JP2004504803A - 多糖含有材料の改変 - Google Patents
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Abstract
多糖含有材料を架橋するためのおよび/または多糖含有材料の特性を改変するための組成物が提供される。多糖含有材料を架橋する方法は多糖構造物をPBD融合タンパク質で処理する工程を含む。多糖含有材料の特性は機能性成分を含むPBD融合タンパク質を用いた処理によって機能化され得る。増大した湿潤強度および/または弾性を有する紙および織物の如き多糖含有材料が記述される。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
【0001】
発明の分野および背景
本発明は、生物学的実体または化学的実体に融合または連結した多糖結合ドメインの多量体構造物に基づく生物学的架橋剤を使用して、多糖材料の構造的性質、化学的性質、物理的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物、ならびにそれによって得られる生物学的組成物に関する。本発明は、ティッシュペーペー、ろ紙および綿糸の機械的性質(湿潤強度など)を高めるために、2つのセルロース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン−プロテインA−Ab複合体またはSペプチド−セルロース結合ドメイン−Sタンパク質融合体を含有するセルロース結合ドメイン(CBD)融合タンパク質を使用することによって例示される。
【0002】
多糖は、自然界の至るところに見出される安定な構造的成分である。多くの生物は、3次元形状および表面構造を提供するためにその細胞の内外における構造的材料として多糖を使用している。天然供給源から得られる多糖の構造的一体性は、多くの場合、多糖が単離された後でも保持されており、多糖を様々な商業目的に使用することを可能にしている。その望ましい物理的特性のために、多糖はまた、商業目的のために合成的方法によっても製造されている。いずれの場合においても、合成的供給源または非合成的供給源のいずれかに由来するセルロースなどの多糖は、紙パルプおよび織物繊維などの様々な商業的に重要な製品に必要な原料を含んでいる。
【0003】
製紙プロセスは、従来的には4つの主要な工程を含んでいる:一般にはパルプとして知られているセルロース繊維の水性懸濁物を得る工程;様々な加工物質および紙強化物質(強化剤および/またはサイズ剤など)をパルプスラリーに加える工程;大部分の水がろ過して除かれる成形用織物に得られた懸濁物を注ぐことによって紙をシート状にし、繊維を乾燥して、所望するセルロースウェブを形成させる工程;および様々な所望する特性を得られた紙に与えるために紙の初期乾燥の後でウェブを後処理する工程(紙の乾燥強度を増大させるサイズ剤の表面塗布を含む)。水性スラリーのパルプに適用されるそのような添加剤はウェットエンド添加剤として知られており、これには、微細物および填剤を保持するための歩留まり向上剤(例えば、ミョウバン、ポリエチレンイミン、カチオン性デンプンなど);ポリエチレンイミンなどのドレネージ助剤;消泡剤;ならびにピッチ、またはマイクロファイバーおよび吸着填剤などの添加剤が含まれる。他のウェットエンド添加剤には、紙の乾燥強度だけでなく、湿潤強度を改善するために添加される、カチオン性ポリアリールアミドおよびポリ(アミドアミン/エピクロロヒドリン)などのポリマーが含まれる。デンプン、グアルゴムおよびポリアクリルアミドもまた、乾燥強度を改善させるために添加される。サイズ剤が、時々、疎水性を親水性のセルロース繊維に付与するために添加される。このようなサイズ剤は、液体容器(例えば、ミルクまたはジュース)用の紙を製造する際に使用され、紙コップおよび紙表面が水性インクで印刷される。この場合、インクが広がらないことが望ましい。そのようなサイズ剤には、松の木から得られるロジンサイズ剤、ワックスエマルション、そしてより近年においては、セルロース反応性サイズ剤が含まれる。シートの初期乾燥の後、スプレー、毛細管吸着、浸漬およびロールコーティングなどによって添加剤を紙に適用することは、多くの場合、ドライエンド添加と呼ばれている。ポリ(ビニルアルコール)、アクリルまたは酢酸ビニルのエマルション、デンプン、サイズ剤、ポリウレタンおよびSBRラテックスがドライエンドにおいて一般に添加される。
【0004】
製紙産業の主要な製品は、中しん原紙、中しん原紙において使用される中央波形加工用紙である。デンプンは波形加工用紙の総重量の2%〜5%を構成する。様々な技術が、中しん原紙の湿潤強度を改善するために使用されている。これには、ホルムアルデヒド樹脂などの化学的な架橋剤の使用、またはワックスなどの疎水性物質の塗布が含まれる。しかし、そのような化合物の紙への添加またはそのような化合物による紙の処理は、多くの場合、処理された紙の再利用性に対するこれらの化合物の好ましくない影響のために中断されている。使用される他の技術では、1平方メートルあたりの紙の重量および強度を増大させるために、半化学的パルプなどのより高価な原料が用いられている。この後者の方法は、出発材料および製造プロセス自体の両方のコストを増大させる。
【0005】
例えば、製紙のように、綿繊維のようなセルロース材料を織物に加工することにもまた数工程が含まれる:繊維を糸に紡ぐこと;糸からの織布またはメリヤス生地の組み立て、その後の調製、染色および仕上げの各操作。織物製品は織物組み立ての一般的な形態である。糸は、一般にサイズボックスにおいてサイズ処理され、その後、水が蒸気缶で除かれ、そして糸は、シートを個々の糸に折れ込ませるためにバストロッドに広がるシートにされる。その後、糸は織られる。これは、一連のたて糸の間によこ糸を織ることによって行われる。調製に含まれる部分工程は、サイズ剤除去、スカーリングおよび漂白である。1工程の複合型スカーリング/漂白プロセスもまた業界で使用されている。
【0006】
様々な化合物が、製織時における糸の切断を防止するために、たて糸に対するサイズ剤として使用されている。良好な糸サイズ剤は、サイズ処理されている糸に保護を提供する十分な強度を有する薄膜を形成するが、糸がサイズ剤の薄膜の下で切れるほど強くないサイズ剤である。サイズ剤は、強度を提供し、かつ糸を摩耗から保護するために、製織に先立ってたて糸に施される。綿を含有する糸に対する従来からのサイズ剤には、一般に、デンプン、デンプン誘導体、ポリビルアルコール、ポリエステル樹脂、ワックス、アクリルポリマーおよびアクリルコポリマーおよびそれらの塩などの薄膜形成剤、湿潤化剤、静電気防止剤、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。従来の熱硬化性樹脂システム(後硬化型または前硬化型のいずれか)は、耐摩耗性、破壊強度および引裂き強度が多くの場合に深刻なほどに損なわれるような程度にまで、セルロース繊維の微細構造ユニットを脆化させ、そしてその可動性を低下させる。多くの場合、耐摩耗性が75%〜85%低下し、破壊強度が50%〜60%低下し、引裂き強度が約50%低下する。さらに、セルロース繊維を含有する糸が上記の従来的な方法によってサイズ処理された場合、サイズ処理された糸から完全にサイズ剤を除くことは困難である。サイズ処理された糸から完全に脱サイズ剤が除かれるとしても、サイズ剤除去プロセスは複雑であるか、または費用がかかる。
