JPH01170466A - 生体内インプラント材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体適合性に優れた生木内インプラント材料
に関するものである。

［従来の技術］ 人工血管・、血管パッチなど血管の代替となる生体移植
用の生体内インプラント材料において、例えば人工血管
では内径８ｍｍ以上のものでは臨床の実績も積まれ多少
の問題はあるものの実用に供するものが開発されている
。しかし取扱性、生体適合性について満足できるものは
開発されていない。

特に、内径が６ｍｍ以下の細径人工血管についてはその
開発要求は極めて強いものの未だ実用に耐えうるちのが
開発されていない。従って、より生体に近い優れた特性
を有する人工血管への要求は強く、さらに細径人工血管
の開発が関係者の現在の関心事であり、かつこの開発が
切に望まれている。

このような移植用材料を開発する手段として、抗血栓性
を有する高分子材料を用いて人工血管を作成し、血栓形
成を本質的に押さえようとする試みが数多く行なわれて
きた。しかし、長期間にわたって完全に血栓閉塞を押さ
えうる高分子材料は未だ開発されていない。

一方、理想的な抗血栓性表面として、血管の内腔を覆っ
ている血管内皮細胞がある。血管内皮細胞は、プロスタ
サイクリンや組繊プラスミノゲンアクチベーターなどを
分泌すると共に、その表面にトロンボモジュリンやヘパ
ラン硫酸を有している。このように、血管内皮細胞は様
々な機構により、血管壁に血小板が粘着し、また血管内
で血液力’５固することを防いでいる。このため人工血
管内腔に血管内皮細胞を付着させることによって、血栓
による閉塞のない細口径の人工血管を作ろうとする試み
が行なわれてきた。−例を挙げると５ｔａｎｌｙらはポ
リエステル繊維から作成された、長さが１０ａｍ、直径
が４ｒｍｕの人工血管の内表面ならびに空隙にフィブリ
ンを貼布あるいは埋めこんだ。

この人工血管を犬の血管に置換したとき、内皮細胞を付
着させた場合のほうが、開存率（血栓による閉塞がおこ
らない割合）が高いとしている。

［発明で解決しようとする問題点］ 従来、繊維から構成される基材、特に人工血管において
、その内腔で血管内皮細胞を直接付着培養した場合には
、血管内皮細胞の基材への接着力が不十分であり、生体
の血管に置換した際、血流によって剥離しやすかった。

また基材上での血管内皮細胞の増殖が悪いため、特に細
径の血管代替物の場合、生体の血管に置換した際、血栓
による閉塞を十分押さえることができなかった。

本発明の目的は、上記欠点のない取扱性良好にして、か
つ生体適合性に優れた医療材料を提供せんとするもので
、特に細径の人工血管においても血栓による閉塞のおこ
り難い材料を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の目的は、繊維から構成される基材の表面にイン
ビトロで平滑筋細胞および／または繊維芽細胞を付着せ
しめた後、血管内皮細胞を付着せしめてなる生体内イン
プラント材料より達成できる。

生体内の血管において、血管内皮細胞は血液に直接接す
る最内層に位置し、その外側を平滑筋細胞、繊維芽細胞
が取り巻いている。本発明ではこの様な構造を再構築す
るため、血管内皮細胞を繊維から構成される基材に付着
させる際、あらかじめ表面にインビトロで平滑筋細胞お
よび／または繊維芽細胞を付着させることを特徴とする
。

本発明の生体内インプラント材料の基材は繊維から構成
されていることが必要である。繊維は常法に従い、織り
、編み、組紐、不織布化による直接法などで必要な形状
を与えることが可能である。

繊維から構成されることにより、強度、柔軟性、縫合性
、耐久性、生体内分解性、細胞との親和性などを広範囲
に設定することが可能であり、例えばポリウレタンなど
のポリマーの多孔体からなる基材と比較して、７血管壁
と類似の構造を作るために最適なものを作成することが
可能である。

