血管的生成能力。有些虽然有，但是需要耗费的时间长，例如仅仅是血管内皮细胞，需要至少15天的时间才有血管的出现，但是并不是成熟的血管。从以上数据可以看出，本发明的血管培养方法适合不同的介质进行生长发育，应用范围更广。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (16)

1.一种体外血管化组织的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将人类胚胎干细胞在细胞培养条件下分化诱导培养，分选获得纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞；
2)将步骤1)获得的纯祖细胞的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在各自培养基中进一步培养,获得成熟和有功能的细胞群；以及
3)将步骤2)获得的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞接种至支架上，在细胞培养条件下进一步培养至形成血管化组织。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化诱导培养包括采用无异源无血清培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分化诱导培养包括在CHIR9901分子存在的情况下诱导细胞分化，分化过程中,用骨形态发生蛋白4和血管内皮细胞生长因子进行连续处理。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支架为包含基于天然或杂化聚合物的支架。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述支架优选聚乙二醇-纤维蛋白。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。
7.一种体外血管化组织，其特征在于，采用上述任一项权利要求所述方法构建获得。
8.如权利要求7所述体外血管化组织，其特征在于，所述体外血管化组织维持在细胞培养物中。
9.一种如权利要求7-8任一项所述的体外血管化组织在药物筛选中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为抗血管生成和/或促血管生成药物。
11.一种微流体平台，其特征在于，包括载玻片及连接于其上由多孔膜分隔为上下两层的聚二甲基硅氧烷层，上层聚二甲基硅氧烷层中心具有圆形外壳，外壳内容纳体外血管化组织。
12.如权利要求11所述微流体平台，其特征在于，下层聚二甲基硅氧烷层具有若干个平行微通道，微通道的出口和入口连接了培养基储存腔。
13.如权利要求12所述微流体平台，其特征在于，所述平行微通道高度和宽度均优选为150μm，个数优选为5个。
14.如权利要求12所述微流体平台，其特征在于，所述圆形外壳直径优选6mm；所述上下两层聚二甲基硅氧烷层厚度分别优选为2mm和3mm；所述培养基储存腔容量优选为250μl。
15.一种微流体平台的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将下层聚二甲基硅氧烷层底部粘合到载玻片上，制备微通道及培养基存储腔；
2)将培养基注入培养基储存腔，在微通道出口侧施加负压,将培养基引入微通道；
3)在支架中接种血管内皮细胞和血管平滑肌细胞后转移至上层聚二甲基硅氧烷层外壳内，进行培养，以获得微流体平台。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的接种比例为10-40:1。
CN201910625880.4A 2019-07-11 2019-07-11 一种体外血管化组织的构建方法及其用途 Pending CN110373377A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910625880.4A CN110373377A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种体外血管化组织的构建方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910625880.4A CN110373377A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种体外血管化组织的构建方法及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110373377A true CN110373377A (zh) 2019-10-25

Family

ID=68252842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910625880.4A Pending CN110373377A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种体外血管化组织的构建方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110373377A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540278A (zh) * 2022-03-25 2022-05-27 青岛大学 微血管体外培养方法及培养液

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245311A (zh) * 2008-02-26 2008-08-20 武汉大学 一种三维高通量药物筛选芯片及其制备方法
CN106811409A (zh) * 2015-12-01 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 基于微流控芯片的多器官肿瘤靶向药物测试平台及其应用
CN106811415A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种与三维培养相结合的transwell微流控芯片及其制备方法
CN107849530A (zh) * 2015-06-22 2018-03-27 新加坡国立大学 血管化组织、皮肤或黏膜等效物
CN109554278A (zh) * 2018-12-27 2019-04-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种器官芯片及基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245311A (zh) * 2008-02-26 2008-08-20 武汉大学 一种三维高通量药物筛选芯片及其制备方法
CN107849530A (zh) * 2015-06-22 2018-03-27 新加坡国立大学 血管化组织、皮肤或黏膜等效物
CN106811409A (zh) * 2015-12-01 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 基于微流控芯片的多器官肿瘤靶向药物测试平台及其应用
CN106811415A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种与三维培养相结合的transwell微流控芯片及其制备方法
CN109554278A (zh) * 2018-12-27 2019-04-02 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种器官芯片及基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王夙博 等: ""血管内皮细胞与平滑肌细胞体外共培养方法及其应用"", 《中国药学杂志》 *
谢尚喆 等: ""内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管：最适比例验证"", 《中国组织工程研究与临床康复》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540278A (zh) * 2022-03-25 2022-05-27 青岛大学 微血管体外培养方法及培养液
CN114540278B (zh) * 2022-03-25 2023-11-21 青岛大学 微血管体外培养方法及培养液

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7122371B1 (en) Modular cell culture bioreactor
CN102016009B (zh) 膜
CN101433478B (zh) 一种全层生物角膜及其构建方法和用途
CN107849530A (zh) 血管化组织、皮肤或黏膜等效物
CN107988158B (zh) 一种三维肿瘤模型脱细胞多孔支架、构建方法及其应用
CN103328625A (zh) 生物反应器
CN105126177A (zh) 三维纳米结构化复合支架及其制备方法
JP2010538681A (ja) 人または動物胚から間葉系幹細胞を抽出及びその分泌物を抽出する方法
CN105079783B (zh) 药物组合物及其制备方法和用途
CN104399125B (zh) 表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法
WO2005014774A1 (ja) 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法
CN107050517B (zh) 无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法
CN101259292A (zh) 一种组织工程血管的构建方法
CN107075443B (zh) 三维细胞培养系统和使用该系统的细胞培养方法
JP6733126B2 (ja) 三次元細胞集合体の作製方法
JP2014060991A (ja) 多孔質中空糸の内腔を用いる幹細胞の培養方法
JP2003503021A (ja) スフェロイドの調製
CN110373377A (zh) 一种体外血管化组织的构建方法及其用途
CN113846016A (zh) 一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用
CN110384823B (zh) 基于丝素蛋白支架的仿生肝小叶及构建方法
CN108324993A (zh) 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
CN107372302B (zh) 体内筛选对肿瘤细胞生物学有影响生物大分子的动物模型
CN109954165A (zh) 一种不含有支架的组织工程血管构建方法
CN110628699B (zh) 一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法
CN113018501A (zh) 一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191025

RJ01 Rejection of invention patent application after publication