JPH01501362A - 人工マトリックスを用いる制御された細胞移植による器官のキメラ新生形態形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人工マトリックスを用いる制御された細胞移植による器官のキメラ新生形態形成 発明の背景 これはＪｏｓｅｐｈ　Ｐ、　ＶａｃａｎｔｉおよびＲｏｂｅｒｔ　Ｓ、　Ｌａｎ ｇｅｒにより１９８６年１１月２０日に出願された“人工マトリックスを用いた 器官のキメラ新生形態形成”という表題の米国特許出願箱９９３，０１８号の一 部継続出願である。

米国政府は、ＮＩＨ承認番号第６Ｍ　２６６９８号の効力により本発明の権利を 持つ。

本発明は一般に医学および細胞培養の分野、特に生体適合性の人工マトリックス で造られた移植可能な器官の分野に関する。

器官の機能の損失は、先天性の欠損、傷害あるいは病気から起こりうる。

器官の機能の損失をもたらす病気の一例として、Ｉ！尿病がある。真性糖尿病は 、インシュリンを産生ずる膵臓のベータ細胞を破壊する。その結果として、糖代 謝を要求する細胞にグルコースが入ることができないため、血清中のグルコース レベルが高値にまで上昇する。複雑な一連の事象を経て起こる血管の変化に次い で全ての器官で多くの問題が進行する。

現在の治療方法は、外部からインシュリンを投与することを包含し、この治療方 法は不完全な血糖レベルの制御を結果する、糖尿病の合併症を防止する成功の度 合は、議論の余地を残している。

器官全体または器官の一部のいずれかとして膵ａｍ織を糖尿患者へ移植すること は、最近はまだ実験的アプローチである。この技術を用いたより生理的な方法に おいて、血清中のグルコースは制御されているらしく、それによって合併症の進 行は遅延される。長期間効力を発揮することに成功しなかった以前の方法は、膵 島細胞の単離したクラスターを、肝臓の血管床への移植とともに門脈循環系内に 注入することにより膵島細胞を移植することであった。より最近の実験方法は。

宿主による免疫的攻撃を防ぐために膵ベータ細胞のカプセル化、および胎児への ベータ細胞を腎臓の被膜下に注入することを包含する。短期間の機能の証拠はあ るが、長期間の結果はほとんど満足のいくものではない（Ｄ、Ｅ、Ｒ，５ｕｔｈ ｅｒｌａｎｄｔＤｉａｂｅｔｏｌｏ　ｉａ　２０．１６１−１８５　（１９８１ ）　ＨＤ、Ｅ、Ｒ，５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ。

且的旦蛙組圏２０．４３５−５００　（１９８１））、現在、膵臓器官全体の移 植が好適な治療法である。

その他、肝臓の重大な障害を引き起こす多（の病気があり。

最終的には肝不全をもたらす。肝不全のための人工的な支持システムがないので 、移植が成功しない場合には、肝不全は常に患者の死を結果する。米国では毎年 ３０．０００人の人々が肝不全で死亡し１社会にかかる費用は毎年１４０億ドル である。

“先天性の代謝異常”と呼ばれる多くの病気がある。これらの病気は、タンパク の代謝の欠陥、アミノ酸代謝の欠陥。

ピリジンおよびプリン代謝の欠陥、脂質代謝の欠陥および無機質代謝の欠陥を結 果する遺伝子欠陥を包含する。これらの病気の多くは、肝臓それ自体の欠陥に基 づく、これらの患者の多くは９診断される時点では、構造的に正常な肝臓、また は適度に正常な肝臓を持つ、事実、これらの病気の多（は本来の肝臓に損傷を与 えず、むしろ傷害は中枢神経系のような他の組織でおこる。肝臓移植のための通 常の指標としては。

急、性徴症肝不全、活動性慢性肝炎、胆道閉鎖、特発性肝硬変。

原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆道炎、先天性代謝異常、いくつかの悪性の病気、 およびその他のまれな指標がある。これらの患者を処置するための唯一の方法は 、肝臓が移植可能となるまで患者を維持することである。肝臓全体の移植は１９ ８０年代を通じて、だんだんと外科手術が成功するようになり。

これは主にＴｈｏｍａｓ　５ｔａｒｚｌ博士の努力による。しかしながら。

手術の技術的な複雑さ、多量の出血、急性発作症状を伴う術後の経過、および肝 臓移植の多くの未知のことが、この手術を主要な医療センターでのみ可能な費用 のかかる技術としている。提供者の不足のため、移植は、移植を必要とする患者 の要求を決して満たすものでないことがだんだんと明らかになってきている。現 在、１年間に約６００人の患者が肝臓移植を受けている。受は入れ人数がたとえ ３倍になったとしても。

末期的な肝臓疾患で死亡してい＜　３０．０００人の患者には不足している。現 在、移植を待つ患者を維持するための良い人工肝臓はない。

肝臓病にかかっている別の患者のグループは、アルコールにより引き起こされた 肝臓病を持つ、現在、アルコールを飲用したことによる末期肝臓病の患者には移 植の方法がない。

これには、提供される器官の不足および複雑な看護の受け入れ体制がないという いくつかの理由がある。米国だけにおいても、この患者人口は非常に大きい０例 えば、　１９７３年のバルチモア地域では、全てのアルコール性肝臓病の発生率 を２０歳以上の人口１００，０００人あたりに換算すると次のとおりであった： 白人男性３６．３人、白人女性１９．８人、白人でない男性６０．０人、および 白人でない女性２５．４人、肝硬変の疾病率は、工場動労者の調査では、アルコ ールを飲まない人よりも、深刻な問題のあるアルコール飲用者の方が２８倍高い ことが報告されている。アルコール消費量と肝硬変の発生率の間には、直接の相 関関係がある。肝硬変による死亡率は国によって大きな変動がある。変動の範囲 は、フィンランドの１００．０００人あたり７．５人からフランスの１００．０ ００人あたり５７．２人までである。

米国では、この傾向は、アルコール性肝硬変の発生率および死亡率の増加によっ て警告されている。　１９５０〜１９７４年の間に。

米国での肝硬変による死亡者は、心臓血管の疾病による死亡者数が２％減少した のに対して７１゜７％増加した。この時点では、これらの患者は全く選択の権利 を持たなかった。

失われた機能の置き換えまたは回復のための適切な方法がない、多くのその他の の生体器官系が存在する０例えば、過去においては、腸の大半を失うことは致死 的条件であった。

今日では、患者は静脈を介して栄養物補給を完全に支持できるが、この技術に関 連した多（の合併症のために、該技術は“不十分な技術”と考えられている。１ つの問題は、完全非経口的栄養に輔る多くの患者は２時間の経過とともに取り消 しのできない肝臓病および肝臓病による死に進行してい（ということである、他 の患者では、複数回の除去および交換を必要とする重大な血流感染症へと発展す る。結局１　！！：、者は利用可能な全ての静脈がなくなり、栄養失調に倒れる か、または感染により死亡する。

腸の移植は、被移植者に移植された腸に存在する多数のリンパ球による大きな生 物学的問題のために、現在まで成功していない、これらは、“移植片対宿主”病 と呼ばれる免疫反応をおこす、この免疫反応において、移植された腸由来のリン パ球は患者は攻撃し、ついには患者を死亡させる。

心臓および筋肉の疾病もまた。この国の罹病率および死亡率の主な原因である。

心筋が損傷を受けた心臓への心臓移植は２次第に成功するような技術となってき ている。しかし。

肝臓移植の場合のように、提供者および強力な免疫抑制剤の使用が必要である。

器官移植および免疫生物学的科学の出現は、腎臓、心臓。

肝臓および他の器官の交換を可能にしている。しかし、これらの複雑な手術を行 う能力が向上するにつれ、技術の限界がより明らかとなってきている６例えば、 小児の肝臓移植において、よりプログラムが明らかにされるにつれて、提供者の 不足が増えてきている。米国では、肝不全の小児８００〜１．．０００人／年に 対して少数の提供者しかいない。そして、移植をうけるこれらの子供たちは、移 植される肝臓が見つかった時点ではしばしばかなり病気が重くなっているので、 成功の可能性が少な（なっている０手術は複雑であり２通常多量の出血を伴う、 保存時間は短いので、被移植者と遠く離れている提供者とが一致するような多く の実施上の問題を結果する。これらの理由から、この仕事は高価で集中的な仕事 であり、第三次医療施設でのみ得られるような多くの資力の投資を必要とする。

失われた機能を取り戻すために必要な実質成分だけを選択的に細胞移植すること が、全体または一部の器官を移植する方法の代わりとして提唱されている（Ｐ、 Ｓ、Ｒｕｓｓｅ１ｍ＋　ハル）コＬ幻）１（３）、　２５５−２６２（１９８５ ）、この方法は３出血をともなう大手術。

麻酔の困難さ、および合併症を回避することを包含するいくつかの魅力ある特徴 を持つ、この方法は、必要とされる機能を与える細胞のみを置き換えるので、導 入される白血球、細胞に存在する抗原、および拒絶反応を促進しうる細胞の型に 関する問題が避けられる。細胞培養技術を加えると、移植の方法において助けと なる別の一連の手段が提供される。培養で細胞を増殖させて細胞数を増やす能力 は、理論的には、自分自身の組織の自己移植を可能にする。例えば、肝機能を支 持するための門脈循環系への肝細胞の注入が試みられている。

腹膜腔に注入する前に肝細胞をコラーゲンで被覆した微小担体ビーズに結合させ るという最近の新し７い方法は、移植、移植された肝細胞を生存および機能させ ることに成功したと報告されている。これは、　Ａ、Ａ、Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ　 ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３＋１１９０−１１９２（１９８６）に記載されて いる。

筋肉あるいは神経組織のよ・うに機能する２その他のタイプの器官または組織の 損失もまた。身体障害および社会的悲劇へと導き得る。筋肉および神経移植の方 法が最近の５０年間を通して外科医たちにより開発されており、この方法は着想 が独創的である。神経機能を回復させるための技術の−・例として、神経中枢か ら死んだ神経繊維を神経機能が失われた場所へ張る９という例がある。他の多く の神経系の疾病は、適切な医療法が発見されていない。最近、神経細胞移植は、 パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経系の成人病における治療方 法として提唱されている。副腎組織の自己移植、または脳の中への胎児細胞懸濁 液の注入が効果的であると考えられている。血管の損失、変形または閉鎖は、し ばしば高血圧または動脈瘤のような病気の原因となる。過去において、外科医ら は最初にこの問題を２体の別の場所からとった血管を損傷を受けた部位に移植す ることによって、または永久的な置き換えとして宿性の代用品を移植することに よって処理した。数回の手術を必要とすることおよびそれに伴う患者の苦痛を包 含する短所がある。

これらの技術には、肝臓または腸のような器官の移植に関連する多くの問題点は ないが、まだその結果はしばしば不完全である。

多くの方法において肝臓および腸のような器官とは異なるが、皮膚もまた病気ま たは傷害により損傷を受ける器官材料であり２体液の損失および疾病から体を保 護する重要な役割を果たす、移植皮膚は動物の皮膚または患者の皮膚から調製さ れているが、最近では培養された表皮細胞によってつ（られる“人工皮膚”が利 用されている。