【0007】
最近、サイズ剤の除去を、汚染を伴うことなく簡便なプロセスで行うことがますます重要な要件になっている。従って、潜在的に毒性の化学的架橋剤の使用を軽減または回避し、かつ使用が費用的および時間的に効果的である添加剤を多糖含有材料(紙および織物材料など)に対して開発することは注目される。
【0008】
関連文献:
細菌セルラーゼの結合ドメインによるセルロース繊維の破壊が、Din他(1991)Bio/Technology、9:1096〜1099によって記載されている。Kim他(1993、Protein Science、2:348〜356)は、Sペプチドキャリア、プロテアーゼ認識配列を有するオリゴペプチドスペーサー、およびガラクトシダーゼ標的を有する組換え融合タンパク質を記載している。C.cellulovoransのCBDのN末端またはC末端のいずれかに融合したヘパリナーゼI(例えば、フラボバクテリウム・ヘパリヌム(Flavobacterium heparinum))の融合タンパク質の発現がShpigel他(1999)Biotech.Bioeng.65:17〜23によって記載された。
【0009】
米国特許第5137819号(Kilburn他)は、セルラーゼ基質結合領域を含む融合タンパク質、ならびにポリペプチドの固定化および精製におけるそれらの使用を開示している。米国特許第5928917号(Kilburn他)は、タンパク質でない化学的成分と、セルロース結合領域を有するポリペプチドとの結合体を開示している。多糖に結合するタンパク質および結合体が米国特許第5962289号(Kilburn他)に記載されている。米国特許第5821358号(Gilkes他)は、ポリサッカリダーゼに由来する結合ドメインおよび/または触媒ドメインを使用して多糖構造物(例えば、綿繊維およびラミー繊維)を改変するための方法および組成物を開示している。
【0010】
米国特許第5837814号(Shoseyov他)は、結晶性セルロースおよびキチンに対して大きな親和性を有するCBDを、CBDと別のタンパク質との融合産物とともに開示している。CBDおよび融合産物に対する応用には、薬物送達、アフィニティー分離および診断的技術が含まれるが、これらもまた開示されている。米国特許第5719044号;米国特許第5496934号;および米国特許第5856201号もまた参照のこと(これらはすべてShoseyov他に対するものである;これらのそれぞれの内容は参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0011】
紙添加剤の利用性の総説が、B.B.Spence、Encyclopedia of Polymer Science and Technology、第2版、Wiley−Interscience、第10巻、761頁〜786頁、New York(1987年)により示される。
【0012】
発明の要約
本発明は、少なくとも1つの多糖結合ドメインを含む組成物を使用してポリマー材料または多糖材料を架橋および/または機能化するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、多糖結合ドメイン(PBD)融合タンパク質、PBD連結剤ユニット、PBD機能的成分、およびこのような組成物を使用して改変された多糖を含む。本発明のPBD連結剤ユニットは、それぞれが独立的に多糖に結合することができる1つまたは2つ以上のPBD、および必要に応じて、PBD間に連結された1つまたは複数のリンカーユニットを含む。本発明の方法は、多糖構造物を含む多糖材料の1つまたは複数の特性を改変するために十分な条件および時間で、多糖構造物を十分な量のPBD融合タンパク質と接触させる工程を含む。本発明の方法および組成物は、変化した機械的性質、化学的性質、電気的性質および/または物理的性質を有する多糖含有材料を製造する際に使用される。
【0013】
本発明の1つの側面により、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【0014】
本発明の別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料をもたらす組成物が提供される。
【0015】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前に行われる。
【0016】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する途中において行われる。
【0017】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する後に行われる。
【0018】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料は、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される。
【0019】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、構造的性質は、多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される。
【0020】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、化学的性質は、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および所定の表面張力からなる群から選択される。
【0021】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、物理的性質は、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される。
【0022】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、電気的性質は、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される。
【0023】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、機械的性質は、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される。
【0024】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも1つのさらなる多糖結合ドメインとを含む。
【0025】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む。
【0026】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む。
【0027】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む。
