JP2002511284A

JP2002511284A - 三次元組織の創造

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Publication number: JP2002511284A
Application number: JP2000542979A
Authority: JP
Inventors: ハルバーシュタット，クレイグ・アール; ホルダー，ウォルター・ディー，ジュニアー
Original assignee: シャーロット−メクレンバーグ・ホスピタル・オーソリティ
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2002-04-16
Also published as: WO1999052356A1; CA2330104A1; AU3552099A; EP1069822A1

Abstract

(57)【要約】生きている被験者において血管化三次元組織を提供する方法が提供されている。本方法は（ａ）細胞接着、増殖および移動を支えることができる生物適合性材料から、移植されるべき細胞を含んでいる多孔性構築物を作り出し、および（ｂ）該構築物を生きている被験者の問題とする領域内へ送達して血管化三次元組織を形成させることからなる工程を含んでいる。好適な構築物は、最も外側の表面から構築物の中心が約５０μｍから約５００μｍの寸法を持っている。好適な構築物はまた、約１０μｍから３００μｍを超えない孔径を持っている相互連絡された多孔性構造も持っている。好適な構築物内の細胞は構築物の外側表面から２５０μｍ以上は離れないように存在する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明は組織工学の方法、特に哺乳動物における血管化三次元組織を作成する
方法に関している。背景技術医薬技術の進歩にも関わらず、組織損失は重大な問題として残っている。組織
損傷は、癌性組織の外科的除去および外傷のような種々の理由により起こされる
であろう。別の理由は臓器移植に関しており、臓器移植では損傷を受けた臓器を
健康なドナー臓器で置き換えることが可能である。しかしながら、臓器移植は欠
点を持っている。第一に、移植のための臓器は不足しており、適した臓器が利用
可能になるまで長時間待たなければならない。第二に、ドナーおよび供与体組織
間の免疫不適合性が移植された臓器が生き残れるかおよび機能するかの能力を制
限しており、利用可能性の問題をさらに困難にしている。さらに、移植過程その
ものが複雑で、侵襲的であり費用もかかる。

【０００２】対照的に、非常に多数の細胞を被験者から直接得ることができる。これらの自
己由来細胞は細胞培養培地中でさらに繁殖できる。さらに、自己由来細胞の使用
は組織不適合性問題を取り除く。従って、単離された細胞から発生された生存可
能な三次元組織は組織損傷の修復での使用に有用である。

【０００３】単離された細胞からインビトロで三次元組織を発生させるための現在の方法は
非常に成功しているわけではない。体組織内へ直接細胞を移植する、およびイン
ビボでこれらの細胞から三次元組織を発育させるための技術を開発するために多
くの研究が実施されてきた。閉じられたカプセル化膜または多孔性マトリックス
のような三次元支持構築物内に播種された細胞が構築物とともに移植され、イン
ビボでの生存、発育および機能発現が試みられた（例えば、米国特許第４，３５
３，８８８、４，４８７，７５８および４，９０２，２９５号を参照されたい）
。しかしながら、移植された細胞からの三次元組織の形成、特に血管化三次元組
織に関してはほとんど成功していない。

【０００４】移植された細胞は栄養、増殖因子、ホルモンならびに酸素を生存のために必要
とする。これまで使用された移植技術は一般的に移植された細胞を維持する有効
な機構を提供していない。このことは血管化組織の形成で特に問題となるところ
である。これらの技術は血管化組織の形成のための必要とされる栄養を移植細胞
に提供する適した血管化床を確立することができていない。

【０００５】さらに、これまで知られている方法は一般に体組織内への細胞の送達に侵襲的
外科的手法を必要としている。例えば、米国特許第５，７１６，４０４号は多量
体マトリックスとともに単離された細胞を移植することによる乳房組織の再構築
または増大法を開示している。そこで使用された多量体線維性マトリックスは現
在使用されているシリコン移植片と同様の構造を持っている。乳房組織内へマト
リックスを挿入するためには複雑で侵襲的な手術が実施されなければならない。

【０００６】哺乳類細胞移植および血管化三次元組織の発育における主たる課題は移植され
た細胞の長期細胞生存を促進することである。現在の方法は表面上にある移植細
胞に頼っており、それは取り囲んでいる宿主血管により提供される栄養からは２
５０μｍより離れた拡散距離にある。まずいことに、栄養および気体の不適切な
供給のため構築物内で組織の壊死コアが発生する。従って、インビボで血管化三
次元組織を作り出す有効で実質上非侵襲的な方法が必要とされている。発明の要約本発明の別の目的はヒトにおいて成長する血管化組織のための方法を提供する
ことである。

【０００７】本発明の別の目的はインビボで細胞含有離散性組織構築物を一つの領域内へ送
達する方法を提供することである。離散性組織構築物は機能性ユニットとして働く、例えば、移植された細胞の増
殖および周りの組織からの細胞血管内殖は、周りの血管系と相互連結された小さ
な細胞の”島”を形成する。

【０００８】従って、本発明は、移植された細胞が栄養源（即ち、発育している血管床）か
ら２５０μｍ以上は離れていない血管化三次元組織を提供する方法に関している
。移植のための細胞を含んでいる多孔性構築物が、血管化三次元組織の構築が望
まれている、生きている被験者内の問題とする領域内へ送達される。移植された
多孔性構築物は移植された細胞の接着、成長および移動ならびに構築物を囲って
いる組織細胞の内殖を助け、三次元離散性組織を形成する。好適には、多孔性構
築物の送達は非侵襲的様式で実施される（例えば、注射により、または外部嚢か
ら内部嚢への細動脈および細静脈連結を持っている生物適合性嚢で送達すること
により）。多数の多孔性構築物が送達されるのも好適である。

【０００９】多孔性構築物は細胞の接着、成長および移動を助ける少なくとも一つの生物適
合性材料で作製されている。そのような生物適合性材料は生物吸収性でも生物非
吸収性でもよい。移植されるべき細胞は多孔性構築物に播種できる。細胞が構築
物内へ播種された場合、構築物中の最も内部の細胞が構築物の外側表面から２５
０μｍ以上離れないように、多孔性構築物は外側表面上の少なくとも一つの点と
構築物の中心が約５０μｍから５００μｍの距離であるような寸法を持っている
。平均的な組織において、代謝的に活性な細胞および毛細血管間の最大距離は約
２５０μｍであることが観察されている。この距離は毛細血管から細胞表面への
酸素および栄養の拡散制限によりインビボで確立されている。構築物はまた、約
１０μｍから約３００μｍの孔径を持っている相互連絡された孔を持っている。
多孔性構築物はまた細胞の接着、成長および移動を変異させる（好適には促進す
る）ためのシグナル（例えば、増殖因子または細胞外マトリックスタンパク質）
を持っているであろう。

【００１０】本発明の一つの態様において、移植されるべき細胞を含んでいる多孔性構築物
は問題とする領域に直接送達される。本発明の別の態様において、多孔性構築物
の送達の前に、インビボで血管化床の形成を促進する第二の構築物を移植するこ
とにより問題とする領域に血管化床が形成される。次に移植されるべき細胞を含
んでいる多孔性構築物が三次元組織のために血管化床上に送達される。

【００１１】本発明の方法は乳房組織、膵臓組織、肝臓組織、神経組織、腎臓組織、筋肉組
織および皮膚組織のような多くの異なった組織の再構築に使用できる。本発明は
最小化非侵襲過程および三次元組織開発のために有用な方法を提供する。