人工皮膚をつ（るための１つの方法は１表皮細胞と一緒に繊維状の格子をシード することによる０例えば、　Ｂｅ１ｌに与えられた米国特許第４．４８５．０９ ７号は、血小板および繊維芽細胞のような収縮作用因子ならびにケラチノサイト のような細胞を組み合わせた場合に、コラーゲン水和物の格子は、皮膚と類似し た物質の生産に使われるということを開示している。

Ｙａｎｎａｓらに与えられた米国特許第４．０６０．０８１号は９合成皮膚とし て有用な多重層膜を開示している。この合成皮膚は、コラーゲンおよびムコ多糖 の架橋組成物のように２体液および酵素の存在下でも分解されない不溶性非免疫 原物質からつくられており、ｌｉ全全体水分の流れを制御するための合成ポリマ ーのような非毒性物質で被覆されている。　Ｙａｎｎａｓらに与えられた米国特 許第４，４５８．６７８号は、皮膚類似物質の製造工程を開示している。この過 程では、グリコサミノグリカンで架橋されたコラーゲンからつ（られる繊維状の 格子が表皮細胞といっしょにシードされている。最初の２つの方法の短所は。

マトリックスが“永久的な”合成ポリマーでつくられているということである。

　’６７Ｂ特許は、皮膚のような器官をつくる適当な細胞を用いたどのような形 状でもとれる生物分解性のマトリックス、という上述の２つの特許にはない特徴 を有する。あいに（、それらは主にコラーゲンに基づいているので。

後者のマトリックスの組成および形状の制御を欠いている。

さらに５コラーゲンは酵素作用および時間の経過に伴う加水分解により分解され るので、該分解は非常に変動的である。

さらに、マトリックスが患者に移植され、マトリックスの全部の層を通って毛細 血管が血管網状組織を形成した時にのみ。

マトリックスは完全に細胞に浸透し、水分制御ポリマーの不在下で機能する。拡 散の機能としてのこれらのマトリックスの限界は、　Ｙａｎｎａ３およびＢｕｒ ｋｅのＪ、　Ｂ’ｏｍｅｄ、　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、５６５−８Ｎ１９８０） 、　ｐ、７３の論文で考察されて、いる。

上記の著者らは、マトリックスの孔径および厚みが生存率と移植の成功を決める 制御因子であると認識していた。しかし、その問題を無視して、移植の際にマト リックスの内部部分に十分に栄養物が供給されないことを処理する彼ら独自の方 法は、マトリックス中に表皮細胞が移るにつれて十分に毛細血管が伸長するのに 移植片が十分薄くて十分に浸透性であるものを望むか、またはマトリックス内に 十分な毛細血管伸長がおこワてからさらに表皮細胞を移植するかのどちらかであ った・ 皮膚は体の“器官”であると考えられる。しかし２人工皮膚を製造するためのこ れらの方法は、肝臓または膵臓のような他のタイプの器官をつくるためには使用 されていない。これは開示されたまたは同様の技術が上記器官をつくるのに利用 され得る。というこの特許における意見を全て包含するにもかかわらずである。

これらの方法が肝臓または膵臓のような大きくて全体が三次構造をもつ器官の構 築に用いられた場合には、器官の中心部の細胞は時間の経過とともに死滅する傾 向があり、初期の増殖速度は維持されないと仮定される。

このことは、細胞密度および厚みが増加するにつれ、成長する三次元構造物の中 への栄養物質の拡散が減少して内部が壊死するような、非常に大きな腫瘍で起こ る状態と類似している。実際、　ＹａｎｎａｓおよびＢｕｒｋｅの見解では、マ トリックスが皮膚移植片と同じくらい薄いものであってもマトリックス内での増 殖は、比較的低い細胞密度でも血管新生がおこるまでは問題があるように思われ る。

それゆえ１本発明の目的は、皮膚、肝臓、腎臓、血管、神経、および筋肉を包含 する。天然の器官に機能的に似た種々の器官をつくるための方法および手段を開 示することにある。

本発明の他の目的は、細胞増殖および移植のための一時的な足場として２人工マ トリックスを設計、構築および利用する方法ならびに手段を提供することにある 。

本発明のさらに他の目的は、その後直ちに移植を行う移植器官の構造支持体とし て、インビトロおよびインビボでの両方で細胞増殖に利用され得る。生物分解性 、非毒性のマトリックスを提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、細胞増殖のための支持体を提供するだけでなく、血 管新生および移植後の増殖細胞集団の分化を高めるような生物分解性人工マトリ ックスの形成および構築のための方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、細胞の行動ならびに他の細胞。

細胞物質および分子シグナルとの相互作用がインビトロで研究できるような９異 なった構造のマトリックスを提供することにある。

（以下余白） ２瀝Ｒと１絢 本発明は２機能的器官類偵物を製造する方法および手段に関する。この方法およ び手段により、所望の機能を持つ細胞が細胞培養技術を用いてポリマーの足場で 増殖され２次いで付着および平衡化のあとで付着、増殖および機能するようにポ リマー−細胞の足場が患者の適当な部位に移植される。成功は、移植された細胞 の周囲の環境への付着および血管形成促進能力に依存する。栄養物質および増殖 因子は、付着、生存、または増殖させるのに必要なだけ細胞の培養の間に供給さ れる。

構造物を移植し、増殖および血管形成が行われた後に生じる類器官は、与えられ た組織の実質成分ならびに血管およびマトリックス成分から形成されたキメラで ある。最初の細胞培養に用いられるポリマーの足場は１時間と共に分解する物質 から構築される。それゆえ、このポリマーは、キメラの器官には存在しない、移 植に続く２内部への血管の成長は、移植された細胞の可溶性生成物を制御する通 常のフィードバック機構を与える。

マトリックスまたは支持構造体の形成に好適な物質は２例えば５ポリグリコール 酸、ポリオルトエステル、またはポリアンヒドリドのような生物分解性の人工的 ポリマーである。

このポリマーは、制御された速度で加水分解により分解され。

再吸収される。これらの物質は２分解能力、扱いやすさ、大きさ。および形態を 最大に制御する。いくつかの実施態様においてこれらの物質は、細胞付着を促進 するゼラチン、またはアガロースのような第２の物質で重層される。ポリマーマ トリックスは、付着に適当な部位、ならびにマトリックスが移植され血管形成が 起こるまでの細胞の生残および増殖を維持するための細胞培養物からの栄養物質 の適当な拡散の両方を与えるような構造でなければならない０本発明に好適な器 官構築のための構造は、広い表面積を持つポリマー繊維で形成される分枝した繊 維の樹状構造である。この好適な構造は。

栄養物質、老廃物、およびガスの比較的狭い濃度勾配を結果するので、細胞の一 様な成長および増殖を与える。最大の細胞付着の理論上の計算は、直径３０ミク ロン、長さ１センチメートルの繊維は１２５，０００．０００個の細胞を支持で き、しかも全ての細胞への栄養物質の出入りを提供することを示唆している。生 物分解性物質の他の利点は、マトリックスの分解の間のゆっくりした放出により 、マトリックスに化合物が取り込まれ得るということである。例えば、栄養物、 増殖因子９分化または脱分化の促進剤７分泌産生物、免疫調節剤、炎症抑制剤、 退化因子、リンパ腺管網状組織または神経繊維の内部成長を促進または可能にす る生物学的に活性のある化合物。

および薬剤は、溶液で、または第２の生物分解性ポリマーマトリックスに取り込 まれた形でマトリックス中に取り込まれ得るか、またはマトリックスと共に供給 され得る。

１つまたはそれ以上の型の細胞を、マトリックスで選択および増殖させることが できる。細胞をインビトロで培養する際のマトリックスの構造１時間の長さおよ び条件は、細胞の付着（生細胞のみがポリマーに付着して残る）、増殖の程度。

および移植の成功のパーセントを測定することにより、細胞の冬型にそれぞれ基 づいて決定される。移植に適切な細胞の例は、肝細胞および胆管細胞、膵臓の島 細胞、上皮小体細胞。

甲状腺細胞ホルモンを産生ずる生殖腺細胞を包含する副腎−視床下部−脳下垂体 系の細胞、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、血管細胞、リンパ管細胞、腎臓細胞 、および腸管細胞。

骨および軟骨形成細胞、平滑筋および骨格筋細胞を包含する。

培養における細胞の最初の増殖は、その後のマトリックス細胞構造物の移植に有 益であり得る細胞の操作を可能にする。

現在利用できる技術は、肝臓タンパクの欠乏病および膵嚢胞性繊維症のような代 謝的欠損症から結果されるようなタンパクをつくらせるため（さもなければこの タンパクは欠乏している）に、細胞内へ遺伝子を導入することが可能である。遺 伝子発現の抑制も、細胞表面上での抗原発現の修飾およびそれによる免疫応答の 修飾に用いられ、それによって細胞は外来のものと認識されない。

本発明は、インビトロでの研究の技術およびマトリックスも提供する。細胞培養 の現在の方法は、細胞の構造および機能の基本的見地に価値のある洞察を提供す るが、３次元で制御しうる系が欠けているので細胞の性質、伝達、制御、および 形態形成の研究は、困難である。付着した細胞で覆われている人工マトリックス は、コラーゲン、マトリゲル”　（Ｍａｔｒｉ−ｇ　ｅ　Ｉ　Ｔ　ｅａ　）のよ うな基底膜複合体、または他の物質のような細胞外マトリックスに埋め込まれ得 る０次いで、細胞型、増殖のための生化学的信号９分化、移動、および細胞外マ トリックス成分の多くの組合せが、３次元系においてインビトロで試験され得る 。これらすべての要素を制御し、性質を観察することにより、生体医学の科学分 野は、天然の構造により似せた設定における細胞の作用への新しい洞察を得るで あろう。

皿亘皇皿１翌に班 第１図は、キメラ器官（この図においては肝臓、膵臓、または腸である）を生産 するための本発明工程の模式図である：（１）適当な実質細胞を採取し１分散さ せ、そして付着および増殖が起こる細胞培養物中のポリマーマトリックスにシー ドし。

そして（２）肝を部分切除して移植片の増殖を促進し１次いで血管新形成、細胞 増殖、およびポリマーマトリックスの再吸収が起こる被移植動物にポリマー−細 胞の足場を移植する。

第２図は、生物分解性の細胞マトリックスに用いられているポリマーの化学構造 であり：（ａ）ポリグラフチン：（ロ）ポリオルトエステル：および（Ｃ）ポリ アンヒドリドである。

第３図は、ポリマーマトリックスからの生物学的活性因子のゆっくりとした放出 を表わす図である。

第４図は、生物分解性ポリマー、細胞およびマトリックスを用いたインビトロで の形態形成を研究するための技術を示す図である。

第５図は、培養４日後のポリグラフチン９１０の繊維に付着した肝細胞の写真（ １７２倍）である、細胞はヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

