CN104039965B

CN104039965B - 胶原蛋白样丝基因

Info

Publication number: CN104039965B
Application number: CN201280066644.XA
Authority: CN
Inventors: T·萨瑟兰; V·S·哈里斯; S·丰斯曼; J·A·M·拉姆尚; Y·Y·彭; S·岡田; A·A·沃克
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2012-11-15
Publication date: 2017-07-21
Anticipated expiration: 2032-11-15
Also published as: AU2012339619B2; CA2855152A1; HK1202579A1; US9394348B2; JP2015505667A; RU2014124139A; EP2780459A4; JP6317258B2; US20140288009A1; AU2012339619A1; BR112014011811A2; NZ626091A; WO2013071356A1; IN2014CN03884A; ZA201403539B; BR112014011811A8; CN104039965A; EP2780459A1

Abstract

本发明涉及可用于生产具有胶原蛋白样结构的丝的丝蛋白、以及编码这种蛋白的核酸。本发明还涉及合成丝蛋白的重组细胞和/或生物体。本发明的丝蛋白可用于各种目的，如在生产个人护理产品、塑料、纺织品和生物医学产品中。

Description

胶原蛋白样丝基因

技术领域

本发明涉及可用于生产具有胶原蛋白样结构的丝的丝蛋白，以及编码这样蛋白的核酸。本发明还涉及合成丝蛋白的重组细胞和/或生物体。本发明的丝蛋白可用于各种目的，例如生产个人护理产品、塑料、纺织品和生物医学产品。

背景技术

“丝”已经成为对极其广泛范围的生物材料单一的、包括所有的描述(Sutherland等人,2010)，所述生物材料是进化中的古老产品。丝通过广泛范围的昆虫来产生，例如通过昆虫的幼虫在蜕变期间为保护目的所形成的茧，通过成虫如丝蚁(webspinner)在前足上纺具有结构的丝以制造其居住的网样袋或廊，在膜翅目(Hymenoptera)(包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁)中的丝是巢构建的一部分，以及通过大量的其它节肢动物，最著名是各种蛛形纲例如蜘蛛，其中圆网(orb-web)通常用于捕获猎物(Sutherland等人,2010)。

丝是显示特殊强度和韧性的纤维蛋白分泌物，正因为如此成为广泛研究的靶标。通过超过30000种蜘蛛和很多昆虫产生丝。此外，与其它节肢动物相比，蜘蛛产生多于一种类型的丝，通常在5和7之间，每种具有不同性质对应不同用途，其中多数涉及网构建。这些丝中，用作生命线并用于网外缘和轮辐的大壶状丝(major ampullate silk)，也称为“曳丝”，已经引起很多关注，因为其每单位重量与钢一样强，却比钢更有韧性。

尽管结构和分布的多样性，丝有共同的特征，特别是作为半晶体材料，所述材料在无定形基质中具有有序分子结构(微晶)的区域，并且典型地也都显示出类似的蛋白组分，通常富含丙氨酸、丝氨酸和/或甘氨酸(Sutherland等人，2010)。

总体而言，这些丝已被表征的很少，其中大多数研究集中在家养蚕、家蚕(Bombyxmori)的茧丝和圆网蛛棒络新妇蛛(Nephila clavipes)、欧洲花园蛛、十字园蛛(Araneusdiadematus)和育儿网蛛(nursery web spider)、Euprosthenops australis(无对应中译文)的曳丝。

在鳞翅目和蜘蛛中，丝蛋白(fibroin)丝基因编码通常很大的蛋白质，所述蛋白覆盖交替疏水和亲水区块的广大区域且在每端具有突出的亲水端结构域(Bini等人,2004)。通常，这些蛋白质包含与β片层、β螺旋、α螺旋和无定形区域松散相关的β折叠片层的晶体阵列的不同组合(参见Craig和Riekel，2002综述)。

家养蚕家蚕(B.mori)、丝的齐备商业可用性意味着没有商业的驱动去制造重组蚕丝，尤其是考虑到在制造蛋白的重组产物中的困难，所述蛋白是如此之大且围绕高度重复的结构。这样的丝包括2条链；以1:1的比例的约390kDa的重链和约26kDa轻链，其中这2条链通过一个关键的二硫键相连。

可用于蜘蛛丝的完整序列数据非常有限。这是因为在研究高度重复结构中的困难(Arcidiacono等人，1998)。主要的实例包括黑寡妇蜘蛛的曳丝(Ayoub等人，2007)和棒络新妇蛛(Nephila clavipes)的鞭状丝(Hayashi和Lewis，2000)。尽管已经证明对茧丝的培养高度成功，然而对蜘蛛丝而言农业不是一种选择。主要的问题是大多数蜘蛛是非常区域性的、侵略性的以及食人的。然而，这意味着已经有相当大的努力去使用重组技术来生产蜘蛛丝。天然的蜘蛛曳丝非常强，虽然来自不同物种的曳丝表现出不同的性质，存在的丝的实例是重量比比钢强5倍，和/或比凯芙拉(Kevlar)(Dupont)的韧性大3倍(Gosline等人，1999，Volrath和Knight，2001)。所有曳丝都具有250-320kDa的高MW(Ayoub等人，2007)，其自身导致重组表达困难。曳丝通常由两种主要蛋白质、主要截断蜘蛛丝蛋白(major ampulatespidroins)所组成。

蜘蛛丝蛋白具有高度重复的结构；它们是模块化的，并且包含数百个不同一致基序的串联重复。MaSp1蜘蛛丝蛋白通常包含两个基序：多聚丙氨酸，和GlyGlyXaa，其中Xaa通常是亮氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸。MaSp2蜘蛛丝蛋白还含有聚丙氨酸，以及GlyProGlyXaaXaa重复，其中Xaa通常是甘氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸。多聚丙氨酸或聚(甘氨酰-丙氨酸)序列形成紧密包装的β-片层晶体。

最近，来自蜜蜂、非洲蜂(Apis melifera)的新结构丝已引起关注。早期X线证据(Rudall，1962)和不同的氨基酸组成表明具有α螺旋结构的丝分子的不同类存在于蜜蜂丝中。进一步的分析表明，存在四链卷曲螺旋(Atkins，1967)。最近的分子研究已经证实这点(Sutherland等人，2006)。已经鉴定出四个丝基因(AmelFibroin1-4)，其中每个包含单一外显子，被1659-1796个碱基的短区所分开的基因在非洲蜂基因组中顺序地结成簇。它们不含有其它丝的高度重复序列。因此，链的尺寸和结构通过重组方法可更容易地产生。蜜蜂丝可用作新的生物医学材料。例如，它可以被静电纺丝成具有大约200nm均匀纤维的片层。

由于丝纤维代表了一些已知最强天然纤维，所以丝纤维已经是广泛研究以试图再现其合成的主题。然而，与鳞翅目和蜘蛛丝蛋白的基因表达常出现的问题是在各种重组表达系统的低表达率，这是由于导致有害重组事件的重复核苷酸基序、大的基因尺寸和导致tRNA库消耗的每个氨基酸密码子数目少的组合。重组表达导致在翻译期间的困难，如作为密码子偏好以及密码子需求结果的翻译暂停、以及广泛的重组率导致基因截断。更短、更少重复序列将避免许多迄今为止与丝基因表达相关的问题。

很早发现丝作为生物医学材料应用，因为丝通常是生物相容的、可生物降解的并且具有低免疫原性。对生物医学应用而言，重组丝可以制作成各种格式。这些包括制作天然纤维、以及使用物理或化学交联的连接形成的水凝胶。还可以产生在性质上的变化以匹配特定临床需要，所以可以生产丝以应用在失败之前需要高压力中、或者需要延展性中，如在血管中，以及需要合适的系数以修改或控制细胞反应中，例如用于组织工程中(Vepari和Kaplan，2007)。例如，这种丝已用于形成无纺垫(Dal Pra等人，2004)，并已静电纺丝成具有从纳米到微米的纤维尺寸的纤维和纤维垫(Jin等，2002)。丝的丝蛋白薄膜可以从水性和非水性溶剂浇铸(Minoura等人，1990)。可以由丝溶液制造多孔海绵，例如通过使用作为致孔剂的盐或糖和在HFIP中(Nazarov等人，2004)、或者在全水系统(Kim等人，2005)中的丝蛋白进行。

在20世纪60年代初，通过X射线衍射图谱(pattern)获得的茧或来自醋栗叶蜂(Nematus ribesii)的唾液腺提取的丝纤维，表明一些叶蜂(膜翅目)的丝具有胶原蛋白结构(Rudall，1967和1968；Lucas和Rudall,1968)。X射线衍射图谱显示具有30A直径规格的胶原蛋白分子绞合线(twisted cable)-提示有两或三链线(Rudall，1967年和1968年)。具有胶原蛋白的X射线衍射图谱特征的蛋白质还发现于丝叶蜂(Nematini)族内其它物种的丝腺中：在赤杨条纹叶蜂(Hemichroa)、落叶松叶蜂(Pristiphora)、Pachynemalus(无对应中译文)、黄头叶蜂(Pikonema)和叶蜂属(Nematus)(丝角叶蜂(Nematinae)亚科)；在正桂花叶蜂(Tomostethus)和Tethida种(无对应中译文)(蔺叶蜂(Blennocampinae)亚科)的丝腺中的前半部分(Rudall和Kenchington，1971)。

醋栗叶蜂丝腺中内容物溶解于0.2M硼酸盐缓冲液之后，随后在乙醇中沉淀，获得下列氨基酸分析(从4种不同制备物中)：(甘氨酸：336(标准偏差＝16)；丙氨酸：122(2)；丝氨酸：33(12)；脯氨酸：100(3)；羟基赖氨酸：37(3)；赖氨酸：14(4)：Rudall和Kenchington，1971)。此分析表明，丝具有胶原蛋白特征的高甘氨酸含量以及具有高丙氨酸含量。然而，在茧和蜘蛛丝中也发现高丰度的这些氨基酸。

考虑由昆虫产生丝的独特性质、以及其仅以微量可被天然利用，需要鉴定编码丝蛋白的其它新核酸。

发明内容

本发明人已经鉴定许多编码与其它丝蛋白不同的丝蛋白的多核苷酸，所述其它丝蛋白已在一级氨基酸序列水平上表征。

因此，在第一方面本发明提供编码胶原蛋白样丝多肽的分离的和/或外源的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述多核苷酸包含以下的一种或多种：

i)如SEQ ID NO:7至12、22或23中任一个所示的核苷酸序列；

ii)编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1至6中任一个所示；

iii)编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至6中任一个或多个至少30％相同；

iv)编码ii)或iii)的生物活性片段的核苷酸序列；

v)与SEQ ID NO:7至12、22或23中任一个或多个至少30％相同的核苷酸序列；或者

vi)与i)至v)中的任一个或多个在严谨条件下杂交的序列。

更优选地，所述多核苷酸包含编码含有氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1至6中任一个或多个至少95％相同。

在特别优选的实施方案中，所述多核苷酸编码本发明的多肽。

在另一方面，本发明提供包含至少一种本发明的多核苷酸的载体。

在优选的实施方案中，所述载体是表达载体。更优选地，在所述表达载体中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。