【００１２】前述のおよびその他の本発明の利点および特色、および同じことが達成される
様式は、好適で模範となる態様を例示している付随する実施例とともに以下の発
明の詳細な説明を考慮するとより容易に明らかになるであろう。発明の詳細な説明本発明はヒトのような生きている被験者における血管化三次元組織を発育させ
るための方法を提供する。この方法の一つの態様において、移植のための細胞が
播種されている多孔性構築物が作製され、血管化三次元組織を構築することが望
まれる、生きている被験者の問題とする領域内へ送達される。移植された多孔性
構築物は移植された細胞の接着、成長および移動ならびに構築物を囲んでいる組
織細胞の内殖を助け、三次元離散性組織を形成させる。

【００１３】本発明の多孔性構築物は、構築物の外側表面と構築物の中心の距離が約１０μ
ｍから約５００μｍ、好適には約２５μｍから約４００μｍ、より好適には約５
０μｍから約２５０μｍである寸法を持っている限りは任意の三次元の形を持つ
ことができる。例えば、多孔性構築物は球形、粒子ビーズ、円柱体、三角形、糸
状および立方体の形であり得る。その最も好適な形において、構築物は各々のお
よびすべての表面から構築物の中心の距離が約２５０μｍの長さを持っている大
きさである。構築物は構築物の中心に位置している最も内側の細胞が、構築物の
少なくとも一つの表面から２５０μｍ以上離れないように形作られている。この
様式では、中に細胞を持っている構築物が生きている被験者の問題とする領域に
送達された後に構築物内のすべての細胞が栄養源（例えば、血管化床）から２５
０μｍ以上離れていないことがより確かになる。

【００１４】細胞が観察される構築物内の距離は主として細胞を養うために多孔性構築物へ
拡散する栄養および酸素の存在により決定される。最大拡散距離は一部細胞型お
よび代謝状態ならびに構築物の多孔性に依存するであろうが、約４００μｍまで
、またはより典型的には２５０−３００μｍである。代謝がより高い細胞におい
ては、最大拡散距離はは約１５０μｍである。最大拡散距離より大きな直線寸法
の粒子では、酸素および栄養の拡散が到達するであろう粒子部分にのみ細胞が分
布しているであろう。表面から最大拡散距離以上離れた粒子領域では、実質的に
は細胞が存在しないであろう。不規則な形を持っている粒子では、細胞が分布し
ている領域は、少なくとも一つの粒子表面から最大拡散距離内にある粒子領域で
あろう。これにはマクロ細孔性粒子中のマクロ細孔表面からの拡散が含まれる。

【００１５】多孔性構築物は構造の骨格を形成している一つまたはそれ以上の生物適合性材
料により形成されている相互に連絡されたマクロ細孔性構造を持っている。構築
物の内部および周囲の環境間で分子の交換および細胞移動が起こせるように構築
物内のマクロ細孔を連絡している多数のマクロ細孔を構築物表面に持たなければ
ならない。細孔の直径は約１０μｍから約３００μｍ、好適には約２５μｍから
約２００μｍ、より好適には約５０μｍから約１００μｍの範囲である。

【００１６】特に、マクロ細孔性構築物は、細孔を通した移動による細胞の通過を可能にす
る十分な大きさの細孔を持っている。マクロ細孔性構築物に対し、血管内殖は大
きな直径の細孔ならびに離散した構築物間の空間内へ進行する。従って、内殖に
より形成された血管床は、マクロ細孔性球形粒子での拡散により示唆された２５
０μｍよりも大きな全体の直径を持っている粒子内の細胞に栄養および酸素を供
給できる。本発明の好適な構築物はマクロ細孔構造を持つ顕微鏡的粒子である。
複数のこれらの粒子は、粒子内および粒子間の両方で多量のチャンネルを持つ塊
を形成し、それを通って栄養含有培地（血漿、リンパ球細胞培養培地など）が粒
子内の細胞に到達し、それにより血管内殖が起こる。これらの好適な粒子の全体
での寸法は典型的には１ミリメーター程度であろうが、これより大きなまたは小
さな粒子径もまた本発明の離散性、マクロ細孔性構築物で企図される。

【００１７】 ”生物適合性”とは多孔性構築物の作製に使用された材料が構築物内へ播種さ
れるべき細胞および構築物が送達されるべき、生きている被験者の領域中の細胞
および組織の望まれる特性に実質的に不利に影響しないことを意味している。ま
た、使用される材料は生きている被験者の他の領域に望まれない医学的影響を実
質的に起こさないことも意味している。材料は多孔性構築物が細胞の接着、成長
および移動を助けるように選択される。従って、使用される生物適合性材料は細
胞の接着、成長および移動を可能にしなければならない。好適には、生物適合性
材料は細胞を支えるのに、および寸法を維持するのに十分なほど機械的に強くな
ければならない。一般に、材料の生物適合性および機械的強さを試験する方法は
本分野ではよく知られている。生物適合性材料は合成品でも天然のものでもよい
。

【００１８】生物適合性材料は生きている被験者の体内に送達されても残るように非生物吸
収性である材料でもよい。より好適には、生物適合性材料は生物吸収性であり、
生きている被験者の体内の問題とする領域に多孔性構築物が送達された後、徐々
に分解されるであろう。そのような分解は遅くおよび漸進的様式であるべきであ
り、好適には十分な細胞が構築物で増殖して組織化された三次元構造を形成した
後に起こるべきである。この様式では、生物吸収性材料の分解は三次元組織の形
成を妨害しない。好適には、生物吸収性材料は移植後約１から３ヶ月内に分解す
る。

【００１９】適した生物吸収性材料の例にはポリエステル、ポリエチレングリコールおよび
ヒドロゲルが含まれるがこれらに限定されるわけではない。適した生物非吸収性
材料の例にはポリテトラフルオロエチレン（テフロン）、ナイロン、ポリカーボ
ネートおよびポリエチレンが含まれるがこれらに限定されるわけではない。適し
た例にはデキストラン、デンプン、セルロース、アガロース、カラゲナン、アル
ギン酸塩（カルボキル化海藻ポリサッカライド）などのポリサッカライド；ポリ
ビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリ
エステル、ポリメタアクリレート、ポリウレタン、ポリホスファゼン、乳酸およ
びグリコール酸の共重合体、リジンおよび乳酸の共重合体、リジンＲＧＤおよび
乳酸の共重合体などの合成ポリマーが含まれるがこれらに限定されるわけではな
い。コラーゲン、コラーゲンとコンドロイチン硫酸（プロテオグリカンの成分）
の共重合体などのようなタンパク質もまた使用できる。

【００２０】構築物はまた細胞接着、成長および移動を変異させる、好適には所望の細胞の
接着、成長および移動を刺激または促進する、および／または望まれない細胞の
接着、成長および移動を阻害するためのシグナルも含んでいるであろう。シグナ
ルは増殖因子、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質および細胞外マトリッ
クスタンパク質で同定されている他の細胞接着ペプチドから選択されるであろう
。増殖因子には例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、酸性または塩基性線維芽
細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子
（ＨＧＦ）、ヘパリン結合増殖因子（ＨＧＢＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）
、神経成長因子（ＮＧＦ）、筋肉形態発生因子（ＭＭＰ）および血小板由来増殖
因子が含まれる。細胞外マトリックスタンパク質の例にはフィブロネクチン、コ
ラーゲン、ラミニンおよびビトロネクチン；および多くの細胞外マトリックスタ
ンパク質中に観察されるトリペプチドＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラ
ギン酸）が含まれる。シグナルはまた、生きている被験者の体内領域の構築物を
囲んでいる所望の細胞（例えば、平滑筋および上皮細胞）の内殖を誘導するため
にも含ませることができる。シグナルは多孔性構築物中の生物適合性材料に共有
結合で結合できるかまたは親和性により多孔性構築物に会合でき、、または構築
物中の生物適合性材料に共有結合で結合または親和性により会合できる材料へ結
合されている。例えば、米国特許第４，５７１，６８６、４，７９２，５２５お
よび５，３３０，９１１号（本明細書において援用される）を参照されたい。