第６図は、ポリマー繊維上で１ケ月間培養した胆管上皮細胞の写真である。

第７図は、成体ラット供与体由来の肝細胞の網への移植片の写真（１７２倍）で ある、ポリマー−細胞移植片は、殺す前に７日間適所に置かれた。肝細胞は健康 で、いくつかの有糸分裂の形態が見られた。血管は全体的に存在している。左側 に、ポリマー領域の炎症性の浸潤が観察される。細胞はヘマトキシリンおよびエ オシンで染色した。

第８図は、ポリマー繊維に１週間付着した肝細胞の走査電子顕微鏡写真（１２１ 倍）である。

第９図は、第８図のポリマー繊維上の肝細胞の高倍率の拡大図（１６００倍）で ある。

第１０図は、ｅｉの中に移植した移植１０日後の腸の細胞の顕微鏡写真（１０倍 ）である、この図は、血管が流れ込んでいる綱の中に６閣の嚢胞状の構造が形成 されているのを示している。

ポリマー繊維は嚢胞の壁に見ることができる。

第１１図は、第１０図の嚢胞の横断面の写真（１７２倍）であり。

腸の上皮細胞が並んだ管腔構造を示す、これらの細胞は方向性を示す、この管腔 は細胞の破片および粘液を含有する。管腔の左側の白い卵形の領域は、ポリマー 繊維を示す、この領域は、炎症性浸潤および新生血管に囲まれている。平滑筋の 層が管腔の右側に見られ、この嚢胞は小腸断片から生じ得ることを示唆している 。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。

第１２図は、グルコースに応答していくらかのインシュリンの分泌を示す５ポリ マー繊維に付着した培養４週間後の膵臓小島の写真である。

第１３図は、バイオマトリックス中のウシ大動脈内皮細胞をシードしたポリマー 繊維の写真である。細胞がポリマーから分校様の方向で、マトリックスに移動し ているのを見ることができる。

第１４図は、ポリマー繊維に付着した培Ｉ１１ケ月後のウシ大動脈内皮細胞の写 真である。

第１５図は、ポリマー繊維がマウス胎児の繊維芽細胞で覆われていることを示す 位相差顕微鏡写真である。この繊維芽細胞がポリマー繊維から離れ、培養皿に直 線的に流れているのを見ることができる。

第１６図は、マウス胎児の繊維芽細胞で覆われたポリマー繊維の位相差顕微鏡写 真である。これら胎児の繊維芽細胞はポリマーから離れ、培地を通って組織培養 プレートの底に付着している。

第１７図は、リン酸緩衝液に浸漬したポリアンヒドリド繊維の走査型電子顕微鏡 写真（４７２倍）である、この写真は、ポリマー繊維を異なった緩衝液に浸漬す ることよりポリマーの表面を改変することができ、それゆえ、細胞の付着および 分化に影響を及ぼすことができることを示している。

第１８図は、１％ゼラチンで覆われたポリマー繊維の走査型電子顕微鏡写真（４ ９３倍）であり、ポリマー繊維は、細胞の付着を増加させるために細胞接着剤で 覆われ得ることを示Ｌ７ている。

第１９図は、神経細胞の増殖に用いられる生物吸収性ポリマー繊維の斜視図であ る。

第２０ａ図は、心筋細胞にシードし、心筋に移植するポリマー針状構造物の設計 図である。

第２０ｂ図は、第２０ａ図に示したようなポリマー針状構造物の拡大図である。

第２１ａ図は、ウシ毛細血管内皮細胞と培地との間に散在する種々の厚さのコラ ーゲン（０，３，０ｍｍ＋　５．５１１１１１１１９．０１１１１１１．および １２．０ｍｍ）を含有するウェル（穴）の横断面図である。

第２１ｂ図は、コラーゲンの厚さく薗）に対して、第２１ａ図に示すウェル内で ２４時間後に残存している細胞数のグラフである。

第２２図は、第２１ａ図および第２１ｂ図に図示された。細胞の生存能力および 増殖における拡散距離の効果を示す写真である：（ａ）２４時間後の対照のウェ ルの細胞であり、細胞数は２４時間で倍、になる；（ハ）５．５閣の０．３２％ コラーゲン上に重層した細胞であり、細胞の生存力は著しく減少し、細胞数は最 初にプレートした数よりもはるかに少ないことを示している；および（Ｃ）培地 および細胞の間に位置する１２ａｎコラーゲン水和物に重層した細胞であり、そ れらの細胞は全て球状となり死んでいることを示している。

２旦」号口」象記１ 本発明は、細胞の移入および移植のための一時的な足場として生物吸収性の人工 基質を用いた２機能的器官類似物を提供するための方法である０本発明方法の成 功は、以下の原理の統合による： １、生物における全ての構造物は、器官から器官および構造物から構造物へと変 化する機能的な組織の一定の再生、再成形、および置き換えを受ける平衡の動的 状態にある。

２、分離した構造細胞は、該細胞が置かれる環境および該細胞が受ける変化の程 度に依存して構造物を再生する傾向にある。

３、組織は、約１〜３１ＩＩ１１３より大きな体積では移植できない。なぜなら ば、新しい血管が形成されるまで栄養物は拡散により供給され、この距離が脈管 形成が起こるまで拡散が起こり得る最大の距離であるからである。

４、細胞の形は細胞骨格成分により決定され、マトリックスへの付着が細胞分裂 および分化機能に重要な役割を果す。

もしも分離した細胞が、細胞付着のない浮遊物として成熟した組織の中に置かれ るならば、該細胞は本来の組織化なしで始めるので、付着部位を見い出し、方向 性を持ち、そして機能するのが困難な時期を有し得る。このことが９組織化し。

増殖して、そして機能して生存しうる移植細胞の総数を制限している。

後者の原理が、支持マトリックスの構造におけるキーポイントである０組織培養 で構築され、その後成功裏に移植される器官のためには、移植後に起こる血管の 内部への増殖に先立って細胞の増殖および分化が起こるように、マトリックスは 十分な表面積をもち、栄養物に接触されなければならない。

移植後、この構造物は、栄養物および老廃物の拡散、および細胞増殖が起こる時 の連続的な血管の内部への増殖を考慮に入れなければならない。

失われた器官機能を置き換えるか、または補うためのこの方法は、薬理学的操作 または、器官全体もしくは器官の一部の移植のいずれかに多（の利点を有する。

この領域では長足の進歩がなされてきたが、これらの努力の結果はしばしば不十 分である。移植または薬理学的操作における成功は、疾病の結果を緩和し得る。

しかし、これは通常、治療を結果しないか、または非特異的な免疫抑制の合併症 ともとの疾病を交換することになる。

本発明方法の１つの利点は、該方法はパラセンジャー白血球および抗原提示細胞 の移植なしに、必要な生物学的機能を有する実質細胞の選択的な移植のための手 段を与えるということである。その結果、薬剤を使用することなく組織の拒絶の 危険が大幅に減少される（特に、もしも同じかまたは類似のＨＬＡ組織組織相胞 を培養できるならばである）０本発明は。

器官の機能喪失を治療するその他の手段以上に他の利点を存する。この利点は、 培養の間に新しい遺伝子を導入して欠乏したタンパク産物をつくらせるように細 胞を操作し得るか。

または細胞表面上の抗原発現を抑えるように細胞を修飾し得るので、同じＨＬＡ 組織組織相胞が利用できない場合に免疫抑制を必要としないことによる０例えば 、インシュリンの遺伝子を患者自身の欠陥のある島細胞に挿入し得る。他の状態 は。

第■因子欠損症、ＯＴＣ欠損症、ならびに炭水化物および脂質代謝障害を治癒さ せる遺伝子を挿入することにより治癒され得る。これらの遺伝子の単離、クロー ニングおよび操作のための技術は、遺伝子工学の技術分野の当業者に利用可能で ある。

移植のために被移植者自身の細胞を培養することの見込みは、より根本的な利点 を有する。つまり、器官提供者の必要性をなくする０例えば、もし患者が虚血性 の損傷のために腸の９０％を失うならば、残りの１０％から細胞を採取し、培養 することができる。この細胞は培養で対数的に増える。適当な細胞数に達するま で細胞を培養し、細胞を適当なポリマーの足場で増殖させ、血管を形成し、増殖 および機能する新しい腸として患者にもどす。

肝機能の置き換えの場合には、培養における肝細胞増殖に対する要求を全くする ことなく、細胞−マトリックス構造を構築することが可能であり得る。この仮説 は、肝臓の小片肝細胞を高効率で得ることができるという観察に基づく０例えば 、２５０ｇｍのラットでの実験では、肝臓は約１２ｇｍであることが知られてい る。この肝臓は、９０％生存率で２．５Ｘ１０”個の生存可能な肝細胞を生ずる 。肝細胞量の１０％だけが細胞の機能に必要であるということも考えられている 。従って、２５０ｇｍのラットには１．２ｇｎ＋の組織が必要であり、約２．５ 　Ｘ　１０’個の細胞の移植片となる。これは、インビボでの増殖がないと仮定 してである。成体と同様に子供への移植が理論的には可能である。８ケ月の子供 は約２５０１ｍの重量の正常な肝臓を持っている。従って、その子供は親から採 取した生検材料から２５ｇｍの組織を必要とする。成体の肝臓は約１５００ｇｏ ＋の重量があるので、生検材料はその肝臓の約１．５％だけであるかまたは５． ０×１０”個の細胞である。さらに、これは増殖がないと仮定している。成体は 、約２．５　ＸＩＯ”個の細胞を産生ずるより大きな生検材料を必要とする。も しこれらの細胞が高い効率で付着し、移植されるのであるならば、新しい宿主内 での増殖が起こる。その結果得られる肝細胞の量は、要求される機能を置き換え るのに適当なものになる。

従来の技術とは太き（異なり２本発明方法は、インビトロにおける細胞の制御さ れた成長および増殖のための一時的な足場を使用し１次いで患者に機能細胞を移 植する。その結果が２機能が置き換えられた器官と類似の３次元構造で細胞の増 殖を可能とするようにインビボで血管形成されている器官である。最初の細胞培 養の条件と同じく１足場の設計および構築の両方が、細胞の生物学的能力を獲得 するように、そして胚および胎児の生命体で起こる器官形成の個体発生をくり返 すように細胞を刺激するために使われる。ここで記述されるように、この技術は キメラ新生形態形成と呼ばれる。

足場の設計および構築が主に重要である。マトリックスは。

細胞に対する栄養物および増殖因子の適切な拡散をさせるように１表面積を最大 にするように形づくられるべきである。

密集して詰まった状態の細胞を通して適切な拡散が起こり得る最大の距離は、生 体内で起こるのと類似の条件下では約１００〜３００ミクロンの範囲内のようで ある。そこでは、栄養物および酸素は血管から周囲の組織に拡散する。各細胞タ イプおよびポリマー構造の実際の距離は、インビトロおよびインビボで細胞の生 存能力および機能を測定して、経験的に決定されるべきである。ウシ毛細血管内 皮細胞とコラーゲンマトリックスとの組み合わせについてのこの測定を、下記の 実施例で詳細に記述する。