在另一方面，本发明提供包含至少一种本发明的多核苷酸、和/或至少一种本发明的载体的宿主细胞。

所述宿主细胞可为任何细胞类型。实例包括而不限于细菌、酵母、动物或植物细胞。在优选的实施方案中，所述细胞是细菌细胞。

在另一方面，本发明提供基本上纯化的和/或重组的胶原蛋白样丝多肽。

在一个实施方案中，所述多肽包含以下的一种或多种：

i)如SEQ ID NO:1至6中任一个所示的氨基酸序列；

ii)与SEQ ID NO:1至6中任一个或多个至少30％相同的氨基酸序列；或者

iii)i)或ii)的生物活性片段。

在一个实施方案中，胶原蛋白样丝多肽具有、或能够在合适条件下形成三螺旋结构。

优选地，所述多肽可从膜翅目种中纯化。

优选地，所述膜翅目的属是赤杨条纹叶蜂(Hemichroa)、落叶松叶蜂(Pristiphora)、Pachynemalus(无对应中译文)、黄头叶蜂(Pikonema)、正桂花叶蜂(Tomostethus)、Tethida(无对应中译文)或叶蜂属(Nematus)(例如，醋栗叶蜂(Nematusribesii)或寡斑叶蜂(Nematus oligospilus))。

在另一实施方案中，所述多肽融合到至少一种其它多肽。在优选的实施方案中，至少一种其它多肽选自：提高本发明多肽稳定性的多肽、协助融合蛋白纯化的多肽、促进三螺旋形成的多肽、以及协助本发明的多肽从细胞中分泌(例如，从细菌细胞中分泌)的多肽。这样的融合蛋白的实例如SEQ ID NO:16至18所示。

在又一方面，本发明提供非人转基因生物体，其包含本发明的外源多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种根据本发明的多肽。

在一个实施方案中，所述转基因生物体是植物或转基因非人动物。

还提供用于制备本发明多肽的方法，所述方法包括在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养一种或多种本发明的宿主细胞、本发明的载体、本发明的转基因生物体，并回收表达的多肽。本领域技术人员将理解，在表达系统中培养载体也称为无细胞表达。

模拟天然蛋白的哺乳动物胶原蛋白需要与脯氨酰-4-羟化酶共表达。脯氨酰-4-羟化酶的共表达在细菌中非常有问题，通常在酵母中尤其是毕赤酵母(Pichia)中实现表达。然而，毕赤酵母需要甲醇来诱导，其中存在加入氧气以得到合适的羟基化意味着发酵需要防火系统。因此，在优选的实施方案中，用于制备本发明多肽的方法不包括脯氨酰-4-羟化酶的表达/存在。

在其它实施方案中，所述方法还包括从多肽中生产产品，例如个人护理产品、纺织品、塑料和生物医学产品。

在另一方面，本发明提供特异性地结合本发明多肽的分离和/或重组抗体。

在又一方面，本发明提供包含至少一种本发明多肽的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒。

优选地，所述多肽是重组多肽。

在另一方面，本发明提供包含至少两个本发明多肽的共聚物。

优选的，所述多肽是重组多肽。

在另一方面，本发明提供包含至少一种本发明多肽、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、或至少一种本发明的共聚物中的一种或多种的产品。

本发明产品的实例包括而不限于个人护理产品、纺织品、塑料和生物医学产品。

在一个实施方案中，在本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶、颗粒、共聚物、或产品中的至少一些多肽是交联的。

在优选的实施方案中，本发明的产品不是，例如由昆虫诸如叶蜂产生的茧的产品。

在另一方面，本发明提供组合物，其包含至少一种本发明多肽、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、或至少一种本发明的共聚物中的一种或多种，以及一种或多种可接受的载体。

在一个实施方案中，所述组合物进一步包含药品。

在另一个实施方案中，所述组合物用作药物、医疗设备或化妆品。

在又一方面，本发明提供包含至少一种本发明的多核苷酸、以及一种或多种可接受的载体的组合物。

在还一方面，本发明提供用于生产含有胶原蛋白样丝多肽的产品的方法，所述方法包括：

i)获得胶原蛋白样丝多肽；以及

ii)加工所述多肽以生产产品。

技术人员将理解，加工步骤的性质将取决于最终产品的形式，以及加工步骤可采取很多在技术人员能力内的不同形式。例如，可通过纺织所述多肽以生产纤维接着编织所述纤维以生产产品来生产含丝纤维的产品。

通常，胶原蛋白样丝多肽将通过执行用于制备本发明多肽的方法来获得、或获自已经完成此方法的第三方。

在另一方面，本发明提供治疗或预防疾病的方法，所述方法包括施用含有至少一种用以治疗或预防疾病的药品以及药学上可接受的载体中的一种或多种的组合物，其中所述药学上可接受的载体选自至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种本发明的共聚物、至少一种本发明的产品、或者至少一种本发明的组合物。

还提供至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种本发明的共聚物、至少一种本发明的产品、或者至少一种本发明的组合物中的一种或多种，以及至少一种药品在制造用于治疗或预防疾病的药物中的用途。

此外，提供至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种本发明的共聚物、至少一种本发明的产品、或者至少一种本发明的组合物中的一种或多种、以及至少一种药品作为治疗或预防疾病的药物的用途。

在再一方面，本发明提供试剂盒，其包含至少一种本发明的多肽、至少一种本发明的多核苷酸、至少一种本发明的载体、至少一种本发明的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种本发明的共聚物、至少一种本发明的产品、或者至少一种本发明的组合物中的一种或多种。

除非另有特别说明，在本文中的任何实施方案应当对任何其它实施方案加以必要修正。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案仅旨在示例目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法明确地在本发明的范围内。

整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，提到单一步骤、物质的组合物、步骤组或物质的组合物的组应包含那些步骤、物质的组合物、步骤组或物质的组合物的组中的一个或多个(即，一个或更多个)。

本发明在下文中通过下述非限制性实例以及参考附加的附图进行描述。

附图说明

图1：使用ExPASy(ETH)程序比对胶原蛋白样结构域(SEQ ID NO:13至15)。

图2：叶蜂丝蛋白表达的考马斯蓝染色SDS PAGE凝胶。

MW：分子量标记物；A：cDNA SF21的表达；B：SF9cDNA的表达；C：V-SF30cDNA的表达。

图3：SF9、SF21、SF30、牛胶原蛋白以及纤连蛋白与纤维母细胞的结合。

图4：重组叶蜂丝蛋白是胶原蛋白的生物物理证据。上(A)：经SDS PAGE分离后每种丝蛋白的全长和胃蛋白酶抗性(+P)片段。对SfC B链观察到不完全消化。在左侧显示分子量标准(kDa)。(B)纯化的重组叶蜂茧胶原蛋白经胃蛋白酶处理后的圆二色性光谱在约220nm处显示表征的胶原蛋白最大值，SfC A(----)、SfC B(-··-··)和SfC C(---)。实线(————)显示典型的胶原蛋白光谱。

序列表索引

SEQ ID NO:1—叶蜂胶原蛋白样丝多肽A型序列。

SEQ ID NO:2—无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽A型序列。

SEQ ID NO:3—叶蜂胶原蛋白样丝多肽B型序列

SEQ ID NO:4—无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽B型序列。

SEQ ID NO:5—叶蜂胶原蛋白样丝多肽C型序列。

SEQ ID NO:6—无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽C型序列。

SEQ ID NO:7—编码叶蜂胶原蛋白样丝多肽A型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:8—编码无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽A型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:9—编码叶蜂胶原蛋白样丝多肽B型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:10—编码无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽B型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:11—编码叶蜂胶原蛋白样丝多肽C型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:12—编码无信号序列的叶蜂胶原蛋白样丝多肽C型序列的开放阅读框。

SEQ ID NO:13：A型丝蛋白的胶原蛋白样结构域(图1)。

SEQ ID NO:14：B型丝蛋白的胶原蛋白样结构域(图1)。

SEQ ID NO:15：C型丝蛋白的胶原蛋白样结构域(图1)。

SEQ ID NO:16：A型胶原蛋白样丝融合蛋白(实施例2)。

SEQ ID NO:17：B型胶原蛋白样丝融合蛋白(实施例2)。

SEQ ID NO:18：C型胶原蛋白样丝融合蛋白(实施例2)。

SEQ ID NO:19：编码SEQ ID NO:16的开放阅读框。

SEQ ID NO:20：编码SEQ ID NO:17的开放阅读框。

SEQ ID NO:21：编码SEQ ID NO:18的开放阅读框。

SEQ ID NO:22：用于细菌表达的密码子优化的开放阅读框A型(无信号)。

SEQ ID NO:23：用于细菌表达的密码子优化的开放阅读框B型(无信号)。

具体实施方式

通用技术和定义

除非另有特别定义，本文使用的所有技术和科学术语应与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、重组生物学、丝技术、免疫学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常理解的意思相同。

除非另有说明，本发明使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术采用标准操作，是本领域技术人员熟知的。这些技术描述和解释于以下来源的文献中，如：J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)、J.Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology:A Practical Approach，第1和第2卷，IRL Press(1991)、D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning:A PracticalApproach，1-4卷，IRL Press(1995和1996)以及F.M.Ausubel等人(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括至今所有的更新)、Ed Harlow和David Lane(编辑)，Antibodies:A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour Laboratory(1988)和J.E.Coligan等人(编辑)CurrentProtocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括至今所有的更新)，这些文献通过引用合并于此。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意思是“X和Y”或“X或Y”，以及对两个意思或对任一意思提供明确支持。此外，含有在倒数第二个和最后一个特征之间的短语“和/或”的列表或特征指任何一个或多个所列出的特征可以任意组合存在。

如本文所用，除非有相反说明，术语约指的是指定值的+/-20％，更优选为+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-1％。

如本文所用，术语“丝蛋白”和“丝多肽”是可用来生产丝纤维和/或纤维蛋白复合体的纤维蛋白质/多肽。

胶原蛋白是一种在动物中发现的天然存在的蛋白，尤其是在哺乳动物的肌肉和结缔组织中。胶原蛋白是结缔组织的主要成分，是哺乳动物中最丰富的蛋白，其构成整体蛋白含量的多达约25％至35％。在哺乳动物包括人中，存在29种定义的类型，每个具有不同结构(组成)和功能。细长纤维形式的胶原蛋白主要在纤维组织如腱、韧带和皮肤中发现。胶原蛋白由三螺旋组成，其常存在为两个相同的链(α1)和另一在其化学组成上稍有不同的链(α2)。胶原蛋白的氨基酸组成对蛋白质而言是非典型的，特别是关于其高羟脯氨酸含量的方面。胶原蛋白的氨基酸序列中最常见的基序是甘氨酸-X-羟脯氨酸和甘氨酸-脯氨酸-Y，其中X和Y可以是任何氨基酸，虽然存在对某些组合的优选(Ramshaw等人，1998)。如本文所用，术语“胶原蛋白样”是指包含甘氨酸-X-Y三联体的多肽，其中X和Y可以是任何氨基酸。本发明的丝蛋白也可以被称为“胶原蛋白丝”蛋白。在一个特别优选的实施方案中，与胶原蛋白不同，本发明的胶原蛋白样丝蛋白没有任何羟脯氨酸。优选地，本发明的胶原蛋白样丝蛋白包含至少约40，更优选至少约50个甘氨酸-X-Y三联体。此外，优选甘氨酸-X-Y三联体构成蛋白质的一级氨基酸序列的至少约40％，更优选至少约50％。在一个实施方案中，本发明的胶原蛋白样丝多肽具有，或者是能够在合适条件下形成三螺旋结构。在一个实施方案中，本发明的胶原蛋白样丝蛋白抗胰蛋白酶消化。

如本文所用，“丝纤维”指含有本发明蛋白质可被织成不同物品如纺织品的长丝(filament)。此术语不包括天然存在的丝纤维，如昆虫的茧。

如本文所用，“共聚物”是指含有两个或更多本发明丝蛋白(例如，本文定义的A型和B型胶原蛋白样丝蛋白)的组合物。此术语不包括天然存在的共聚物，如昆虫的茧。

如本文所用，当指如在本发明的丝纤维中的多肽时，术语“至少一个”不意味着丝纤维仅包含单一的多肽分子，而指存在所述多肽的同质群(例如，A型胶原蛋白样丝蛋白)，而不存在本发明的其它相关分子(例如，B型和/或C型胶原蛋白样丝蛋白)。