【００２１】多孔性構築物を提供する方法は哺乳動物においての多くの異なった三次元組織
の発達に成功裡に適用されてきた。生きている被験者の体内の問題とする領域内
に送達するために多孔性構築物中に含まれている細胞の選択は、望まれる三次元
組織の位置および型に依存している。例えば、もし三次元膵臓組織が望まれるな
らば、多孔性構築物は膵臓細胞を含んでいるであろう。別の例において、もし欠
損乳房組織を置き換えるために構築物の開発が望まれるならば、血管内皮細胞お
よび平滑筋細胞のような細胞が使用できる。線維芽細胞、軟骨細胞および脂肪細
胞を含む間葉細胞のような細胞も単独でまたは内皮または平滑筋細胞とともに使
用できる。本発明で使用される他の型の細胞には肝細胞、尿細管細胞、セルトリ
細胞、甲状腺細胞、島細胞、骨格筋細胞、神経細胞、心筋細胞、骨細胞、幹細胞
などが含まれる。

【００２２】適した供給源から細胞を単離するための種々の技術が本分野で一般的に知られ
ている。本発明で使用された細胞は好適には自己由来のものである（即ち、生き
ている被験者自身から得られた）。細胞は同種（即ち、問題とする被験対象と同
一種の被験対象から得られた）でも異種（即ち、異なった種の被験対象から）で
もよい。加えて、細胞はインビボまたはインビトロでも、および多孔性構築物内
へ取り込ませる前または後でも処理できる。例えば、細胞は数を増やすために培
養しても、または一つまたはそれ以上の特性を変化させるために修飾してもよい
。例えば、所望の遺伝子を導入することにより、または望まれない遺伝子を望ま
しい遺伝子に置き換えることにより細胞の特性を改良するインビトロでの細胞遺
伝子修飾は本分野では一般的に知られている。細胞が問題とする領域に送達され
た時、宿主組織により細胞が実質的に拒絶されないように、同種または異種細胞
の免疫学的特性を修飾することも本分野では知られている。幹細胞および胎児細
胞のような免疫学的に不活性な細胞が免疫学的不適合を避けるために好適に使用
される。

【００２３】本発明の多孔性構築物中に取り込まれるべき細胞は一つの供給源からのまたは
異なった供給源からの均質な細胞であろう。従って、異質な細胞が使用されるな
ら、多孔性構築物は二つまたはそれ以上の生物適合性材料および二つまたはそれ
以上の前記のシグナルを持っており、各々は構築物中の異なった型の細胞を支え
ている。多孔性構築物内へ取り込まれるべき細胞の数は１０細胞／ｃｍ²から１
ｘ１０⁸細胞／ｃｍ²の範囲であろう。

【００２４】多孔性構築物は細胞増殖を支える多孔性足場を作製するための本分野で知られ
た多くの方法で作製でき、前に特定したような本発明の多孔性構築物の固有の特
性を得るため、これらの方法をある程度変形させている。そのような変形は本開
示が通告された当業者には明らかであろう。

【００２５】多孔性構築物のマクロ細孔性格子構造は、マクロ細孔性格子構造を作るための
通常の方法を使用して一つまたはそれ以上のポリマーの重合過程の間に形成され
る。もしくは、構築物中のマクロ細孔は重合後のポリマーの溶解または材料の除
去により形成される。別の方法においては、ポリマーの溶解により細孔が形成さ
れているポリマーの多孔性マトリックスから構築物が形成される。その方法にお
いては、二つの重合前駆体、マトリックスポリマー前駆体（例えば、コラーゲン
、フィブリンなど）および可逆的ゲルポリマー前駆体（例えば、アルギン酸塩、
ゴム、アガロースなど）が水溶液中で重合され、生細胞、マトリックスポリマー
および可逆的ゲルポリマーから成る形態保持固形マトリックスを形成させる。可
逆的ゲルポリマーを次に溶解しおよび除去して生細胞を含んでいる不溶性多孔性
マトリックスを形成させる。この方法論は本明細書で説明されているように必要
なサイズが強制されおよび適切なマクロ細孔材料を持つ、小さな離散した組織構
築物を構築するために使用される。別の方法が、代理人書類番号第ＵＭＩＣＨ８
ＶＩ号のもと本明細書と同じ日付で出願された”多孔性ヒドロゲル材料の製造法
および該方法の生成物”と題した米国仮出願（本明細書において援用される）に
記載されている。

【００２６】多孔性構築物は小さなビーズまたは他の離散した構造を製造するための既知の
方法により作製される。適した技術には圧力または空気剪断噴霧、押し出し、乳
化、および静電小滴形成、重力による小滴形成、遠心力による小滴形成、ラリー
液体ジェット不安定性技術を用いた小滴形成および慣性力を用いた小滴形成のよ
うな小滴形成技術が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、適
した多孔性構築物は、噴霧乾燥および凍結乾燥（これらに限定されるわけではな
い）を含む既知の乾燥技術を用いたコラーゲン溶液または分散液の乾燥ビーズへ
の固化によりコラーゲン材料から製造される。また、より大きなサイズを持つビ
ーズは、例えば、粉砕により小さなサイズへ縮小される。

【００２７】例えば、自己由来乳房組織の開発では、平滑筋細胞が多孔性ポリグリコライド
ビーズまたは他の多孔性の生分解性または天然に存在する材料（多孔性タイプＩ
コラーゲンビーズ）上で播種および増殖できる。平滑筋細胞が特定した密度に達
したら、ヒドロゲルのコーティング、例えば、血管内皮細胞を含んでいるアルギ
ン酸塩ＲＧＤがビーズ上で重合される。内皮細胞を含むアルギン酸塩はビーズを
取り囲み、ビーズ内でインターカレートする。このことにより内皮細胞と平滑筋
細胞間の密接な接触が起こり、必要な細胞間コミュニケーションが行われる。平
滑筋ビーズはこの組織を作製するのに必要な物理的構造を提供する。

【００２８】多孔性構築物は使用前に滅菌しなければならない。そのような技術にはＵＶ照
射、ガンマ線照射、電子線滅菌およびエチレンオキシドのような化学薬品を使用
した滅菌が含まれるが、それらに限定されるわけではない。使用される滅菌法は
多孔性構築物の構造および血管化三次元組織の形成を支えるその能力に実質的に
不利な影響を与えてはならない。

【００２９】多孔性構築物の構造への細胞接着および付着を促進する材料で多孔性構築物を
コーティングするのも好適である。そのような材料の例にはフィブロネクチン、
ビトロネクチン、コラーゲン、ポリリジン、ラミニン、これらの細胞外マトリッ
クスに由来するポリペプチドおよびその他の細胞接着分子が含まれるが、それら
に限定されるわけではない。そのようなコーティングは任意の時に実施できる；
例えば、ポリマー前駆体へのコーティング、インビトロでの細胞播種前、または
インビトロでの播種後、しかし問題とする生きている被験者の体内へ構築物を送
達する前の調製された構築物のコーティング。コーティングの一つの例は、前記
のように調製され、ビーズ上へヒドロゲル（例えば、アルギン酸塩ＲＧＤ）を重
合することによりヒドロゲルで被覆された、多孔性ポリグリコライドビーズおよ
び多孔性コラーゲンビーズのような多孔性ビーズで使用することである。ヒドロ
ゲルはビーズを取り囲むだけでなく、ビーズ内でインターカレートする。

