JP2011504374A - 繊維状ポリペプチドおよび多糖を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子導入:Kleeら(1987).Annu.Rev.Plant Physiol.38:467−486;KleeおよびRogers(1989).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6巻,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,pp.2−25,J.SchellおよびL.K.Vasil,編,Academic Publishers,San Diego,Calif.;およびGatenby,(1989).pp.93−112,Plant Biotechnology,S.Kung,およびC.J.Arntzen編,Butterworth Publishers,Boston,Mass.を参照のこと。
(ii)直接DNA取り込み:Paszkowskiら,.Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6巻,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,J.Schell,およびL.K.Vasil編,Academic Publishers,San Diego,Calif,(1989)p.52−68;およびToriyama,K.ら,(1988).Bio/Technol 6:1072−1074(プロトプラストにDNAを直接取り込むための方法)を参照のこと。また、Zhangら,Plant Cell Rep.(1988)7:379−384;およびFrommら,Nature(1986)319:791−793(植物細胞の短時間の電気的ショックによって誘導されるDNAの取り込み)を参照のこと。また、Kleinら,Bio/Technology(1988)6:559−563;McCabeら,Bio/Technology(1988)6:923−926;およびSanford,Physiol.Plant(1990)79:206−209(粒子衝突による植物細胞または組織へのDNAの注入)を参照のこと。また、Neuhausら,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30−36;およびNeuhausおよびSpangenberg,Physiol.Plant(1990)79:213−217(マイクロピペットシステムの使用)を参照のこと。米国特許第5464765号(細胞培養物、胚、またはカルス組織の、ガラス繊維または炭化シリコンウィスカー形質転換)を参照のこと。あるいは、DeWetら,Experimental Manipulation of Ovule Tissue,Chapman,G.P.,Mantell,S.H.及びDaniels,W.編,Longman,London,(1985)pp.197−209;およびOhta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715−719(発芽花粉とのDNAの直接のインキュベーション)を参照のこと。
好ましい実施形態によれば、架橋は、ジチロシン結合が形成されるように行われる。これらの方法は当業者には広く知られており、MalencikおよびAnderson(Biochemistry、1996、35、4375〜4386)によって議論される(その内容は参照として本明細書中に組み込まれる)。
転移温度(Tm)を超えて加熱した後で、エラスチンは、下記の酸化剤を使用して架橋することができる:リシルオキシダーゼビス(スルホスクシミジル)スベラート、ピロロキノリンキニン(PQQ)、カテコール/ペルオキシダーゼ試薬、N−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下での1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt)、1,6−ジイソシアナトヘキサン(HOBt)、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ゲニピン。
絹糸ポリペプチド、例えば、クモ絹糸およびカイコ絹糸などは、有機溶媒(例えば、メタノールなど)を使用してβシートに重合することができる。代替では、絹糸ポリペプチドは、βシートを形成させるために、水に可溶化し、続いて、脱水することができる。
コラーゲンは、グルタルアルデヒドおよび他の化学的架橋剤によって、または、種々の糖を使用する糖化によって、または、金属イオン(例えば、銅など)を使用するFenton反応によって、または、リシンオキシダーゼによって、または、UV放射線によって架橋することができる。
レシリンキメラ遺伝子の構築
レシリンcDNAの調製:Elvin他[Nature、437:999〜1002、2005]によれば、レシリンはほとんどがD.melanogasterにおいてさなぎの段階で発現される。したがって、RNAをcDNA調製のためにこの段階から抽出した。RNAを、TRI(登録商標)試薬(Sigma、St.Louis、MO)を使用してD.melanogasterのさなぎから抽出した。レシリンcDNAの逆転写を、製造者の説明書に従って、オリゴ(dT)15プライマーとともにM−MLV RT(H−)(Promega corporation、Madison、WI)により行った。