术语“植物”包括整个植物、营养结构(例如叶、茎、根)、花器官/结构、种子(包括胚、胚乳和种皮)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞以及其后代。

“转基因植物”是指含有在同种、变种或栽培品种的野生型植物中未发现的基因构建体(“转基因”)的植物。本文所指“转基因”具有生物技术领域标准意思，包含通过重组DNA或RNA技术产生的或改变的并被引入植物细胞的遗传序列。转基因可包括源自植物细胞的遗传序列。通常地，转基因通过诸如转化之类的人工操作引入植物中，但如本领域技术人员认可的任何方法都可用。

“多核苷酸”是指寡核苷酸、核酸分子或其任何片段。其可以是基因组或合成来源的双链或单链的DNA或RNA，可以与糖类、脂质、蛋白质或其它材料组合来执行本文限定的特定活性。

如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多的核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。典型地，是指转录调节元件对所转录的序列之间的功能关系。例如，如果启动子在适当的宿主细胞中刺激或调节编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码序列，如本文所限定的多核苷酸。一般而言，可操作地连接到转录序列的启动子转录调节元件与所转录的序列是物理上相邻的(contiguous)，即它们是顺式作用。然而，一些转录调节元件，如增强子不必与其所增强转录的编码序列在物理上相邻或位于紧邻的位置。

术语“信号肽”是指分泌的成熟蛋白之前的氨基末端多肽。信号肽被切除，因而并不出现在成熟蛋白质中。信号肽具有指导和反式定位分泌蛋白质穿过细胞膜的功能。信号肽也称为信号序列。

如本文所用，“转化”是指通过并入多核苷酸在细胞中获得新基因。

如本文所用，术语“药品”是指能被用来治疗或预防特定疾病的任何化合物，可通过本发明的丝蛋白配制的药品的实例包括但不限于蛋白质、核酸、抗肿瘤剂、镇痛剂、抗生素、抗炎化合物(类固醇类和非类固醇类都包括)、激素、疫苗、标记物质等等。

多肽

通过“基本上纯化的多肽”或“纯化多肽”意思是一般从在其天然状态下结合的脂质、核酸、其它多肽和其它污染分子诸如蜡中所分离出的多肽。除了本发明的其它蛋白以外，所述的基本上纯化的多肽优选地至少60％的游离，更优选地至少75％的游离，更优选地至少90％的游离于其天然结合的其它成分。在另一方面，本发明涉及天然中不存在的本发明的胶原蛋白样丝蛋白的同质群，或含有其的组合物、单一型。

在多肽的背景中，术语“重组”是指通过细胞或在无细胞表达系统中与其天然状态相比以改变量或改变速率而产生多肽。在一个实施方案中，所述的细胞是天然不产生所述多肽的细胞。然而，所述的细胞可以是含有导致所述待产多肽量改变，优选增加的非内源基因的细胞。本发明的重组多肽包括尚未从产生其的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其它成分中分离出来的多肽，以及在这样细胞或无细胞系统中产生而后从至少一些其它成分中纯化出来的多肽。

术语“多肽”和“蛋白质”一般可相互替换的使用，指单多肽链，其可或不可通过添加非氨基酸基团而修饰。在一个实施方案中，本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”也包括本文所述的本发明的多肽的变体、突变体、修饰物、类似物和/或衍生物。

多肽的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，其缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。查询序列至少50个氨基酸长，GAP分析在至少跨50个氨基酸的区域比对两条序列。更优选地，查询序列是至少100个氨基酸长，GAP分析在跨至少100个氨基酸的区域比对两条序列。甚至更优选地，查询序列至少250个氨基酸长，GAP分析在跨至少250个氨基酸的区域比对两条序列。甚至更优选地，GAP分析跨两条序列全长进行比对。

如本文所用，“生物活性”片段是指本发明多肽的一部分，其保持了全长多肽的限定活性，即用于产生丝的能力。只要生物活性片段保持了所述限定活性，其可为任意长度。优选地，生物活性片段是，当相关时，至少100，更优选至少200，以及甚至更优选至少225个氨基酸长。在一个实施方案中，本发明的“生物活性”片段包括本发明多肽的胶原蛋白样结构域，如在图1中所提供的那些。

对于所限定的多肽，应理解比上述那些％同一性数值高的％同一性数值包括优选的实施方案。因此，在适用的情况下，根据最低％同一性数值，优选所述多肽含有与相应的指定SEQ ID NO具有下述同一性的氨基酸序列：优选至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，以及甚至更优选至少99.9％。

本发明多肽的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核酸中引入适当核苷酸改变而制备，或通过体外合成所需的多肽。这样的突变体包括，例如在氨基酸序列内进行残基的删除、插入或取代。只要最终多肽产物具有所需特性，可进行删除、插入和取代的组合来实现最终的构建体。

突变(改变的)多肽可通过本领域已知的任何技术制备。例如，可对本发明的多核苷酸进行体外诱变。这样的体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到适当的载体，转化载体到“突变”株，如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)上，并使转化的细菌繁殖适当代的世代。另一个实例中，对本发明的多核苷酸进行如Harayama(1998)明白描述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可包括本发明可能的基因，并还有与本发明那些基因相关的基因，如来自本文表征具体物种之外的其它膜翅目物种的丝基因。突变/改变的DNA来源的产物可通过本文描述的技术容易地筛选确定它们是否可用作丝蛋白。

在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将依赖于待修饰的特征。可对突变的位点进行单独修饰，或进行一系列修饰，例如通过(1)首先用保守氨基酸选择进行取代，然后根据达到的结果用更激进的选择进行取代，(2)删除靶残基，或(3)在定位位点的相邻处插入其它残基。

氨基酸序列删除一般在约1到150个残基的范围内。

取代突变体在多肽分子中具有至少一个氨基酸残基的去除并在其位置插入一个不同残基。最感兴趣的取代诱变位点包括鉴定为对功能重要的位点。其它感兴趣的位点是那些获自不同株或物种的特定残基相同的位点。这些位置对于生物活性可以是重要的。对这些位点，尤其是在落入至少三个其它相同保守位点的序列内的那些，优选地通过相对保守的方式进行取代。这样保守取代显示在表1中，标题为“示例取代”。

表1：示例取代

原始残基	示例取代
		Ala(A)	val；leu；ile：ser；thr
Arg(R)	lys
		Asn(N)	gln：his
Asy(D)	glu
		Cys(C)	set；thr；ala；gly；Val
Gln(Q)	asn；his
		Glu(E)	asp
Gly(G)	pro：ala：ser；val；thr
		His(H)	asn；gln
Ile(I)	leu；val；ala；met
		Leu(L)	ile；val；met；ala；phe
Lys(K)	arg
		Met(M)	leu；phe
Phe(F)	leu；val；ala
		Pro(P)	ala；ser；thr
Ser(S)	thr；ala；val；gln
		Thr(T)	ser；gln；ala
Trp(W)	tyr
		Tyr(Y)	trp；phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；ser；thr

在一个特别优选的实施方案中，与胶原蛋白不同，本发明的胶原蛋白样丝蛋白没有任何羟脯氨酸。

优选地，本发明的胶原蛋白样丝蛋白含有至少约40，更优选至少约50甘氨酸-X-Y三联体，其中X和Y可以是任何氨基酸。在另一实施方案中，本发明的胶原蛋白样丝蛋白含有在约40至约150个之间，更优选在约50和约100个之间的甘氨酸-X-Y三联体。

在另一优选的实施方案中，甘氨酸-X-Y三联体组成蛋白的一级氨基酸序列的至少约40％、更优选至少约50％。

关于氨基酸取代，特别是在胶原蛋白样结构域中的氨基酸取代的其它指南可见于Persikov等人(2005)。

在一个实施方案中，优选在Y位置的取代不是具有分支β-碳的氨基酸。

在一个实施方案中，如SEQ ID NO：2、4和6所示的多肽含有N末端蛋氨酸。

在一个实施方案中，本发明的胶原蛋白样丝多肽具有或能够在合适条件下形成三螺旋结构。丝蛋白折叠成三螺旋结构可通过添加(例如，作为融合蛋白生产)三螺旋启动序列，例如来自化脓链球菌(S.pyogene)的Sc12V-结构域增强。

在另一实施方案中，本发明的多肽(和/或融合蛋白)含有能够形成三螺旋结构的胶原蛋白样结构域的多聚体或其片段(这样结构域的实例提供在图1中)。所述多聚体可包含来自本发明的许多不同多肽的胶原蛋白样结构域或其片段，或包含相同结构域或其片段的一致重复。重复的数目可以是，例如4至15，或5至12。

此外，如果需要，非天然氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代或加入而引入本发明的多肽中。这样氨基酸包括但不限于一般氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸环己酯、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般的氨基酸类似物。

本发明的范围内也包括在合成过程中或合成后进行不同修饰的本发明多肽，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白酶切、连接抗体分子或其它细胞配体等。这些修饰可能起到增强本发明多肽的稳定性和/或生物活性的作用。

本发明多肽可通过许多方法生产，包括天然多肽的生产和回收、重组多肽的生产和回收以及多肽的化学合成。在一个实施方案中，本发明的分离多肽通过在有效产生所述多肽的条件下培养能够表达所述多肽的细胞，并回收所述多肽而产生。优选待培养细胞为本发明的重组细胞。有效的培养条件包括但不限于允许多肽生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效培养基是指任何培养基，其中培养细胞以产生本发明的多肽。这样的培养基通常包括含有可同化碳、氮和磷酸盐来源，以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养素如维生素的水性培养基。本发明的细胞可通过传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘以及平皿(Petri plate)中培养。培养可在适合重组细胞的温度、pH和氧气含量的背景中进行。这样的培养条件在本领域普通技术人员的专业范围内。

多核苷酸

通过“分离多核苷酸”，包括以正义或反义方向或两者组合的DNA、RNA或其组合、单链或双链、dsRNA或其它，其指至少部分地从在其天然状态下相连或连接的多核苷酸序列中分离出来的多核苷酸。优选地，分离多核苷酸至少60％游离、优选地至少75％游离、最优选地至少90％游离于其天然相连的其它成分。此外，术语“多核苷酸”与术语“核酸”在本文中可相互取代。

在多核苷酸背景中，术语“外源的”是指与其天然状态相比以改变量存在于细胞或无细胞表达系统中的多核苷酸。在一个实施方案中，所述的细胞是在天然状态下不含有所述多核苷酸的细胞。然而，所述细胞可以是含有导致编码多肽产量改变，优选增加的非内源多核苷酸的细胞。本发明的外源多核苷酸包括尚未从其存在的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其它成分中分离出来的多核苷酸，以及在这样的细胞或无细胞系统中产生而后从至少一些其它成分中纯化出来的多核苷酸。

多核苷酸的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定，其缺口产生罚分＝5，缺口延伸罚分＝0.3。除非另有说明，查询序列至少45个核苷酸长，GAP分析在跨至少45个核苷酸的区域比对两条序列。优选地，查询序列至少150个核苷酸长，GAP分析在跨至少150个核苷酸的区域比对两条序列。更优选地，查询序列至少300个核苷酸长，GAP分析在跨至少300个核苷酸的区域比对两条序列。甚至更优选地，GAP分析对两条序列的全长进行比对。