本発明に用いることのできる繊維の原料となるポリマー
としては、ポリエステル、ポリウレタン、ポリフェニレ
ンサルファイド、ポリスルホン、ポリエーテル、ポリア
ミド、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、セルロ
ース、セルロースエステル、セルロースエーテル、ポリ
テトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリビニ
ルアルコール、ポリ酢酸ビニル、キチン、キトサン、ポ
リゲルコール酸およびこれらの共重合体などである。

特にポリエステル、ポリウレタンが好ましい。

これらの繊維を１．０デニール以下の極細繊維で構成す
ることも有効である。すなわち極細繊維化することによ
り織り、編み密度を上げても基材の柔軟性が失われず、
またウォータージェットなどの手法により繊維を絡ませ
ることにより、切断面からほつれにくくすることが可能
で、生体の血管との縫合性を良好にすることができる。

これらの特性は人工血管として用いる際に特に重要であ
る。このなめには繊維の太さは０．５デニール以下にす
ることがより好ましい。

極細繊維の製法および加工方法については、すでにＵＳ
Ｐ３，５３１，３６８：ＵＳＰ３，３５０．４８８：特
許公報昭６１−４５４６等に見られるように、多成分系
繊維を形成し、その−成分を除去もしくは剥離せしめて
極細繊維化する方法がある。この極細化処理は、予め行
なって基材となしても良いが、基材となした後、極細化
処理することもできる。かかる方法を経ずに直接極細繊
維となしたものを用いることも当然可能である。

また繊維の起毛も有効である。これは基材の表面をやす
り棒で擦るなどの手法によって行なうことが可能である
。起毛することによって平滑筋細胞や繊維芽細胞の付着
する足場の数が著しく増大し、材料の表層だけでなく繊
維の間隙にも細胞が入り込むことが可能となり、より安
定で強固な綱泡層が短い培養期間で完成する。この細胞
層とは細胞とその細胞層らが合成した細胞外マトリック
ス成分を含むものをさす。極細繊維を用いることはこの
起毛を容易に作ることが可能で、しかもコラーゲンなど
の繊維性物雪を主成分とする細胞外マトリックスと強固
に複合体を形成する意味でも好ましい結果をもたらす。

本発明で用いる平滑筋細胞は動脈、静脈および消化管な
どから採取可能であるが、特に血管由来のものが好まし
く、これらの組織より、イクスプラント法あるいは酵素
消化法によって採取できる（江橋節部編「心臓・血管研
究方法の開発」、学会出版センター、１９８３．　ｐ５
５〜６１）。

また繊維芽細胞は血管由来のもののほか、より容易に入
手可能な皮膚由来のものを用いても良い。

これらの細胞はウサギ、イヌ、ブタ、マウス、サル、モ
ルモットなどいずれの動物より分離して良いが、最終的
にヒトに移植することを目的とする場合にはヒト由来の
ものを用いる必要があり、移植を受ける当人の細胞を用
いることが最も好ましい。平滑筋細胞と繊維芽細胞はど
ちらか単独で用いても良いが、両者を適当な割合に混合
して基材に付着させることもできる。これらの細胞は生
体から分離後本発明に記す基材に付着され、適当な培地
中でインビトロで培養されることにより必要な数にまで
細胞が増加せしめることができる。またこれらの細胞が
コラーゲンを主成分とする。Ｉ胞外マトリックスを合成
することも、内皮細胞が付着するための良い足場を形成
する一因となる。また基材へ細胞を付着させるに先立ち
、適当な数になるまで通常の手法に従って、例えば組織
培養フラスコを用いてインビトロにて細胞を培養させた
後、基材に付着させることも有効である。