【0028】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む。
【0029】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む。
【0030】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む。
【0031】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む。
【0032】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む。
【0033】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む。
【0034】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインA抗体とを含む。
【0035】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む。
【0036】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む。
【0037】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む。
【0038】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む。
【0039】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む。
【0040】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む。
【0041】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む。
【0042】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む。
【0043】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む。
【0044】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む。
【0045】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む。
【0046】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む。
【0047】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む。
【0048】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む。
【0049】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む。
【0050】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む。
【0051】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む。
【0052】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む。
【0053】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む。
【0054】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む。
【0055】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む。
【0056】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【0057】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【0058】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0059】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0060】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0061】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、グルカン結合ドメイン(例えば、β−1,3−グルカン結合ドメイン)である多糖結合ドメインを含む。
【0062】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む。
【0063】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖含有材料の多糖構造物を架橋する多糖結合ドメイン連結剤を形成する少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む組成物が提供される。
【0064】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している機能化成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、機能化成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0065】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している疎水性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、疎水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0066】
本発明のなおさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している親水性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、親水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0067】
本発明のさらにさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している化学的反応性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0068】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している光化学的反応性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、光化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0069】
本発明のなおさらなる側面により、少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む多糖結合ドメイン連結剤を含む組成物が提供される。
【0070】
本発明のさらにさらなる側面により、少なくとも2つの多糖結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。好ましくは、核酸構築物は、少なくとも2つの多糖結合ドメインを結合する少なくとも1つのリンカーペプチドをコードする少なくとも1つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含む。
【0071】
本発明のさらなる側面により、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学性質的、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメインとの接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、その後、少なくとも1つの成分または基を多糖結合ドメインに共有結合させ、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【0072】
本発明は、紙および織物材料などの優れた多糖構造物含有材料を製造するための方法および試薬を提供することによって、現在知られている形態の短所を解決する。
【0073】
図面の簡単な説明
本発明は、添付された図面を参照して例としてのみ本明細書中に記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示された詳細は、本発明の好ましい実施形態の例として、また本発明の好ましい実施形態の説明的な議論のためだけであり、そして本発明の原理的で概念的な側面の最も有用で、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されていることが強調されている。この点に関して、本発明を根本的に理解するために必要である以上に詳しく本発明の構成的細部を示すことはなされておらず、図面とともに理解される説明により、当業者には、本発明のいくつかの形態が実際にどのように組み立てられ得るかが明らかになる。
図1aは、pET−CBDプラスミドの概略図である。
図1b〜1cは、CBDclosのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
図1dは、pET−CBD−180の概略図である。
図1e〜1gは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCBD−180のヌクレオチド配列(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
図2aは、1コピーのCBD−180と、それに読み枠を合わせて融合させた1つのCBDとを含むpET−CCP−180の概略図である。
図2b〜2eは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCCP(セルロース架橋タンパク)のヌクレオチド配列(配列番号5)およびアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
図3aは、pET−ProtA−CBDの概略図である。
図3b〜3gは、ProtA−CBDのヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
図4aは、pET29−Spep−CBD−Sprotの概略図である。
図4b〜4gは、Spep−CBD−Sprotのヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
図5aは、1分子あたり2つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図5bは、1つのセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、第2のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している図5aのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図6は、一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示す。
図7a〜7cはそれぞれ、CBD連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図7aは、それぞれがCBDに結合している1対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7bは、それぞれが隣接するCBDにJUN/FOS架橋を介して結合している複数のCBDを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7cは、大きなタンパク質成分により連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。
図8は、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを有するCBD機能的成分(CBDC)を概略的に示す。
図9a〜9cは、CBD連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
図10a〜10dは、コントロール紙片、CBD処理紙片およびCCP処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
図11は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
図12a〜12bは、コントロール糸、CCP処理糸、ProtA−CBD処理糸およびAb−ProtA−CBD処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
図13は、大腸菌においてSタンパク質−CBD−Sペプチド(SCS)を発現させた結果の写真を示す。タンパク質マーカー(レーン1)、IPTGで誘導される前の総大腸菌タンパク質(レーン2)、IPTGで誘導された後の総大腸菌タンパク質(レーン3)、およびSCSタンパク質を含有する封入体(レーン4)。
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。すべての測定値は、23℃、65%の相対湿度、および20mm/分の一定の変形において得られた。四角−コントロール;丸−2.5mg/mlのCBD;三角−2.5mg/mlのCCP。
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。すべての測定値は23℃で得られた。蒸留水(10μl)を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した(コントロール−黒棒;CBD−点刻棒;CCP−白棒)。