对于所限定的多核苷酸，应理解高于以上提供的那些的％同一性数值包括优选的实施方案。因此，在适用时，根据最低％同一性数值，优选本发明的多核苷酸含有与相应的指定SEQ ID NO具有下述同一性的序列：至少40％，更优选地至少45％，更优选地至少50％，更优选地至少55％，更优选地至少60％，更优选地至少65％，更优选地至少70％，更优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，更优选地至少93％，更优选地至少94％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，更优选地至少99％，更优选地至少99.1％，更优选地至少99.2％，更优选地至少99.3％，更优选地至少99.4％，更优选地至少99.5％，更优选地至少99.6％，更优选地至少99.7％，更优选地至少99.8％，甚至更优选地至少99.9％。

本发明的多核苷酸可包括与天然存在的分子相比的一个或多个突变，其为核苷酸残基缺失、插入或取代。突变体可以是天然发生的(即，从天然来源分离的)，或合成的(例如，在该核酸上进行位点定向诱变)。

本发明的寡核苷酸和/或多核苷酸在严谨的条件下与本发明的丝基因或所述基因侧翼区杂交。本文所用的术语“严谨的杂交条件”等是指本领域熟悉的参数，包括随寡核苷酸长度改变杂交温度。核酸杂交参数可见于编纂这种方法的参考文献中，如Sambrook等人(见前述)和Ausubel等人(见前述)。例如，本文所用的严谨的杂交条件，可指在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％聚蔗糖、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白(BSA)、2.5mMNaH₂PO₄(pH7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中65℃杂交，然后在50℃下0.2×SSC、0.01％BSA中洗一次或更多。或者，核酸和/或寡核苷酸(也可称为“引物”或“探针”)在核酸扩增技术如PCR中所用的条件下与目标昆虫基因组区，如叶蜂属(Nematus sp)的基因组进行杂交。

本发明的寡核苷酸可为RNA、DNA或其衍生物。尽管术语多核苷酸和寡核苷酸有重叠意思，寡核苷酸通常是指相对短的单链分子。这种寡核苷酸的最小尺寸为寡核苷酸与靶核酸分子上的互补序列形成稳定杂交所需的尺寸。优选地，所述寡核苷酸是至少15个核苷酸长，更优选地至少18个核苷酸长，更优选地至少19个核苷酸长，更优选地至少20个核苷酸长，甚至更优选地至少25个核苷酸长度长。

一般而言，多核苷酸或寡核苷酸单体通过磷酸二酯键或其类似物连接形成从相对短的单体单元如12-18个到几百个单体单元大小的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括：磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷硒酰(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、硫代磷酸苯胺(phosphoroanilothioate)、磷酸苯胺(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯。

本发明包括寡核苷酸，其可用作例如鉴定核酸分子的探针、或产生核酸分子的引物。用作探针的本发明寡核苷酸通常与可检测的标记物，如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子相结合。

重组载体

本发明的一个实施方案包括一种重组载体，其包括至少一种本发明的分离多核苷酸分子，所述分离多核苷酸分子被插入到能够将多核苷酸分子递送到宿主细胞的任何载体中。这样的载体包括异源多核苷酸序列，其为那些并非发现天然相邻于本发明多核苷酸分子的多核苷酸序列，并且优选地来源于与多核苷酸分子来源物种不同的物种。所述载体可为RNA或DNA，原核的或真核的，且典型地为转座子(诸如US 5,792,294中所描述的)、病毒或质粒。

一种类型的重组载体包括可操作地连接到表达载体的本发明的多核苷酸分子。短语可操作地连接是指将多核苷酸分子以转化入宿主细胞中时该分子能够表达的方式插入到表达载体中。本文所用的表达载体是指能够转化宿主细胞并有效表达指定多核苷酸分子的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能够在宿主细胞内复制。表达载体可为原核的或真核的，典型地为病毒或质粒。本发明的表达载体包括任何在本发明重组细胞中发挥功能(即指导基因表达)的载体，包括在细菌、真菌、内寄生物、节肢动物、动物和植物细胞中。本发明特别优选的表达载体可在植物细胞中指导基因表达。本发明的载体也可用于在无细胞表达系统中产生多肽，这样的系统是本领域熟知的。

特别地，本发明的表达载体包括如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点等调节序列，以及其它与重组细胞兼容的和控制本发明多核苷酸分子表达的调节序列。特别地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些，如启动子、增强子、操纵子和阻遏序列。适当的转录控制序列包括能够在至少一种本发明重组细胞中发挥功能的任何转录控制序列。许多这样的转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物、植物或哺乳动物细胞中发挥功能的序列，例如而不局限于：tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α交配因子、毕赤酵母乙醇氧化酶、α病毒亚基因组启动子(如Sindbis病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(如中间体早期启动子)、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复、劳氏肉瘤病毒、热休克、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列，以及其它能够在原核或真核细胞中控制基因表达的序列。

有用的表达载体的实例包括而不限于pColdI、pColdII、pColdIII和pColdIV(pCold载体信息：http://catalog.takarabio.co.jp/en/product/basic_info.asp？uni-tid＝U100005856)

特别优选的转录控制序列为在植物中具有指导转录活性的启动子，可以是组成型的或阶段型和/或组织特异性的，取决于所用的植物或其部分。植物启动子包括但不限于表现为组成型表达的启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；叶特异性表达的启动子，如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子；根特异性表达的启动子，如来自谷氨酰胺合酶基因的启动子；种子特异性表达的启动子，如来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的十字花科蛋白(cruciferin)A启动子；块茎特异性表达的启动子，如来自马铃薯的Ⅰ类马铃薯糖蛋白(patatin)启动子；或果实特异性表达的启动子，如来自番茄的多聚半乳糖醛酸酶(PG)启动子。

本发明的重组分子也可(a)包含分泌信号(即信号片段核酸序列)以使本发明的表达多肽从产生多肽的细胞中分泌出来和/或(b)包含融合序列，所述融合序列导致本发明的核酸分子作为融合蛋白表达。合适信号片段的实例包括能够指导本发明多肽分泌的任何信号片段。优选的信号片段包括但不限于组织纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)、干扰素、白介素、生长激素、病毒包膜糖蛋白信号片段、Nicotiana nectarin(无对应中译文)信号肽(US5,939,288)、烟草伸展蛋白信号、大豆油质蛋白油体结合蛋白信号、拟南芥(Arabidopsisthaliana)液泡碱性几丁质酶信号肽，以及本发明多肽的天然信号序列。此外，本发明核酸分子可连接到指导所编码的多肽到蛋白酶体的融合片段上，如泛素融合片段。重组分子也可包括本发明核酸序列周围和/或内部的干扰和/或非翻译序列。

宿主细胞

本发明另外一个实施方案包括重组细胞，其含有本发明的一种或多种重组分子转化的宿主细胞，或其后代细胞。可通过任何能够将多核苷酸分子插入细胞中的方法将多核苷酸分子转化进入细胞。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附和原生质融合。重组细胞可保持为单细胞或可长成组织、器官或多细胞生物体。转化的本发明多核苷酸分子可以保留其表达能力的方式保持在染色体外，也可整合到被转化(即重组)细胞染色体上的一个或多个的位点。

待转化的合适宿主细胞包括可使用本发明多核苷酸转化的任何细胞。本发明宿主细胞能够内源地(即天然地)产生本发明多肽，或者使用至少一种本发明多核苷酸分子转化后能够产生这样的多肽。本发明的宿主细胞可为能够产生至少一种本发明蛋白质的任何细胞，包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌(Salmonella)、埃希菌属(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、酵母(Saccharomyces)、夜蛾(Spodoptera)、分枝杆菌(Mycobacteria)、粉夜蛾属(Trichoplusia)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如COS-7)细胞和Vero细胞。更多的宿主细胞实例是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，包括减毒菌株；贪食夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；以及非致瘤性小鼠生肌G8细胞(例如ATCC CRL1246)。其它适当的哺乳动物细胞宿主包括其它肾细胞系、其它成纤维细胞系(如人、小鼠、鸡胚成纤维细胞系)、骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。特别优选的宿主细胞是植物细胞，例如从DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物收藏所)可获得的那些。

重组DNA技术可用来改善转化的多核苷酸分子的表达，通过操作如宿主细胞内多核苷酸分子的拷贝数、那些多核苷酸分子转录的效率、产生的转录本翻译的效率，以及翻译后修饰的效率等。可用于提高本发明多核苷酸分子表达的重组技术包括但不限于多核苷酸分子可操作地连接到高拷贝数的质粒、多核苷酸分子整合到一个或多个的宿主细胞染色体中、向质粒中加入载体稳定性序列、取代或修饰转录控制信号(如启动子、操纵子、增强子)、取代或修饰翻译控制信号(如核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列)、修饰本发明多核苷酸分子以符合宿主细胞使用的密码子，以及删除使转录本不稳定的序列。

转基因植物

术语“植物”是指整株植物、植物器官(如叶、茎、根等)、种子、植物细胞等等。本发明实践中考虑使用的植物包括单子叶植物和双子叶植物。靶植物包括但不限于下列：谷类(小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、高粱和相关作物)；甜菜属(甜菜和饲用甜菜)；梨果、核果和软果(苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃、草莓、覆盆子和黑莓)；豆科植物(豆类、扁豆、豌豆、大豆)；油料作物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)；黄瓜植物(西葫芦、黄瓜、甜瓜)；纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)；柑橘类水果(橙、柠檬、葡萄柚、蜜桔)；蔬菜(菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、红辣椒)；樟科(酪梨、肉桂、樟脑)；或如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶、藤、蛇麻花、草、香蕉和天然橡胶植物的植物，以及观赏植物(花、灌木、阔叶树和常绿植物，如松柏类)。

本发明背景中限定的转基因植物包括植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代，其通过使用重组技术进行遗传修饰以在所需的植物或植物器官中产生本发明的至少一种多肽。转基因植物可使用本领域已知的技术产生，如那些一般描述于A.Slater等人，Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants，(牛津大学出版(2003))，以及P.Christou和H.Klee，Handbook of Plant Biotechnology，John Wiley和Sons(2004))。

本发明多核苷酸可在转基因植物发育所有阶段组成型地表达。根据所用植物或植物器官，所述的多肽可通过阶段特异性方式表达。此外，所述的多核苷酸可组织特异性的表达。

在本发明中可用已知的或发现使编码目标多肽的基因在植物中表达的调节序列。对所用调节序列的选择取决于目标的靶植物和/或靶器官。这样的调节序列可获自植物或植物病毒，或可通过化学合成。这样的调节序列是本领域技术人员熟知的。

组成型植物启动子是公知的。除上述的启动子外，一些其它适当的启动子包括但不限于胭脂碱合酶启动子、章鱼碱合酶启动子、CaMV35S启动子、核酮糖-1,5二磷酸羧化酶启动子、基于Adhl的pEmu、Actl、SAM合酶启动子、Ubi启动子以及叶绿素a/b结合蛋白的启动子。或者，可能需要使得转基因以受调节的方式表达。通过将丝蛋白的编码序列置于组织特异性、发育特异性或可诱导启动子的控制下可能调节多肽表达。植物中已经报道若干组织特异性的调节基因和/或启动子。其包括编码种子贮藏蛋白(如napin(无对应中译文)、十字花科蛋白(cruciferin)、β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)、大豆球蛋白和菜豆球蛋白)、玉米醇溶蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)、或涉及脂肪酸生物合成的基因(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(FAD2-I))和其它胚胎发育过程中表达的基因(如Bce4)。对种子特异性表达特别有用的为豌豆球蛋白启动子。其它用于在成熟叶中表达的启动子是那些衰老开启时转换的启动子，如来自拟南芥的SAG启动子。US 4,943,674讨论了一类表达在开花期或在开花期经过果实发育，至少到开始成熟期间的果实特异性的启动子。其它组织特异性启动子的实例包括在块茎中(如马铃薯糖蛋白基因启动子)和纤维细胞中(一个受发育调节的纤维细胞蛋白的实例是E6纤维)指导表达的启动子。