最初に、細胞を組織培養の当業者に公知の技術を用いて培養する。−皮細胞が増 殖し、マトリックスを被覆し始めたならば、それらを付着、増殖および機能させ るために患者の適当な部位に移植する。生物分解性ポリマーマトリックスの利点 の１つは、脈管形成および他の生物活性化合物がマトリックスに直接に取り込ま れ得るので、それらがインビボでマトリックスが分解するようにゆっくりと放出 されることである。

細胞−ポリマー構造物に血管が形成され、構造物が分解すると、細胞はそれらの 固有の特性に従って分化する。例えば。

通常、身体内で管を形成する細胞は管に似た構造に自身を形づくり、神経細胞は 適当に構築されている通路に沿って伸びる。

好適な実施Ｂｔａにおいて、マトリックスはポリアンヒドリド、ポリオルトエス テルまたはポリグリコール酸のような生物吸収性または生物分解性合成ポリマー から成り、その構造は第２図で示される。いくつかの実施ｕ様では、ポリマーへ の細胞の付着は、基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン。

アラビアゴム、コラーゲン１．　Ｉｆ、　Ｉ［［、ＩＶ、およびＶ型、フィブロ ネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、それらの混合物、および細胞培養 の技術分野の当業者に公知の他の物質のような化合物でポリマーを被覆すること により促進される。インビトロでの研究のために、増殖中の細胞の最終的な性質 に依存して、ポリメタクリレートおよびシリコンポリマーを含有する非生物分解 性ポリマー物質を用いることができる。非分解性物質は、細胞間の反応（習性、 伝達、制御および形態形成）の理解のような、移植以外の目的ために細胞を培養 で増殖させる場合に特に有用である。なぜならば、好適なマトリックス構造は２ 通常拡散によってのみ栄養物が供給されるよりも、固定された細胞密度をより高 （することが可能であるからである。

本発明に用いられる全てのポリマーは、その後の細胞の成長および増殖に適当な 支持を与えるのに必要な９機械的および生化学的なパラメーターと適合しなけれ ばならない、ポリマーは、インストロンテスター（Ｉｎｓｔｒｏｎ　ｔｅｓｔｅ ｒ）を用いた引張力、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリマー分 子量、示差走査型熱測定（ＤＳＣ）によるガラス遷移温度および赤外（ＩＲ）分 光法による結合構造のような機械的特性に関して；エイムス試験およびインビト ロでの催奇試験を包含する最初のスクリーニングテストによる毒性、ならびに免 疫原性、炎症、放出および分解の研究についての動物での移植研究に関して特徴 づけることができる。

インビトロでの細胞付着および生存能力は、走査型電子顕微鏡９組織学、および 放射性同位元素を用いた定量評価を用いて評価され得る。

ポリマーの足場の構造は、移植された実質成分に新しい血管がかたくからみ合っ て細胞の成長９組織化、および機能を支持するようになるまで、拡散によって細 胞が養分を与えられるのに十分な表面積をもつ必要がある。細胞の単層にシード されたポリマーディスクおよび分枝状繊維網状体の両方がこれらの要求を満す。

現時点では繊維状構造が好適である。この繊維は円形、扇形、平板、星形であり 得、単独または他の繊維とのからみ合わせであり得る０分校状繊維の使用は同じ 原理に基づいており、その性質は容量の増加に比例して増加する表面積の問題を 解決するために用いられている。全ての多細胞生物は、このくり返される分枝構 造を利用する。分枝基は２個々の器官の機能単位と同様に、器官間の連絡網を示 す、この構造物を細胞とともにシードおよび移植すると、各々が宿主の環境にさ らされているば（大な数の細胞の移植を可能にし、新しい血管形成が起こる間の 栄養物および老廃物の自由な交換を与える。

本発明方法を第１図に図解する。要求される器官機能を与えるために必要な細胞 １０の型は、提供者、被移植者、または細胞培養系から得ている９例えば、肝臓 、腸または膵臓細胞の懸濁液１２を調製し、ポリマーマトリックス１４にシード する。

細胞−ポリマーの足場１６を至適条件下で適当な時間培養する。

次いで、この細胞−ポリマーの足場１６を移植する。失われた肝臓機能を与える ための器官の例では、器官を新しい血管形成の源として作用する肝門循環系に隣 接する網の中に移植する。任意に部分的な肝切除を行い、細胞の再生を刺激する 。

適切な血液供給に加えて、肝門循環系からの“肝栄養”因子が肝臓の再生を促進 する。膵臓の血液から供給されるインシュリンのような因子が、特異的に再生過 程を促進するということも考えられる。あるいは、栄養物、増殖因子２分化また は脱分化の誘導物質１分泌産物、免疫調節物質、炎症の阻害物質、退化因子、リ ンパ管網状組織または神経繊維の内部への増殖を促進または許容する生物学的活 性化合物、および薬剤を包含するこれらの因子は、第３図で図説されているよう にマトリックスの中に取り入れることができるか、またはマトリックスと結合さ せて与えることができる。

第１図で示された分校状繊維１４は、直径３０ミクロンおよび長さが１．Ｏｃｒ ａのとき、理論的には１２５　、０００　、０００個の細胞を支持できる。肝臓 器官が構築される例では、細胞集団は肝細胞および胆管細胞を含むことができる 。細胞は、宿主、関係のある提供者または確立された細胞系から得ることができ る。

胎児の細胞系は、該細胞が一般に他の細胞系よりも丈夫であるので利用され得る 。

１つかまたはそれ以上の細胞系の付着に対しｔ単一のマトリックスを用いた方法 の１つの変形では、各々の集団について最初の細胞付着および増殖がマトリック ス内で別々に起こるように足場が構築される。あるいは、特異的な位置で種々の 型の細胞の付着を最適化するために、単一の足場を異なる物質から形成し得る。

付着は細胞型とマトリックスの成分の両方の機能である。

ここでの好適実施態様は、宿主に移植される単一細胞−マトリックス構造を利用 することである。しかし、１つ以上の細胞−マトリックス構造を使用するのが望 ましい状況があり得２機能する３次元器官構造を異なる細胞−マトリックス構造 から形成するために、各々は付着した細胞の増殖のための最適時間で移植される 。い（つかの状況では、生物分解性ポリマーマトリックス（周囲の開業細胞の修 正を誘導してより未発達にさせる化合物または“脱分化物質”を含む）のある部 位に、最初に細胞をさらすことにより移植部位を調製することが望ましいことで あり得る。その後、移植された細胞マトリックス構造は、それがより成熟した細 胞にかこまれているよりも胎生の環境においてより正常に発生し得る。

上述の機能的な肝臓型の器官の設計、構築、および移植に対する技術および材料 を適用して、胆管上皮細胞をシードした長くて固い繊維を肝細胞をシードした構 造物に挿入することを始めた。移植およびポリマーの分解後、胆管細胞は所望の 位置へ胆汁を放出するための適当な接続を形成した。血管の供給、リンパ管網状 体、および神経細胞の内部への増殖を促進することができた。付着した肝細胞お よび胆管上皮細胞の両方をもつ組み合わせのポリマー−細胞の足場を、大腸間膜 の後方に位置する後方腹膜の中に移植することができた。

胆管導管の伸長を大腸間膜を通って空腸の辺縁の中にまで進めることができ、胆 管ドレナージを空腸または上方の腸の中に入れることができる。血管形成、細胞 −細胞の再組織化。

およびポリマーの再吸収が起こると、肝機能が置き換えられ。

胆汁の流出が始まって腸の中に進んでい（、この位置は、血管が供給されるので 、いくつかの潜在的な利点を有する。

“肝栄養”因子が肝門循環系から生じて、再生のために肝臓に供給されているこ とが知られている。脈管形成は、これらの移植された肝細胞への流入物としての 肝栄養因子の源として知られている膵臓に直接に隣接している門脈床から起こり 得る。流出物は半奇系を通り全身的な循環系に流れる腹膜後の副行血管を通り得 る。もしこれが起こると、末期段階の肝ｌ１ＩＩＩＩ害の患者の胃腸の出血を導 （合併症である肝門の高血圧の減少を許容する移植肝ｌ１ｖｉＩＩＩ胞を介した 門脈体静脈チャンネルになる。

元の肝臓は構造的に正常であり、胆汁を流出させることができる代謝的肝臓疾患 の場合には２足場上の適当な肝細胞を被移植者の肝臓の中に直接置くことが出来 る。この肝臓内移植は正常な宿主胆管系に関して起こる。その後９元の肝臓は患 者の細胞と患者の胆管樹の中に流れ込んだ被移植者の細胞のキメラとなる。

この方法を成功させるために、インビボおよびインビトロの両方で移植細胞の機 能を測定しなければならない、インビボでの肝機能の研究は、被移植者の総胆管 の中にカニユーレを置くことにより行われり得る０次いで、胆汁の増加分が回収 できる。胆汁色素は、非誘導体のテトラピロールを検索する高圧液体クロマトグ ラフィーによるか、またはβ−グルクロニダーゼでの処理を伴うかまたは伴わな いジアゾ化アゾジピロールエチルアンスラニレートとの反応によりアゾジピロー ルに変換し、その後薄層クロマトグラフィーにより分析できる。２重結合および 単結合のビリルビンもまた。結合した胆汁色素のアルカリ性加メタノール分解後 に薄層クロマトグラフィーにより測定できる。一般に、多数の機能する移植肝細 胞を移植すると、結合したビリルビンのレベルが増加する。

単結合および２重結合したビリルビンを測定する同じ方法が。

これらのビリルビン結合物のレベルについて培地をテストすることによりインビ トロで実施し得る。類似の器官の機能研究を、細胞培養中および移植後の両方の 細胞機能の拡張を測定するのに必要とされるような、当業者に公知の技術を用い て行うことができる。

移植片を形成するための条件を最適化するために、一旦インビトロおよびインビ ボでの機能を確かめて、構造物の形態形成への研究を開始することができる。採 取されてきた胆管上皮細胞を、ポリマーの足場にシードすることが出来る０次い で、この足場に、肝細胞を再びシードすることができる。

第４図に略図で示した細胞−細胞の相互作用は、光学顕微鏡。

透過型顕微鏡および走査型電子顕微鏡のための組織学的切片と同様に１時間差顕 微ビデオ法によりインビトロでモニターすることができる。

タンパク分析を用いる研究と同様に、ポリマーの足場上の細胞量を定量するため に、標識されたグルコースを用いた研究を行うことが出来る０次いで、細胞量に ついてのこれらの研究は、適当な細胞量がどれだけであるかを決定するために。

