JP2003503021A - スフェロイドの調製 - Google Patents

スフェロイドの調製

Info

Publication number
JP2003503021A
JP2003503021A JP2001505671A JP2001505671A JP2003503021A JP 2003503021 A JP2003503021 A JP 2003503021A JP 2001505671 A JP2001505671 A JP 2001505671A JP 2001505671 A JP2001505671 A JP 2001505671A JP 2003503021 A JP2003503021 A JP 2003503021A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
spheroid
spheroids
mixture
elongated
forming
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2001505671A
Other languages
English (en)
Inventor
リー ジョーンズ，ダレク
Original Assignee
ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン filed Critical ユニバーシティ オブ ウェールズ カレッジ オブ メディスン
Publication of JP2003503021A publication Critical patent/JP2003503021A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 スフェロイド形成活性をもつ混合物又は物質は、スフェロイド形成活性を与えるのに十分な温度及び期間、ウシ胎児血清を加熱処理することにより得られる。細胞培養に導入した場合、そのようにして得られた前記物質又は混合物は、細胞を、単層とは対照的に三次元培養で成長させる。上述の混合物又は物質の製造のためのキット及び前記混合物又は物質のさらなる使用をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本願発明は、ウシ胎児血清からのスフェロイド形成活性をもつ物質又は混合物
の製造方法及びスフェロイド形成方法に関する。
【０００２】 スフェロイドとは、常態では懸濁状態で成長する細胞の三次元培養である。ス
フェロイド形成のための多くの方法は、例えば米国特許第５６２４８３９号に明
示されている、しかしながらそれらは比較的複雑であることが知られている。用
語「スフェロイド」は、慣用的におおよそ球状の形の物体を表現するためにしば
しば用いられるが、前記用語は、本明細書においてはより広く、物質上での単層
状態とは対照的に細胞を懸濁状態で成長させるあらゆる三次元細胞構造を表すた
めに用いられる。したがって前記用語スフェロイドは、おおよそ球状の細胞クラ
スターだけでなく、単層形態ではなく細胞が三次元構造を形成するようなひも状
構造又は格子若しくは網状構造をも包含する。
【０００３】 スフェロイドは、一般的には、例えば組織培養の研究に使用される。
【０００４】 本発明の第１の側面によれば、スフェロイド形成に使用するための物質又は混
合物を製造する方法が提供され、上記方法は、その結果として生じる物質又は混
合物にスフェロイド形成活性を与えるのに十分な時間及び温度でのウシ胎児血清
の加熱処理を含む。
【０００５】 前記加熱処理は、好ましくは６０℃〜８０℃の間の温度で行われ、よりいっそ
う好ましくは６５℃〜７５℃の間である。しかしながら、これらの範囲外の温度
、特にこれらの範囲より低い温度が使用されうることは予想される、とはいえ、
上記の場合インキュベーション時間がより長くなるであろう。前記加熱処理は、
例えば３０分間〜１２時間の間で行われうる。ＦＣＳの多くのバッチについて、
前記物質又は混合物を製造のための至適条件は、７０℃、５時間であることが知
られている。しかしながら、異なる量の前記物質又は混合物が異なる温度及びイ
ンキュベーション時間にて製造され、一般的により高い温度及びより長いインキ
ュベーション時間においてより多く製造される。とは言っても、より高い温度は
、前記血清中のタンパク質の大量の凝固を生じさせ、よって前記物質又は混合物
の活性の低下に終わる。
【０００６】 前記方法は、前記結果として生じる物質又は混合物を分割して約−２０℃にて
保存するステップをさらに含みうる。
【０００７】 本発明の第２の側面によれば、先に記載された方法により形成された、スフェ
ロイド配合物に使用するための物質又は混合物が提供される。
【０００８】 本発明のさらなる側面によれば、容器中で細胞を先に記載された方法により形
成される物質又は混合物と接触させることを含むスフェロイド形成方法が提供さ
れる。
【０００９】 １つ以上の細胞タイプを使用することができ、よって前記方法をホモスフェロ
イドに加えて、ヘテロスフェロイドの形成に使用できるようにする。確かに、ヘ
テロスフェロイドは、いくつかの細胞タイプを必要とされる割合で加えることで
容易に形成されうる。
【００１０】 前記スフェロイド形成方法は、典型的には一晩中のインキュベーション期間を
必要とする。
【００１１】 スフェロイドの大きさは、最初の細胞数、インキュベーション時間、及び培養
容器の形状により規定されうる。一般的に小さい及び中間の大きさ（１００マイ
クロメーターまで）のスフェロイドは、２４時間後に形成され、そしてその後そ
れらの大きさは細胞増殖によってよりはむしろスフェロイドの融合によって主に
増す。
【００１２】 スフェロイドの調製に使用される前記物質又は混合物は、１つの態様において
、プラスチックで作られた容器上にコートされうる。あるいは、スフェロイドの
調製は、非コート容器において行われ、そしてこの場合、スフェロイドの調製に
使用される前記物質又は混合物の５〜１０％溶液が、上記細胞培養の培地に加え
られる。
【００１３】 本発明のさらなる側面によれば、線状に配置した多数の細胞を含む提供された
細長いスフェロイドがある。
【００１４】 前記細長いスフェロイドは、「ひも状スフェロイド」として知られている。