1.生来的な推定されるキチン結合ドメインを含む、レシリンの17個の弾性反復(gi|45550440、ヌクレオチド698〜1888)。これはRes−ChBD遺伝子として示される(タンパク質配列:配列番号11、配列番号55;ポリヌクレオチド配列:配列番号17)。
2.Elvin他[Nature、437:999〜1002、2005]と類似する遺伝子のN末端融合および単独発現のための、レシリンの17個の弾性反復および生来的リンカー(ヌクレオチド698〜1666)。これはレシリンとして示される(タンパク質配列:配列番号14、配列番号56;ポリヌクレオチド配列:配列番号15)。
3.レシリンの17個の弾性反復に融合されたクロストリジウム・セルロボランスCBD(CBDclos)。これはCBD−レシリンとして示される(タンパク質配列:配列番号12、配列番号57;ポリヌクレオチド配列:配列番号18)。
4.CBDに融合されたレシリン(遺伝子番号2)。これはレシリン−CBDとして示される(タンパク質配列:配列番号13、配列番号58;ポリヌクレオチド配列:配列番号19)。
レシリンキメラ遺伝子の発現
全4つのベクターをBL21(DE3)(Novagen、EMD Chemicals,Inc.、CA)に形質転換した。5mlの一晩培養物を、回転式振とう機において37℃で、100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地で成長させた。これらの開始培養物を、1/100の開始培養物/培養体積の比率で、100mg/Lのアンピシリンを含む250ml〜350mlのLBへの接種のために使用した。0.8〜0.9のO.D.600において、発現を1mMのIPTGにより誘導した。誘導後4時間で、細菌を遠心分離によって集めた。6H−Res−ChBDのペレットを最初の分析のために50mlのアリコートに分け、ペレットを−80℃で貯蔵した。
レシリン−ChBDの精製およびその特徴づけ
6H−Res−ChBDの小規模回分精製:50mlの細菌ペレットを2mlの100mM Tris(pH7.5)/0.1%Triton(登録商標)X−100/Complete(商標)(Roche、Basel、スイス)に再懸濁した。細菌を、氷上での2分間のパルス化バーストを伴う超音波処理によって溶解した。可溶物および細菌沈殿物を4℃で10分間の15000RPMでの遠心分離によって分離した。SDS−PAGE分析により、Res−ChBD生成物はほとんどが可溶性画分に見出されることが明らかにされた(図4、レーン1、レーン2)。500μlの溶解物を、75μlの事前に平衡化されたHIS−Select(登録商標)ニッケル親和性ゲル(Sigma、St.Louis、MO)を含有する1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。精製を製造物マニュアルに従って行った。最後の溶出を、0.4Mのイミダゾールを含有する100μlの溶出緩衝液により2回繰り返した。
結合緩衝液;20mM NaHPO4、0.5M NaCl、10mMイミダゾール
溶出緩衝液;20mM NaHPO4、0.5M NaCl、0.5Mイミダゾール
1.1ml/分での5カラム体積(CV)の結合緩衝液
2.溶解物の、1ml/分での5mlの注入
3.結合緩衝液による5CVの洗浄
4.溶出緩衝液による0.7ml/分での10分間の、500mMイミダゾールまでの直線勾配
5.1ml/分での5CVの結合緩衝液による平衡化。
溶出タンパク質をO.D.280において検出した。400μlの分画物を集め、SABとともに煮沸された10μlの試料を12.5%SDS−PAGEゲルに負荷した。
6H−Res−ChBDの小規模回分精製:精製が、図4のレーン3〜レーン7に例示されるように達成された。
多糖結合ドメイン(PBD)を何ら有しない6H−レシリン−17弾性反復(配列番号56)の発現および精製
配列番号56のレシリンをE.coliにおいて発現させた後、可溶性タンパク質を、図11に例示されるようにNi−NTAカラムで精製した。加えて、このタンパク質は、熱安定性であることが見出され、また、レシリン−ChBDと同じ様式で固体レシリンに重合させられた。
CBD−レシリン(配列番号57)の精製およびその特徴づけ
細菌におけるCBD−レシリンの発現の後、CBD−レシリンは、封入体で発現されることが見出された(図12)。
不溶性画分を遠心分離によって沈殿させた。
1.穏やかな振とうとともに30分間、PBS緩衝液/1%Triton(登録商標)X−100/1mM EDTAによる再懸濁、その後、遠心分離。
2.穏やかな振とうとともに30分間、PBS緩衝液/1%Triton(登録商標)X−100による再懸濁、その後、遠心分離。
3.穏やかな振とうとともに30分間、PBS緩衝液による再懸濁、その後、遠心分離。
1.変性条件下でのNi−NTA精製。IBを、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)/20mMイミダゾール/0.5M NaCl/6M GuHClにおいて可溶化した。タンパク質を、事前に平衡化されたNi−NTAカラムに負荷し、タンパク質を、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)/0.5Mイミダゾール/0.5M NaCl/6M GuHClの直線勾配により溶出した。O.D.280nmにおいて検出されたピークを含有する分画物を集め、50mMのTris(pH7.5)緩衝液に対する透析によってリフォールディングさせた。タンパク質をSDS−PAGEによって分析した。タンパク質のリフォールディングをセルロース結合アッセイによってアッセイした(図13)。