細胞機能の研究と関係づけることができる。

以下の実施例は、細胞培養における生物侵食性の人工ポリマーへの細胞調製物の 実際の付着、および動物へのこのポリマー−細胞の足場の移植を示す、細胞を採 取する標準的技術を用いて、単一の細胞ならびに胎児および成体のラットおよび マウスの肝細胞、膵臓の島細胞、および小腸のクラスターを、生物分解性のポリ マーであるポリグラフチン９１ｏ、ポリアンヒドリド、およびポリオルトエステ ル上にシードしている。６５匹の胎児および１４匹の成体の動物を供与体とした 。１１５個のポリマーの足場を７０匹の被移植動物に移植した８６６個は肝細胞 とともにシードし２２３個は腸細胞およびクラスターとともにシードし；そして 、２６個は膵臓の島調製物とともにシードした。細胞は培養において生存能力を 残存しており、胎児の腸および肝細胞の場合には、ポリマー上にある間増殖して いた。培養４日後に、細胞−ポリマーの足場を２宿主動物内の網、層中骨間の脂 肪バッド、または腸間膜のいずれかに移植した０部分的肝切除と組み合わせた胎 児の腸移植の３つの場合では、網における移植が成功し、この場合のうちの１つ は目視できる６、０ＩｎＩ１１の嚢胞を形成していた。肝細胞移植の３つの場合 （１つは成体の細胞を用い、２つは胎児の細胞を用いて移植された）も、肝細胞 の生存性９分裂像、および細胞塊の血管形成を示す。

（以下余白） 甘ｌ」−ばＬ友汰 ポリマー類： ３種の吸収性合成ポリマーが、細胞の付着、増殖および移植のためのマトリック スとして使用されるフィラメントおよびディスクを製造するのに用いられた（第 ２図）。

１、ポリグラフチン、このポリマーは、吸収性を有する合成縫合糸材料として開 発され、グリコリドおよびラクチドを９０　：　１０の割合で有するコポリマー である。これは、　Ｖｉｃｒｙｌ！１ｇ成吸収縫合糸として製造されている（１ ！ｔｈｉｃｏｎ　Ｃｏ、、Ｓｏｓ＋ｅｒｖｉｌｌｅ＋Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）　 （Ｃｒａｉｇ　Ｐ、Ｈ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｊ、Ａ、、Ｄａｖｉｓ　ＬＷ、ら　 ：ポリグラフチン９１０およびポリグリコール酸吸収性合成縫合糸の生物学的比 較、伽」Ｌ１４１：１０１０（１９７５）　）　。

２、ポリオルトエステル、使用された特殊なポリマーは。

３．９−ビス（エチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピａ　（５，５ ）ウンデカンと、　ｔｒａｎｓ　−Ｌ　４−シクロヘキサンジメタツールと、１ ，６−ヘキサンジオールとの９モル比２：１：１のコポリマーである（ＳＲ１， Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）（Ｗｅｌｌｅｒ　Ｊ−＋　ＰｅｎｈａｌｅＷ、Ｈ，、Ｈ ｅｌｗｉｎｇ　Ｒ，Ｆ、ら：ポリアセクールおよびポリオルトエステルからのノ ルエチンドロンの放出　ＡＩＣｈＥ　Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ＋２０ ６：７７、ｐｐ、２８−３６（１９８１）　）　。

３、ポリアンヒドリド、使用された特殊なポリマーは、ビス（１，４−カルボキ シフェノキシ）プロパンとセバシン酸とのコポリアンヒドリドである。これは、 生物適合性であり。

薬剤供給の応用に広（利用されている（Ｈｅｉｆｅｒ　Ｊ、、　Ｐｅｎｈａｌｅ ％ｄ、Ｈ，、Ｈｅｌｓｎｉｎｇ　Ｒ，Ｆ、ら：ポリアセクールおよびポリオルト エステルからのノルエチンドロン（Ｎｏｒｅｔｈｉｄｒｏｎｅ）の放出）　、　 ＡＩＣｈＥＳ　ｔａ　ｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ＋　２０６：７７、ｐｐ、２８ −３６．１９８１：　Ｌｅｏｎｇ　ＫＪ、、Ｄ”Ａｉ＋ｏｒｅＰ、　Ｍａｒｌｅ ｔｔａ　Ｍ、ら：薬剤キャリアマトリックスとしての生物腐食性ポリアンヒドリ ド、■、生物適合性および化学反応性。

Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔ、Ｒｅｓ、　２０：５１．１９８６：　Ｄｏｍｂ　Ａ 、Ｊ、、Ｌａｎｇｅｒ　Ｒ，：ポリアンヒドリド　！、高分子量ポリアンヒドリ ドの調製、Ｊ。

Ｐｏ１ｙ、Ｓｃｉ、　（印刷中）　、Ｋｏｐａｃｅｋ　Ｊ−＋Ｕ１ｂｒｉｃｈ　 Ｋ、：生物医学的ポリマーの生物分解ｅｈＩＬヱｏｌ　、Ｓｃｉ、９：１（１９ ８３，および参考文献中）。

ポリマーの構造： ポリグリコリドは、製造者により供給されたものを使用した。ポリアンヒドリド およびポリオルトエステルの小さな薄いディスクまたはフィラメントは９次の方 法のうちのひとつを使って製造した。

Ａ、溶媒を用いたキャスティング：塩化メチレンを用いた１０％ポリマー溶液を 、直径１０ｍｍのディスクの形状を有する枝分かれしたパターンのレリーフ構造 物に流し、カバープレスを用いて２５℃で１０分間保持した。溶媒を蒸発させる と、その表面に枝分かれしたパターンが彫り込まれた厚さ０．５■のフィルムが 得られた。

Ｂ、圧縮成形法：直径が１０ｍ＋＋、厚みが０．５ｍａ＋で、技分かれしたパタ ーンのレリーフを有するディスク中に１００■のポリマーを入れてｓ　３０，０ ＯＯｐｓｉで圧縮した。

Ｃ，フィラメントの引き伸ばし：フィラメントは、溶融したポリマーから引き伸 ばして製造された（直径３０ミクロン）。

平らにしたＩｃ１１の小さな房がこの実験で使用された。

Ｄ、ポリグラフチン９１０：グリコリドおよびラクチドが９０：１０の割合であ るコポリマーでなり、共通の基部に収束している多数の繊維は＋　Ｑ−Ｖｉｃｒ ｙｌ”の縫合糸材料からポリマーのよりあわせた端部をほぐすことにより、形成 した。これらの枝分かれした繊維の房は約１ｃｍの高さであった。それぞれの繊 維は直径３０ミクロンであった。

動物： すべての実験において、スプラーグードーリーラットとＣ５７Ｂ１ノロマウス（ Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｓ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の若い成体および胎児を、細胞提供体として使用した。こ れらの動物は１匹ずつ個々に飼育し、飼料および水が任意に摂取し得るようにし 、１２時間間隔で光を与え、そして暗くした。

ペンドパルビクール（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ、　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ 、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）を０．０５■／ｇの用量で動物に腹腔（ＩＰ）内投与し て麻酔をかけ。

メトキシフルラン（Ｐｉｔｗａｎ−Ｍｏｏｒｅ＋　Ｉｎｃ、、　Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ　Ｃｒｏｓｓｉｎｇ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）をコーン（ｃｏｎｅ）投与により補充した。胎児動物は 、妊娠１３．１７．２０日目において、肝臓、膵臓および腸を提供体として使用 するために回収された。若い成体の動物は。

肝臓および膵臓の提供体として、そして細胞の足場となるマトリックスの被移植 体として使用した。

の　と　立 肝Ｅｉｉ： 麻酔を行った後、若い成体動物の腹部の毛をそって、ベタジンで処理し、無菌的 に腹部を開いた。肝臓を分離し、　１００Ｕのヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ−５ｉｎ ｎ、Ｉｎｃ、＋Ｃｈｅｒｒｙ　Ｈｌｌｌ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）でヘパリン化 し、門脈に、２３ゲージのプラスチック■カニユーレ（Ｃｒｉｔｉｋｏｎ＋Ｉｎ ｃ、、Ｔａ５ｐａ＋　Ｆｌｏｒｉｄａ）を挿入した。小さい大動脈は、横に切開 し、肝臓を滅菌生理食塩水２〜３ｃｃで洗浄し、そのちとあった場所から除去し 、セルゲンの方法（Ｓｅｌｇｅｎ。

Ｐ、Ｏ，：ラット肝細胞の調製１１１１１組織分散における酵素要求性、シ」」 １１Ｌ且邦１８２：３９１．１９７３）の修正法により、　０．０２５％のコラ ゲナーゼ■型（ＢＣＡ／Ｃａｐｐｅｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ　Ｃｈａｓ ｔｅｒ。

Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）酸化溶液を散布した滅菌シャーレに移した。

２０分間潅流した後、細胞の分散と細胞培養のために肝臓を滅菌フードに移した 。

肝細胞の採取には２段階のコラゲナーゼ潅流法を利用した。

インビボでの肝臓の潅流は、パルス的な潅流よりもむしろ１分間あたり３０〜４ ０！Ｉ１１”の潅流液の連続的な潅流により行われるべきである。最初に収穫し た２〜３Ｘ１０”個の肝細胞のうち、１０〜２０％の細胞が生存していたのが、 連続的な流れを供給するぜん動性のポンプに切り換えることにより４〜６Ｘ１０ ’個の細胞を収穫し、８０〜９０％の生存率を示すようになった。

種々の緩衝液についてもその効果を試験した０例えば、　ＨＥＰＥＳ緩衝液は、 潅流液の酸性度を減少させるために使用された。

培養物中の肝細胞ポリマーの足場にカビ類または細菌類が混入しないように、肝 細胞の単離および潅流の両者において無菌操作を行った。抗生物質もまた。コラ ゲナーゼ潅流溶液に添加した。

胎児動物は、妊娠の適当な時期における妊娠動物からの子宮の角状器官を分離し 除去することにより得た。複数の胎児がいる無傷の子宮を生理食塩水に入れ、こ れを解剖顕微鏡のそなえつけられた無菌室に移した。個々の胎児を切開し、肝臓 、腸および膵臓を回収し、プールした０次に、器官を、細胞分離のために滅菌フ ードに移した０組織は細かく裁断し。

０．０２５％のコラゲナーゼ■型で処理し、細胞懸濁液として分散させた。

膵ｌｌ： 麻酔をかけた後、若い成体動物の腹部の毛を剃り、ベタジンで処理し、無菌的に 腹部の中央を切開した。総胆管を単離すると、膵臓があられれた。　Ｇｏｔｏｈ らが述べた手法を使用し。

２．５ｃｃの２．０％コラゲナーゼ■型（ＢＣＡ／Ｃａｐｐｅｌ　Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）を、総胆管中に 注射することにより。

膵臓に注入した（Ｇｏｔｏｈ　Ｍ、、　Ｍａｋｉ　Ｔ、、　Ｋｉｙｏｚｕｍｉ　 Ｔ、ら、マウス牌島分離の改良法、　Ｔｒａｎｓ、　４０；４．ｐｐ、４３６− ４３８．１９８５）、　５分後に、膵島細胞を分離するため、膵臓を滅菌フード へ移した。