【００１５】 典型的には、前記細長いスフェロイドは、少なくとも約１cm、又は好ましくは
約２cmの長さでありえる。典型的には、細長いスフェロイドは、直径約０．２〜
０．５mmであることができ、そして１cmの長さ当たり１００，０００〜１５０，
０００の細胞を含んだ、２５cmの長さでありうることが知られている。しかしな
がら、細長いスフェロイドは、１００cm超の長さになりうることは、留意される
べきである。
【００１６】 重ねて、前記細胞は１以上のタイプであり、よって２つのホモ−又はヘテロ−
ひも状スフェロイドを作製することができる。１つの例において、ＭＣＦ７及び
乳房線維芽細胞株が、準備された。１以上の層が、内側の細長い細胞の配列を取
り囲んで配列しうる。ＥＣＶ細胞は、三重のひも状スフェロイドにおいて３つの
細胞層を提供するために付加的に使用された。
【００１７】 本発明のさらなる側面によれば、細胞培養物を、前記必要とされる濃度におい
て、先に記載の方法により形成したスフェロイド形成物質又は混合物と接触させ
、上記懸濁液を管状部材内に入れ、上記管状部材の内容物をインキュベートし、
そして上記細長いスフェロイドを取り出すことによりスフェロイドを形成するこ
とを含む細長いスフェロイドを形成する方法が提供される。典型的には、前記必
要とされる濃度は、１ミリリットル当たり細胞６００〜１０００万個の範囲内で
ある。他の態様において、前記管状部材は、約１mmの内径をもちうる。典型的に
は、前記管状部材は、約２５cmの長さと２mmの外径をもつ「蝶」の形状でありう
る、しかしながら、あらゆる適合した管、例えばプラスチックの管状部材、そし
て好適な寸法の管状部材を使用することができた。
【００１８】 前記方法は、インキュベートする前に前記管状部材を伸ばす、そして好ましく
はその管を水平の位置に保つステップをさらに含みうる。
【００１９】 本発明のさらなる側面によれば、先に記載の方法により形成される、スフェロ
イド形成に使用するための物質又は混合物及び培養容器を含む、細長いスフェロ
イドを形成するためのキットが提供される。前記培養容器は、管状であることが
でき、Ｖ字形の断面をもつ、横に並ぶか格子か格子の形に形成された１以上の細
長い部品であることができる。
【００２０】 前記キットは、懸濁液を管状部材中に入れ、上記管状部材から前記細長いスフ
ェロイドを取り出し、及び／又はインキュベートの間、上記管状部材を水平に配
置し続けるといった手段をとる、細長いスフェロイド形成のために必要とされる
細胞をさらに含みうる。
【００２１】 本願発明による、スフェロイド形成に使用するための前記物質又は混合物の多
くの使用が具体化されることができ、そしてその例は以下の各項を含む。 （ｉ） それは、組織培養の研究におけるホモ−又はヘテロスフェロイドの作製
のための市販の製品として、未精製状態又は精製状態のどちらでも容易に準備さ
れうる。 （ii） それは、インビトロにおいて血管を作るために異なる細胞タイプ、例え
ば線維芽細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞から作られる、ひも状スフェロイドの
調製に使用されうる。 （iii) それは、一種の皮膚移植として使用するために、人工支持材に接着され
うるケラチノサイト／線維芽細胞及び他の皮膚細胞のミニ・スフェロイドの調製
に使用されうる。これは、広範囲開放創の表面上に皮膚細胞の微小な島を生み出
すことができる。傷の滲出物が前記の島の間を通過することをはじめに許容しな
がら前記スフェロイドの密度は、皮膚の島の最適な生育及び連結をもたらすべく
調節されうる。 （iv） それは、抗癌治療における他の観点のための主成分を形成しうる。腫瘍
細胞が、本発明の物質又は混合物によって、スフェロイドとして培養されるとき
、それらの増殖は、明らかに弱まり、そして上記細胞が互いにより強く接着する
（その結果スフェロイドを形成）。したがって、それは、腫瘍細胞の増殖を遅ら
せる又は止めさえする抗転移因子及び／又は作用物質のための主成分を形成しう
る。
【００２２】 したがって、本発明のさらなる側面によれば、先に記載した方法により形成さ
れる、スフェロイド形成に使用するための物質又は混合物の抗癌治療における使
用が提供される。
【００２３】 本発明は、ウシ胎児血清中に含まれる１以上のタンパク質の重合体を含み、少
なくとも２MDa の分子量とスフェロイド形成活性をもつ重合体成分までさらに範
囲を広げる。
【００２４】 他の側面において本願発明は、ウシ胎児血清中に含まれる１以上のタンパク質
の重合体を含み、少なくとも２MDa 超の分子量をもち、そしてスフェロイド形成
活性をもつ重合タンパク質を提供する。
【００２５】 他の側面において本願発明は、それにより重合タンパク質がスフェロイド形成
活性をもちうるところのウシ胎児血清の加熱処理により得ることができる重合タ
ンパク質を提供する。
【００２６】 他の側面において本願発明は、創傷治癒及び／又は皮膚移植に用いる、ケラチ
ノサイト及び線維芽細胞を含む群から選ばれる皮膚細胞の調製のための重合タン
パク質の使用を提供する。
【００２７】 他の側面において本願発明は、一般的なＶ字型の下部横断面をもつ細長い培養
容器を提供し、上記培養容器中に細胞培養物とスフェロイド形成物質又は混合物
を取り込み、上記容器の内容物をインキュベートし、そして細長いスフェロイド
を取り出すことを含む、細長いスフェロイド形成の方法を提供する。
【００２８】 便宜的に、以下本明細書において「スペファデル（Ｓｐｅｆａｄｅｌ）」は、
市販のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の加熱処理により作製される、本発明のスフェロ
イド形成物質又は混合物に与えられる名称である。
【００２９】 本発明を、これまで定義してきたが、本発明は、先に又は以下の本明細書中に
述べる特徴のあらゆる本願発明の組合わせを含むと理解すべきである。
【００３０】 本発明は、さまざまな手段において実施することができる、そこで具体的な例
を実施例の形で、添付の図面への言及とともにここで記載する。
【００３１】 実施例１−「スペファデル」の調製 水浴中６５〜７５℃の間の温度にて３０分間〜７時間のウシ胎児血清（ＦＣＳ
）の加熱処理は、「スペファデル」として知られる物質又は混合物を生じる。異