2.洗浄されたIBを、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)/20mMイミダゾール/0.5M NaCl/6M GuHClにおいて可溶化した。その後、タンパク質を、Ni−NTAカラムが装着されたAKTAprime(商標)plus(GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン)に注入し、装置においてプログラム化される自動リフォールディングプロトコルを使用して精製した。リフォールディングされたタンパク質を含有する分画物を集め(図14)、その後、セルロース結合アッセイを行った。自動化されたリフォールディングを受けたCBD−レシリンタンパク質はほとんどが、6MのGuHClまたは8Mの尿素の存在下で精製された試料の透析を伴う標準的プロトコルによってリフォールディングされたタンパク質と同様な結合画分において見出された。これは、この方法は非常に効率的かつ時間節約であるので、この方法が適用され得ることを示している。
レシリン−CBD(配列番号58)のクローン化および発現
レシリン−17弾性反復および推定されるレシリンリンカーをコードするDNAフラグメントを、CBDを含有するベクターに上流側にクローン化して、配列番号19のポリヌクレオチドを作製した。正しい挿入を配列によって確認し、その後、この遺伝子をタンパク質発現のためにpHis−parallel3にクローン化した。発現を、他の全タンパク質と同様にBL21細菌において行った。タンパク質発現の後、細菌を遠心分離し、CBD−レシリンについて記載されるように溶解した。可溶性画分および不溶性画分を遠心分離によって分離した。SDS−PAGE分析により、組換えタンパク質の約50%が可溶性画分に見出されたことが明らかにされた。セルロース結合アッセイをレシリン−CBDの粗溶解物に対して直接に行った。これは、レシリン−CBDがセルロースに高い親和性で結合することをもたらした(図17を参照のこと)。
レシリン−CBD(配列番号58)の精製
レシリン−CBDの発現の後、BL21細菌を遠心分離し、他のタンパク質について記載されるように溶解した。可溶性画分および不溶性画分を遠心分離によって分離した。溶解物を0.45μmのシリンジフィルターでろ過した。その後、タンパク質を、事前に平衡化されたNi−NTAカラムに負荷し、20mMリン酸塩緩衝液(pH7.5、0.5Mイミダゾール、0.5M NaCl)の直線勾配により溶出した。O.D.280nmにおいて検出されたピークを含有する分画物をプールし、リン酸塩緩衝剤生理的食塩水(PBS)に対して3回透析して、イミダゾールを除いた。タンパク質をX2試料適用緩衝液(SAB)とともに煮沸し、クーマシーブルー染色されたSDS−PAGEによって分析した(図16)。
レシリン−CBD(配列番号58)の耐熱性およびセルロース結合アッセイ
精製されたレシリン−CBDタンパク質を含有する試料溶液を85℃で15分間インキュベーションし、その後、14000rpmで15分間遠心分離した。50μlの加熱されたタンパク質溶液を、実施例3に記載されるようなセルロース結合アッセイのために30mgのセルロース粉末(Sigmacell)に加えた。セルロース結合アッセイはまた、非加熱のレシリン−CBD溶液をコントロールとして行われた。図17に示されるように、レシリン−CBDタンパク質は、耐熱性と、熱処理によって損なわれなかったセルロースに対する効率的な結合能との両方を示す。
異なるpHの溶液におけるレシリンタンパク質の溶解性
材料および方法
酵素的酸化反応または金属触媒酸化(MCO)反応から生じる反応性酸素化学種(ROS)により誘導される酸化ストレスが大きな影響をタンパク質の側鎖および全体的特性に及ぼし得るという証拠がますます増大している。チロシンは、タンパク質におけるROS感受性が非常に大きい残基の1つである。その酸化生成物には、3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(DOPA)、ドーパミン、ドーパミンキニン、ジチロシン(DT)およびisoDTが含まれる。加えて、DOPAはチロシンのヒドロキシルラジカル処理の主生成物である(Ali F.E.他、Journal of inorganic biochemistry、2004、98、173〜184)。Ali他(2004)によれば、様々なpHの溶液におけるチロシンのMCOは、様々な生成物、例えば、ジチロシンおよび3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(DOPA)などを生じさせる。
両方の場合において、大量のタンパク質沈殿がおよそpH5で観測された。図18に例示されるように、タンパク質が、5.6および5.4に至るまでのpHの溶液にそれぞれ残留した。このことから、これらの組換えタンパク質の溶解性のpH範囲が明らかにされる。これらの基本的な決定により、レシリン側鎖に対するMCOの影響を調べることができる。
異なるpHにおけるレシリンタンパク質生成物の光誘導重合
材料および方法
0.5mMのRu(bpy)3Cl2・6H2Oおよび2.5mMの過硫酸アンモニウム(APS)を含有する、様々なpHでのレシリンタンパク質溶液およびレシリン−ChBDタンパク質溶液(50μl)を日光に10分間さらし、その後、タンパク質を分離し、クーマシー染色されたSDS−PAGEで検出した。Ru(bpy)3Cl2・6H2OおよびAPSを含まないタンパク質試料をコントロールとして使用した。