繊維基材へこれら平滑筋細胞および／または繊維芽細胞
を安定して付着せしめるために、基材にグロー放電およ
、び／またはプラズマ処理を行なったり、内腔にコラー
ゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、
ラミニン、フィブリンなどの細胞接着性物質をあらかじ
めコーティングすることが好ましい。このコーティング
をより確実にするなめ、基材のグロー放電処理および／
またはプラズマ処理あるいは、コーティングされた細胞
接着性物質の化学的手段による架橋処理を行なったり、
基材へ細胞接着因子を共有結合などの手段によって、固
定化するなどの処理を行なうことができる。

基材表面にインビトロで細胞を付着させるには、１０％
ＦＣ３を含むＭ１９９メディウム等の培地に平滑筋細胞
および／または繊維芽細胞を浮遊させた細胞培養液を基
材に接着させるか、あるいは該細胞培養液中に基材を入
れて培養することにより行なう。基材の少なくとも一部
が極細繊維から構成される場合には、表面のみでなく、
極細繊維が絡まることにより形成されるマトリックス構
造の間隙に存在する繊維にも細胞を付着させることがで
き、細胞を３次元的に生育させることができ、より生体
に近い材料にすることができる。

平滑筋細胞および／または繊維芽細胞を基材の繊維間隙
や表面で培養することにより、細胞はコラーゲンやムコ
多糖からなる細胞外マトリックス成分を自ら合成し、繊
維から構成される基材を、より生体内に近い状態に代え
る。

この際、細胞を付着せしめた基材を培地中に浮遊させた
り、あるいは基材を伸縮させつつ培養することは極めて
有効である。こうした処理をすることで細胞の細胞外マ
トリックスの合成が活発化し、繊維と細胞をより強固に
固着させることができる。

生体内ではこのような平滑筋細胞および／または繊維芽
細胞と細胞外マトリックスの構造体上で血管内皮細胞が
生育している。本発明においては、血管内皮細胞の基質
への付着が強固であり、内皮細胞の諸機能がより生体内
に近い状態に保たれる。

この現象がどのようなメカニズムによるのかについては
、現在までのところ十分に理解されているわけではない
が、−例として、繊維芽細胞からは血管内皮細胞増殖因
子（ＥＣＧＦ）が分泌され内皮細胞の増殖を促進するこ
とが知られている。

本発明の血管内皮細胞は、ウサギ、イヌ、ブタ、マウス
、サル、モルモットなど種々の動物由来のものが使用で
きるが、最終的にヒトに移植することを目的とする場合
にはヒト由来のものを用いる必要があり、移植を受ける
当人の細胞を用いることが最も好ましい。

本発明の血管内皮細胞は動脈、静脈、毛細血管などから
例えば江橋節部編「心臓・血管研究方法の開発」ｐ２７
〜３７と同種の手法により採取することができる。ヒト
の場合は大伏在静脈、あるいは脂肪組織の毛細血管由来
のものを用いるのが一般的である。

血管内皮細胞を分難後、細胞を浮遊させた培地を接触さ
せることにより、平滑筋細胞および／または繊維芽細胞
を付着、増殖せしめた基材上へ内皮ａ胞を容易に付着さ
せることができる。この際、内皮細胞の数が不足する場
合には、インビトロで例えば、組織培養フラスコ内で内
皮細胞を増殖させた後付着に供することができる。

この際、平滑筋細胞および／または繊維芽細胞を含む基
材をコラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニ
ン、ビトロネクチン、フィブリンなどの細胞接着性物買
をあらかじめコーティングしたり、血管内皮細胞を浮遊
させた培地に添加しておくことにより、より多くの細胞
を、強固に基材に付着させることが可能になる。血管内
皮細胞は、平滑筋細胞および／または繊維芽細胞が生育
した基材の表面を被覆するように増殖する。この被覆の
程度は基材の表面の２０％以上、より好ましくは５０％
以上である。

また、細胞外マトリックスの形成を促進し、内皮細胞の
付着をより容易かつ確実に行なうために、平滑筋細胞お
よび／または繊維芽細胞を培養する際に、基材を浮遊さ
せたり、基材を伸縮させつつ培養することが好ましい。