【００３０】多孔性構築物と移植されるべき細胞は、多孔性構築物が形成されている間に、
例えば、重合過程の間に取り込ませることができる。多孔性構築物の形成の間に
細胞を取り込ませる方法は本分野でよく知られている。もしくは、細胞を前もっ
て形成された多孔性構築物内へ播種することもできる。多孔性構築物の細孔は前
記のようにかなり大きいので、例えば、多孔性構築物をある時間、移植されるべ
き細胞が浮遊している細胞培地内へ浸すことにより細胞播種を容易に行うことが
できる。望まれる細胞数が多孔性構築物内へ結合するように培地中の細胞密度お
よび時間を調節することができる。

【００３１】任意に、多孔性構築物中の細胞は多孔性構築物とともに問題とする被験者の体
内へ移植される前に、インビトロである期間増殖させることが可能である。その
ようなことを行う方法は当業者には明らかであろう。例えば、その中に結合され
た細胞を含む多孔性構築物は都合よく適した培養培地に浸すことができる。細胞
の増殖および分化を促進するため、増殖因子および細胞外マトリックスタンパク
質のような細胞接着、増殖および移動を変異させる適したシグナル分子が培養培
地に加えられる。

【００３２】問題とする被験者の体内の領域へ送達されたら、構築物を取り囲んでいる領域
中の細胞が構築物内へ移動し、三次元組織の形成を促進することを多孔性構築物
は可能にする。

【００３３】本発明に従うと、三次元組織が構築されることが望まれる、生きている被験者
の体内領域に、中に細胞を持っている少なくとも一つの多孔性構築物が送達され
る。０．１ｍｌの容量から５００ｍｌの容量の多数の多孔性構築物が体内に置か
れるであろう。各々のそのような離散した構築物が発育し、周囲の血管および他
の発育した構築物と相互連絡するようになり、天然の組織の機能性ユニットを模
倣して、三次元組織の発育を容易にする。

【００３４】多孔性構築物の送達は、複雑な手術過程を避け、実質的に非侵襲的様式で好適
に実施される。例えば、構築物は問題とする組織内へ容易に注射できるように形
作ることができる。１回以上の注射が望ましいであろう。もしくは、外部嚢から
内部嚢への細動脈および細静脈連結を持っている生物適合性嚢でこれらの構築物
が送達される。

【００３５】一つの特別な態様において、第二の構築物も使用され、それは細胞を含んでい
てもいなくても良い。問題とする生きている被験者の体内領域へ送達されたら、
この第二の構築物はそれを取り囲む血管化床の形成を刺激できる。血管化床が形
成されたら、移植されるべき細胞をその中に持っている前記の多孔性構築物が血
管化床の上または近傍に送達される。前もって発育した血管化床は、移植された
細胞に必要とされる栄養をより良く供給することができる。

【００３６】好適には、前記のような多孔性構築物は血管化床の前もっての形成のための第
二の構築物として使用される。しかしながら、血管化床の形成を誘導できる限り
、第二の構築物は任意の生物適合性材料から、および事実上任意の形および寸法
で作製でき、多孔性構築物の特性に制限されない。好適には、約５μｍの小球が
血管化組織の創造を助けるために使用される。加えて、第二の構築物はマクロ細
孔である必要はない。好適には、第二の構築物は血管化床の形成を刺激するシグ
ナルを含んでいる。そのようなシグナルの例はトリペプチドアルギニン−グリシ
ン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）である。このトリペプチドは最適に第二の構築物
に連結できる。

【００３７】そのような第二の構築物の例は約１から２ｍｍの直径を持つ固形アルギン酸ナ
トリウム−ＲＧＤマクロビーズである。これらのビーズは、比較的短い時間で、
生きている被験者の体内で血管化床の発育を誘導できることが示されている。第
二の構築物は、前に説明されたような多孔性構築物の送達に使用された方法と同
じ方法により送達されるであろう。

【００３８】本発明は哺乳動物、特にヒトにおいての多くの異なった適用で使用できる。三
次元乳房組織、膵臓組織、肝臓組織、腎臓組織、筋肉組織、皮膚組織などを含む
（しかし、これらに限定されるわけではない）多くの型の血管化組織が本発明の
方法を用いて発育できる。

【００３９】この方法は、損傷を受けたまたは望まれない組織が取り除かれた体の一部を再
構築する再構築療法で使用できる。特に、本発明の方法は軟組織欠損の再構築ま
たは修復に使用される。典型的には、軟骨細胞、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋
細胞などから選択された細胞が播種された多数の離散したマクロ細孔性構築物が
失われた軟組織に置き換わるために移植され、組織塊を形成して陥没を埋めまた
は隆起を生み出し、または必要とされる所に組織の大きな塊を提供する。例えば
、本発明の方法を用い、癌性乳房組織が除去された領域に軟血管化乳房組織が構
築でき、それにより乳房を再構築する。それを行うには、患者から単離された正
常血管内皮細胞および平滑筋細胞の両方を含んでいる多孔性構築物が構築でき、
本発明に従って拡大した乳房組織のポケットへ送達される。

【００４０】さらに、本発明の方法は哺乳動物におけるある種の疾患を処置するために使用
できる。例えば、インシュリン欠損糖尿病を処置するため、望ましいレベルのインシュ
リンを放出する三次元ランゲルハンス島が皮下間隙のような比較的血管性部位内
へ移すことができ、これらの離散組織構築物を使用する三次元血管床の作製と組
み合わされる。

【００４１】要約すると、ヒトのような哺乳動物の問題とする領域に血管化三次元組織を作
製する有効で非侵襲的方法が提供された。多数のマクロ細孔性構築物が生物適合
性材料から構築され、それは三次元組織の発育のために移植されるべき細胞を含
んでいる。多孔性構築物は所望の領域へ実質的に非侵襲的様式で送達される。多
孔性構築物の寸法およびそのマクロ細孔の大きさは、移植された細胞が体の栄養
源から２５０μｍ以上は離れないように作製される。その結果、移植された細胞
の接着、増殖および移動ならびに構築物を取り囲む組織細胞の内殖のために十分
な援助が提供され、三次元離散組織が形成される。

【００４２】本発明は以下の非制限的実施例でさらに例示される。しかしながら、本発明は
多くの異なった形に具体化されるであろうし、ここに示した実施態様に制限され
ると解釈してはならない；むしろ、本開示が十分でおよび完全であるように、お
よび当業者に本発明の範囲を完全に伝えるようにこの実施態様が提供されている
。実施例１アルギン酸ナトリウムＲＧＤマクロビーズによる血管化床の形成アルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤ）と共有結
合で結合されたアルギン酸ナトリウム（ａｌｇ−ＲＧＤ）を２ｇｍ／１００ｍＬ
（２％）の濃度で、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液（Ｇ
ｉｂｃｏ／ＢＲＬ）と混合した。十分に混合した後、ａｌｇ−ＲＧＤは０．４５
μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅｕｎｉｔ）を用いて濾過滅菌した。約５０ｍ
Ｌ／時間の流量に設定されたシリンジポンプを使用し、ａｌｇ−ＲＧＤ溶液を１
．５％塩化カルシウムの滅菌濾過溶液（１．５μｍの塩化カルシウムを１００μ
ｍのＭｉｌｉｐｏｒｅ逆浸透水と混合）に無菌的に滴加した。直径約１から２ｍ
ｍのビーズがこの過程で生じた。巾着縫合技術（５０ｍＬの円錐チューブカップ
が縫合面の３９ｍｍ周長に印を付けるために使用され、４．０プロレン縫合糸が
円の輪郭をたどるために使用され、および円の中心の皮膚が鉗子を用いて持ち上
げられた）を用いることによりＦｉｓｈｅｒラット（メス）の背中に皮下ポケッ
トが作られ、１ｍＬのビーズスラリー液がこの皮下間隙内へ移植された。