なる量の「スペファデル」は、異なる温度及びインキュベート時間において作製
され、そしてより多くの「スペファデル」は、より高い温度及びより長いインキ
ュベーション時間において作製される。「スペファデル」の至適作製条件は、７
０℃５時間である。７５℃以上であるところのより高い温度は、前記血清中のタ
ンパク質の多くの凝固を生じ、「スペファデル」活性の低下に終わる。
【００３２】 スフェロイド形成の不活性は、６０℃で４時間まで加熱処理したＦＣＳにおい
て見られたが、しかしこの温度で７時間のインキュベートの後には「スペファデ
ル」活性があった。
【００３３】 「スペファデル」の作製及び量は、ＦＣＳのバッチの違いに大きく依存するこ
とに留意すべきである。この場合前記温度及び処理の長さは、調節され、そして
上記「スペファデル」のスフェロイド形成活性が試験される。
【００３４】 「スペファデル」は、典型的には７０℃５時間ＦＣＳを加熱することにより調
製され、そして必要とされるまで、アリコートとして−２０℃で保存している。
【００３５】 実施例２−スペファデルによるスフェロイド調製 スフェロイドは、普通の滅菌組織培養用フラスコ／ペトリ・ディッシュ又は滅
菌した組織培養用ではないフラスコ／ペトリ・ディッシュの中で異なる細胞株か
ら調製されうる。スフェロイドは、「スペファデル」により２４時間以上プレ・
コートし、そしてその後洗浄し、その表面に吸着しなかったすべてのタンパク質
等を除いたフラスコ／ディッシュの中で調製されうる。スフェロイドは、標準的
組織培養培地、例えばＲＰＭＩ １６４０，ＤＭＥＭ，ＤＭＥＭ／Ｆ１２等のい
ずれかの中に１％〜１０％「スペファデル」が存在する、フラスコ／ディッシュ
内で調製されうる。スフェロイドは、懸濁状態の細胞によってのみ形成され、そ
してプラスチック組織培養容器にすでに接着した細胞によって形成されない。試
験した全細胞タイプの果密下の単層に１０％スペファデル培地を加えた場合、そ
れらは、単層として成長を続け、そしてＦＣＳ添加培地により培養された細胞と
ほぼ同じ速度で成長する。これらの条件下で「スペファデル」は、前記細胞に対
して全く毒性がない。
【００３６】 コートしたプラスチック容器におけるスフェロイド調製 前記スフェロイド調製に使用される容器は、細胞培養に好適な、実質的にはあ
らゆる種類の毒性のないプラスチックでありうるが、しかし無菌のものでなくて
はならない。首尾よく使用される典型的な容器は、ヌンク／ステリリン社２５cm 2 組織培養フラスコ、ステリリン社９０mm微生物学プレート、ファルコン社２５
mm及び５０mm組織培養プレート、並びに９６，２４、及び６穴ヌンク・マイクロ
タイター・プレートを含んだ。約１ml／プラスチック表面１５cm2 にて「スペフ
ァデル」を加え、そしてその表面上に均等に広げた。前記容器を、その後３７℃
のインキュベーターの中に２４〜７２時間置いた。前記所望の時間の後、前記「
スペファデル」を取り除き、そして前記容器の表面は、血清を含まない培地（例
えばＤＭＥＭ／Ｆ１２）の５mlアリコートにより１０分間３回洗浄され、この洗
浄は、１mg／mlウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ペニシリン（１００ユニット／
ml）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ml）、及びファンギゾン（２μｇ／ml
）（この濃度におけるこれら３つの抗生物質は、ＰＳＦとして知られる）を含む
約４mlの前記と同じ培地の添加より前になされた。
【００３７】 乳房腫瘍細胞株、例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、及びＢＴ４７４、乳房及び
皮膚からのヒト線維芽細胞、並びに膀胱癌細胞株、例えばＥＣＡＣＣ又はＡＴＣ
Ｃから入手できる全てのＥＣＶを、コートしたプラスチック容器におけるスフェ
ロイド調製に全て使用した。基本的に細胞を、２５cm2 ヌンク組織培養フラスコ
内で、１０％ＦＣＳ及びＰＳＦを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２により、５％ＣＯ2 をも
つ３７℃インキュベーター中で、ほぼコンフルエントになるまで、標準的方法に
おいて単層として培養し、それからそれらをトリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％
ブタ・トリプシン及び０．０５％ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝食塩水）により細胞懸
濁液とした。細胞を、完全１０％ＦＣＳ培地中で懸濁させ、そして４００Ｇにて
遠心分離機にかけ、そしてＰＳＦ及びＢＳＡを含むＳＦＭ中に１００万細胞／ml
にて再懸濁する前に、カウントした。ホモスフェロイドに関して、約１mlの前記
細胞懸濁液を、それぞれ２５cm2 フラスコに加え、そしてＣＯ2 インキュベータ
ー中に２４時間放置し、その後スフェロイドが、２０〜数百又は数千までの細胞
の集団として形成された。初めは、細胞同士の接着により小さなスフェロイドを
形成し、そしてその後小さなスフェロイドの融合により大きなスフェロイドを形
成した。一般的にスフェロイドのサイズは、用いた細胞数とそれらを一緒に放置
しておく時間の長さにより調節しうる。インキュベート時間又は細胞数のいずれ
かを増やすことで、通常スフェロイドのサイズが大きくなる。
【００３８】 異なる細胞数比をもつヘテロスフェロイドは、容易に調製されうる。例えば２
５０，０００個の線維芽細胞の１００万個のＭＣＦ７細胞への添加は、線維芽細
胞の４倍の数のＭＣＦ７細胞を含むスフェロイドを生じさせる。前記線維芽細胞
は、細胞数の割合に関係なく又はたとえ前記線維芽細胞をすでにスフェロイド形
成したＭＣＦ７細胞に加えたとしても、常に最後にはＭＣＦ７細胞によって囲ま
れたヘテロスフェロイドの中心となる。
【００３９】 コートしなかったプラスチック容器におけるスフェロイド調製 コートしなかったプラスチック製品におけるスフェロイド調製に使用される前
記培養容器及び基本培地は、前記コートした方法に使用されるものと全く同じで
ある。前記方法の主な違いは、１mg／mlＢＳＡの代わりの前記基本培養培地への