其它调节序列如终止子序列和多腺苷酸化信号包括任何在植物中发挥如此功能的这样的序列，其选择对于本领域技术人员是显而易见的。由于终止区似乎是相对可相互替换的，因而将主要根据方便选择表达盒中使用的终止区。所用的终止区可以是与转录起始区天然配套的、可以是与目标多核苷酸序列天然配套的或者可以是来自于其它来源。终止区可以是天然存在的，或完全或部分合成的。方便的终止区可获自农杆菌(A.tumefaciens)Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区或来自β菜豆球蛋白的基因、化学诱导的植物基因、pIN。

一些技术可用于向靶植物引入含有编码目标多肽的核酸序列的表达构建体。这种技术包括但不限于用钙/聚乙二醇方法转化原生质体、电穿孔和显微注射或(包被的)粒子轰击。除了这些称为直接DNA转化法之外，涉及载体的转化系统是广泛可得的，如病毒和细菌载体(例如来自于农杆菌属)。在选择和/或筛选后，已经转化的原生质体、细胞或植物部分可通过本领域已知的方法再生成整株植物。转化和/或再生技术的选择对本发明来说并不严格。

为证实转基因存在于转基因细胞和植物中，可通过本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。可用诸多方法中任意者来检测转基因的表达产物，其取决于产物的性质，包括Western印迹和酶分析。一种定量蛋白表达及检测不同植物组织中复制的特别有用的方法是使用报告基因，如GUS。当获得转基因植物后，可对其进行栽培以产生具有所需表型的植物组织或部分。可收获所述植物组织或植物部分，和/或采集种子。该种子可作为栽培具有所需表征的组织或部分的其它植物的来源。

转基因非人动物

产生转基因动物的技术是本领域所熟知的。对此主题有用普通教科书是Houdebine的Transgenic animals-Generation and Use(Harwood Academic,1997)。

异源DNA可引入，例如哺乳动物受精卵中。例如，全能或多能干细胞可通过显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或其它方法转化，然后将转化的细胞引入胚胎中，随后胚胎发育成转基因动物。在高度优选的方法中，用含有所需DNA的逆转录病毒感染发育的胚胎，然后感染的胚胎产生转基因动物。然而，在最优选的方法中，适当的DNA共注射到胚胎的前核或胞质中，优选地在单细胞期，以及允许所述胚胎发育成为成熟转基因动物。

用来产生转基因动物的另一方法涉及通过标准方法将核酸显微注射到前核期卵中。然后在移植到假孕受者的输卵管中之前培养被注射的卵。

转基因动物也可通过核移植技术产生。使用此方法，在调节序列控制下使用并入目标结合结构域或结合配偶体的编码序列的质粒稳定地转染供体动物的成纤维细胞。然后将稳定的转染子与去核的卵母细胞融合，培养并移植到雌性受者中。

在一个实施方案中，所述转基因非人动物是家蚕(Bombyx silkworms)(Tomita等人，2011)。

丝的回收方法和生产

本发明的丝蛋白可从重组细胞，如植物、动物、细菌或酵母细胞中提取和纯化，通过各种方法生产所述的蛋白。在一个实施方案中，方法涉及通过降低pH和加热(比三螺旋的解链温度不低于4℃，优选不低于10℃)，然后通过硫酸铵分馏法从同质化的细胞/组织/植物等中去除蛋白。简单地，通过同质化细胞/组织/植物提取总可溶性蛋白。通过在pH4.7下沉淀然后60℃处理去除蛋白。而后产生的上清液用40％饱和度的硫酸铵分馏。产生的蛋白质将具有95％纯度级。可通过常规的凝胶或亲和层析实现进一步纯化。

在另一实例中，使用高浓度的酸，如HCl或丙酸处理细胞裂解物，降低pH到～1-2，持续1小时或更长，其将使丝蛋白溶解而使其它蛋白沉淀。

在选择的pH和离子强度条件下当蛋白浓度超过关键值时，本发明丝蛋白通过自发自组装从溶液中形成纤维聚集物。可按照O'Brien等人的方法收集所述聚集物并将其机械纺织成肉眼可见的纤维(＂Design,Synthesis and Fabrication of Novel Self-Assembling Fibrillar Proteins"，in Silk Polymers:Materials Science andBiotechnology,104-117页,Kaplan,Adams,Farmer和Viney,编(1994),美国化学学会，华盛顿特区)。

本发明的产物具有低的加工要求。本发明的丝蛋白需要最小的加工处理，例如纺织形成强纤维，这与家蚕和蜘蛛的重组丝多肽形成对比，后者需要复杂的纺织技术以获得二级结构(β-片层)和纤维的强度。

然而，纤维可从具有液晶相特征性质的溶液中纺出。可发生相变的纤维浓度取决于溶液中蛋白质的组成或蛋白质的组合。然而，相变可通过监测溶液的透明度和双折射来进行检测。当溶液获得半透明的外观并且通过交叉的偏振滤光片观察记录双折射时，可检测到液晶相的起始。

在一种纤维形成技术中，纤维可首先通过孔口(orifice)从蛋白溶液中挤出并进入甲醇中，直到产生足够通过机械装置拾起的长度。然后由这种机械装置通过甲醇溶液拉出纤维，收集并干燥。抽取纤维的方法视为本领域熟知的。

在一个实施方案中，使用挤出进沉淀剂如聚乙二醇的硫酸铵。

在US 2004/0170827和US 2005/0054830描述更多可用来生产本发明产物的方法的实例。

在优选的实施方案中，本发明的丝蛋白，例如在形成管、棒或海绵时是交联的。在一个实施方案中，所述蛋白使用本领域已知的技术交联到目标的表面/物品/产品等上。在另一个实施方案中(或者与之前实施方案结合)，至少一些丝蛋白相互交联。这种交联可使用本领域已知的化学和/或酶技术进行。例如，酶交联可通过赖氨酸氧化酶催化，而非酶交联可从糖化的赖氨酸残基中(Reiser等人，1992)或使用谷氨酰胺转移酶来生成。在另一个实施方案中，本发明的丝蛋白通过戊二醛交联。特别是在B和C链中具有酪氨酸残基的优势，可使用仅涉及这种残基的光化学交联(Elvin等人，2010)。交联的进一步详情参见Ramshaw等人(2000)Stabilisation of collagen in clinical applications.In:Handbook ofBiomaterials Engineering,Wise,D.L.(编),Marcel Dekker Inc.,New York,717-738页。

抗体

本发明所用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异抗体、双抗体、三链抗体、异共轭抗体(heteroconjugate antibody)、包括完整分子以及其片段的嵌合抗体，如能够结合表位决定簇的Fab、F(ab')2和Fv，以及其它抗体类分子。

抗体片段保留一些能力以选择性地结合其抗原或受体，以及抗体片段如下定义：

(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可通过使用酶木瓜蛋白酶消化整个抗体来产出完整的轻链和一条重链的部分来产生；

(2)Fab'，抗体分子的片段，其可通过使用胃蛋白酶处理整个抗体、接着通过还原以产出完整的轻链和部分重链来获得；每个抗体分子中获得两个Fab'片段；

(3)(Fab')2，抗体的片段，其可通过使用酶胃蛋白酶处理整个抗体而无随后的还原来获得；(Fab)2是通过二硫键结合的两个Fab'片段的二聚体；

(4)Fv，定义为遗传工程化的片段，其含有作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区；以及

(5)单链抗体("SCA")，定义为遗传工程化的分子，其含有通过合适多肽接头所连接的作为遗传融合单链分子的轻链可变区、重链可变区。

制造这些片段的方法是本领域已知的(参见，例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1988))。

(6)单结构域抗体，通常为缺少轻链的可变重链结构域。

短语“特异性结合”意思是在具体条件下，所述化合物结合本发明的多肽而不以显著量结合其它例如蛋白质或碳水化合物。特异性结合可需要因其特异性而选择出的抗体。在另一个实施方案中，如果在抗体与本发明多肽的结合与另一蛋白，尤其是丝蛋白或胶原蛋白(例如，来自哺乳动物的)相比时，具有大于10倍的差异，以及优选地大于25、50或100倍的差异时，则抗体视为“特异性结合”。

如本文所用，术语“表位”是指被抗体结合的本发明多肽的区。可施用表位给动物以产生抗此表位的抗体，然而本发明的抗体优选特异性地结合整个多肽背景中的表位区。

如果需要多克隆抗体，使用本发明的免疫原性多肽免疫选定的哺乳动物(小鼠、兔、山羊、马等)。根据已知的程序收集和处理免疫动物的血清。如果包含多克隆抗体的血清含有对其它抗原的抗体，所述多克隆抗体可通过免疫亲和层析进行纯化。生产和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可制造这样的抗体，本发明也提供本发明多肽或其片段半抗原连接到另一多肽用作动物中的免疫原。

本领域技术人员也可以容易地生产针对抗本发明多肽的单克隆抗体。通过杂交瘤制作的单克隆抗体的普通方法学是公知的。可通过细胞融合建立产生永生抗体的细胞系，也可通过其它技术如使用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或EB病毒(Epstein-Barr virus)转染。可根据各种性质筛选产生单克隆抗体的组；即同种型和表位亲和力。

另外一种技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中，例如噬菌体在其包被表面表达具有大量互补决定区的scFV片段。此技术是本领域公知的。

用于产生本发明抗体的其它技术是本领域已知的。

本发明的抗体可结合至固体载体和/或在合适容器中与适合的试剂、对照、说明书等包装成试剂盒。

在一个实施方案中，本发明的抗体是可检测标记的。允许直接测量抗体结合的示例可检测标记包括放射性标记、荧光团、染料、磁珠、化学发光基团、胶体颗粒等等。允许间接测量结合的标记的实例包括其中底物可提供有色或荧光产物的酶。其它示例的可检测标记包括加入合适底物后能提供可检测产物信号的共价结合的酶。用在结合物中的合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等等。若商业上不可获得时，这种抗体-酶结合物可通过本领域技术人员已知的技术容易的生产。更多的示例可检测的标记包括生物素，其以高亲和力结合抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素；荧光染料(例如藻胆蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素和德克萨斯红)，其可与荧光活化细胞分拣器一起使用；半抗原；等等。优选地，可检测标记允许在光度计盘中直接测量，例如生物素。这样的标记抗体可用于本领域已知的技术中来检测本发明的多肽。

组合物

本发明的组合物可包括“可接受的载体”。这种可接受的载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，以及其它水性生理平衡盐溶液。也可使用非水性载体，如固定油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。

在一个实施方案中，“可接受的载体”是“药学上可接受的载体”。术语药学上可接受的载体指分子实体和组合物，当其被施用至动物，特别为哺乳动物时，更特别为人时不产生过敏、毒性或其它不良反应。有用的药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括但不限于不影响本发明多肽活性的溶剂、分散介质、包衣剂、稳定剂、保护性胶体、粘合剂、增稠剂、摇溶剂、渗透剂、隔离剂和等渗剂和吸收延缓剂。可通过，例如使用包衣，如卵磷脂，在分散时维持所需颗粒尺寸以及使用表面活性剂来维持适当的流动性。更普遍地，本发明多肽可通过与通常配制技术相对应的任何无毒固体或液体添加剂联合使用。