【００４３】図１Ａは移植１週間後のトリクローム染色の組織学的結果を示している。図１
Ｂはビーズおよび形成した組織境界面での血管床の形成を示している。これらの
結果は、血管系が比較的短時間で発育でき、材料の形で誘導されであろうことを
示している。しかしながら、この材料はマクロ細孔であるようには設計されてお
らず、組織構築物内への細胞内殖のための手段を提供していない。より大きな固
形移植物が同様の動物に使用された場合、細胞生存を支えるであろう血管床を形
成せずに移植物の全周辺の周りに嚢が形成された。実施例２アルギン酸ナトリウムＲＧＤマクロビーズによる血管化床の形成アルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸トリペプチド（ＲＧＤ）と共有結
合で結合されたアルギン酸ナトリウム（ａｌｇ−ＲＧＤ）（実施例１より１００
Ｘ以上濃縮されている）を１．２ｇｍ／１００ｍＬ（１．２％）の濃度で、０．
８ｇＮａＣｌ、０．２ｇヘキサメタリン酸ナトリウムの逆浸透水溶液（１００ｍ
Ｌ）と混合した。十分に混合した後、ａｌｇ−ＲＧＤは０．２μｍフィルターを
用いて濾過滅菌した。約５０ｍＬ／時間の流量に設定されたシリンジポンプを使
用し、ａｌｇ−ＲＧＤ溶液を１．５％塩化カルシウムの滅菌濾過溶液（１．５μ
ｍの塩化カルシウムを１００μｍのＭｉｌｉｐｏｒｅ逆浸透水と混合）に無菌的
に滴加した。直径約１から２ｍｍのビーズがこの過程で生じた。巾着縫合技術（
５０ｍＬの円錐チューブカップが縫合面の３９ｍｍ周長に印を付けるために使用
され、４．０プロレン縫合糸が円の輪郭をたどるために使用され、および円の中
心の皮膚が鉗子を用いて持ち上げられた）を用いることによりＦｉｓｈｅｒラッ
ト（メス）の背中に皮下ポケットが作られ、１ｍＬのビーズスラリー液がこの皮
下間隙内へ移植された。

【００４４】図２Ａおよび２Ｂは移植２週間後の組織学的結果を示している。図３は血管内
皮細胞上に位置しているタンパク質である因子ＶＩＩＩで染色した組織学的切片
である。材料は巾着状皮下空隙に移植され、２週間後に採取された。組織中の黒
丸は血管内皮細胞として明確に同定されている。実施例３コラーゲンから作製された多孔性構築物による血管化三次元組織の創造これまでの実施例は適切な材料のビーズ構造は無血管性皮下ポケット内への血
管内殖の起動力を提供するであろうことを示している。しかしながら、これらの
材料は多孔性ではなく、ビーズの大きさは直径約１から２ｍｍであった。マクロ
細孔ビーズがこれらの構造内への血管内殖を促進するかどうかを決定するため、
Ｃｅｌｌｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入されたタイプ
Ｉコラーゲン（ウシコラーゲン）マイクロスフェアが移植された。このビーズは
直径４００から７００μｍの寸法範囲で、５０から１００μｍ寸法の名目孔寸法
を持っており、生物学的生産のためにインビトロで哺乳動物細胞を捕捉および増
殖するように設計されている。巾着縫合技術（５０ｍＬの円錐チューブカップが
縫合面の３９ｍｍ周長に印を付けるために使用され、４．０プロレン縫合糸が円
の輪郭をたどるために使用され、および円の中心の皮膚が鉗子を用いて持ち上げ
られた）を用いることによりＦｉｓｈｅｒラット（メス）の背中に皮下ポケット
が作られ、１ｍＬのビーズスラリー液がこの皮下間隙内へ移植された。図４はラ
ット大動脈平滑筋細胞が播種されているコラーゲンビーズのヘマトキシリンおよ
びエオシン切片である。ビーズの高度な多孔性構造（図中の暗い帯）および６日
後にビーズ内でどのように細胞が増殖しているか（より明るい染色領域）を注目
されたい。図５Ａおよび５Ｂは移植２週間後の組織学的結果を示している。図５
Ａは巾着状皮下間隙にコラーゲンビーズを移植して２週間後のコラーゲン染色の
組織学的切片である。図５Ｂは内皮細胞の表面上に発現される抗原である因子Ｖ
ＩＩＩで染色されたコラーゲンビーズの組織学的切片である。これは血管化のマ
ーカーである。コラーゲンビーズ内が染色されていることに注目されたい。

【００４５】関連する実験において、大動脈平滑筋細胞がコラーゲンビーズに移植された。
移植２週間後の組織学的結果は発現された∝−アクチンの暗い染色により示され
ている。図７においてコラーゲンビーズ上の因子ＶＩＩＩで染色された増殖内皮
細胞が示されている。褐色の染色は細胞がビーズの間隙にあること、即ち、細胞
が宿主から移動してきたことを示している。実施例４２週皮下移植物の組織学的観察多くの組織および器官が離散組織セグメントとして組織化される。これらのセ
グメントは一般に入り組んだ毛細血管床に囲まれている実質細胞または間質細胞
の島として配置される。これらの離散組織構築物の大きさは細胞の代謝要求性お
よび栄養、気体および細胞へのまたは細胞からの廃棄生成物のための拡散距離に
より規定される。

【００４６】三次元血管床の発育は、生体外で作られた大きな組織構造物の移植を成功させ
ることに必須である。腫瘍切除に続いて患者から除去された組織の大きな塊に置
き換わるであろう軟組織を発育させるため、細胞生存を支える血管床を創造する
戦略が開発されてきた。

【００４７】アルギン酸塩は細胞カプセル化および創傷包帯化に以前から使用されている天
然のヒドロゲルである。しかしながら、この材料は組織工学骨格材料に必要とさ
れる細胞接着を行わない。それ故、アルギン酸塩へ細胞接着トリペプチドＲＧＤ
を結合させる過程が開発された。次の仕事はこの材料を変化する形態の、従って
拡散を強いる構築物へ加工することであった。

【００４８】タイプＩウシコラーゲンまたはアルギン酸ナトリウムがＬｅｗｉｓラットの皮
下間隙内へ移植された。タイプＩウシコラーゲンは多孔性球体（直径０．４から
０．７ｍｍ）として得られ、一方、ＲＧＤトリペプチドと結合されたアルギン酸
ナトリウムはロッド、固形ビーズ（直径１．０から３．０ｍｍ）または多孔性ビ
ーズ（直径２．７から３．２ｍｍ）に形づくられた。各々の移植材料の容量は１
ｍＬであった。移植物は移植２週間後に採取され、カプセル形成、血管内殖、組
織内殖および炎症性応答が特徴付けられた。表１は実験を略記している。

【００４９】ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅ（Ｉ
ＡＣＵＣ）はすべての動物実験手順を認可した。皮下ポケットはメスＬｅｗｉｓ
ラットの背中にロッドのための側部切開またはビーズのための巾着縫合技術を使
用して作られた。２週間後に移植物を採取し、組織学的に加工した。簡単には、
組織−医用生体材料境界面を保存するために動物をブアン固定液かまたはＺ固定
ホルマリンで潅流した。ホルマリン固定液中で少なくとも２４時間固定した後、
組織試料を組織−医用生体材料境界面を保存するため中線で半分に注意深く切断
した。これらの小さな組織塊はパラフィン包埋法を用いて処理した。４ミクロン
切片が切断され、組織はヘマトキシリンおよびエオシン、コラーゲン束検出のた
めのマッソンの３色染色法で染色され、または内皮細胞検出のためのフォン−ウ
ィルブランド因子ＶＩＩＩに対する抗体（Ｄａｋｏ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ
）で染色された。