５〜１０％「スペファデル」の添加である。コートしたプラスチック製品におけ
るスフェロイドの調製に使用した全ての他の条件を、コートしなかったプラスチ
ック製品におけるスフェロイドの調製に適用する。
【００４０】 実施例３−ひも状スフェロイドの調製 ひも状スフェロイドは、コートしなかったプラスチック製品におけるスフェロ
イドのための細胞と同様に、１０％「スペファデル」中に懸濁状態で準備された
細胞から作られる。細胞を完全なひも状に形成するために、完全なひも状を形成
するために十分な細胞が存在し、しかし全ての栄養分を使い果たし、そして温度
の細胞死を生じる過剰な細胞が存在しないように、それらは、一定濃度において
播種されるべきである。実際にひも状スフェロイドに使用される細胞数は、使用
する細胞種にも依存する。そしてある細胞、例えば線維芽細胞は、短かいひも状
スフェロイドしか形成できないが、これはおそらく、上皮系の細胞、例えばＭＣ
Ｆ７又はＢＴ４７４腫瘍細胞株と比較したとき、その細胞間の接着が、より弱い
ためであろう。
【００４１】 細胞は、先に記載した１０％「スペファデル」培地中に懸濁液の状態で準備さ
れる。大部分の細胞種にとって、ひも状スフェロイドの調製に最適な細胞数は、
６００〜１０００万個の細胞／mlである。ＭＣＦ７及びＢＴ４７４細胞にとって
最適条件は、約８００万個の細胞／mlである。一旦前記細胞を、前記所望の濃度
における懸濁状態として準備すれば、それらを、直ちに、使い捨ての無菌ひも状
スフェロイド器具内に置くことができる。広く使用されている前記器具は、ひじ
ょうに簡単であり、そして内径／外径がそれぞれ約１mmと２mmの、約２５cmのチ
ューブの長さをもつ無菌２１ゲージ「バタフライ（ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ）」（登
録商標）から成る。前記「バタフライ」は、中空のプラスチック管によりルアー
・シリンジ・コネクターに連結される中空の針である。他のサイズを、使用する
ことができる。
【００４２】 ＭＣＦ７細胞のひも状スフェロイド調製の方法を、ここで記載する。
【００４３】 先に記載のとおり、１０％「スペファデル」中に８００万個のＭＣＦ７細胞／
mlの懸濁液を準備する。使い捨ての１mlシリンジを手に取り、そして１０％「ス
ペファデル」０．６５mlを吸い上げる、そして次に気泡が入らないように注意し
てＭＣＦ７細胞懸濁液０．３５mlをゆっくりと吸い上げる。この間上記シリンジ
内に上記懸濁液が分離した層を形成するようにシリンジを垂直に保持しながら吸
い上げる。前記シリンジを前記バタフライに連結し、そしてゆっくりと上記シリ
ンジを押す。前記懸濁液が、容量が約０．３５mlのプラスチック製のバタフライ
・チューブの末端にとどくまでの間、シリンジを垂直に保持したままにする（気
泡は前記ひも状スフェロイドを切る原因となるため、その導入を避けるように注
意しなくてはならない）。そのすぐ後に、前記のチューブを水平位置に、一直線
に保持するために、水平保持フレーム越しにわずかに張る。それぞれのひも状ス
フェロイドは、通常いつでも作られ、そしてこの保持フレームはチューブを６本
まで収容できる。前記の全工程は、微生物による汚染を最小限に抑えるため層流
フード内で無菌的に行われる。前記フレーム及びチューブを、直ちに５％ＣＯ2
インキュベーターに置いて、そして一晩中（１８時間）放置する。この後、前記
チューブを、１つずつ取り外し、そして前記バタフライの針の末端に近いところ
で無菌的に前記プラスチック製のチューブを切断する前に滅菌布（ｓｔｅｒｉｓ
ｗａｂ）により除菌した。前記チューブの内容物を、次に９０mm無菌プラスチッ
ク・プレートの中の１０mlの１％「スペファデル」培地中にゆっくりと押し出す
（前記シリンジを徐々に加圧することによりとどまっている０．７mlの培地を前
記チューブを通して押し出す）。前記の結果として得られたものは、１cmの長さ
当たり約１５０，０００個の細胞を含む、約２０cmの長さのＭＣＦ７細胞の「ひ
も状スフェロイド」である。
【００４４】 ２つ及び３つの細胞タイプを含むヘテロ−ひも状スフェロイドは、同様の方法
を用いて調製されもする。ＭＣＦ７及び乳房線維芽細胞株を含むヘテロスフェロ
イドを、培地１ml当たり６００万個のＭＣＦ７及び３００万個の線維芽細胞を含
む細胞懸濁液を用いて調製する。このヘテロ−ひも状スフェロイドにおいて、前
記線維芽細胞は、ＭＣＦ７細胞により囲まれて常に中心に存在する。前記三重ひ
も状スフェロイドにおいてＥＣＶ細胞が、前記細胞懸濁液中に同様に存在し、そ
してそれらは、前記ＭＣＦ７細胞の周りに細胞層を形成し、図１に示すとおり３
つの細胞層をもたらした。
【００４５】 図２及び３を参照して、ひも状スフェロイド調製の他の製法を、ここで記載す
る。
【００４６】 実施例４ この方法において、ひも状スフェロイドを、１０％スペファデルを含むＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２に懸濁された細胞を用いて調製する。その方法は、ポリスチレン、ポ
リカーボネート又は細胞培養に適合したあらゆる材料で作られた、そして図２及
び３に見られるようなＶ字形をした波形の輪郭をもつ、特別な形をした培養容器
２０の使用を必要とする。使用される「Ｖ字」輪郭の寸法は、５mm〜１５mmの幅
（ｗ）及び５mm〜１５mmの高さ（ｈ）の間から逸脱しうる。使用される「Ｖ字」
溝（‘Ｖ’ｃｈａｎｎｅｌ）の長さは、典型的には１５cmまでであることができ
るが、しかしさらに長くても使用されうる。Ｖ字輪郭は、１つだけで使用されう
るが、しかし通常いくつかの「Ｖ字」輪郭を互いにくっつけて、数本の平行な「
Ｖ字」溝を含む容器を生み出す。前記「Ｖ字」溝の末端は、壁２２によりふさが
れる。
【００４７】 この方法において、１０％スペファデルＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の細胞懸濁液
は、その後でインキュベーター内の平らな面の上に置かれる。「Ｖ字」溝の中に
置かれる。前記細胞は、重力のせいで液体の中で沈み、そして前記溝の面が傾斜
しているために、ほとんど全ての前記細胞が、前記溝の底の溝筋に落ち、図３に
見られるような沈殿細胞から成る切れ目のない長さのものを生じる。