図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。水滴(それぞれ20μl)をCCP処理紙に滴下して、写真を25ms毎に撮影した。最初のフレーム(A)は、水が紙に接触する前に撮影された。フレームB〜Eは、それぞれ、2分後、4分後、6分後および8分後に撮影された。最後のフレーム(F)は、処理されなかった紙に対して、水が紙と接触した25ms後に撮影された。水の吸収は、光学的接触角度計を使用して視覚化された。
【0074】
好適な実施形態の詳細な説明
本発明により、多糖材料の表面性質、化学的性質、電気的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物が提供される。
【0075】
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施形態により例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施され得るか、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明のためであり、限定であると見なすべきではないことを理解しなければならない。
【0076】
繊維およびフィラメントなどの多糖構造物は、構造物を多糖含有材料に加工する途中またはその後においてPBD含有組成物で処理され、それにより、多糖構造物および/またはそれらの製品(織物および紙など)は架橋および/または機能化される。PBD含有組成物は万能的な生物学的架橋剤として機能し、その構造は、多糖を含有する最終製品の増大した弾性または疎水性などの所望する結果を得るために変化させることができる。このような生物学的架橋剤は、大きさが数百ダルトンから数百万ダルトンまでの範囲にある1つまたは2つ以上の生物学的実体または化学的実体に融合または連結(「融合または連結」=共有結合)したセルロース結合ドメインなどのPBDを少なくとも1つ含有する多量体タンパク質である。一般に、そのような生物学的実体は1つまたは2つ以上の第2のタンパク質である。第2のタンパク質は、セルロース結合ドメイン、またはデンプン結合ドメイン、または疎水性基もしくは酵素(特に、多糖構造物の処理および/または多糖含有最終製品の特性を改善および/または促進し得る酵素、例えば、リパーゼまたはラッカーゼなどの酵素)に結合したPBDなどの機能化PBDなどの別のPBDであり得る。あるいは、第2のタンパク質は、プロテインA−抗体複合体などの非PBDタンパク質であり得る。
【0077】
改変された多糖含有材料を調製するために、多糖構造物は、多糖材料に加工している途中またはその後において、十分な量の生物学的架橋剤と、多糖構造物を含有する多糖材料の1つまたは2つ以上の特性を改変するのに十分な条件および時間で接触させられる。一例として、セルロース繊維を紙に加工するか、または綿を糸に加工する途中における従来のサイズ処理工程の代わりに、またはそのような工程とともに、PBD融合タンパク質を使用して、多糖構造物を凝集させ、かつ/または多糖繊維およびフィラメントなどの多糖構造物を架橋して、加工時における構造物自体および/または製造される多糖含有材料の湿潤強度を増大させるようにすることができる。好ましくは、PBD融合タンパク質による処理は従来のサイズ処理工程の代わりである。しかし、いくつかの適用においては、この2つの手順を、例えば、デンプンサイズ処理と、そしてデンプンおよび繊維を架橋するデンプン結合タンパク質を含むPBD融合タンパク質と組み合わせることは有用であると考えられる。さらに、機能的成分を含むPBDは、例えば、紙などの多糖含有材料の濡れ性を低下させるために疎水性成分(脂肪酸誘導体または疎水性アミノ酸配列など)で多糖含有材料(セルロースマトリックスなど)を機能化するために使用することができる。
【0078】
本発明は、例えば、商業的な製紙プロセスおよび織物プロセスにおいて使用されているような多糖構造物を処理する既存の方法を上回るいくつかの利点を提供する。セルロース繊維などの好適な多糖含有材料を生物学的架橋剤で処理することによって、処理されない材料、および/またはPBD融合タンパク質以外の強化剤を使用して処理された材料と比較して、改善された機械的性質(例えば、増大した強度および耐久性)を有する製品を得ることができる。さらに、波形加工用紙を製造する際、PBD試薬を、紙の湿潤強度を増大させるために、成形段階において、あるいはサイズ処理段階の前またはその後において、そのいずれかで適用することができる。成形段階で適用された場合、十分な湿潤強度が得られ、その結果、サイズ処理工程を省略することができる。これにより、紙を加工するために使用される装置の約1/3を省略することができるために、時間が節約されるだけでなく、紙の製造コストが大きく低下する。化学的架橋剤および疎水性材料とは対照的に、生物学的架橋剤の使用により、このプロセスを使用して作製される紙製品の再利用性もまた改善される。
【0079】
本発明の別の利点は、製紙の成形工程において、多くの微細繊維が、成形用織物を通過するために失われるということである。PBD試薬により、それらは紙スラリー中に維持され、その結果、原料のより良好な回収がもたらされる。さらに、段ボール容器を製造する最終加工工程において、アルカリ糊が、波形加工用紙を壁板に結合するために使用される。PBD分子は強アルカリ条件によって溶出され、これにより、アルカリ糊が紙に浸透し得る能力が高められる。
【0080】
本発明の多量体PBD融合タンパク質は、PBDと第2のタンパク質との2つの基本的な構成単位を有する。この場合、第2のタンパク質はPBDであってもよく、またはPBDでなくてもよい。PBDは、セルロースなどの多糖に結合するアミノ酸配列、またはPBDが結合する多糖基質の基本的な構造ユニット(骨格糖および/または末端糖および糖自体のいずれかを含み、単糖および二糖を含む)を含むポリマーに結合するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドであり得る。PBDの定義には、天然に存在するPBDの変異体、変化体およびその他が含まれる。その唯一の条件は、それらが多糖含有基質に結合するということである。PBDは可逆的または不可逆的のいずれかで基質多糖に結合することができ、基質は天然物または合成物であり得る。PBD融合タンパク質は、同じポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質あるいは異なるポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質に由来し得る複数の多糖結合ドメインを有し、かつ同じ多糖または異なる多糖に結合し得る複数の多糖結合ドメインを有するタンパク質分子であり得る。複数のPBDが存在する場合、それらは、好ましくは、PBD融合タンパク質内において別個のドメインを占め、そして、互いに独立して機能し得る。用語CBDは、セルロース結合に関与している天然タンパク質から得ることができるドメインをいうか、あるいは自身がセルロースに結合する天然タンパク質の単離されたアミノ酸配列またはフラグメントをいう(例えば、Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768;Gilkes他、(1988)J.Biol.Chem.263:10401〜10407を参照のこと。これらの両方の内容は参考として本明細書中に組み込まれる)。PBDおよびCBDは、天然物、合成物または部分合成物であり得る。