【００５０】３から６匹の動物が各々の移植材料型に対して評価された。少なくとも２人の
読み取り手が最小応答を０とし最大応答を４として試料を組織学的に点をつけた
。組織学的試料は血管内殖、カプセル形成、組織内殖および炎症について評価し
た。平均値および標準偏差はすべての移植材料について計算され、Ｆｉｓｈｅｒ
の基準を使用するＡＮＯＶＡ分析がＳｔａｔＶｉｅｗ４．５（Ａａｃｕｓ，Ｂ
ｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を用いて計算された。

【００５１】

【表１】

【００５２】表１：Ｌｅｗｉｓラットモデル内へ移植された医用生体材料のためのレイアウト
。移植されたアルギン酸塩ロッドのために分析された動物数は組織学的処理の間
に組織−材料境界面を保存することが困難であったために少なくなった。^* ３個の移植物が材料内への組織内殖の欠如により組織学的固定の間に失われた
。^** １匹の動物が移植後に死亡した。固形ロッドおよびビーズ：アルギン酸塩ロッドは１．２％ａｌｇ−ＲＧＤ溶液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ
ディスポ透析器内へ注入することにより形成させた。これらの透析器チューブは
５ｍｌの容量で１０ｍｍの幅、３００，０００の分子量カットオフであり、滅菌
水が前もって満たしてあった。ディスポ透析器容器中の水を捨て、滅菌１．５％
ＣａＣｌ₂で置き換え、次に３．３ｍｌのａｌｇ−ＲＧＤ（ＰＢＳ溶液）を容器
に埋め込まれている透析チューブの内部に入れた。アルギン酸塩−ＲＧＤを１時
間ゲル化させ、ＣａＣｌ₂をＤＭＥＭに置き換えた。手術の時点で、ディスポ透
析器チューブ膜を小さなはさみで切り出し、アルギン酸塩の円柱をペトリ皿に置
いた。皿の下に定規を置き、アルギン酸塩を滅菌メスで１ｃｍのロッドに切断し
た。直径は約１ｃｍであって、移植物をビーズ移植物の容量と同じである約１ｍ
ｌにしている。ロッドの配置のためラットの側面に切開術が施こされ（鈍切開が
ポケットの形成に使用された）、ロッドはポケット内部に置かれ、切開部が留め
られた。

【００５３】固形ビーズのためには、アルギン酸ナトリウム（Ｐｒｏｎｏｖａ，ロット番号
４１１−２５６−０５）はアルギニン、グリシンおよびアスパラギン酸トリペプ
チド（ＲＧＤ）と共有結合で結合された。アルギン酸塩−ＲＧＤ（ａｌｇ−ＲＧ
Ｄ）は２ｇｍ／１００ｍＬ（２％）の濃度で、カルシウムおよびマグネシウムを
含まないリン酸緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）と混合した。十分に混合した後、
ａｌｇ−ＲＧＤは０．４５μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いて濾過した
。次に６０ｍＬシリンジ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）および３０ゲー
ジ注射針を使用し、ａｌｇ−ＲＧＤ溶液を１．５％塩化カルシウムの滅菌濾過溶
液（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に無菌的に滴
加した。Ｈａｒｖａｒｄシリンジポンプ（ＨａｒｖｅｒｄＩｎｄｕｓｔｒｉｅ
ｓ）が５０ｍＬ／時間の流速で使用された。直径約１から３ｍｍのビーズがこの
様式で形成された。

【００５４】皮下ポケットはビーズのための巾着縫合技術を用いてメスＬｅｗｉｓラットの
背中に作り出された。巾着は、５０ｍＬの円錐チューブカップを縫合面の３９ｍ
ｍ周長に印を付けるために使用し、次に４．０プロレン縫合糸が円の輪郭をたど
るために使用された。１ｍＬのビーズスラリー液（アルギン酸塩またはコラーゲ
ンビーズ）を移植する前に、皮下間隙を鈍切開するため、中心からわずかに離し
て１．５ｃｍの切開が行われ、切開部はＶｉｃｒｙｌ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，
Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）で閉じられ、次にプロレン縫合糸
が堅く絞められ１ｍＬの皮下ポケットが形成された。すべての材料は一夜ウシ胎
児血清含有（２％）ＤＭＥＭで前処理された。

【００５５】固形アルギン酸塩−ＲＧＤビーズおよびロッドを含んでいる組織切片の組織学
的分析は移植２週間後に比較された。繊維性カプセルがロッドの周りに形成され
ており、より小さいビーズ移植物では材料内への認識できる組織内殖は起こって
いなかった。アルギン酸塩ロッド内への組織内殖の欠如は、組織学的処理間に組
織−生体医用材料境界面を維持するのを困難にした。これら両方の移植部位で巨
細胞および多核白血球（ＰＭＮ）がごく僅かに存在していた。高倍率では、アル
ギン酸塩−ＲＧＤビーズの周りに形成されたカプセルが観察できた。カプセルは
高度に血管化されているようである。免疫組織化学的切片でカプセル領域の至る
所に因子ＶＩＩＩの存在が同定された。（このマーカーは内皮細胞を同定するた
めに使用される。）ビーズおよびロッドの周りに高度に血管化されたカプセルを形成する能力は栄
養の送達のために重要な因子である。しかしながら、これらの構築物の大きさは
（１．５ｍｍより大きい）栄養および酸素の拡散距離（０．１５ｍｍ）よりも１
桁大きい；従って、これらの物質に送達された細胞は適切な栄養供給を受けてい
ないであろう。多孔性コラーゲンビーズ：多孔性ウシタイプＩコラーゲンビーズが、移植された細胞を支えるのに必要と
される寸法で三次元血管床を確立できるかどうかを決定するために選択された。
タイプＩコラーゲンビーズはＣｅｌｌｅｘ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入され
た。ビーズは０．４−０．７ｍｍの平均直径で、および０．０５から１ｍｍの範
囲の孔径でグルタルアルデヒド固定された。このビーズは高度に多孔性であり、
０．４−０．７ｍｍの直径範囲、および０．０５から１ｍｍの孔径範囲であり、
細胞接着を促進する。タイプＩコラーゲンビーズは前記の巾着縫合技術を用いて
Ｌｅｗｉｓラットの背中に移植された。移植されたタイプＩ多孔性コラーゲンビ
ーズの組織学的試験は、アルギン酸塩ビーズと異なり、ビーズ構造内への細胞内
殖が存在していることを示した。しかしながら、組織構築物の至る所に巨細胞お
よび多核白血球の存在も増加していた。これらの移植領域内の因子ＶＩＩＩに対
する染色で、血管内皮細胞が移植した領域の至る所に位置していた。マクロ細孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズ：この微構成を模倣し、２．７から３．２ｍｍの直径、および決定されていない
孔径範囲を持つマクロ細孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズが開発された。多孔性
アルギン酸塩−ＲＧＤビーズは２Ｍ炭酸水素ナトリウムおよび１．５％ＢＳＡ溶
液と混合された３％アルギン酸塩−ＲＧＤ（１：１：１）を用いて作製された。
中程度の回転を用いて撹拌板上で約１５分間撹拌すると、アルギン酸塩−ＲＧＤ
は泡立ちおよび粘凋になった。この泡立つ物質を１０ｍＬシリンジに入れ、秒当
たり約１ビーズの速度で塩化カルシウム溶液（０．５Ｍ塩化カルシウム溶液を氷
酢酸と９：１の容量比で混合）内へ滴加した。ビーズを滅菌２回蒸留水で洗浄し
、ビーズは７００ｍｌの０．３３Ｍ塩化カルシウム溶液中に入れた。このビーズ
混合物は次にＢｕｃｈｉ（Ｂｕｃｈｉ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ロータベータ
ーに設置し、ビーズが容器の底に沈むまで真空で吸引した。ビーズはガンマ照射
で滅菌された。多孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズは前記の巾着縫合技術を用い
てＬｅｗｉｓラットの背中に移植された。移植２週間後の多孔性アルギン酸塩−
ＲＧＤビーズの組織学的横断面は血管床がビーズ移植物の至る所に存在している
ことを示した。要約：移植されたアルギン酸塩−ＲＧＤおよびタイプＩコラーゲンビーズの組織学的
切片はカプセル形成、移植部位内の血管系の存在、組織内殖および炎症応答につ
いて等級を付け、その結果は図８に棒グラフ形式で示されている。各々のこれら
の観察で０から４の等級が与えられ、０は最小量であり、４は最大量である。図
８に示されているように、両方の移植物は血管床発育の機構を提供した。しかし
ながら、固形アルギン酸塩ビーズは物質内への組織内殖を許さず、一方、タイプ
Ｉコラーゲンビーズおよび多孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズは移植部位の至る
所で組織内殖を支えた。アルギン酸塩−ＲＧＤビーズでは巨細胞およびＰＭＮの
存在が最少であり、一方、タイプＩコラーゲンビーズでは中程度から重度の炎症
反応が示された。タイプＩコラーゲンビーズに対する炎症性応答は、材料を共有
結合で修飾するために使用されたグルタルアルデヒド固定によるものであろう。