【００４８】 ２４〜３６時間後、前記細胞は互いに接着し、ひも状スフェロイドを生じる。
前記ひも状スフェロイドは、「Ｖ字」溝から丁寧に取り出されるか、又は必要と
される場合、前記培地を慎重に変えることができるところのその場所に残されう
る。ホモ及びヘテロ−ひも状スフェロイドは、１つの細胞タイプ又は混成細胞タ
イプの細胞懸濁液を用いてこの方法により調製されうる。この方法に用いられる
細胞濃度は、前記細胞種及び前記「Ｖ字」溝中に置く液体の容量に依存して変わ
る。一般的に細胞濃度は、上記細胞が沈殿した場合、前記溝の長さとして１cmの
長さごとに約１０００００〜２０００００個の細胞が存在するように調節される
。したがって、５mlの培地を含む１５cmの長さの「Ｖ字」溝は、典型的には３０
〜６０万個の細胞／mlの細胞濃度を必要とするであろう。
【００４９】 実施例５ これは、前記「Ｖ字」溝法の変法である。図４及び５を参照する時、主な違い
は、前記細胞を沈殿させる「Ｖ字」溝容器３０である。それは、相互に連結され
た「Ｖ字」溝の格子を形成するために、互いに直角の２組の「Ｖ字」溝（３２，
３４）から成る。使用される前記「Ｖ字」溝の横断面の寸法、細胞懸濁液、及び
インキュベート条件は、実施例４の線状「Ｖ字」溝法のそれと同様でありうる。
細胞を前記「Ｖ字」溝格子内に置くとき、それらは、沈殿し、そしてそれらの道
筋が交わるところでつながった、互いに直角のひも状スフェロイドを形成する。
これは「格子型ひも状スフェロイド（Ｇｒｉｄ ｓｔｒｉｎｇ ｓｐｈｅｒｏｉ
ｄ）」（図５）の形成となり、その寸法は、前記容器における「Ｖ字」溝の間の
間隔に依存する。
【００５０】 ひも状スフェロイドの調製について、前記チューブ法より実施例４及び５の「
Ｖ字」溝法の有利であり得る点は、最初の細胞タイプによるひも状スフェロイド
の形成の後に、培地を取り除き、そして第２の細胞タイプの細胞懸濁液を加える
ことができる点である。これは、ヘテロ−ひも状スフェロイド調製の他の方法を
生み出す、異なる細胞タイプの逐次的な添加を可能にするであろう。
【００５１】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従って形成された三重のひも状スフェロイドの、部分断面の
概略図である。
【図２】 図２は、ひも状スフェロイド製造のための複数のＶ字溝を含む培養容器の略透
視図である。
【図３】 図３は、沈殿した細胞を示す、１つのＶ字溝の横断図である。
【図４】 図４は、スフェロイド製造のための、格子状Ｖ字溝を含む培養容器の略正面図
である。
【図５】 図５は、図４の容器において製造した格子形ひも状スフェロイドの概要図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｍ 3/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ //(Ｃ１２Ｍ 3/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B029 AA03 BB11 CC08 DF06 4B065 AA93 AC12 BC37 BC41 BD39 BD42 CA44 4C084 AA02 AA07 BA03 BA22 CA20 CA36 NA14 ZB262 4C087 AA01 AA03 BB35 CA34 DA15 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA20 AA30 BA60 CA42 EA34 FA65 HA07

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 スフェロイド形成に用いる物質又は混合物の製造方法であっ
    て、得られる物質又は混合物にスフェロイド形成活性を与えるために十分な時間
    及び温度においてウシ胎児血清の加熱処理することを含む前記方法。
  2. 【請求項２】 前記加熱処理を６０℃〜８０℃の温度で行う、請求項１に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】 前記加熱処理を６５℃〜７５℃の温度で行う、請求項１又は
    ２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記加熱処理を３０分間〜１２時間行う、請求項１〜３のい
    ずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記加熱処理を７０℃の温度で約５時間行う、請求項１〜４
    のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記の得られた物質又は混合物をアリコートとして約−２０
    ℃で保存するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 スフェロイドの製造に使用するための、請求項１〜６のいず
    れか１項に記載の方法により形成された物質又は混合物。
  8. 【請求項８】 容器内で細胞培養物を、請求項１〜６のいずれか１項に記載
    の方法により形成された物質又は混合物と接触させることを含む、スフェロイド
    形成方法。
  9. 【請求項９】 前記スフェロイド形成物質又は混合物を、前記容器上にコー
    トする、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記スフェロイド形成物質又は混合物の５〜１０％溶液を
    、前記細胞培養物の培地に添加する、請求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記細胞培養物が、それによりヘテロ−スフェロイドが形
    成されるところの１以上の細胞タイプを含む、請求項８〜１０のいずれか１項に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 線状に配列した複数の細胞を含む細長いスフェロイド。
  13. 【請求項１３】 少なくとも１cmの長さをもつ、請求項１２に記載の細長い
    スフェロイド。
  14. 【請求項１４】 １cmの長さ当たり１００，０００〜２００，０００個の細