簡単に説明すると９組織を２５％フィコール溶液中に浸漬し。

これが不連続なフィコール密度勾配（２３，２１，１１％）層の下になるように し、８００％ｇで１０分間遠心分離を行った。２１〜１１％の界面に集まる小島 を冷バンク溶液で洗い、３２０％ｇで３回遠心分離した。小島を１０％の胎児ウ シ血清が添加されたＲＰ）ＩＩ　１６４０　（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ ａｎｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）培地に再懸濁さ　゛せ、ポリマーの足場上にのせた 。胎児動物は上述のように。

供与体として回収した。

腸： 胎児動物の腸は、上述のように得た。

ポリマー−細胞の足場および移植： １ｘｉｏ’〜ｌＸｌ０’個／ｃｃの懸濁液中の細胞をポリマーマトリックス上に プレートした。そしてそれを、１０％の胎児ウシ血清を添加したＣｈｅｅ培地中 に、１０％Ｃ島の雰囲気下で３〜４日間保持した。移植直前の足場における細胞 の生存性を。

トリバンブルー排除法により評価した。若い成体スプラーグードーリーラットを 麻酔し９手術する場所の毛を沿って、ベタジンで処理した。

ポリマー−細胞の足場を１次の３つの場所のうちの１つに移植した： １）肩甲骨の脂肪部分： ２）網；および ３）腸間膜。

はとんどの動物は、細胞増殖を刺激するため９部分的な肝切除を行った。動物を ３．７．または１４日目に殺し、ヘマトキシリンとエオシンとで１組織学的に移 植体を調べた。細胞のないポリマーをコントロールとして使用した。ポリマー− 細胞の足場を、培養４日後および移植前に組織学的に調べ、細胞の付着と生存性 とを評価した。

細胞−マトリックス構造を調べるために、以下の方法をまた。使用した。

免疫螢光染色：細胞−ポリマーの足場を含む組織を、液体イソペンタンに浸漬す ることにより凍結させ、冷凍庫に一７０’Ｃで保存し、アルブミンでコーティン グしたスライド上に固定した。１５〜３０分間室温で解凍した後、スライドをリ ン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。市販のフルオレシン　イソチオシ アネー）　（ＦＩＴＣ）でラベルされた抗血清によりラベルされた適当なモノク ローナル抗体（例えば、Ｈｖ抗原または肝細胞膜の他のマーカーに対するモノク ローナル抗体）を適当に希釈し、その数滴を個々に１分離した水性生検区画に滴 下した。そして、それらを３０分間にわたり室温で温室中でインキユベートした 。　ＰＢＳで洗浄した後、それぞれの区画を、グリセラルーＰＢＳ混合液でカバ ーし、光源として落射照明と高圧水銀ランプとを有する免疫螢光顕微鏡を使用し て調べた。

（以下余白） 電子顕微鏡検査法：を子顕微鏡検査のための試料を、新鮮な組織から得、そして ２％グルタルアルデヒド中で固定し。

次に１％オスミウムテトロキサイド中で後固定し、濃度を段階的に変化させたア ルコール中で脱水し、そしてエポン８：１２中に包埋した。プラスチックに包埋 された組織の１ミクロンの厚みの断片を、所望の領域から調製する０選択した塊 を。

整え、超薄層断片を作成し、そして酢酸ウラニルとクエン酸鉛とで染色し、そし てフィリップス３００Ｘ電子顕微鏡で検査する。

走査電子顕微鏡検査法（ＳＥＭ）　：肝細胞を分離し、適当なポリマーに付着さ せた後、それらを適当な間隔で培養する。培養後、２％グルタルアルデヒド−リ ン酸緩衝液の５０　：　５０溶液中で１時間インキヱベートして試料をＳＥＭの ために調製し。

その試料を次に、過剰のグルタルアルデヒド溶液を取り除くために１０分間にわ たり、ＰＢＳ中で４回洗浄した。試料を、エタノール溶液を用い、その濃度を徐 々に高くしながら脱水した。次にエタノールを液体ＣＯ□と交換する臨界点乾燥 機中に。

試料を置いた。温度を臨界点にまで徐々に上昇し、脱水を確実にする。そして試 料を、金の薄膜で覆い、そして走査電子顕微鏡の高真空下におく。

１４体の成体と６５体の胎児とを含む７９体の動物を、細胞を獲得するための供 与体として用い、１１５個のポリマーの足場を。

移植のために調製した。これらの足場の６０個に肝細胞をシードし、２３個に腸 細胞とその塊を、そして２６個に膵島と細胞調製物とをシードした。移植は７０ 匹の受容体動物に行われた。

５８匹は、移植組織片の組織構造の検査のために７日目に殺し。

３匹は移植後３日目に、そして９匹は１４４日目調べられた。

培養３日から４日目におけるポリマーの足場での細胞生存率は、使用したポリマ ー材料のタイプにより異なった。第５図は、４日間培養したときの、ポリマーマ トリックス上の肝細胞を示す、第６図は、１ケ月間培養したときのポリマー繊維 上の胆汁管上皮細胞を示す、第８図および第９図は、１週間培養したときのポリ マー繊維に付着した肝細胞を示す、細胞の１０％未満が、ポリアンヒドリドディ スク上で生存した一方、ポリオルトエステルディスクおよびフィラメント上で培 養した細胞の８０％が生き残り、そしてポリグラフチン９１０上では９０％を越 える細胞が生き残った。

培養３週間のポリグラフチン繊維上の肝細胞により、有意な増殖の証拠が示され た。それは、細胞集団中に点在する断片的な繊維で１〜３■の直径の手痛の形成 により示される。

血管の内部成長が、すべてのタイプおよび構造のポリマーにおいて、移植後３日 目で確認された。移植された繊維網状組織中で、新しい血管が、ポリマーフィラ メントの裂は口中に形成された。そのポリマーディスクは、ポリマー材料に隣接 する毛細管の形成を示した。この血管形成性の応答は、移植されたポリマーに対 する炎症性の（急性のおよび慢性の異物反応の両方を示す）浸潤を伴った。炎症 の強度は、試験されたポリマーのタイプによって異なった。宿主に対して外来物 質がより広い表面領域においてさらされるため、ポリオルトエステルまたはボリ グラクチンの技分かれした繊維をとり囲む炎症が、ディスク形状よりも比例的に 大きいようであったが、ポリアンヒドリドが、最も激しい急性および慢性の応答 を引き起こした。

３動物における肝細胞移植物の組織学的な検査により、第７図に示されるように 、７日目で肝細胞の成功裏の移植の証拠が示された。健康に見える肝細胞の小さ な集団が、隣接する細胞膜および有糸分裂の形態を示しているいくらかの領域の 間で胆汁小管とともに観察された。その細胞は、炎症反応に取り囲まれ、そして 血管が、その細胞集団中や周囲に存在した。ポリマー材料は、細胞にちょうど隣 接するように観察された。

腸細胞および集団（クラスター）の成功裏の移植が、３動物で観察された。組織 学的な知見は、肝細胞の移植物に類似していた。７日目の移植物の全体の調査で 、長さ約６．０ＩＩ１１１１の嚢胞の構造物が、その壁内で示されるポリマー繊 維とともに移植部位で見い出された（第１０図）、第１１図で示されるように、 電子顕微鏡での調査により内腔内によく分化した腸上皮細胞（粘性のセルデブリ スによって腔をライニングしている）が見い出さた。ポリマー繊維、血管、そし て炎症細胞を含む嚢胞の１つの壁は、腸上皮細胞に直接隣接する。他の壁は。

筋肉のコーティングを含んでいた。これは、小さな細かくきざんだ胎児の腸の切 片を、最終的に発達した嚢胞の源として。

そのポリマーが有することを示唆する。その嚢胞は、充分に分化した腸上皮細胞 および粘性の分泌をする細胞を示した。

腸上皮細胞の他の集団は、活発な有糸分裂を示した。

移植に先立って、細胞をシードすることなしに移植した対照のポリマーは、それ らに対応するもの（柔組織の細胞とともにシードされ培養物で保持されたもの） と同様の血管由来のおよび炎症性の反応を誘導した。これにより、その細胞自身 は、その炎症および観察される新しい血管形成に主な役割を果たしていないこと が示唆された。もし、適当であるならば、免疫抑制の薬剤を、注入することまた はポリマー構造中に取り込ませることが可能である。しかし、その移植物に対す る制限された炎症反応は、実際、成育を促進するのに好ましいかもしれない、こ れは、より正常な治癒応答を促進し。

そして新しい血管の“呼び出し”の役割を果たし得る。

供与体自身の細胞、または培養する前にリンパ細胞がとり除かれた細胞を使うこ とが、腸細胞の培養および移植に特に重要である。もし移植前にリンパ細胞が腸 細胞からとり除かれなければ、そのことにより“移植片対宿主”病が引き起こさ れる０本発明では２機能に必要とされる細胞のみを、ポリマー上に載置し、これ を患者に移植するので、この可能性は減少する。

成功裏に連続して培養されその機能を保持する他のタイプの細胞には、膵臓細胞 および大動脈細胞が包含される。第１２図は、培養４週間のポリマー繊維に付着 した膵島の写真であり、グルコースに応答してインシュリンをいくらか分泌する のが示されている。第１３図は、バイオマトリックス中にウシ大動脈内皮細胞が シードされたポリマー繊維の写真である。

その細胞が、小技のような方向性でマトリックスの中ヘポリマーを離れて移動す るのが見られる。第１４図は、培養１ケ月後のポリマー繊維に付着したウシ大動 脈の内皮細胞の写真である。これらの細胞は、構造を再生するように見られる。

上記細胞のそのようにしようとする能力は、それらが置かれた環境とそれらが受 けた改変の程度に依存する。第６図に示すようにインビトロで小管を形成する胆 汁管細胞に加えて、ポリマー繊維に結合した大動脈内皮細胞は、培養１ケ月後に 分校した小管構造を形成した。ポリマー繊維が再吸収するとき。

その細胞は、それらの方向性を維持した。そのことは、それらが自身の幾何学的 構造を保持するためそれら自身の新しいマトリックスを分泌することを示す。

第１５図は、マウス胎児の繊維芽細胞で覆われたポリマー繊維を示す位相差顕微 鏡写真である。繊維芽細胞は、培養皿上で直線上となっているポリマー繊維をそ れて流れ出るように見られ得る。このことは、細胞−細胞間の方向性の指示が。

ポリマー繊維をはなれて移動するときに維持されたことを示す。

第１６図は、マウス胎児繊維芽細胞で覆われたポリマー繊維の位相差顕微鏡写真 である。これらの胎児繊維芽細胞は、培地を通してポリマーをはなれて移動し、 そして組織培養プレートの底に結合していた。このことは、生きている組織の架 橋が胎児繊維芽細胞によりポリマー繊維と培養組織の底との間で作り出されたこ とを示し、そのことは、それらの空間的な結びつきを示している。