本発明の生体内インプラント材料とは、生体移植用の医
療材料であり、具体的には人工血管、血管パッチ、人工
心臓弁、心血管用パッチ、人工鍵、人工食道、人工気管
、人工歯根、人工関節、人工骨等が挙げられる。なかで
も本発明材料は血栓閉塞がおこりにくいため、人工血管
、血管パッチ等の血管代替材料として最適であり、特に
細径人工血管として好ましく用いることができる。

また本発明の材料は、血管壁のモデルとして血管内皮細
胞と、平滑筋細胞および／または繊維芽細胞の相互作用
を研究に用いたり、血管内皮細胞を大量培養してその生
産物を使用する時にも利用可能である。

［実　施　例］ 次に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本
発明はこれらのみにとられれるものではない。

実施例１ ０．０７デニールのポリエステル極細繊維を用い平織り
組織にて内径３胴、長さ６ａＴＩのチューブを作成した
。このチューブに厚手のポリエステルフィルムをいれ両
面から軽く針布起毛した。ついで高圧の水条流をあて繊
維相互を絡ませた。織り目の間には分繊した極細繊維が
数本横切った横蓬を成していた。平滑筋細胞はウサギ胸
部大動脈より採取した。すなわち無菌的に取り出した動
脈の内膜をメスにて除去した後、血管壁を５ｍｍ角に切
断した。

次いで内皮が存在していた面を繊維培養用のシャーレに
密着させ、１０％のウシ胎児血清（’ＦＣ８）を含むダ
ルベツコ変法Ｍ　Ｅ　Ｍを加え、３７度のＣＯ２インキ
ュベーター内で培養した。１０日後に組織からイクスプ
ラントした平滑筋細胞をトリプシン処理し、浮遊した細
胞を組織培養フラスコ内で培養し、平滑筋ＭＡ胞を得た
。

この細胞が、平滑筋細胞であることの確認は、フラスコ
内でコンフレンドになった時、独特のヒルアンドバレイ
構造を取ること、および細胞内にミオシン様フィラメン
トを含むことを電子顕微鏡的に検出することによった。

細胞をトリプシン処理した後、２０％のＦｅ２を含むダ
ルベツコ変法ＭＥＭにｌＸ１０５個／　ｍｌの割合で浮
遊させチューブ内腔に注入した。ついで両端を縫合系で
しばり、ＭＥＭを加えたローラーボトル内で水平位置を
保ったまま緩やかにローラーボトルを８時間回転させる
ことで、チューブ内腔へ平滑筋細胞を付着させた。この
操作によって注入細胞の約７０％がチューブに付着した
。培養はチューブの両端を開放した後、ボトル自体をゆ
っくりと回転させながら３７度の恒温室内で行なった。

７日後の細胞数は１．５Ｘ１０５個であった。チューブ
の一部を切り取りリヘマトキシリンーエオイジン染色を
行なったところ、チューブの内面全体および繊維の間隙
の大部分が細胞によって被覆されていることが確認され
た。また細胞間にはコラーゲンを主成分とする細胞間マ
トリックス物質が認められた。

血管内皮細胞はイヌ外頚静脈由来のものを使用した。無
菌的に取り出した動脈をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で数回
洗浄した後、０．０５％のトリプシンを含むＰＢＳを加
え、両端をしばり、室温に２０分間静置した。両端を開
放後、細胞の浮遊したトリプシン液から細胞を遠心分離
にて集め２０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）と、１　、５
　ｒｒｕｚ　／　ｍｌのＥＣＧＦ　（コラボレーテイブ
社製）を含むＭ１９９培地を用い、３７度のＣ○２イン
キュベーター内で培養した。

この細胞が、血管内皮細胞であることの同定は、蛍光ラ
ベルした■因子関連抗原抗体で蛍光染色されることを確
認することによった。１０日間培養することで５Ｘ１０
４個の細胞を得た。