    胞を含む、請求項１２又は１３に記載の細長いスフェロイド。
  15. 【請求項１５】 ２以上の細胞タイプを含む、請求項１２〜１４のいずれか
    に記載の細長いスフェロイド。
  16. 【請求項１６】 そのコアの周囲に配置した異なるタイプの細胞の１以上の
    層をもつ、１のタイプの細胞の細長いコアを含む、請求項１２〜１５のいずれか
    １項に記載の細長いヘテロ−スフェロイド。
  17. 【請求項１７】 ＭＣＦ７及び乳房線維芽細胞を含む、細長いヘテロ−スフ
    ェロイド。
  18. 【請求項１８】 必要とされる濃度において細胞培養物を、スフェロイド形
    成物質又は混合物と接触させることにより懸濁液を形成し、上記懸濁液を管状部
    材内に入れ、上記管状部材の内容物をインキュベートし、そして上記細長いスフ
    ェロイドを取り出すことを含む、細長いスフェロイド形成方法。
  19. 【請求項１９】 前記必要とされる濃度が、細胞６００〜１０００万個／ml
    の範囲内である、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記管状部材が、約１mmの内径をもつ、請求項１８又は１
    ９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記インキュベートの前に前記管状部材をまっすぐにする
    ステップをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 【請求項２２】 スフェロイド形成物質又は混合物と管状部材を含む、細長
    いスフェロイド形成用キット。
  23. 【請求項２３】 抗癌治療における請求項１〜１１のいずれか１項に記載の
    方法により形成されたスフェロイド形成物質又は混合物の使用。
  24. 【請求項２４】 ２MDa 超の分子量をもち、そしてスフェロイド形成活性を
    もつ、ウシ胎児血清中に含まれる１以上のタンパク質の重合体を含む、重合タン
    パク質。
  25. 【請求項２５】 それにより重合タンパク質がスフェロイド形成活性をもち
    うるところのウシ胎児血清の加熱処理により得ることができる重合タンパク質。
  26. 【請求項２６】 組織培養用のスフェロイド製造のための、請求項２４又は
    ２５に記載の重合タンパク質の使用。
  27. 【請求項２７】 １以上の線維芽細胞、平滑筋細胞、及び膀胱癌細胞で作ら
    れたスフェロイドの製造のための、請求項２４又は２５に記載の重合タンパク質
    の使用。
  28. 【請求項２８】 創傷治癒及び／又は皮膚移植に使用するための、ケラチノ
    サイト及び線維芽細胞を含む群から選ばれる皮膚細胞の調製のための請求項２４
    又は２５に記載の重合タンパク質の使用。
  29. 【請求項２９】 一般的なＶ字形の下部横断面をもつ細長い培養容器を提供
    し、上記培養容器内に細胞培養物とスフェロイド形成物質又は混合物を取り込み
    、上記容器の内容物をインキュベートし、そして前記細長いスフェロイドを取り
    出すことを含む、細長いスフェロイド形成方法。
  30. 【請求項３０】 格子の要素がＶ字形の断面であるところの格子形の対応す
    る培養容器を提供し、そして上記培養容器中に細胞培養物とスフェロイド形成物
    質又は混合物を取り込み、上記容器の内容物をインキュベートし、そして上記格
    子状のスフェロイドを取り出すことを含む、格子構造を形成するスフェロイド製
    造方法。
  31. 【請求項３１】 前記インキュベーションが、２４〜３６時間の期間である
    、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記Ｖ字形の断面を、２０°〜１２０°の範囲の傾斜角度
    で定める、請求項２９又は３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 一般的なＶ字形の下部横断面をもつ細長い部分をもつ培養
    容器とスフェロイド形成物質又は混合物を含む、細長いスフェロイド又はそれら
    の格子状の構造を形成するためのキット。
  34. 【請求項３４】 容器内において１以上の細胞培養物を、請求項２４又は２
    ５に記載の重合タンパク質と接触させることを含む、スフェロイド形成方法。
JP2001505671A 1999-06-17 2000-06-19 スフェロイドの調製 Pending JP2003503021A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9913979.2A GB9913979D0 (en) 1999-06-17 1999-06-17 Spheroid preparation
GB9913979.2 1999-06-17
PCT/GB2000/002215 WO2000078927A2 (en) 1999-06-17 2000-06-19 Spheroid preparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003503021A true JP2003503021A (ja) 2003-01-28

Family

ID=10855436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001505671A Pending JP2003503021A (ja) 1999-06-17 2000-06-19 スフェロイドの調製

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7052720B1 (ja)
EP (2) EP1624055A1 (ja)
JP (1) JP2003503021A (ja)
AT (1) ATE478940T1 (ja)
AU (1) AU772667B2 (ja)
CA (1) CA2373391A1 (ja)
DE (1) DE60044871D1 (ja)
GB (1) GB9913979D0 (ja)