Ru(bpy)3Cl2・6H2OおよびAPSを含有する全試料で、高分子量の生成物が形成された。それにもかかわらず、外見的に架橋された生成物のパターンはpHに従って異なった(図19、矢印を参照のこと)。
レシリンの金属触媒重合
材料および方法
精製されたレシリンを50mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)または脱イオン水のどちらかに対して3回透析した。透析後、タンパク質を85℃で15分間インキュベーションし、続いて、10000rpmで30分間遠心分離した。一般には、重合を、Kato他(2001)(Kato Y、Kitamoto N、Kawai Y、Osawa T(2001)、他の金属触媒酸化システムではなく、過酸化水素/銅イオンシステムはタンパク質結合型ジチロシンをもたらす、Free Radical Biology&Medicine、31(5)、624〜632)、および、Ali他(Ali FE、Barnham KJ、Barrow CJ、Separovic F(2004)、銅/過酸化水素の種々の酸化システムによるチロシン残基の金属触媒酸化、J Inorg Biochem、98(1):173〜84)によって報告されるMCO法に従って行った。全反応を1.5mlのエッペンドルフチューブにおいて250μlの最終体積で行った。MCO重合を、4mmolのH2O2(30%H2O2の1μl)および200μMのCuCl2(H2Oに溶解された20mM CuCl2の2.5μl)を加え、その後、37℃での一晩のインキュベーションを行うことによって行った。タンパク質溶液のみのチューブ、H2O2のみまたはCuCl2のみを伴うタンパク質溶液のチューブを陰性コントロールとして使用した。反応を、1mMのEDTAを加えることによって停止させた。最後に、試料をX2 SABにおいて煮沸し、SDS−PAGEによって分析した。
重合が、図20に示されるように、リン酸塩緩衝液および水の両方において達成された。これらの結果のさらなる分析が進行中である。
組換えレシリン−セルロースウィスカー複合物の調製
材料および方法
10mg/mlの6H−Res−ChBD(配列番号55)を含有するHisタグ精製されたタンパク質溶液を、10kDaカットオフのVivaspin遠心分離濃縮器(Sartorius、英国)に載せ、6000rpmで遠心分離して、100mg/mlの濃度にした。この段階で、200μlの試料をその後の分析のために取り出し、貯蔵し、その一方で、溶液の残りをさらに濃縮して、200mg/mlの濃度にした。
150μlの6H−Res−ChBD試料(図21B−右端)、ならびに、75μlおよび150μlの6H−Res−ChBD−セルロースウィスカー試料複合物(図21B−それぞれ、中央および左)を鋳型から取り出し、さらなる分析のために示差走査熱量測定法(DSC)に送った。
クモ絹糸−CBD融合遺伝子の構築
材料および方法
クモ絹糸(SpS)は、E.coliにおける発現のために最適化された合成遺伝子(配列番号23)である。その配列は、ジョロウグモ(Nephila clavipes)のスピドロイン1配列の生来的配列(アクセションP19837)に由来するモノマーコンセンサスの15回反復を設計したものである。
1.SmaIおよびAatIIによる合成モノマー(配列番号26)の消化。
2.NaeIおよびAatIIによる合成モノマー(配列番号26)の消化。
これらのDNA生成物を1%アガロースゲルで精製し、精製されたフラグメントの連結により、2merクモ絹糸遺伝子を得た。続いて、2mer体の縮合を行って、4mer遺伝子を作製し、そして、4mer体および2mer体を縮合して、6mer遺伝子を形成した。
1.2つの6mer反復をCBDclosの3’末端に融合して、CBDclos−SpS12(配列番号28)を作製した。2つの6mer体の縮合を上記のように行った。
2.CBDclosを2つの6mer反復の中央において融合した。融合遺伝子はSpS6−CBD−SpS6として示される(配列番号29)。2つの6mer体のクローニングを、1つのCDB−6merプラスミドのSmaIおよびNaeIによる二重消化、ならびに、もう一方のStuIによる消化によって行った。フラグメントを精製し、連結して、SpS6−CBD−SpS6を形成した。
SpS−CBD融合遺伝子の発現および精製
材料および方法
E.coliにおけるSpSタンパク質およびSpS−CBDclosタンパク質の発現:pET30a−SpSベクターおよびpET30a−SpS−CBDclosベクターをBL21(DE3)(Novagen、EMD Chemicals,Inc.、CA)に形質転換した。5mlの一晩培養物を、回転式振とう機において37℃で、50mg/lのカナマイシンを含むLB培地で成長させた。これらの開始培養物を、1/100の開始培養物/培養体積の比率で、50mg/lのカナマイシンを含む250ml〜350mlのLBへの接種のために使用した。0.6〜0.9のO.D.600において、発現を1mMのIPTGにより誘導した。誘導から4時間後、細菌を遠心分離によって集めた。1つのペレットを最初の分析のために50mlのアリコートに分け、ペレットを−80℃で貯蔵した。
結合緩衝液;20mM NaHPO4、0.5M NaCl、10mMイミダゾール
溶出緩衝液;20mM NaHPO4、0.5M NaCl、0.5Mイミダゾール
1.1ml/分での5カラム体積(CV)の結合緩衝液