細胞をトリプシン処理した後、２０％ＦＣ８を含むＭ１
９９培地に浮遊させ、平滑筋細胞付着済の人工血管内腔
に注入した。ついで両端を縫合糸でしばり、培地を加え
たローラーボトル内で水平位置を保ったまま緩やかにロ
ーラーボトルを４時間回転させることで人工血管に血管
内皮細胞を付着させた。この操作によつ注入細胞の約６
５％が人工血管に付着した。次いで人工血管の両端を開
放した後、ボトル自体をゆっくりと回転させながら３７
度の恒温室内でさらに１０日間、２０％のＦｅ２を含む
Ｍ１９９培地を用いて培養を行なった。１０日後、細胞
を付着させた材料の一部を切り取りへマトキシリンーエ
オイジン染色および、蛍光ラベルした軸因子関連抗原抗
体を用いて染色した。平滑′Ｈ細胞は表面に生育してお
り、最内層に、内皮細胞が１層認められた。この内皮細
胞層によって、チューブ内腔面の７０％以上が被覆され
ていることが確認された。

このチューブをイヌ１頭から２本づつ合計１０本作成し
、細胞を採取したイヌとそれぞれ同じ５頭のイヌの大腿
動脈に置換した。３０日間後の開存率は９０％であり、
閉塞した１例は感染によるものであった。開存したチュ
ーブ内表面の８５％以上が内皮細胞によって被覆されて
おり、赤色血栓はいずれの箇所にも認められなかった。

比較実施例１ 実施例１と同一のチューブを用い、内皮細胞だけを実施
例１と同様に培養した。２日後、内皮細胞を蛍光染色し
たところ、細胞は繊維に付着してわずかに生育している
だけで、チューブ内腔の被覆率は１０％以下であった。

このチューブを実施例１と同様に１０本ずつ５頭のイヌ
の血管に置換したところ、３０日後の開存率は３０％で
あった。

開存したチューブの内面にはいずれの場合にも赤色血栓
が認められ、内皮細胞による被覆率も４０％以下であっ
た。

実施例２ ０．５デニールのポリウレタン繊維を用いて平織り組織
にて作成された布を直径１．５】の円形に切断し、２４
穴の培養皿の底面に設置した。ウサギ皮膚より分離し、
１０％のＦｅ２を含むダルベツコ変法ＭＥＭにて培養し
ておいた繊維芽細胞を、５Ｘ１０４個／ｍｌの割合で同
一の培地に浮遊させたものを１　ｍｌずつ培養皿に加え
、ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養皿全体をゆっ
くりと振とうしながら培養した。この繊維芽細胞を付着
させた布を緩衝液０．５ｍｌに溶解したフィブロネクチ
ン０．５■にて処理し、フィブロネクチンをコーティン
グした。次いでウサギ胸部大動脈から実施例１と同様に
分離、培養した血管内皮細胞を１５％のＦｅ２を含むＭ
１９９培地に２Ｘ１０４個／　ｍｌの割合で浮遊させた
しの１ｍｌを加え、５日間培養した。ヘマトキシリンー
エオイジン染色および蛍光ラベルした■因子関連抗原抗
体により血管内皮細胞を染色したところ布表面の約９０
２６が内皮細胞によって被覆されていた。

比較実施例２ あらかじめ繊維芽細胞を培養しない布に実施例２と同様
の実験を行なったところ、内皮細胞は布の表面の繊維に
保かにみられるだけであり、内皮細胞による布表面の被
覆率は５％以下であった。

［発明の効果］ 本発明の材料は、生体適合性に優れ血栓閉塞のおこり難
いものであるため、インプラント材料として有用であり
、特に細径人工血管用として優れた材料である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）繊維から構成される基材の表面にインビトロで平
   滑筋細胞および／または繊維芽細胞を付着せしめた後、
   血管内皮細胞を付着せしめてなる生体内インプラント材
   料。