【００５６】本実験で用いられた動物モデルは、大きな欠損で血管床が確立できるかどうか
を試験する能力を提供する。平均して、宿主血管床から移植されたビーズの中心
までの距離は組織学的処理後で２．０ｍｍであった。この厚さで三次元血管床作
り出す能力は軟組織再構築を可能にするであろう。同様の厚さの多工程移植によ
る連続的組織容量増加もまた容易である。この方法は癌性乳房組織除去に続く乳
房再構築に必要とされるより大きな組織塊を発育させるのに使用できる。実施例５２、４および８週での皮下移植物の組織学的観察マクロ細孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズは実施例４に説明したように調製お
よび移植され、組織学的観察が移植後２、４および８週で行われた。結果は図９
−１３に示されている。多孔性アルギン酸塩−ＲＧＤビーズは移植された物質の
至る所で血管床の存在とともに組織内殖を可能にしている。図１３は取り囲んで
いるカプセルの最大の厚さ（瘢痕組織に対応する）は２週間（筋肉に面している
移植物の部位で）または４週間（皮膚に面している移植物の部位で）で起こり、
８週では減少していることを示している。

【００５７】前述の発明は理解を明確にする目的で図版および実施例によりいくぶん詳細に
説明されてきたが、ある種の変更および変形が付随する特許請求の範囲内で実施
されることは明らかであろう。

【００５８】明細書において、本発明の好適な態様が示されており、特別な用語が用いられ
ているが、用語は制限する目的ではなく一般的および記述的な認識でのみ使用さ
れており、本発明の範囲は前記の特許請求の範囲に示されている。

【００５９】本明細書で述べられたすべての出版物および特許出願は、本発明が関与する当
業者のレベルの指標である。すべての出版物および特許出願は、各々個々の出版
物および特許出願が特別におよび個々に援用されると示されていたと同じ程度に
本明細書において援用される。同様に、本出願の特許出願は本明細書において援
用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａはラットの皮下間隙に移植され、移植１週間後に採取されたａｌｇ−Ｒ
ＧＤ（１ＸＲＧＤ濃度）ビーズのトリクローム染色を示しており、ビーズ間の
組織内殖を例示している（４０倍）。図２Ｂはａｌｇ−ＲＧＤビーズおよび組織境界面での血管床の形成を示してい
る（２００倍）。

【図２】図２Ａはラットの皮下間隙に移植され、移植２週間後に採取されたビーズ（ａ
ｌｇ−ＲＧＤ（１００ＸＲＧＤ濃度）のトリクローム染色）間の組織内殖を示
している（４０倍）。図２Ｂはビーズおよび組織境界面での血管床の形成を示している（２００倍）
。

【図３】図３はアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ間に増殖した組織中の因子ＶＩＩＩ局在化
を示している。

【図４】図４は平滑筋細胞が播種されているコラーゲンビーズの横断面を示している。

【図５】図５Ａは２週間移植されたラットから採取されたコラーゲンビーズの組織学的
切片（４０倍および２００倍）のトリクローム染色を示している。図５Ｂは図５Ａと同一切片からの２つの因子ＶＩＩＩ染色を示しており、血管
内皮細胞がコラーゲンビーズ移植物の至る所に位置していることを示している（
上の写真は４０倍であり、下の写真は２００倍である）。

【図６】図６はコラーゲンビーズで移植され、２週間後に採取された大動脈平滑筋細胞
の増殖を示している（４００倍）。

【図７】図７は２週間後に採取され、コラーゲンビーズ上の因子ＶＩＩＩ染色での内皮
細胞の細胞増殖を示している。

【図８】図８はアルギン酸塩ロッドまたはビーズまたはコラーゲンビーズの２週間皮下
移植物の組織学的採点を比較している棒グラフである。

【図９】図９は移植から２、４および８週でのアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ皮下移植物
の組織学的採点を比較している棒グラフである。

【図１０】図１０は種々の時間間隔でのアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ移植物の領域を比較
している棒グラフである。

【図１１】図１１は異なった時点でのアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ移植物の幅を比較して
いる棒グラフである。

【図１２】図１２は異なった時点でのアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ移植物の厚さを比較し
ている棒グラフである。