これらの研究は、肝臓、腸、そして膵臓の細胞が細胞培養においてポリマー上に うまく結合し、そして生存し得ること。

そして肝臓および腸の細胞が宿主動物中にうまく移植されることを証明する０次 の方法がポリマーへの細胞結合の最適化を証明するために用いられ、これには肝 臓および膵臓がモデルシステムとして使用された。

非定量的な細胞の結合の研究が行なわれ、その方法においては、結合の研究のた めのモデル細胞としてＮ、１．Ｈ，３Ｔ３細胞を用いた。試験されたポリマーに は、ポリグラクチン、ポリオルトエステルおよびポリアンヒドリドが含まれてい た。結合の研究は、膵島細胞について行なわれた。

（以下余白） ｆ」コＬ二ＩＩＬ！ ポリグラフチン９１０．ポリオルトエステルおよびポリアンヒドリドの表面コン フォメーシッンを変化させる目的のため。

これらのポリマーを数種類の異なる緩衝液で処理した後、ａｉ胞付着に重要であ ると考えられる物質でおおった。それぞれのポリマーはクエン酸緩衝液（ｐＨ４ ，０）　、リン酸緩衝溶液（ｐＨ７，０）、または炭酸緩衝液（ｐＨ１０，０） に浸漬することによりテストした。これらを３７℃で２日、５日または７日間イ ンキュベートした。ポリマー物質の表面特性は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によ る５００倍および１７００倍の拡大像によって特徴づけた。

被覆用材料は次のものを包含した８２％および５％の寒天溶液；２％、６％およ び７％のアガロース溶液；１．５％および１１％のゼラチン；そして１．５％お よび１１％のアラビアゴム。

被覆物は、適当重量の材料の脱イオン水溶液を調製し、３０分間オートクレーブ することにより調製した。溶液は使用するまで４０〜５０℃の温水浴中で液体の 状態に保たれた。各ポリマーを適当な被覆物質に無菌的に浸漬した。ゼラチンは ２％グルタルアルデヒドニリン酸緩衝液（５０：５０）で１時間にわたり架橋さ せた。ゼラチンとアラビアゴムとを使用した複合被覆物質をテストした。コラー ゲンでおおわれたポリマーは。

ポリマーを■型コラーゲンで被覆し、このポリマー−コラーゲン材料を一晩凍結 乾燥することにより調製された。コラーゲンでおおわれたサンプルの幾つかは、 リン酸緩衝液に１時間浸漬した。サンプルはすべてはＳＩＪを用いて被覆の均一 性を調べた。サンプルはすべて無菌フード下で８〜１２時間のＵｖ照射により殺 菌を行なった。次に、細胞を加えて、細胞付着の実験を行なった。

■胞豆ｌ豊裏肢 細胞ポリマーのサンプルは、下記のサンプル調製手法を使用し９位相差顕微鏡検 査法と５ＩＪＩとでテストした。サンプルは２％グルグルアルデヒドニリン酸緩 衝液（５０：　５０）に１時間浸漬することによって固定化し９次にリン酸緩衝 液で２０分間にわたりすすぎを３回行った。次に、これらのサンプルを。

次第に濃度を増加させたエタノール（７０％、８０％、９０％、９５％）にそれ ぞれ２０分にわたり浸漬して、脱水させ、無水エタノールに一晩浸した後、液体 ＣＯ□を用いて臨界点乾燥法で乾燥し、金で被覆した。

の　−と゛　′１ 若い成体マウスに麻酔をかけ、腹部を正中線に沿って無菌的に切開した。総胆管 を分離し、３０ゲージの針をこれに挿入した＊　２．５　ｃｃの■型コラーゲナ ーゼを総胆管を通して注入した。このとき十二指腸をクランプで締めておき、膵 管中への逆流が起こるようにした０次に、膵臓を取り出して、３７°Ｃにて４５ 分間、コラ−ゲナーゼで消化した。次に膵臓を冷バンク溶液で洗浄し、膵臓組織 をナイロンメツシュフィルターを通した。次に、不連続的なフィコール勾配を用 いて、膵島を分離し、これを冷バンク溶液で洗浄し、そして１０％胎児ウシ血清 を添加したＲＰＭ１１６４０培地に再懸濁させた。膵島を適当なポリマーを含有 する２４ウエルのプレートにｔｔＸし、３７°Ｃにて。

１０％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。

Ｎ、！、）１．３Ｔ３細胞は細胞付着の他の実験のための細胞系列として用いた 。

第１７図はリン酸緩衝液に浸漬したポリアンヒドリド繊維の走査電子顕微鏡写真 （４７２倍）である。この写真により、ポリマー繊維を異なる緩衝液に浸漬する とポリマー表面が変化し。

従って、細胞の付着と分化とに影響をあたえることがわかる。

第１８図は１％ゼラチンでおおわれたポリマー繊維の走査電子顕微鏡写真（４９ ３倍）である。この写真により、ポリマー繊維が既知の細胞粘着剤で被覆される と細胞付着を促進し得ることがわかる。

表１は、培養５日後の３Ｔ３細胞の　Ｖｉｃｒｙｌ”への付着を示す、ポリマー が１１％ゼラチン、コラーゲン、およびコラーゲン−リン酸緩衝液で被覆された ときに最大の付着が認められた。表■は、２日後と５日後の３７３１胞のポリオ ルトエステルへの付着を示す。２日後に、架橋１１％ゼラチン−１１％ガムでコ ートされたポリマーへの最大の付着が認められた。５日後に、架橋１１％ゼラチ ンでコートされたポリマーへの最大の付着が認められた。ｐＨが細胞付着に影響 を与えるのがわかった。ｐＨ７のとき５日目に、そして、　ｐＨ１ｏのとき２日 目に最大の付着が起こった。表■により、３Ｔ３細胞のポリアンヒドリドへの付 着を実証している。最大の付着は、被覆されていないポリアンヒドリドにおいて ２日後に起こった。ポリマーが分解するため、この表に挙げられたリスト以外の ポリマーについては研究しなかった０表■は、２週間培養後の膵臓細胞（膵島お よび繊維芽細胞）のＶｉｃｒｙＮ’への付着を示している。

最大の付着は、架橋されたあるいは架橋されていない１１％または１．５％のゼ ラチンおよびコラーゲンでおおわれているポリマーで起こった。ポリオルトエス テルおよびポリアンヒドリドへのこれらの細胞の付着は非常にわずかしか観察さ れなかった０表Ｖは、２週間培養後、膵島細胞の付着を示し、最大付着は、また 、コラーゲンでおおわれたポリマーにおいて起こることがわかる。

（以下余白） ｌ上 ５日間培養後における３Ｔ３細胞のＶＩＣＲＹＬ”への付着麦エ ポリオルトエステルへの３Ｔ３細胞の付着１口１ ポリアンヒドリドへの３Ｔ３細胞の付着尺度 Ｍ Ｌ ２週間培養後のＶＩＣＲＹＬ”への膵島細胞の付着尺度 本発明方法は非常に多目的なものであり、かつインビボおよびインビトロの両方 において有用である０例えば、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ　）に包埋された ポリマー繊維上の細胞は２インビトロにおいて三次元器官構造物をつくり出すの に使用され得る。インビボにおける通用においては、ポリマー構造物を細胞に適 合するようにつくっておくと、移植後に細胞の所望の機能と構造とが得られ、し かも、細胞培養において細胞の増殖９分裂および機能が早い時期に達成され得る 。増殖および移植が成功裏に行なわれるという指標は、移植物が、それにとって 代わるべきあるいはそれを補充すべきである器官と同等の機能を示す場合をさし ていう０例えば、腎臓は、効果的な透析器官として、血流中に濃縮された低分子 量物質を除去する機能が働いている限り、レニンをつくる必要はない。

機能する肝臓は、凝固因子のようなタンパクの生産および胆汁の排出のみを必要 とするであろう。この目的のため、肝臓の移植片は小腸に隣接する網、脂質性高 血管性膜に移植され得る０機能する腸は、生命維持のため、充分な栄養物を吸収 することができる。この栄養物は通常の“食物”よりもむしろカロリー溶液状態 で存在し得る。

肝臓または膵臓に加えて、“分泌”器官が同様の方法を適用して調製され得る。

その方法においては１分泌細胞を選択し；マトリックスを作成し；そのマトリッ クス上で細胞を培養し；そして、細胞−マトリックス構造物を、該細胞−マトリ ックス構造の血管形成を促進すべき場所へ移植する。

第１９図に示すように分泌器官以外の゛′器官”は本発明の方法を使用して調製 され得る。神経は、適当な神経細胞５４を含有する長い繊維５２使用して神経構 造物５６を形成することにより、調製され得る。この長繊維に沿って神経細胞を 増殖させた後、構造物５６は、神経作用の必要である適当な場所に移植される。

第２０ａ図および２Ｏｂ図でに示すように９本発明は心筋疾患の患者の治療に利 用され得る。筋肉細胞をポリマーの針状体に増殖させ（第２０ｂ図）９次にこれ を心臓の表面に埋める（第２０ａ図）。先に述べた原理によれば、損傷を受けた 心臓自身は新しい心臓には置き換えられないが、新しく強い筋肉組織が傷ついた 領域上に成長し、この成長した組織が下部組織と同時に心臓脈を打ち、失った機 能の一部を回復し１部分的に傷跡組織を再形成する。

主に火傷患者の治療に用いられる人工皮膚をつくり出すのに１種々の異なる方法 が使用されている。これらのうちで。

最も成功したのは、生物的に分解しうるコラーゲンマトリックスを利用する方法 である。この方法においては、このコラーゲン上に上皮細胞をシードしておいて 、これを傷の部位に付着させ、そしてこれをシリコーンのような非分解性の物質 で形成された水分不透過膜で覆う。これらの方法は、より小さい面積およびより 大きい容積を有する他の器官（例えば。

肝臓および膵臓）の構築に有用であると述べられているが。

実際に試みると効果的ではない。移植に先立って、インビトロで細胞の付着およ び分裂増殖を許容し得る高い表面面積構造物を提供する必要があることについて の認識がなかったからである。成功させるためには、この構造物は、血管形成さ れていないときに、十分な栄養物の拡散、廃物の排泄および呼吸が可能であるよ うに、設計されなければならない、可能な限り小さい濃度勾配のもとで、細胞が 多少とも培地に出てこなければ、これは起こらない。細胞が増殖するにつれて。

細胞へのあるいは細胞からの栄養物、廃物、ガスの伝達通路が制限されるように なり、培地からもっとも遠い細胞が死んでいく。人工皮膚移植物は、下部組織に 速やかに載置されたため、細胞密度における有意の増加に先立ち、マトリックス 中への毛細血管の増殖が始まった。このことは、これまでは。