2.溶解物の、1ml/分での5mlの注入
3.結合緩衝液による10CVの洗浄
4.溶出緩衝液による1ml/分での15分間の、500mMイミダゾールまでの直線勾配
5.1ml/分での10CVの結合緩衝液による平衡化。
溶出タンパク質をO.D.280において検出した。500μlずつの分画物を集め、SABとともに煮沸された20μlの試料を10%SDS−PAGEゲルに負荷した。
タバコ植物の形質転換:Rubisco発現カセットおよび融合遺伝子を含むバイナリー型pBINPLUSベクターを、植物形質転換のためのA.tumefaciens LBA4404株に導入した。リーフディスク形質転換を、以前に記載されたように、N.tabacum−SR1植物を用いて行った(DeBlock他、1984、The EMBO Journal、第3巻、第8号、1681頁〜1689頁、1984)。15個を超える独立したタバコ形質転換体をそれぞれの構築物について作製し、インビトロで増殖させ、温室に移した。導入遺伝子の存在を、Rubiscoカセットのターミネーター/プロモーターについての特異的なプライマーを使用するゲノムDNAに対するPCRによって確認した。形質転換体の自家受粉によって得られたT1種子を集め、カナマイシン(300mgl−1)を含有する発芽培地でさらに選抜した。滅菌処理は、70%エタノールにおいて30秒間、その後で、2.5%NaOClにおいて5分間であった。
E.coliにおけるSpSタンパク質およびSpS−CBDclosタンパク質の発現:SpSタンパク質およびSpS−CBDタンパク質がE.coliにおいて首尾良く発現した(図22A)。可溶性タンパク質および不溶性(IB含有物)タンパク質のSDS−PAGE分析では、SpSタンパク質産物が可溶性画分に見出され、これに対して、SpS−CBDタンパク質産物はほとんどが不溶性の封入体(IB)画分に見出されることが明らかにされた(図22B)。
1.CBD−SpS12を発現し、アポプラストに分泌する、CBD−SpS12 No.13.7およびNo.13.8の2つの植物が特定された。これらは本明細書中では13.7および13.8としてそれぞれ示される。
2.6mer−CDB−SpS6を細胞質において発現する、SpS6−CBD−SpS6 No.6.4およびNo.6.8の2つの植物が特定された。これらは本明細書中では6.4および6.8としてそれぞれ示される。
クモ絹糸の金属触媒重合
材料および方法
精製されたSpSタンパク質(実施例8)(これは15個のチロシン残基を含有する)を50mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)または脱イオン水のどちらかに対して4回透析した。透析後、タンパク質を13000rpmで10分間遠心分離した(図29、レーン2、レーン3、レーン4)。重合反応を、Kato他(2001)(Kato Y、Kitamoto N、Kawai Y、Osawa T(2001)、他の金属触媒酸化システムではなく、過酸化水素/銅イオンシステムはタンパク質結合型ジチロシンをもたらす、Free Radical Biology&Medicine、31(5)、624〜632)、および、Ali他(Ali FE、Barnham KJ、Barrow CJ、Separovic F(2004)、銅/過酸化水素の種々の酸化システムによるチロシン残基の金属触媒酸化、J Inorg Biochem、98(1):173〜84)によって報告されるMCO法に従って行った。全反応を1.5mlのエッペンドルフチューブにおいて250μlの最終体積で行った。MCO重合を、4mmolのH2O2(30%H2O2の1μl)および200μMのCuCl2(H2Oに溶解された20mM CuCl2の2.5μl)を加え、その後、37℃での一晩のインキュベーションを行うことによって行った。タンパク質溶液のみのチューブ、H2O2のみまたはCuCl2のみを伴うタンパク質溶液のチューブを陰性コントロールとして使用した。反応を、1mMのEDTAを加えることによって停止させた。最後に、試料をX2 SABにおいて煮沸し、クーマシー染色されたSDS−PAGEによって分析した。
重合が、図29のレーン3およびレーン7に示されるように、リン酸塩緩衝液および水の両方において達成された。
CBD含有/非含有のクモ絹糸およびセルロースウィスカーのスポンジを調製するための方法
材料および方法
タンパク質水溶液(5wt%)をTeflon鋳型においてセルロースウィスカーと混合した。均質な溶液を得た後、100%メタノールを15%の最終濃度にタンパク質−ウィスカー混合物に加えた(撹拌を手によって行った)。鋳型を−80℃の冷凍庫に1時間以上置いた。タンパク質−ウィスカーの凍結溶液を凍結乾燥して、スポンジを作製した。この方法は、Nazarov R他、再生絹フィブロインからの多孔性3D足場、Biomacromolecules(2004)、5、718〜726に基づく。
組換えクモ絹糸−セルロースウィスカーのスポンジの調製
精製されたSpSタンパク質を、水を4回交換しながら18時間にわたって水に対して透析した(最初の交換が12時間後であり、その後の3回の交換が2時間毎であった)。透析後、タンパク質水溶液を5wt%に濃縮した(図30、レーン5に対してレーン2およびレーン4)。その後、濃縮されたSpSタンパク質をTeflon鋳型においてセルロースウィスカーと混合して、100/0%、30/70%、0/100%の所望される比率をそれぞれ得た。
絹糸−ウィスカー複合物のTmの決定
材料および方法