WO (1) WO2000078927A2 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010233563A (ja) * 2009-03-09 2010-10-21 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養装置
WO2012036011A1 (ja) * 2010-09-14 2012-03-22 旭硝子株式会社 培養基材
WO2014141528A1 (ja) * 2013-03-15 2014-09-18 国立大学法人佐賀大学 心臓又は血管組織型スフェロイド
WO2019087988A1 (ja) * 2017-10-30 2019-05-09 公立大学法人横浜市立大学 構造体と細胞塊を連結した構築物
WO2022230977A1 (ja) * 2021-04-30 2022-11-03 国立研究開発法人理化学研究所 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5162784B2 (ja) * 2007-07-11 2013-03-13 日東電工株式会社 細胞培養基材及びその製造方法並びに細胞培養方法
EP2529238A4 (en) 2010-01-28 2014-10-08 The Regents Of The University Of Michigan HANGING DRIPPING DEVICES, SYSTEMS AND / OR METHODS
JP6472601B2 (ja) * 2014-03-19 2019-02-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞排除性を発現する溝構造
KR101798726B1 (ko) 2014-12-04 2017-11-16 가톨릭관동대학교기술지주 주식회사 에너지를 이용한 다능성 세포 유도 장치 및 방법
WO2016089178A1 (ko) * 2014-12-04 2016-06-09 가톨릭관동대학교산학협력단 에너지를 이용한 다능성 세포 유도 장치 및 방법
KR102050852B1 (ko) * 2016-03-11 2019-12-03 주식회사 스템온 세포 리프로그래밍 장치
WO2017155166A1 (ko) * 2016-03-11 2017-09-14 가톨릭관동대학교기술지주 주식회사 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법
WO2017155167A1 (ko) * 2016-03-11 2017-09-14 가톨릭관동대학교산학협력단 세포 리프로그래밍 장치
KR101855967B1 (ko) 2016-03-11 2018-05-10 가톨릭관동대학교산학협력단 물리적 자극에 의한 환경유입을 이용한 세포 리프로그래밍 방법
EP3287521B1 (en) 2016-08-25 2021-06-23 Philip Morris Products S.A. Cell culture

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237033A (en) 1979-04-23 1980-12-02 Merck & Co., Inc. Pretreatment of microcarriers for cell culture
KR100221695B1 (ko) 1991-08-12 1999-09-15 그린 마틴, 브라이언 쥐 테슬리 약학적 구상 제형
JP3199405B2 (ja) 1991-08-30 2001-08-20 生化学工業株式会社 肝細胞球状集塊化剤及び球状集塊化肝細胞の製造方法
JPH05260957A (ja) 1992-01-22 1993-10-12 Kao Corp 肝細胞スフェロイド及びその調製法
JP3428133B2 (ja) 1993-04-09 2003-07-22 日本油脂株式会社 細胞培養材料、製造および培養方法
JPH0779772A (ja) 1993-09-13 1995-03-28 W R Grace & Co 細胞培養液及びその培養液を用いたスフェロイドの製造方法
US5508188A (en) 1994-01-21 1996-04-16 The Regents Of The University Of California Method of growing cells in a mammal
JPH0870847A (ja) 1994-09-02 1996-03-19 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞浮遊培養用容器
JPH09140377A (ja) 1995-11-17 1997-06-03 Shiseido Co Ltd ヒト毛乳頭細胞由来の毛包誘導
JP3887435B2 (ja) 1996-07-12 2007-02-28 第一製薬株式会社 スフェロイド形成促進剤
JP4324988B2 (ja) 1997-12-17 2009-09-02 東洋紡績株式会社 発毛誘導剤および発毛方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN7010000001, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, 1993, Ｖｏｌ．３９， Ｎｏ．４, ｐ．２９３−２９９ *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010233563A (ja) * 2009-03-09 2010-10-21 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養装置
WO2012036011A1 (ja) * 2010-09-14 2012-03-22 旭硝子株式会社 培養基材
WO2014141528A1 (ja) * 2013-03-15 2014-09-18 国立大学法人佐賀大学 心臓又は血管組織型スフェロイド
WO2019087988A1 (ja) * 2017-10-30 2019-05-09 公立大学法人横浜市立大学 構造体と細胞塊を連結した構築物