考慮にいれられていなかった。

キメラ性の新生形態形成と言う概念は、増殖中の細胞集団の血管伸長が起こるま でに、細胞が拡散により栄養物が付与され得る能力による。細胞がシードされた コラーゲンまたはゼラチンを使用し、細胞−マトリックス構造物の固体移植物は 、拡散の際にサイズの点で物理的に制限されていると考えられる。いま、他の研 究者により５現在、細胞をシードした天然複合マトリックスを使用して、“器官 に相当するもの”が調製されている。その一つはコラーゲンゲルであり、これは ■型コラーゲンの水和溶液であるらしい。次の実験では。

この水和コラーゲンの細胞集団への栄養物の拡散能力についてテストする。

ウシ毛細血管の内皮細胞をゼラチンをコートした２４穴ウ工ル組織培養皿にプレ ートし、−晩をかけて細胞を付着させた。

最初の細胞数は、ｌＸｌ０’であった。翌日、細胞を、最終濃度が０．３２％に なるように異なる容量の■型コラーゲンで覆った。コラーゲンの上に標準容量の 培地を加えたため、栄養物源から細胞までの距離が異なった。この培地はウシ毛 細血管内皮細胞の増殖に最適化されたものであった。ダルベツコの最小基本培地 、１０％ウシ血清および１０μｌ／ｄのレチナール由来の増殖因子を使用した。

第２１ａ図に示されたように、細胞と培地との間に挿入されたコラーゲンの厚さ は０．３．０ｍｍ。

５．５　ｖｍ、　９．０　ａｍ、および１２．０Ｍであった。２４時間後に培地 とコラーゲンとを取り除き、細胞の数を数えた。

第２１ｂ図に示した実験結果は実質的に予想と一致した。水和コラーゲンマトリ ックスの厚さが増大につれて、生存細胞数が減少した。細胞付着後の最初の細胞 数は８９，５８０±３．７１９であった。コラーゲンマトリックスの挿入物がな くて、培地に直接接する細胞は、２４時間で２倍になり、　１６３．２３３±８ ．５８２となった。培地と細胞との間のコラーゲンゲルの厚さが３ｗｍのとき、 細胞の残存数は４９．５８７±３．７０８となった。この数は厚さが５．５　ｍ のとき２６，５１３±３．０１５　、　９ｍｍのとき４．５９３±８９９゜そし て１２■のとき５＋３９０±４８８に減少した。９腫と１２肺の場合には、すべ ての細胞は円形となり生育できなかった。

第２２図は、細胞増殖能と分裂における拡散距離の影響を示す写真である：（ａ ）コントロールウェルの２４時間後の細胞であリ、２４時間後には細胞数が２倍 となっている；　（ｂ）０．３２％コラーゲンにより５．５　ｗｎの厚さで覆わ れた細胞であり、生存細胞は著しく減少し、細胞の数が最初にプレートされた細 胞数よりはるかに少なくなっている；そして、（Ｃ）培地と細胞との間に挿入さ れた１２ｍｍの厚みのコラーゲンで覆われた細胞であり。

すべての細胞が円形となって、死滅している。

これらのデータにより、移植を成功させるためには、拡散距離が細胞の生存およ び増殖の臨界的要素であるという考えが支持される。従って、コラーゲンゲルの 均一にシードされた細胞は生物学的に拡散距離という拘束により制限される。

１　ｃｍ’を下まわる移植物を用いると、この移植物の周辺から３〜５閣の深さ まで細胞が生存し得ると考えがちである。しかし、移植物の中央の細胞は栄養物 、拡散およびガス交換の制限のため、生存できない、５〜１０ｍｍという、非常 に薄い厚みで大きな平板ゲルを用いれば、より大きい移植物とすることが可能で あろうことが想像される。しかし、この二次元的な溶液は移植において幾何的な 制限を受ける。細胞密度を増大させるに従って、拡散がより大きい制限を受け、 従って。

距離が相応してより短くなるということは明白である。

本発明を特定の実施態様により説明したが、最大表面積を有するマトリックス上 で細胞を培養し、栄養物を含む環境にさらすことによって９人工器官を構築する 本発明の方法および手段の改変および修飾は当業者に明白である。これらの修飾 および改変は１本発明に添付の請求の範囲に包含される。

ＦＩＧ、１ ホ′リグラクチン　９１ｏ（ｒりυｌ→ＦＩＧ、２ 贈廷（５ヂ Ｆ　Ｉ　Ｇ、３ ＦＩＧ、４ ＦＩ　Ｇ、５ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１Ｏ ＦＩＧ、１ｌ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、１７ ＦＩＧ、旧 ＦＩＧ、１９ Ｆ　Ｉ　Ｇ、２０ａ ＦＩＧ、２０ｂ シＩＩ砲数　×１０ ＦＩＧ、２２ｃ 国際調査報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．人工マトリックスを用いる制御された細胞移植の方法であって， ａ．生体適合性材料で形成されたマトリックスを提供すること，を包含し， 該材料は特定の所望の形状に成形され得，そして栄養溶液中で細胞増殖を均一に 支持するように構成され，栄養物を充分拡散させ，排出物を除去し，そして栄養 溶液から全細胞へ充分なガス交換ができるのに充分な面積を有し，そのため，細 胞増殖および分化は，移植がその後に続く血管の内部成長前，およびさらに細胞 増殖が起こるような移植後の両方において起こり得る。
2. ２．マトリックス材料として生物分解性ポリマーの選択することをさらに包含す る，請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．さらに次の工程を包含する請求の範囲第１項に記載の方法： ｂ．移植すべき細胞集団を供給する工程；ｃ．該マトリックスに細胞をシードす る工程；およびｄ．栄養溶液中において該マトリックス上で細胞を増殖させ，細 胞一マトリックス構造物を形成する工程。
4. ４．さらに次の工程を包含する請求の範囲第３項に記載の方法： ｅ．適度に血管組織が形成された位置に宿主の前記細胞一マトリックス構造物を 移植し，前記細胞一マトリックス構造物内へ血管の成長を行なわせる工程。
5. ５．脱分化因子を含む生物分解性ポリマーより形成されるマトリックスを，前記 細胞一マトリックス構造物が移植されるべき位置において，まず宿主へ移植する 工程をさらに包含する，請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．第１の細胞一マトリックス構造物とは異なる細胞集団を有する付加的な細胞 一マトリックス構造物をさらに移植する工程を包含する，請求の範囲第４項に記 載の方法。
7. ７．シード前に細胞集団からリンパ球を除去することを包含する，請求の範囲第 ３項に記載の方法。
8. ８．細胞表面での抗原の発現を変化させるような細胞の修飾をさらに包含する， 請求の範囲第３項に記載の方法。
9. ９．宿主細胞適合性組織型の細胞の選択をさらに包含する請求の範囲第４項に記 載の方法。
10. １０．栄養物，補因子，増殖因子，血管形成促進性化合物，免疫調節剤，炎症抑 制剤，退行因子，分化および脱分化促進因子，リンパ管網状組織の内部成長を促 進する生物学的活性分子，神経の成長を促進する因子および薬剤でなる群から選 択される化合物を提供することをさらに包含する，請求の範囲第１項に記載の方 法。
11. １１．ポリオルトエステル，ポリアンヒドリド，ポリグリコール酸，基底膜成分 ，寒天，アガロース，ゼラチン，アラビアゴム，コラーゲンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ， ＩＶおよびＶ型，フィブロネクチン，ラミニン，グリコサミノグリカンおよびそ れらの複合混合物でなる群における生物適合性材料を選択することをさらに包含 する，請求の範囲第１項に記載の方法。
12. １２．前記生物適合性材料が，非毒性，非免疫原性，非炎症性物質に生物分解さ れ得る物質の群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
13. １３．前記生物適合性材料が，凹凸のあるディスク状である請求の範囲第１項に 記載の方法。
14. １４．前記生物適合性材料が繊維状である請求の範囲第１項に記載の方法。
15. １５．肝細胞，胆管細胞，上皮小体細胞，甲状腺細胞，副腎視床下部一脳下垂体 系細胞，心筋細胞，腎臓上皮細胞，腎臓管状細胞，腎臓基底膜細胞，神経細胞， 血管細胞，腸管細胞，骨および軟骨形成細胞，平滑筋および骨格筋でなる群から の細胞を選択することをさらに包含する請求の範囲第３項に記載の方法。
16. １６．栄養溶液中での細胞増殖を制御するための人工マトリックスであって， 細胞懸濁液が付着する点を提供するような構造の生物適合性マトリックスを包含 し， 該マトリックスは，栄養溶液中で細胞増殖を均一に支持するように構成され；栄 養物を充分拡散させ，排出物を除去し，そして栄養溶液から全細胞へ充分なガス 交換ができるのに充分な面積を有し，そのため，血管網組織が存在しない場合に おいても，充分な細胞増殖と分化とが起こり，３次元細胞一マトリックス構造物 を形成し得る。
17. １７．前記マトリックスが，ポリアンヒドリド，ポリオルトエステル，ポリグリ コール酸，コラーゲン，ポリメタクリレート，シリコンポリマー，およびそれら の組合せでなる群がら選択される物質で構成される請求の範囲第１６項に記載の マトリックス。
18. １８．細胞付着を高める被覆層をさらに包含する請求の範囲第１６項に記載のマ トリックス。
19. １９．前記第２の材料が，前記マトリックス表面への細胞の付着を高める物質の 群から選択され，該物質の群が，寒天，アガロース，ゼラチン，アラビアゴム． 基底膜材料，コラーゲンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ，およびＶ型，フィブロネクチ ン，ラミニン，グリコサミノグリカン，およびそれらの複合混合物でなる，請求 の範囲第１６項に記載のマトリックス。
20. ２０．前記マトリックスがディスク状であり，そして細胞付着のための特定の凹 凸のある，請求の範囲第１６項に記載のマトリックス。
21. ２１．前記マトリックスが繊維状構造物である請求の範囲第１６項に記載のマト リックス。
22. ２２．前記繊維状構造物が中空繊維を含む請求の範囲第２１項に記載のマトリッ クス。
23. ２３．前記繊維状構造物が固体繊維を含む請求の範囲第２１項に記載のマトリッ クス。
24. ２４．前記マトリックスが生物分解性である請求の範囲第１６項に記載のマトリ ックス。
25. ２５．前記マトリックスが針状構造物である請求の範囲第１６項に記載のマトリ ックス。
26. ２６．栄養物，補因子，増殖因子，血管形成促進性化合物，免疫調節剤，炎症抑 制剤，退行因子，分化および脱分化促進因子，リンパ管網状組織の内部成長を促 進する生物学的活性分子，神経の成長を促進する因子，薬剤およびそれらの組合 せでなる群から選択される化合物をさらに包含する請求の範囲第１６項に記載の マトリックス。
27. ２７．前記マトリックスが，異なる起源の細胞の付着のために別々の領域を有す るように構成された請求の範囲第１６項に記載のマトリックス。
28. ２８．前記マトリックスが該マトリックス内で管状構造物の増殖を支持するよう に構成された請求の範囲第２７項に記載のマトリックス。
29. ２９．異なる細胞集団の付着と増殖とを最大にするように構成された分隣した領 域を有する請求の範囲第１６項に記載のマトリックス。