【0081】
多糖結合ドメイン(多糖結合ドメインを含む触媒活性なポリサッカリダーゼおよび触媒不活性なポリサッカリダーゼの両方を含む)は、生化学的技術および/または遺伝子工学的技術を含む様々な技術のいずれかにより得ることができる。従って、多糖結合ドメインは、タンパク質分解(例えば、Gilkes他、J.Biol.Chem.(1988)213:10401〜10407を参照のこと)によって、または当業者に知られている技術を使用する遺伝子操作(ランダム変異、部位特異的変異誘発法またはDNAシャフリングなど)によって得ることができる。部位特異的変異誘発法を使用して、ポリサッカリダーゼの触媒活性に関連する特定のアミノ酸を変異させ、そして触媒活性を阻害または阻止するが、多糖の結合を妨げないアミノ酸によって置換することができる。例えば、CenAでは、283位のアスパラギン酸を置換することができる。そのような方法は、元のポリサッカリダーゼ配列に極めて類似するアミノ酸配列を効果的にもたらすが、触媒活性を含有する機能的ドメインは変異誘発法または生化学的改変によって機能不能にされる。結合ドメインのみが依然として機能的である。変化型PBDまたは変異型PBDを得るために、1つまたは2つ以上の所定のアミノ酸残基が置換され得るか、または様々なPBDのアミノ酸配列に挿入され得るか、または様々なPBDのアミノ酸配列から欠失され得る。PBDタンパク質配列またはPBDポリペプチド配列におけるアミノ酸置換は、例えば、対象となるアミノ酸残基の極性、電荷、疎水性および親水性などの類似性または相違に基づいて合理的な様式で行うことができる。タンパク質において一般的に見出されるすべてのアミノ酸の極性および疎水性などの特性は、アミノ酸配列を特異的に変化(変異)させる技術が十分に知られているようにこの分野では十分に知られている。得られた変化型PBDまたは変異型PBDは本発明の範囲内であると見なされる。置換、挿入および/または欠失を、例えば、特定の多糖含有材料を架橋または機能化するために複数の望ましい属性を有する変化型PBDを得るために行うことができる。
【0082】
特定の変異または改変を有するポリサッカリダーゼ配列全体ではなく、多糖結合ドメインだけに対応するアミノ酸配列を使用することができる。この場合、PBDが、ポリサッカリダーゼを機能的ドメインに切断することによって得られる。例えば、単離されたポリサッカリダーゼは、機能的ドメインからなる2つ以上のフラグメントにタンパク質を切断するプロテアーゼ処理に供される。ときには、ポリサッカリダーゼは特異的なプロテアーゼ部位を含む。例えば、C.finiのエンドグルカナーゼA(CenA)は、立体配座に特異的なC.finiプロテアーゼにより切断されるPTボックスを含む。その反応の生成物は、PT配列を有する多糖結合ドメインと、ポリサッカリダーゼ触媒ドメインとである。ポリサッカリダーゼが非常に特異的配列なプロテアーゼにより切断されない場合、ポリサッカリダーゼは、特異性が低いプロテアーゼに供され、そして活性なフラグメントを、当業者に知られているクロマトグラフィーおよび他のペプチド精製技術によって単離することができる。
【0083】
結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするDNA配列をクローニングするためのプローブを作製するためにアミノ酸配列情報を使用することが含まれる。これらのクローン化された配列は、多糖結合ドメインのみをコードする欠失変異体を作製するために使用することができる。逆に、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするcDNA配列が知られている場合、他のポリサッカリダーゼに対する配列相同性に基づいて、多糖結合ドメインの位置を予測するために生化学的データ、アミノ酸データおよびDNA配列データを使用することによって、多糖結合ドメインに対応するDNA配列を特異的に構築することができる。ポリサッカリダーゼ遺伝子および多糖結合タンパク質を単離する際に使用される技術はこの分野では知られており、これには、合成、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの組合せが含まれる。多糖結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、遺伝子融合、ファージディスプレイ、DNAシャフリング、およびランダム変異誘発法または部位特異的変異誘発法が含まれる。遺伝子操作の様々な技術が十分に知られており、これには、制限、消化、切り出し、連結、インビトロ変異誘発法、プライマー修復、リンカーおよびアダプターを用いることなどが含まれる(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、Sambrook他(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY(1989年)を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる)。本発明のPBDタンパク質をコードする核酸は、単離および精製されたRNAから、またはゲノムクローニングによって得ることができる。cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーのいずれかを、この分野で十分に知られている技術を使用して調製することができ、そしてコード配列の任意の部分に対して実質的に相補的なプローブを用いて特定のPBDヌクレオチド配列についてスクリーニングすることができる。あるいは、cDNAまたはゲノムDNAを、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRクローニングのテンプレートとして使用することができる。全長のクローン、すなわち、所望するPBDタンパク質のコード配列全体を含むクローンを、発現ベクターを構築するために選択することができ、または重複するcDNAを連結して、完全なコード配列またはその所望する部分(結合ドメインなど)を形成させることができる。あるいは、PBDをコードするDNAは、この分野で十分に知られている固相技術を使用して化学合成によって全体または一部を合成することができる。
【0084】