如本文概括的，在一些实施方案中，本发明的含丝蛋白的产物可用作药学上可接受的载体。

下面描述了具有对本发明多肽具体用途的具体参考的其它合适组合物。

用途

由于丝蛋白异常的韧性和强度，其可用于创造新的生物材料。然而，蜘蛛和昆虫的纤维蛋白质通常是大蛋白(超过100KDa)，并由高度重复的氨基酸序列组成。这些蛋白质由含有高度偏向性的密码子的大基因所编码，使其特别难以在重组系统中生产。相比之下，本发明的丝蛋白是短的和较少重复的。这些性质使得编码这些蛋白的基因对于通过新生物材料的重组生产特别有吸引力。

本发明的丝蛋白可用在医学、军事、工业和商业应用的广泛和多样领域中。丝蛋白，例如以丝纤维的形式可用于医疗设备的制造，如缝合、皮肤移植、细胞生长基质、置换韧带和外科用网片，以及在工业和商业产品的广泛领域中，如,例如线缆、绳、网、鱼线、服装织物、防弹背心衬里、容器织物、背包、背囊、包或包肩带、粘性结合材料、非粘性结合材料、带材料、帐篷织物、帆布、防水油布、车辆覆盖物、围墙材料、封闭剂、建筑材料、耐风雨材料、韧性隔离材料、运动器材；以及实际上几乎在使用任何需要高拉伸强度和弹性特性的纤维和织物中。本发明的丝蛋白，例如以丝纤维和/或共聚物的形式也应用于个人护理产品组合物中，如化妆品、皮肤护理、护发和染发中；以及颗粒的涂层，如颜料中。

丝蛋白可以其天然形式应用或者其可被修饰成提供更有益效果的衍生物。例如，如US 5,981,718和US 5,856,451所述，丝蛋白可通过结合聚合物来修饰以降低变应原型。适当的修饰聚合物包括但不限于聚烯化氧(polyalkylene oxides)、聚乙烯醇、聚羧酸盐、聚乙烯吡咯烷、和葡聚糖。在另一实例中，丝蛋白可通过选择性消化和其它蛋白修饰物的剪切来修饰。例如，丝蛋白可通过在升高的约60℃温度下用酸处理切成更小的肽单位。有用的酸包括而不限于稀盐酸、硫酸和磷酸。或者，丝蛋白的消化可通过碱处理，如氢氧化钠、或可使用适当的蛋白酶进行酶消化来完成。

蛋白质可通过进一步修饰以提供对个人护理产品的具体应用中有益的性质特性。对用于个人护理产品的蛋白修饰是本领域所熟知的。例如，常用的方法描述于US 6,303,752、US 6,284,246和US 6,358,501中。修饰的实例包括但不限于乙氧基化以促进水油乳化剂增强、硅氧基化以提供亲脂兼容性、酯化以协助肥皂和洗涤剂组合物相容性。另外，丝蛋白可用功能基团产生衍生物，功能基团包括但不限于胺、环氧乙烷、氰酸盐、羧酸酯、硅酮聚多元醇(silicone copolyols)、硅氧烷酯、季铵化脂肪胺、氨基甲酸乙酯、聚丙烯酰胺、二羧酸酯和卤代酯。丝蛋白也可通过和二亚胺(diimine)反应和通过形成金属盐来产生衍生物。

与上述对“多肽”(及“蛋白质”)的定义一致，这样的衍生物和/或修饰分子在本文中也泛称为“多肽”和“蛋白质”。

本发明丝蛋白可与其它类型纤维纺在一起和/或成束或编织。实例包括而不限于聚合纤维(如聚丙烯、尼龙、聚酯)、其它植物和动物来源的纤维或丝(如棉花、羊毛、家蚕或蜘蛛丝或蜜蜂(例如参见WO 2007/038837))以及玻璃纤维。优选的实施方案是丝纤维和10％的聚丙烯纤维一起编织。本发明涉及这样的纤维组合产品，其可容易地实施以增强任何所需特性，例如外观、柔软性、重量、耐久性、抗水性、改善制造成本，这些可能是在用于医疗、工业或商业应用的制造生产含丝蛋白产品如纤维中的普遍追求。

本发明的丝蛋白可用于海运和/或储存期间稳定化合物，例如治疗药物如疫苗和抗生素(参见，例如Zhang等人，2012)。

个人护理产品

化妆品和皮肤护理组合物可为无水组合物，其含有在化妆可接受介质中有效量的丝蛋白。这些组合物的用途包括但不限于皮肤护理、皮肤清洁、化妆和抗皱产品。化妆品和皮肤护理组合物中有效量的丝蛋白在本文中限定为相对于组合物的总重量从约10^-4到约30％重量的比例，但优选地从约10^-3到15％重量。此比例可根据化妆品或皮肤护理组合物的类型成函数变化。US 6,280,747中描述了化妆可接受介质的适当组合物。例如，化妆可接受介质可包括相对于组合物总重量的一般从约10％到约90％重量比例的脂肪物质，其中脂肪相包括至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。或者，组合物可以作为稳定分散剂的形式，如作为油包水或水包油乳剂。或者，组合物可包括一种或多种常规化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、充填剂、表面活性剂、UVA和/或UVB遮光剂、芳香剂、增稠剂、湿润剂和阴离子、非离子或两性聚合物，以及染料或颜料。

使用含有至少一种本发明丝蛋白的乳化材料可生产的乳化化妆品和类药物，包括，例如清洁化妆品(美容香皂、洁面、洗发香波、冲洗等)、头发护理产品(染发剂、头发化妆品等)、基本化妆品(普通乳膏、乳液、剃毛膏、润发乳、古龙水、剃须润肤水、化妆油、面膜等等)、妆扮化妆品(粉底、眉笔、眼霜、眼影、睫毛膏等等)、芳香化妆品(香水等)、晒黑和防晒化妆品(晒黑和防晒霜、晒黑和防晒露、晒黑和防晒油等)、指甲化妆品(指甲油等)、眼线化妆品(眼线等)、唇部化妆品(口红、唇膏等)、口腔护理产品(牙膏等)、洗浴化妆品(洗浴产品等)等等。

化妆品组合物也可以是指甲护理产品的形式，如指甲油。指甲油在本文限定为用于处理和着色指甲的组合物，包括在化妆可接受介质中的有效量的丝蛋白。用于指甲油组合物的有效量的丝蛋白在本文中限定为相对于指甲油总重的约10^-4到约30％重量的比例。US 6,280,747描述了用于指甲油的化妆可接受介质的成分。指甲油通常含有溶剂和膜形成物质，如纤维素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸聚合物或共聚物、乙烯共聚物或聚酯聚合物。所述组合物也可含有有机或无机颜料。

头发护理组合物在本文中定义为用于处理头发的组合物，包括但不限于香波、护发素、洗剂、气雾剂、凝胶剂和摩丝剂，其含有在化妆可接受介质中有效量的丝蛋白。用于头发护理组合物中有效量的丝蛋白在本文中定义为相对于组合物总重的约10^-2到约90％重量的比例。US 2004/0170590、US 6,280,747、US 6,139,851和US 6,013,250中描述了头发护理组合物中化妆可接受介质的成分。例如，这些头发护理组合物可为水、醇或水醇溶液，对于水醇溶液，所述醇优选地为相对总重为约1％-约75％重量比例的乙醇或异丙醇。此外，头发护理组合物可包括一种或多种常规化妆的或皮肤病学的添加剂或佐剂，如上所述。

染发组合物在本文中定义为用于头发着色、染色或漂白的组合物，其包括在化妆可接受介质中有效量的丝蛋白。用于染发组合物中的有效量的丝蛋白在本文中定义为相对于所述组合物总重约10^-4到约60％重量的比例。US 2004/0170590、US 6,398,821和US 6,129,770中描述了用于染发组合物的化妆可接受介质的成分。例如，染发组合物一般包括无机过氧化物基的染料氧化剂和可氧化着色剂。过氧化物基的染料氧化剂最通常的是过氧化氢。氧化染发剂通过初级中间物(例如对苯二胺、对氨基苯酚、对二氨基嘧啶、羟基吲哚、吲哚胺、氨基胸苷或氰基苯酚(cyanophenols)与次级中间物(例如苯酚、间苯二酚、间氨基苯酚、间苯二胺、萘酚、吡唑酮、羟基吲哚、儿茶酚或吡唑)的氧化偶联而形成。另外，染发组合物可包括氧化酸、螯合剂(sequestrant)、稳定剂、增稠剂、缓冲载体、表面活性剂、溶剂、抗氧化剂、聚合物、非氧化染料和调节剂。

丝蛋白也可用来包被颜料和化妆品颗粒以改善颗粒的分散性来用于化妆品和包被组合物。化妆品颗粒在本文中定义为颗粒材料，如在化妆品组合物中使用的颜料或惰性颗粒。合适的颜料和化妆品颗粒包括但不限于无机有色颜料、有机颜料和惰性颗粒。无机有色颜料包括但不限于二氧化钛、氧化锌、以及铁、镁、钴和铝的氧化物。有机颜料包括但不限于D&C红No.36、D&C橙No.17、D&C红No.7、11、31和34的钙色淀、D&C红No.12的钡色淀、D&C红No.13的锶色淀、FD&C黄No.5的铝色淀和炭黑颗粒。惰性颗粒包括但不限于碳酸钙、硅酸铝、硅酸钙、硅酸镁、云母、滑石、硫酸钡、硫酸钙、粉末Nylon^TM、全氟化烃和其它惰性塑料。

丝蛋白也可用于牙线(参见，例如US 2005/0161058)。所述牙线可为单丝纱或多丝纱，以及纤维可以扭曲也可以不扭曲。牙线可包装成单件、或者包装成带有刀具以切割成任何所需长度的卷。可提供除丝状之外各种形状牙线，例如但不限于条带或片等。所述牙线可用不同材料包被，例如但不限于蜡、用于牙线的聚四氟乙烯单丝纱。

丝蛋白也可用于肥皂(参见，例如US 2005/0130857)。

颜料和化妆品颗粒包被

用于颜料和化妆品颗粒涂层的有效量丝蛋白在本文中定义为相对于颗粒干重的约10^-4到约50％，并优选从约0.25到约15％重量的比例。待用丝蛋白的最优量取决于待包被的颜料或化妆品颗粒的类型。例如，与无机有色颜料使用的丝蛋白量优选地在约0.01％到20％重量之间。至于有机颜料，丝蛋白的优选量在约1％到约15％重量之间，而对于惰性颗粒，优选量在约0.25％到约3％重量之间。在US 5,643,672中描述制备包被的颜料和颗粒的方法。这些方法包括：在搅拌或混合的同时将丝蛋白水溶液加入颗粒中以形成丝蛋白和颗粒的悬浮液再干燥，将丝蛋白溶液喷雾干燥至颗粒上或冻干丝蛋白和颗粒的悬浮液。这些包被的颜料和化妆品颗粒可用于化妆品配方、油漆、墨水等。

生物医学

丝蛋白可用作在绷带上的涂层以促进伤口愈合。为此应用，绷带材料用有效量的丝蛋白涂层。对于伤口愈合绷带的目的，有效量的丝蛋白在本文中定义为相对于绷带材料重量的约10^-4到约30％重量的比例。要涂层的材料可为任何柔软的、生物惰性的、多孔的布或纤维。实例包括但不限于棉、丝、人造丝、醋酸盐、丙烯酸、聚乙烯、聚酯及其组合。布或纤维的涂层可通过许多本领域已知的方法实现。例如，待涂层的材料可浸入含有丝蛋白的水溶液中。或者，含有丝蛋白的溶液也可使用喷枪喷洒至待涂层材料的表面上。或者，含有丝蛋白的溶液也可使用辊涂印刷方法涂层到表面上。伤口绷带可包括其它添加剂，包括但不限于消毒剂如碘、碘化钾、碘化聚烯吡酮、利凡诺、过氧化氢、苄烷铵氯化物和氯己啶；治疗加速剂如尿囊素、盐酸地布卡因和苹果酸氯化苯胺；血管收缩剂如盐酸萘甲唑啉；收敛剂如氧化锌；和结痂剂如硼酸。