実施例15および実施例16に記載される方法に従って作製されたスポンジを示差走査熱量測定法(DSC)によって分析した。それぞれの操作について、約5mgの試料を使用し、サーモグラムを、窒素下、5℃/分の加熱速度で0℃から300℃まで記録した。
DSC分析(図31A〜図31C)は3つの異なるサーモグラムプロフィルを示す。クモ絹糸−セルロースウィスカーの複合物のサーモグラムにおいて、クモ絹糸およびセルロースウィスカー単独の転移温度ピーク2が消失し、より高いピークが243.69℃に現れた。表20には、ウィスカー、絹糸および70%ウィスカー/30%絹糸スポンジのDSCサーモグラムから得られる転移温度ピークがまとめられている。この分析は、絹糸−ウィスカーの組合せがウィスカーの転移温度ピーク2における著しい増大をもたらすことを明らかにする。表20には、ウィスカー、絹糸および70%ウィスカー/30%絹糸スポンジのDSCサーモグラムから得られる転移温度ピークがまとめられている。
配列番号8は、レシリンの弾性反復単位の配列である。
配列番号9は、ショウジョウバエ由来の最小レシリンポリペプチド配列である。
配列番号10は、Clostridium cellulovorans由来のセルロース結合ドメイン(CBD)の配列である。
配列番号11は、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリン17弾性反復(Res−CHBD)の配列である。
配列番号12は、レシリン17弾性反復に融合されたClostridium cellulovoransのCBD(CBDclos)(CBD−レシリン)の配列である。
配列番号13は、リンカーポリペプチドを介してCBDに融合されたレシリンの配列である。
配列番号14は、C′リンカーポリペプチド(Elvin)に融合されたレシリンの配列である。
配列番号15は、リンカーポリペプチド配列に融合されたレシリンの配列である。
配列番号16は、15spsクモ絹糸ポリペプチドの配列である。
配列番号17は、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリン17弾性反復(Res−CHBD)のポリヌクレオチド配列である。
配列番号18は、レシリン17弾性反復に融合されたClostridium cellulovoransのCBD(CBDclos)(CBD−レシリン)のポリヌクレオチド配列である。
配列番号19は、リンカーコード配列を介してCBDに融合されたレシリンの配列である。
配列番号20及び21は、植物中での発現のためにコドン最適化されたCBD−レシリン融合構築物の配列である。
配列番号22は、植物中での発現のためにコドン最適化された、天然の仮想的なキチン結合ドメインを含むレシリンのポリヌクレオチド配列である。
配列番号23は、15spsクモ絹糸の合成遺伝子の配列である。
配列番号24は、CBDポリヌクレオチド配列に融合された15spsクモ絹糸の配列である。
配列番号25は、Clostridium cellulovoransのCBD(CBDclos)ポリヌクレオチド配列である。
配列番号26は、クモ絹糸の反復単位の配列である。
配列番号27は、合成クモ絹糸の反復単位(GENEART)のポリヌクレオチド配列である。
配列番号28は、12spsクモ絹糸ポリヌクレオチド配列に融合されたCBDclosの配列である。
配列番号29は、クモ絹糸6sps−CBD−6sps構築物のポリヌクレオチド配列である。
配列番号30は、プロモーター及び5′UTRを含むルビスコの小サブユニットカセットの配列である。
配列番号31は、3′UTR及びターミネーターを含むルビスコの小サブユニットカセットの配列である。
配列番号32は、CBDに融合された15spsクモ絹糸の配列である。
配列番号33は、6Hisタグ化された15spsクモ絹糸ポリペプチドの配列である。
配列番号34は、6Hisタグ化された15spsクモ絹糸CBD融合ポリペプチドの配列である。
配列番号35は、CBDclos 12spsクモ絹糸融合ポリペプチドの配列である。
配列番号36は、6sps−CBD−6sps融合ポリペプチドの配列である。
配列番号38は、合成クモ絹糸の反復単位(GENEART)のポリペプチド配列である。
配列番号39は、レシリンキチン結合ドメインの配列である。
配列番号40は、塩基性エンドキチナーゼBキチン結合ドメインの配列である。
配列番号41は、グルコアミラーゼデンプン結合ドメインの配列である。
配列番号42は、デキストラン結合ドメインの配列である。
配列番号43は、アルギン酸結合ドメインの配列である。
配列番号44は、ヒアルロン酸結合ドメインの配列である。
配列番号45は、レシリンにおける反復アミノ酸配列である。
配列番号46は、エラスチンにおける反復アミノ酸配列である。
配列番号48は、液胞区分けシグナルコードポリヌクレオチドの配列である。
配列番号49は、液胞区分けシグナルポリペプチドの配列である。
配列番号50は、アポプラスト区分けシグナルコードポリヌクレオチドの配列である。
配列番号51は、アポプラスト区分けシグナルポリペプチドの配列である。
配列番号52及び53は、CBDとレシリンとの間のリンカーとして使用されるポリペプチドの配列である。
配列番号54は、Lacオペレーター、6XHisタグ、スペーサー領域、rTEV切断部位及び多数のクローニング部位を含むpHIS−Parallel3フラグメントの配列である。
配列番号55は、6H−Res−ChBDの配列である。
配列番号56は、6H−レシリンの配列である。
配列番号57は、6H−CBD−レシリンの配列である。