PBDは、本発明において使用されるオリゴ糖に結合する酵素を含む様々な供給源から得ることができる。下記の表5には、可溶性グルカン(α、βおよび/または混合結合体)に対する親和性を有するすべての結合ドメインを含む、1つまたは2つ以上の可溶性/不溶性の多糖に結合するそのような結合ドメインが列挙されている。C.fimiのエンドグルカナーゼCenCに由来するN1セルロース結合ドメインは、可溶性のセロサッカリドに結合し、そしていずれかの可溶性多糖に結合することが知られている小さなタンパク質集団の1つである。また、表1〜表4には、仮想的なβ−1,3−グルカン結合ドメインを含有するタンパク質の例(表1);連鎖球菌のグルカン結合反復を含有するタンパク質(Cplスーパーファミリー)の例(表2);キチン結合ドメインを有する酵素の例(表3);およびデンプン結合ドメインを有する酵素の例(表4)が列挙されている。セルロース結合ドメインタンパク質を含む様々なスカホールドタンパク質、例えば、クロストリジウム・セルロボランス(Clostridium cellulovorans)によって産生されるスカホールドタンパク質(Shoseyov他、国際特許出願PCT/US94/04132)などもまた、PBPを調製するために使用することができる。トリコデルマ(Trichodenma)種およびその他を含むいくつかの菌類もまた、PBPが単離され得るポリサッカリダーゼを産生する。
【表1】
【表2】
【0085】
注目される結合特性および結合特異性を有する新しいPBPを様々な方法で同定およびスクリーニングすることができる。そのような方法には、例えば、NMR分光法(Zhu他、(1995)Biochemistry、34;Gehring他、(1991)Biochemistry、30:5524〜5531)、UV差分光法(Beishaw他、(1993)Eur.J.Biochem.211:717〜724)、蛍光(滴定)分光法(Miller他、(1983)J.Biol.Chem.258:13665〜13672)、UVまたは蛍光によるストップフロー分析(De Boeck他、(1985)Eur.J.Biochem.149:141〜415)、アフィニティー方法(アフィニティー電気泳動(Mimura他、(1992)J.Chromatography、597:345〜530)あるいは固定化された単糖またはオリゴ糖でのアフィニティークロマトグラフィーなど)、沈殿または凝集による分析(濁度法的または比濁法的な分析(Knibbs他、(1993)J.Biol.Chem.14940〜14947)を含む)、競合的阻害アッセイ(定量的なIC50決定を伴うかまたは伴わない)および様々な物理的または物理化学的な方法(示差走査熱測定法または等温滴定熱測定法を含む)(Sigurskjold他、(1992)J.Biol.Chem.267:8371〜8376;Sigurskjold他、(1994)Eur.J.Biol.225:133〜141)、あるいは熱CD分光法または熱蛍光分光法を使用するオリゴ糖の非存在下または存在下でのタンパク質安定性の比較アッセイ(融解)などの分光学的(滴定)方法が含まれる。
【0086】
一般に、PBPがオリゴ糖に結合するKaは、少なくとも弱い抗体−抗原抽出物の範囲内にあり、すなわち、10−3であり、好ましくは10−4であり、最も好ましくは10−6である。PBPのオリゴ糖に対する結合が発熱性または吸熱性である場合、多糖構造物を処理している時の温度を調節する手段を提供することにより、結合は、より低い温度で、それぞれ、増大または低下する。
【表3】
【表4】
a生デンプン消化アミラーゼ、bマルト生成α−アミラーゼ、cマルトテトラオース生成アミラーゼ(1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ)、dマルトペンタオース生成アミラーゼ、e熱安定性α−アミラーゼ、f以前のClostridium thermosulfurogenes。AMYG、GAMおよびGLA:グルコアミラーゼ、AMYまたはAML:α−アミラーゼ、CGT:β−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼまたはシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ORF:オープンリーディングフレーム。A.:Aspergillus、B.:Bacillus、C.:Corticium、D.:Dictiosteium、H.grisea:Humicola grisea、H.resinea:Hormoconis resinea(Amorphotheca resinea)、K.:Klebsiella、N.:Neurospora、S.:Streptomyces、Th.curvata:Thermomonospora curvata、Th.:Thermoanaerobacter。
表 5
【0087】
多数のCBDが知られており、これらは少なくとも12のファミリーに分類されており、そのいずれも、CBDの目的とする使用に依存してCBDの供給源として役立ち得る。ファミリーIは菌類の酵素のCBDのみを含む。残る11ファミリーにおける大多数のCBDは細菌起源である。最もよく理解されているCBDは、ファミリーI、II、IIIおよびIVに属するCBDであり、それらのCBDは、長さが、平均して、それぞれ、36アミノ酸、105アミノ酸、150アミノ酸および150アミノ酸である。ファミリーI、II、IIIおよびIVのいくつかのCBDは、ロールカステラ状に折り畳まれた複数の反平行なβシートを含むとして特徴付けられており、ファミリーI、IIおよびIIIのCBDは非晶質セルロースおよび結晶性セルロースの両方に結合し、これに対して、ファミリーIVのCBDは非晶質セルロースに結合するが、結晶性セルロースには結合しない。ファミリーIVのCBDのみが可溶性のセルロース誘導体およびセロオリゴ糖に結合する。結晶性セルロースおよびキチンに結合するCBDは、類似する親和性で結合し、マイクロモル濃度の範囲の結合定数を有する。ファミリーIのCBDはセルロースに可逆的に結合し、これに対して、ファミリーIIおよびファミリーIIIのCBDは非変性条件のもとで不可逆的に結合する。好ましいCBDには、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)、トリコデルマ・レーセイ(Trichoderma reesei)およびM.Bisporaのそれぞれの種に属する菌株から得ることができるCBD(N.R.Gilkes他、(1988)J.Biol.Chem.263:10401〜10407;N.R.Gilkes他、(1991)Microbiol.Rev.55:303〜315);セルロモナス・フィミから得られるセルラーゼ遺伝子(Whittle他、(1982)Gene、17:139〜145;Gilkes他、(1984)J.Gen.Microbiol.130:1377〜1384);C.fimiから得られるエキソグルカナーゼ(Cex)およびエンドグルカナーゼ(CenA)ならびにそれらの遺伝子配列(cexおよびcenA)(Wong他、(1986)Gene、44:315〜324;O’Neill他、(1986)Gene、44:325〜330);Shoseyov他(1992)(Proc.Natl.Acad.Sci.89:3483〜3487)により記載されるクロストリジウム・セルロボランス(Clostridium cellulovorans)に由来する17KD(ペプチド)CBDが含まれる。このCBDの組換え形態はセルロースおよびキチンに対して強い親和性を示す(Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768)。