本发明丝蛋白也可以膜的形式用作伤口覆料。US 6,175,053描述丝蛋白以无定形膜的形式用作伤口敷料。无定形膜包括结晶度低于10％的致密无孔膜，其包含有效量丝蛋白。对于创伤护理的膜，丝蛋白的有效量在本文中定义为在约1到99％重量之间。所述膜也可包括其它成分，其包括但不限于其它蛋白，例如丝胶,以及如上所述的消毒剂、治疗加速剂、血管收缩剂、收敛剂和结痂剂。其它蛋白如丝胶可包含组合物的1到99％重量。所列其它成分量优选地低于组合物总数的约30％重量，更优选地在约0.5到20％重量之间。通过在水性溶液中溶解上述材料，通过过滤或离心去除不溶物，再将溶液浇铸到光滑固体表面如丙烯酸盘上，接着干燥可制备伤口敷料膜。

本发明丝蛋白也可用于缝合(参见，例如US 2005/0055051)。这种缝合特征为由超高分子量纤维和丝纤维制成的编织套。聚乙烯提供强度。聚酯纤维可与高分子量聚乙烯编织在一起以提供改良的拴系性质。所述丝可以对比色供给以提供改良的缝合识别和鉴定痕迹。丝比其它纤维也是更加组织兼容的，其允许在靠近打结处剪掉末端而不必担心在缝合末端和周围组织之间的有害相互作用。高强度缝合线的处理性能也可通过使用不同材料涂层缝合线而加以增强。所述缝合线有利具有Ethibond5号缝合线的强度，却具有2号缝合线的直径、触感和拴系能力。因此，所述缝合线对于大部分整形外科程序是理想的，如旋转套修复术、跟腱修复术、髌韧带修复术、ACL/PCL重建、臀和肩重建操作，以及代替用于缝合锚中或与缝合锚一起使用的缝合线。所述缝合线可以是非涂层的，或用蜡(蜂蜡、石油蜡、聚乙烯蜡或其它)、硅酮(Dow Corning硅油202A或其它)、硅酮橡胶、PBA(聚丁酸)、乙基纤维素(Filodel)或其它涂层物来涂层，以改善例如编织物的润滑性、打结安全性或耐磨性。

本发明丝蛋白也可用于支架(参见，例如US 2004/0199241)。例如，提供包括腔内支架和移植物的支架移植物，其中支架移植物包括丝。所述丝在接受支架移植物的宿主中诱导反应，其中所述反应可导致在丝支架移植物与丝支架移植物的丝相邻的宿主组织之间的粘连增强。通过多种方法中的任意者可将所述丝附着至移植物上，例如通过将丝交织到移植物上、或通过将丝粘附至移植物上(例如，通过粘合剂、或通过缝合的方法)。丝的形式可以是线、穗带、片层、粉末等等。对于丝在支架移植物上的定位，丝可仅附着到支架的外部，和/或丝可附着到支架移植物的远端区，以协助将那些远端区固定在宿主中的邻近组织。在本发明的背景中可利用很多种支架移植物，这取决于所需治疗的位置和性质。支架移植物可以是，例如分叉的或管状移植物、圆柱状或锥形的、可自展的或球形展开的、单片或模块等等。

除了丝以外，支架移植物可在一些或所有丝上包含涂层，其中所述涂层在支架移植物插入宿主时降解，因此所述涂层延缓所述丝和宿主之间接触。适当的涂层包括而不限于明胶、可降解聚酯(例如PLGA、PLA、MePEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA及其共聚物和混合物)、纤维素和纤维素衍生物(例如，羟丙基纤维素)、多糖(例如，透明质酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、壳聚糖)、脂质、脂肪酸、糖脂、核酸酯、聚酐、聚正酯和聚乙烯醇(PVA)。含丝的支架移植物可包括生物活性剂(药物)，其中所述试剂从支架移植物中释放而后诱导增强的细胞应答(例如，细胞或细胞外基质沉积)和/或插入支架移植物的宿主的纤维化反应。

本发明丝蛋白也可用于离体生产韧带和腱的基质中(参见，例如US 2005/0089552)。多能细胞，如骨髓基质细胞(BMSC)可被种植在基于丝纤维的基质中。生物工程韧带或腱通过以下得以有利地表征：通过在应用机械力方向上的细胞定向和/或基质卷曲模式，以及还通过产生韧带和腱特异性标志物包括胶原蛋白I型、胶原蛋白III型和纤连蛋白，其在如施加机械力时通过所述机械力或刺激所产生的机械负荷轴上。在优选实施方案中，所述的韧带或腱表征为存在以螺旋组织排列的纤维束。能够生产的韧带或腱的一些实例包括前十字韧带、后十字韧带、转轴肌腱、肘和膝的内侧副韧带、手的屈肌腱、踝的外侧韧带以及颌或颞颌关节的腱和韧带。通过本发明的方法可生产的其它组织包括软骨(关节和半月板两者)、骨、肌肉、皮肤和血管。

本发明丝蛋白也可用于水凝胶(参见，例如US 2005/0266992)。丝纤蛋白水凝胶可表征为开孔结构，所述开孔结构允许丝纤蛋白水凝胶用作组织工程支架、细胞培养的底物、伤口和烧伤敷料、软组织替代物、骨填充剂以及药学或生物学活性化合物的载体。

所述丝蛋白也可用于皮肤病学组合物(参见，例如US 2005/0019297)。此外，本发明丝蛋白及其衍生物也可用于持续释放组合物(参见，例如US 2004/0005363和US 2012/0195967)。

含有本发明丝蛋白的产品也可更广泛地用作培养(例如细胞和/或组织培养)和/或细胞如干细胞(参见，例如US 2012/0189669、US 2012/0172985、US 2012/0171257、US2011/0293685、US 20090214614、US 20110238179和US 20070041952)种植的支架。

纺织品

本发明丝蛋白也可应用至纤维表面随后用于纺织品中。这在纤维上提供蛋白膜的单层而产生光滑精整。US 6,416,558和US 5,232,611描述了加入罩面(finishing coat)到纤维上。这些公开中描述的方法提供多种精整纤维的用途广泛的实例以提供良好触感和光滑表面。对此应用，使用有效量丝蛋白来涂层所述纤维。对用于纺织品中纤维涂层的目的，有效量丝蛋白在本文中定义为相对于纤维材料重量的从约1到约99％重量的比例。纤维材料包括但不限于棉纺织纤维、聚酯如人造丝和Lycra^TM、尼龙、毛织品和其它天然纤维包括天然丝。适于将丝蛋白应用至纤维上的组合物可包括助溶剂如乙醇、异丙醇、hexafluoranols(无对应中译文)、异硫代氰酸盐(isothiocyanouranates)以及可与水混合形成溶液或微乳剂的其它极性溶液。含有丝蛋白的溶剂可喷到纤维上或可将纤维浸到溶液中。尽管不是必须的，优选涂层材料进行急骤干燥。另一种方案是将丝蛋白组合物应用到编织纤维上。此应用的理想实施方案为将丝蛋白用于涂层可伸展的编织中如用于长袜上。

复合材料

丝蛋白，例如以纤维形式可加入到聚氨酯、其它树脂或热塑性填充物中以制备面板和其它建筑材料、或者作为替代木材和颗粒板的模块器具和台顶(benchtop)。所述复合材料也可用于建筑和汽车构造特别是屋顶和门板。丝再次增强了树脂，使得材料更强且允许与其它颗粒板和组合材料相比具有相同或更高强度的轻量构造。丝蛋白，例如以纤维形式的丝蛋白可被分离并加入至合成的形成复合材料的树脂中或与植物来源的蛋白质、淀粉和油组合使用以生产生物基的复合材料。JP 2004284246、US 2005175825、US 4,515,737、JP 47020312和WO 2005/017004描述了生产这种材料的方法。

造纸添加剂

本发明丝的纤维性能可增加造纸的强度和品质结构。通过在棉浆中的斑纹丝线来制作的丝纸以制备超平滑手工纸，可用于礼品包装、笔记本封面、纸袋。在JP 2000139755中一般描述了可包括本发明丝蛋白的纸制品的生产方法。

先进材料

本发明的丝具有相当的韧性，并且格外突出的是与其它丝相比在潮湿时维持这些性质(Hepburn等人，1979)。

在服装纺织工业中的实质性增长领域是技术和智能纺织。对健康、高功能值、有利环境型和个人化的纺织产品存在上升的需求。纤维，如本发明的那些在潮湿时不改变性质以及特别维持其强度和可伸展性，这有利于用在运动和休闲穿的以及工作穿的功能性服装和防护衣中。

武器和监视技术的发展促进了个人防护设备和战场相关系统和结构的创新。除常规需要如对长时间暴露、严重磨损的材料耐用性、以及保护免于外部环境之外，本发明丝织品可加工成抵抗弹道抛射、火和化学品。WO 2005/045122和US 2005268443描述了生产这种材料的方法。

实施例

实施例1：制备和分析末龄后期唾液腺cDNA

从在终末龄幼虫的唾液腺分离的cDNA中鉴定在叶蜂(sawfly)(寡斑叶蜂，柳树叶蜂)丝中发现的蛋白。从堪培拉(澳大利亚)的伯利格里芬(Burley Griffin)湖周围的柳(Salix)(柳树)种中收集柳树叶蜂幼虫(来自叶蜂属(Nematus)的寡斑叶蜂(N.oligospilus))。在实验室中以鲜柳树叶的饮食喂养幼虫直到需要。

使用RNAqueous-4PCR试剂盒(Ambion)从10幼虫叶蜂的唇腺中分离出28.1μg总RNA，从该总RNA中使用Micro-FastTrack^TM2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)分离出mRNA，之后构建寡斑叶蜂丝腺cDNA文库。该cDNA文库是使用CloneMiner^TMcDNA试剂盒(Invitrogen)从mRNA构建。cDNA文库包括约2.9×10⁷菌落形成单位(cfu)，其少于原始载体的1％。在文库内的平均插入尺寸为1.1kpb。

发送五十个随机选择的克隆进行序列分析(表2)。在28个克隆中发现引入的cDNA序列，其余插入原始的cDNA克隆载体。鉴定的cDNA序列中的二十个含有序列，所述序列中大多数翻译序列中含有3残基的重复序列Gly-Xaa-Yaa，这是胶原蛋白和其它含三螺旋结构的特征。Gly是每第三个残基必需的，因为只有此氨基酸小到足以适合在三螺旋的中心内。含有Gly-Xaa-Yaa重复的序列被分为3个不同级别以及称为胶原蛋白A、B和C。从数据库比较预测其它序列的可能同一性。

在图1中提供使用Expasy(ETH)程序进行的胶原蛋白样结构域的比对。对于3个胶原蛋白段，在A和B中的126个残基以及C链中的120个残基。在非Gly位置中，120-126个氨基酸、20个对所有三个链是通用的。在A和B链之间有共同的另外21个位置(＝41)。在A-和C-链之间有共同的另外24个位置(＝44)。对B-和C-链之间有共同的另外13个位置(＝33)。在蛋白质的C端还有酪氨酸富集区，其中每个蛋白以酪氨酸结尾。