配列番号58は、6H−レシリン−CBDの配列である。
配列番号59は、6H−Res−ChBDの発現配列である。
配列番号60は、6H−レシリンの発現配列である。
配列番号61は、6H−CBD−レシリンの発現配列である。
配列番号62は、6H−レシリン−CBDの発現配列である。
Claims (60)
- 異種の多糖結合ドメインに結合された繊維状ポリペプチドのモノマーをコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、前記多糖結合ドメインがセルロース結合ドメインではない、単離されたポリペプチド。
- 異種の多糖結合ドメインに結合されたレシリンポリペプチドまたはクモ絹糸ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 前記繊維状ポリペプチドは、レシリン、エラスチン、クモ絹糸、カイコ絹糸、コラーゲンおよびイガイ足糸タンパク質からなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記繊維状ポリペプチドはレシリンを含む、請求項3に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記繊維状ポリペプチドはクモ絹糸を含む、請求項3に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記レシリンは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記レシリンは、配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号52または配列番号53に示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項7に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインからなる群から選択される、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインからなる群から選択される、請求項2に記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号11〜配列番号13および配列番号32〜配列番号36に示される通りである、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記クモ絹糸は、配列番号16または配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の単離されたポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号17〜配列番号22、配列番号24、配列番号28および配列番号29からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項13または14に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- レシリンをコードする核酸配列と、前記レシリンの発現を植物において行わすことができるシス作用調節エレメントとを含む核酸構築物。
- クモ絹糸をコードする核酸配列と、前記クモ絹糸の発現を植物において行わすことができるシス作用調節エレメントとを含む核酸構築物。
- 請求項13または14に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
- 少なくとも1つのシス作用調節エレメントをさらに含む、請求項18に記載の核酸構築物。
- 前記シス作用調節エレメントは植物プロモーターである、請求項19に記載の核酸構築物。
- 前記植物プロモーターはrbcS1プロモーターである、請求項20に記載の核酸構築物。
- 液胞シグナル配列をコードする核酸配列をさらに含む、請求項20に記載の核酸構築物。
- 前記シス作用調節エレメントはターミネーター配列である、請求項19に記載の核酸構築物。
- 前記ターミネーター配列はrbcS1配列である、請求項23に記載の核酸構築物。
- 請求項18に記載の核酸構築物を含む細胞。
- 植物細胞である、請求項25に記載の細胞。
- 請求項16または17に記載の核酸構築物を含む植物細胞。
- レシリンまたはクモ絹糸である繊維状ポリペプチドと、多糖とを含む、単離された複合物。
- 異種の多糖結合ドメインを含む繊維状ポリペプチドと、多糖とを含む、固定化されていない単離された複合物。
- 前記多糖は、キチン、セルロース、デンプン、デキストラン、グルカン、キトサン、アルギン酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項28または29に記載の単離された複合物。
- 前記繊維状ポリペプチドは多糖結合ドメインを含む、請求項28に記載の単離された複合物。
- 前記多糖結合ドメインは異種の多糖結合ドメインである、請求項31に記載の単離された複合物。
- 前記多糖結合ドメインは、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キトサン結合ドメイン、アルギン酸結合ドメイン、デンプン結合ドメイン、デキストラン結合ドメイン、グルカン結合ドメインおよびヒアルロン酸結合ドメインを含む、請求項29または31に記載の単離された複合物。