JPWO2019087988A1 (ja) * 2017-10-30 2020-11-12 公立大学法人横浜市立大学 構造体と細胞塊を連結した構築物
JP7158040B2 (ja) 2017-10-30 2022-10-21 公立大学法人横浜市立大学 構造体と細胞塊を連結した構築物
WO2022230977A1 (ja) * 2021-04-30 2022-11-03 国立研究開発法人理化学研究所 網膜色素上皮細胞のひも状凝集体、それを製造するためのデバイスおよび製造方法、ならびに該ひも状凝集体を含有する治療薬

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000078927A3 (en) 2001-06-28
AU5542800A (en) 2001-01-09
WO2000078927A2 (en) 2000-12-28
EP1624055A1 (en) 2006-02-08
ATE478940T1 (de) 2010-09-15
US7052720B1 (en) 2006-05-30
GB9913979D0 (en) 1999-08-18
DE60044871D1 (de) 2010-10-07
CA2373391A1 (en) 2000-12-28
EP1185620B1 (en) 2010-08-25
EP1185620A2 (en) 2002-03-13
AU772667B2 (en) 2004-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2003503021A (ja) スフェロイドの調製
US5202120A (en) Methods of reducing glial scar formation and promoting axon and blood vessel growth and/or regeneration through the use of activated immature astrocytes
ES2524443T3 (es) Expansión in vitro de células postparto usando microportadores
US6043089A (en) Skin culture and process for preparing the same
CN101568637B (zh) 心血管组织培养用基材
EP2154241A2 (en) Cell culture well-plates having inverted colloidal crystal scaffolds
US7541187B2 (en) Method of providing a substrate with a ready-to-use, uniformly distributed extracellular matrix
Gospodarowicz et al. The coating of bovine and rabbit corneas denuded of their endothelium with bovine corneal endothelial cells
US20160206780A1 (en) Matrix Scaffold for Three-Dimensional Cell Cultivation, Methods of Construction Thereof and Uses Thereof
JP2005224614A (ja) 生体人工臓器内にカプセル化された細胞の増殖制御
JP2002511284A (ja) 三次元組織の創造
JPH11502712A (ja) フィルターデバイス
JPH11503946A (ja) ヒアルロン酸誘導体を基本とするバイオ適合性物質を支持体として含む人工皮膚
JPH06327462A (ja) 細胞凝集体の形成方法
EP0727481B1 (de) Verfahren zur Kultivierung von Organfunktionszellen
WO2005014774A1 (ja) 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法
EP0905231B1 (en) Method for increasing the stability and/or shelf-life of various substrates
JP3738273B2 (ja) 改良ケラチノサイト培養物およびその使用
JP6422221B2 (ja) 多能性幹細胞からなる細胞塊製造方法
CN115322947B (zh) 一种采用成体肾前体细胞经悬浮分化培养构建肾微器官的方法和应用
CN113278579B (zh) 细胞三维培养体系、其制备方法及其应用
CN114672457A (zh) 来源于肿瘤组织的具有肿瘤特异性杀伤效果的t淋巴细胞及其制备方法和细胞制剂
TW419367B (en) A biomedical material for improving the adhesive and proliferating ability of tissue cell and a artificial vessel
Skarlatos et al. Accelerated development of human monocyte-macrophages cultured on Plastek-C tissue culture dishes
Kuriyama et al. Mass cultivation of human retinal pigment epithelial cells with microcarrier

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20051121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20051121

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070604

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100112

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100706