表2 鉴定来自寡斑叶锋丝腺的cDNA中含有的蛋白

实施例2：叶蜂胶原蛋白样丝蛋白的重组表达

选择来自三个氨基酸序列型A(SF21)、B(SF9)和C(SF30)每种的三个cDNA序列进行表达研究。所述cDNA在pDONR222中。使用Stratagene定点诱变试剂盒(#200519)根据制造说明通过PCR诱变向原始构建体引入限制性酶切位点。引入限制性内切酶酶切位点允许从每个叶蜂丝基因分离DNA以及将其插入至表达载体中。

叶蜂胶原蛋白样丝A型基因通过NdeI和EcoRI插入到pColdI载体。叶蜂胶原蛋白样丝B型基因通过NdeI和EcoRI插入到pColdIV载体。叶蜂胶原蛋白样丝C型基因经BamHI和SalI插入到pColdIII，并包括来自来自化脓性链球菌(S.pyogenes)的细菌胶原蛋白Scl2的三螺旋启动序列(V-结构域)。

为表达叶蜂丝蛋白，转化的大肠杆菌BL21细胞的一个菌落被添加至100ml起始培养介质2×YT-Amp并在37℃以200rpm振摇过夜。然后，此培养具有100毫升新鲜加入的2×YT-2％葡萄糖-Amp，并用1mM IPTG在25℃诱导10小时，然后在20℃另外持续16小时。通过离心(3000×g30分钟)收获细胞糊。此蛋白关联在细胞沉淀中。为提取，将1克细胞糊重悬于pH8.0的10ml的40mM Na/磷酸盐缓冲液中，然后通过超声进行细胞破裂。通过离心(20K×g下40分钟)来澄清细胞裂解混合物，保留上清液。

采用Pall50ml IMACHyperCel柱使用亲和纯化来纯化表达的丝蛋白。200mM的钠/磷酸盐的个体储备溶液、4.4M氯化钠和2M咪唑加入到澄清的裂解物至pH7.6的20mM的钠/磷酸盐缓冲液、500mM NaCl和30mM咪唑的终浓度。将此溶液上样到亲和柱上，接着用5个柱体积的缓冲液A(pH7.6的20mM的钠/磷酸盐缓冲液、300mM NaCl和40mM咪唑)洗涤亲和柱，足以在280nm吸收处没有剩余洗脱材料。然后，用一系列的1个柱体积的缓冲液A来洗脱柱，其含有逐步逐次增加的各种量的咪唑(70、100、150、250和500mM的咪唑。通过在214nm或280nm处的吸收来监测洗脱的馏分，然后进一步通过SDS-PAGE分析进行分析。随后，将含丝蛋白样品合并并浓缩，以及通过膜过滤(10KDa切断)将缓冲液交换至pH8.0的20mM磷酸盐。随后，进一步通过在阴离子1ml Q柱和阳离子1m SP柱上的离子交换色谱分析法纯化此材料，然后进一步通过在Superdex200柱上的凝胶过滤进行纯化。许多方法可用于纯化蛋白。

来自pCold载体的叶蜂丝蛋白表达的实例显示在图2中。在此实施例中，SF30表达为具有V结构域的融合蛋白。

实施例3：胶原蛋白样丝结合成纤维细胞

对细胞粘着的研究，使用在PBS中2μg蛋白质包被的组织培养96孔微量滴定板在4℃过夜。使用含2％BSA的PBS阻断2小时后，小鼠成纤维L929细胞以250,000个细胞cm^-2接种到包被的表面上。播种前，将细胞通过短暂暴露于Tryple^TMExpress(Gibco#12605)来收获、并用无血清介质3次洗涤细胞之后重悬于无血清介质中。暴露于37℃/5％CO₂中2h之后，用温PBS充分冲洗在孔中的细胞两次，将100μl的MTS溶液加入到板中进行另外1-3小时的孵育。细胞也用鬼笔环肽(对应肌动蛋白)和DAPI(对应DNA)染色。

本发明的胶原蛋白样丝蛋白支持L929细胞的粘附，推测其通过整合素受体实现(图3)。本发明的丝与哺乳动物胶原蛋白和纤连蛋白一样好。这些结果表明，本发明的胶原蛋白样丝蛋白在生产生物医学植入物中是有用的。

实施例4：重组叶蜂丝蛋白形成胶原蛋白样结构

为证明叶蜂胶原蛋白样丝A至C型蛋白能够折叠成三螺旋结构，每种类型的序列在大肠杆菌中单独表达(图4)。全长的、表达的丝蛋白用亲和色谱法和凝胶渗透色谱法如下进行纯化：将细胞通过超声在的pH8.0的40mM磷酸钠缓冲液中裂解、将细胞裂解物通过离心(20,000×g40分钟)来澄清，并保留清澈的上清。通过在IMAC HyperCel^TM柱(Pall)上吸附澄清裂解物来纯化表达的丝蛋白，通过逐步递增至500mM的用HCl调至pH8的咪唑来洗脱。交叉流过滤用于降低盐含量和浓缩蛋白溶液。通过在HiPrep Sephacryl^TMS-200柱(GEHealthcare)上的凝胶渗透色谱法进行最后的纯化。通过使用在50mM乙酸中的0.1mg/ml的胃蛋白酶消化蛋白来制备单个三螺旋胶原蛋白篇段。所有产品的纯度通过SDS-PAGE评估。

通常胶原蛋白耐受胃蛋白酶消化，所述处理常用于纯化胶原蛋白分子。与胶原蛋白结构相符合，重组产生的叶蜂丝蛋白的大部分在20℃耐受胃蛋白酶消化(图4A)。与之相比，在高温下的蛋白质结构变性后，整个分子对蛋白酶敏感。胃蛋白酶耐受片段的圆二色光谱证实蛋白质以胶原蛋白三螺旋折叠，其中各光谱显示具有约220纳米最大值的阳性椭圆性(图B)。

本领域技术人员将理解，可对本发明进行许多变化和/或修改，如具体实施方案所示而不脱离广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本实施方案在所有方面视作是说明性的而非限制性的。

本申请要求来自2011年11月16日提交的US 611560,649的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

本文讨论和/或引用的所有出版物以其整体并入本文。

对文件、法令、材料、设备、条款等的任何讨论，其包括在本说明书中仅为提供本发明背景的目的。不应该认为由于其存在于本申请每个权利要求的优先权日之前，而承认其中的任何或全部构成现有技术基础的部分，或者是本发明相关领域的公知常识。

参考文献

Antonicelli(2007)Curr.Top.Dev.Biol.79:99-155.

Atkins(1967)J.Mol.Biol.24:139-41.

Ayoub et al.(2007)PLoS One13:e514.

Bini et al.(2004)J.Mol.Biol.335:27-40.

Craig(2002)Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.133:493-507.

Craig and Riekel(2002)Comp Biochem.and Phys.Part B133:247-255.

Dal Pra et al.(2005)Biomaterials26:1987-99.

Elvin et al.(2010)Biomaterials31:8323-8331.

Gosline et al.(1999)J.Exp.Biol.202:3295-303.

Hayashi and Lewis(2000)Science287:1477-9.

Hepburn and Kurstjens(1988)Apidologie19:25-36.

Hepurn et al.(1979)Insect Biochem.9:66.

Jin et al.(2002)Biomacromolecules3:1233-9.

Kim et al.(2005)Biomaterials26:2775-85.

Lucas and Rudall(1968)Extracecllular fibrous proteins:the silks.InComprehensive Biochemistry eds.M Florkin,EH Stotz,Chapter7.26B:475-558.Amsterdam,London,New York:Elsevier.

Mathews(1975)Connective tissue:macromolecular structure andevolution.Springer-Verlag.

Nazarov et al.(2004)Biomacromolecules5:718-26.

Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453.

Persikov et al.(2005)J.Biol.Chem.280:19343-19349.

Reiser et al.(1992)Nucleic Acids Research32(Web Server issue):W321-W326.

Ramshaw et al.(2000)J.Struct.Biol.122:86-91.

Rudall(1962)In Comparative Biochemistry(ed:Florkin and Mason)4:297-435Academic Press,New York.

Rudall(1968)Comparative biology and biochemistry of collagen.In:Treatise on Collagen ed BS Gould Chapter22A:83-137.London and New York:Academic.

Rudall and Kenchington(1971)Annual Review of Entomology16:73-96.

Sutherland et al.(2006)Genome Res.16:1414-1421.

Sutherland et al.(2010)Annu.Rev.Entomol.55:171-88.

Tomita et al.(2011)Biotechnol.Lett.33:645-654.

Vepari and Kaplan(2007)Prog.Polym.Sci.32:991-1007.

Vollrath and Knight(2001)Nature410:541-8.

Zhang et al.(2012)PNAS109:11981-11986.

Claims

1.一种编码胶原蛋白样丝多肽的分离的和/或外源的多核苷酸，其中所述多核苷酸由以下的一种或多种组成：

i)如SEQ ID NO:11或12所示的核苷酸序列；或

ii)编码由氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:5或6所示。

2.一种载体，其包含至少一种根据权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的载体，其是表达载体。

4.一种宿主细胞，其包含至少一种根据权利要求1所述的多核苷酸、和/或至少一种根据权利要求2或权利要求3所述的载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞或酵母细胞。

5.一种基本上纯化的和/或重组的胶原蛋白样丝多肽，其中所述多肽由如SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求5所述的多肽，其可从膜翅目种中纯化。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中膜翅目的属是叶蜂属。

8.根据权利要求5所述的多肽，其融合到至少一种其它多肽。

9.一种制备根据权利要求5至8中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下培养一种或多种根据权利要求4所述的宿主细胞、或生产根据权利要求5所述的重组蛋白的转基因生物体，并回收表达的多肽。

10.一种制备根据权利要求5至8中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在允许编码所述多肽的多核苷酸表达的条件下、在无细胞的表达系统中培养权利要求3所述的载体，并回收表达的多肽。

11.一种分离和/或重组抗体，其特异性地结合根据权利要求5至8中任一项所述的多肽。

12.一种丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒，其包含至少一种根据权利要求5至8中任一项所述的多肽。

13.根据权利要求12所述的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒，其中至少一些所述多肽是交联的。

14.一种含有至少两个根据权利要求5至8中任一项所述的多肽的共聚物。

15.根据权利要求14所述的共聚物，其中至少一些所述多肽是交联的。

16.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求5至8中任一项所述的多肽、至少一种根据权利要求12或权利要求13所述的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、或至少一种根据权利要求14或权利要求15所述的共聚物中的一种或多种、以及一种或多种可接受的载体。

17.根据权利要求16所述的组合物，其进一步包含药品。

18.根据权利要求17所述的组合物，其用作药物、医疗设备或化妆品。

19.一种组合物，其含有至少一种根据权利要求1所述的多核苷酸、以及一种或多种可接受的载体。

20.一种用于生产含有胶原蛋白样丝多肽的产品的方法，所述方法包括：

i)获得根据权利要求5至8任一项所述的胶原蛋白样丝多肽；以及

ii)加工所述多肽以生产产品。

21.至少一种根据权利要求5至8中任一项所述的多肽、至少一种根据权利要求12或权利要求13所述的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种根据权利要求14或权利要求15所述的共聚物、或者至少一种根据权利要求16至19中任一项所述的组合物中的一种或多种、以及至少一种药品在制造用于治疗或预防疾病的药物中的用途。

22.一种试剂盒，其包含至少一种根据权利要求5至8中任一项所述的多肽、至少一种根据权利要求1所述的多核苷酸、至少一种根据权利要求2或权利要求3所述的载体、至少一种根据权利要求12或权利要求13所述的丝纤维、海绵、膜、水凝胶或颗粒、至少一种根据权利要求14或权利要求15所述的共聚物、或者至少一种根据权利要求16至19中任一项所述的组合物中的一种或多种。