- 前記繊維状ポリペプチドは、イガイ足糸タンパク質、レシリン、カイコ絹糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンまたはそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項29に記載の単離された複合物。
- 追加の繊維状ポリペプチドをさらに含み、前記追加の繊維状ポリペプチドは前記繊維状ポリペプチドとは異なり、イガイ足糸タンパク質、レシリン、カイコ絹糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項28または29に記載の単離された複合物。
- 架橋されている、請求項28または29に記載の単離された複合物。
- 非架橋である、請求項28または29に記載の単離された複合物。
- 少なくとも2つの同一でない繊維状ポリペプチドを含む、単離された複合物であって、前記少なくとも2つの同一でない繊維状ポリペプチドのうちの第1の繊維状ポリペプチドが、請求項1に記載の単離されたポリペプチドである複合物。
- 少なくとも2つの同一でない繊維状ポリペプチドを含む、単離された複合物であって、前記少なくとも2つの同一でない繊維状ポリペプチドのうちの第1の繊維状ポリペプチドが、請求項2に記載の単離されたポリペプチドである複合物。
- 前記繊維状ポリペプチドを、前記繊維状ポリペプチドと、多糖との間での結合を可能にする条件のもとで多糖と接触させて、請求項28または29に記載の単離された複合物を作製することを含む、請求項28または29に記載の単離された複合物を作製する方法。
- 前記接触後に前記複合物を架橋することをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記架橋することが、光化学的架橋、酵素的架橋、化学的架橋および物理的架橋からなる群から選択される方法によって達成される、請求項41に記載の方法。
- 前記複合物を追加の繊維状ポリペプチドにより被覆することをさらに含み、前記被覆することが、前記複合物を架橋した後で達成される、請求項41に記載の方法。
- 前記繊維状ポリペプチドを前記接触前に追加の繊維状ポリペプチドと結合することをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記追加の繊維状ポリペプチドは、イガイ足糸タンパク質、クモ絹糸タンパク質、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチンならびにそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項43または44に記載の方法。
- 前記多糖は、キチン、セルロース、デンプン、デキストラン、グルカン、キトサン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 軟骨または骨の疾患または状態を処置するための医薬品の製造のための、請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物の使用。
- 軟骨修復、膝修復、半月板修復、膝潤滑剤および椎間板修復のための請求項47に記載の使用。
- 尿失禁を処置するための医薬品の製造のための、請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物の使用。
- 請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物を含む足場。
- 治療効果的な量の請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物をその必要性のある対象に投与し、それにより、軟骨の疾患または状態を処置することを含む、軟骨または骨の疾患または状態を処置する方法。
- 前記投与することが局所的に達成される、請求項51に記載の方法。
- 前記局所的に投与することが関節内投与によって達成される、請求項52に記載の方法。
- 前記関節内投与は、膝関節、肘関節、股関節、胸鎖関節、額関節、手根関節、足根関節、手関節、足関節、椎間円板および黄色靱帯からなる群から選択される接合部の中への投与を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記軟骨の疾患または状態は、変形性関節炎、制限された関節可動性、痛風、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、軟骨溶解、強皮症、変性椎間板障害および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項51に記載の方法。
- 治療効果的な量の請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物をその必要性のある対象に投与し、それにより、尿失禁を処置することを含む、尿失禁を処置する方法。
- 前記投与することが、尿道を取り囲む領域への注入によって達成される、請求項56に記載の方法。
- 請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物を含む医薬組成物。
- 請求項28〜39のいずれかに記載の単離された複合物を含む美容用組成物。
- ゲル、ストリップ、注入物またはフォームとして配合される、請求項58または59に記載の医薬組成物または美容組成物。
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