【図１３】図１３は異なった時点でアルギン酸塩−ＲＧＤビーズ移植物を取り囲んでいる
カプセルの厚さを比較している棒グラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年４月９日（２００１．４．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１０】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１１】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１２】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ホルダー，ウォルター・ディー，ジュニアーアメリカ合衆国ノース・カロライナ州 28226，シャーロット，ケンブリッジ・クレッセント・ドライブ 4715 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 AA27 BB11 CC02 CC08 CC10 CC13 DA10 DF10 DG10 4B064 AH19 CA10 CC01 DA01 DA13 4C081 AB11 AB13 AB14 AB18 CA021 CA041 CA051 CA081 CA101 CA161 CA171 CA191 CA201 CA211 CA231 CA241 CA281 CD041 CD121 CE02 DB04 DC03 4H011 BB19 CA01 CB05 CB08 CD13 DH02 DH05 DH25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生きている被験者に血管化三次元組織を提供する方法であっ
て、該生きている被験者の問題とする領域内に多数の離散したマクロ細孔性構築
物を送達することから成り、該構築物は（ａ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；および（ｂ）該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以内
に配置された細胞から成っており、該多数の構築物の送達に続いて問題とする該
領域中で血管化の増加が起こる。
【請求項２】該生物適合性材料が生体吸収性材料である請求項１に従った
血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項３】該生物適合性材料が非吸収性材料である請求項１に従った血
管化三次元組織を提供する方法。
【請求項４】該生体吸収性材料がポリエステル、ポリエチレングリコール
およびヒドロゲルから成る群より選択される請求項２に従った血管化三次元組織
を提供する方法。
【請求項５】該非吸収性生物適合性材料がポリテトラフルオロエチレン、
ポリカーボネート、ポリエチレンおよびナイロンから成る群より選択される請求
項３に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項６】該生体吸収性材料がポリビニルアルコール、ポリアクリルア
ミド、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリエステル、ポリメタアクリレート、
ポリウレタン、ポリホスファゼン、乳酸およびグリコール酸の共重合体、リジン
および乳酸の共重合体およびリジンＲＧＤおよび乳酸の共重合体から成る群より
選択される請求項２に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項７】該生物適合性材料がヒドロゲルおよび天然に存在するポリマ
ーから成る群より選択される請求項１に従った血管化三次元組織を提供する方法
。
【請求項８】該生物適合性材料がアルギン酸塩である請求項７に従った血
管化三次元組織を提供する方法。
【請求項９】該生物適合性材料がコラーゲンである請求項７に従った血管
化三次元組織を提供する方法。
【請求項１０】該方法がさらに細胞接着、増殖または移動を変異させるた
めのシグナルを問題とする該領域内へ送達することを含む請求項１に従った血管
化三次元組織を提供する方法。
【請求項１１】該シグナルが増殖因子、ホルモン、細胞外マトリックスタ
ンパク質および細胞接着ペプチドから選択される請求項１０に従った血管化三次
元組織を提供する方法。
【請求項１２】該増殖因子が上皮細胞増殖因子、酸性または塩基性線維芽
細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、ヘパリン結合増殖因子
、形質転換増殖因子、神経成長因子、筋肉形態発生因子および血小板由来増殖因
子から成る群より選択される請求項１１に従った血管化三次元組織を提供する方
法。
【請求項１３】該シグナルがトリペプチドＲＧＤおよびＹＩＧＳＲから成
る群より選択される細胞接着ペプチドである請求項１０に従った血管化三次元組
織を提供する方法。
【請求項１４】該シグナルがコラーゲンである請求項１０に従った血管化
三次元組織を提供する方法。
【請求項１５】シグナルが生物適合性材料に共有結合で結合されている請
求項１０に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項１６】多数の離散したマクロ細孔性構築物が約５ｍｍの最大粒子
径を持っている請求項１に従った生きている被験者に血管化三次元組織を提供す
る方法。
【請求項１７】各々の離散したマクロ細孔性構築物が、該構築物の各々の
外表面から４００μｍを超えない中心を持つ請求項１に従った生きている被験者
に血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項１８】該多数の離散したマクロ細孔性構築物が２５μｍから１５
０μｍ間の孔径の細孔を持っている請求項１に従った生きている被験者に血管化
三次元組織を提供する方法。
【請求項１９】該多数の構築物の送達が注射によるものである請求項１に
従った生きている被験者に血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項２０】該多数の構築物が該生きている被験者の該問題とする領域
へ、外側の嚢から嚢内への細動脈および細静脈連絡を持っている生物適合性嚢中
で送達される請求項１に従った生きている被験者に血管化三次元組織を提供する
方法。
【請求項２１】該送達工程の前に該細胞を増殖させることをさらに含む請
求項１に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項２２】該細胞が平滑筋細胞である請求項１に従った血管化三次元
組織を提供する方法。
【請求項２３】該細胞が平滑筋細胞、内皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、線維
芽細胞、尿細管細胞、セルトリ細胞、甲状腺細胞、島細胞、骨格筋細胞、副腎細
胞、神経細胞、心筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、幹細胞などから成る群より選択さ
れる請求項１に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項２４】該細胞が同種、自己由来および異種細胞から成る群より選
択される請求項１に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項２５】該生きている被験者がヒトである請求項１に従った血管化
三次元組織を提供する方法。
【請求項２６】生きている被験者に血管化三次元組織を提供する方法であ
って、該生きている被験者の問題とする領域内に多数の離散したマクロ細孔性構
築物を送達することから成り、該構築物は（ａ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；（ｂ）該生物適合性材料内の該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以内
に配置された細胞；および（ｃ）細胞接着、増殖または移動を変異させるためのシグナルから成っており、
ここで、該多数の構築物の送達に続いて問題とする該領域中で血管化の増加が起
こる。
【請求項２７】該生物適合性材料がアルギン酸塩およびタイプＩコラーゲ
ンから成る群より選択される請求項２６に従った血管化三次元組織を提供する方
法。
【請求項２８】該シグナルが該生物適合性材料に共有結合で結合された細
胞接着ペプチドである請求項２６に従った血管化三次元組織を提供する方法。
【請求項２９】生きている被験者の軟組織欠損を修復する方法であって、
軟組織欠損を持っている生きている被験者内へ多数の離散したマクロ細孔性構築
物を送達することから成り、該構築物は（ａ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；（ｂ）該生きている被験者から得られ、平滑筋細胞、内皮細胞、間葉細胞、線維
芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞から成る群より選択される細胞から成っており
、該細胞は該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ
以内に配置されており、および該多数の構築物の送達は該軟組織欠損を少なくと
も部分的に直すのに十分である。
【請求項３０】該多数の離散したマクロ細孔性構築物がさらに細胞接着、
増殖または移動を変異させるためのシグナルを含んでいる請求項２９に従った軟
組織欠損を修復する方法。
【請求項３１】該生きている被験者がヒトであり、および該軟組織欠損が
乳房組織の欠損である請求項２９または請求項３０に従った軟組織欠損を修復す
る方法。
【請求項３２】生きている被験者に血管化三次元組織を提供する方法であ
って、以下の工程から成っている；（ａ）インビボで血管系床の形成を支える生物適合性材料を該問題とする領域内
へ送達し、ここで血管系床は該問題とする領域で発育する；および（ｂ）該血管系床へ隣接して細胞を送達する、ここで、該細胞の送達に続いて該問題とする領域内で血管化三次元組織が発育す
る。
【請求項３３】該細胞が該多数の離散したマクロ細孔性構築物に含まれて
いる請求項３２に従った生きている被験者に血管化三次元組織を提供する方法で
あって、該構築物は：（ｉ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；および（ｉｉ）該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以
内に配置された細胞から成っている。
【請求項３４】該構築物が血管内皮細胞増殖を促進するであろう材料でコ
ーティングされている請求項１に従った生きている被験者に血管化三次元組織を
提供する方法。
【請求項３５】該コーティングがフィブロネクチン、ビトロネクチン、コ
ラーゲン、ポリリジン、ラミニン、これらの細胞外マトリックスに由来するポリ
ペプチドおよびヒドロゲル成る群より選択される請求項３４に従った血管化三次
元組織構築物を提供する方法。
【請求項３６】多数の離散したマクロ細孔性構築物から成る生きている被
験者に血管化三次元組織を提供するための組成物、該組成物は（ａ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；および（ｂ）該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以内
に配置された細胞から成っており、該多数の構築物の送達に続いて該問題とする
領域中で血管化の増加が起こる。
【請求項３７】さらに細胞接着、増殖または移動を変異させるためのシグ
ナルを含んでいる請求項３６に従った組成物。
【請求項３８】多数の離散したマクロ細孔性構築物を生きている被験者の
該問題とする領域内へ送達することにより該生きている被験者に血管化三次元組
織を提供するための組成物の製造における生物適合性材料の使用であって、該多
数の離散したマクロ細孔性構築物は（ａ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；および（ｂ）該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以内
に配置された細胞から成っており、該多数の構築物の送達に続いて該問題とする
領域中で血管化の増加が起こる。
【請求項３９】多数の離散したマクロ細孔性構築物を生きている被験者の
該問題とする領域内へ送達することにより該生きている被験者に血管化三次元組
織を提供するためのキットであって、該キットは（ａ）インビボで血管系床の形成を支える生物適合性材料、ここで該生きている
被験者の問題とする領域内への該生物適合性材料の送達は該問題とする領域中で
の血管系床の発育を誘導する；および（ｂ）多数の離散したマクロ細孔性構築物、該構築物は；（ｉ）多孔性構造を持っている生物適合性材料；および（ｉｉ）該生物適合性材料内に該材料の少なくとも一つの表面から４００μｍ以
内に配置された細胞から成っており、ここで、該血管化床に隣接して該多数の離
散したマクロ細孔性構築物を送達すると、該多数の離散したマクロ細孔性構築物
の送達に続いて該問題とする領域で血管化三次元組織が発育するのが誘導される
。