【0088】
PBDタンパク質はまた、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質の多糖結合領域の機能的部分を少なくともコードするDNAを含むDNA構築物を宿主細胞に形質転換することによって調製することができる。PBDのDNA配列は真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかの宿主細胞で発現させることができる。発現して単離されたPBDは、その後、他のPBDおよび/または1つもしくは2つ以上の機能化タンパク質に結合させることができる。
【0089】
これらの場合のいずれにおいても、単離された多糖結合ドメインは、一般に、ポリサッカリダーゼ活性が目的とする融合タンパク質の所望する特徴である場合を除いて、触媒的なポリサッカリダーゼ活性を除くために十分に純粋である。好ましくは、そのような調製物の触媒活性は、ポリサッカリダーゼを発現する細胞から得られた粗抽出物の活性よりも小さい。より好ましくは、触媒活性は、1000個の機能的な結合ドメインあたり1個未満の機能的な触媒ドメインの化学量論を反映する。所望する発現産物の活性を試験するために、PBDの結合活性を、例えば、アビセル(微結晶性セルロース)などの微結晶性セルロースに対する結合によって、そして仮想的な結合ドメインが溶液から除かれることを示すことによって明らかにすることができる。所望する活性を有するポリペプチドは、高度に精製された形態でセルロースから容易に単離される。アビセルに対する結合は、天然型セルラーゼ(Gilkes他、J.Biol.Chem.(1984)259:10455〜10459)および組換えセルラーゼ(Owolabi他、Appl.Environ.Microbiol.(1988)54:518〜523)の両方を精製するために使用されている。
【0090】
多量体PBD融合タンパク質の第2の基本的な構成単位は、第1の構成単位であるPBDと同じであり得る第2のPBD、または第1の構成単位とは異なり得る第2のPBDであり得るタンパク質である。従って、多量体融合タンパク質は、それぞれがPBDをコードする1対のヌクレオチド配列によってコードされ、そしてこの分野で十分に知られているように読み枠を合わせて連結されている二量体PBD融合タンパク質であり得る(例えば、米国特許第5856201号および米国特許第5837814号(ともにShoseyov他、これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。図5aには、第1および第2の両方のタンパク質がCBDであり、従って二量体CBDを形成するPBD融合タンパク質の一例が示されている。この場合、CBDは同じであってもよく(ホモ二量体CBD)、または異なっていてもよい(ヘテロ二量体CBD)。図5bには、図5aのセルロース架橋タンパク質の使用が示されている。この場合、一方のセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、そしてもう一方のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している。図6は、リンカーユニットを介して連結された1対のCBDを含む一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示している。
【0091】
あるいは、第2の構成単位は、1つまたは2つ以上の機能化基を必要に応じて含むPBDであり得る。機能化基により、多糖含有材料の1つまたは2つ以上の性質を改変することができる機能的な基が意味される。一般に、機能化基は、ケイ素結合性ペプチド、ポリマー結合性ペプチドまたは金属結合性ペプチドなどのタンパク質またはペプチドである(Ljungquist他、(1989)Eur.J.Biochem.86:563〜569;Spanner他、(1995)Bone17:161〜165;Slice他、(1990)J.Biol.Chem.265:256〜263;Pessi他、(1993)Nature、362:367〜369)。機能化ポリペプチドの他の例には、多糖繊維およびデンプン分子を架橋する手段を提供するデンプン結合ドメインが含まれる;デンプンは、繊維の内因性成分であり得るし、またはサイズ剤として適用され得る。デンプン結合ドメインは、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)のグルコアミラーゼから得ることができる(Chen他、(1991)Gene、99:121〜126)。同様に、多糖分子およびグルテン分子は、マトリックスタンパク質(高分子量グルチニン(HMWG)など)を別のポリペプチドとして使用することによって架橋することができる。特定の適用には、機能化基はまた、1つまたは2つ以上のチオール基などの化学基、発色基、色素、反応性基(アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシ、カルボジイミドなど)、または光反応性基(PBDに結合したフェニルアジドなど)を含むことができる。様々な化学的実体をPBDに結合させる方法が米国特許第5,962,289号に記載されている(これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0092】
PBD融合タンパク質の第1の構成単位は、必要に応じて、リンカーユニットを介して第2の構成単位に連結させることができる。PBD連結剤ユニットのリンカーユニットは、生物学的ポリマー(タンパク質、ポリペプチドまたは多糖など)ならびに合成ポリマー(アクリルポリマーなど)およびマトリックスタンパク質(高分子量グルチニン)を含む様々な天然分子または合成分子を含むことができる。リンカーユニットのペプチド成分またはタンパク質成分の例には、JUNタンパク質およびFOSタンパク質(例えば、Gentz他、(1989)Science、243:1695〜1699を参照のこと);デンプン結合ドメイン(SBD)(例えば、Chen他、(1991)Gene、99:121〜126を参照のこと)、およびSペプチドまたはSタンパク質(例えば、Kim他、(1993)Protein Science、2:348〜356を参照のこと)が含まれる。融合タンパク質における第1および第2のポリペプチド(あるいは複数の第1および/または第2のポリペプチド)は、融合タンパク質の目的とする使用に部分的に依存して、ペプチド結合を介して、またはより大きなリンカーユニットを介して直接連結させることができる。図8は、第1のCBDと、第2のCBDと、第1および第2のCBDを連結するリンカーユニット(LU)とを有するCBD連結剤ユニットを概略的に示している(図中ではCUと示される)。第1および第2のCBDは末端性であるとして、そしてリンカーユニットの反対側の極に存在するとして図8には描かれているが、CBDおよびリンカーユニットの他の数および配置も考えられ、そして本発明の範囲内である。リンカーユニットは、共有結合的結合、イオン性結合、疎水性結合、水素結合、タンパク質翻訳およびタンパク質伸長を含む様々な手段の1つまたはその組合せによってPBD連結剤ユニットのそれぞれのPBDに結合させることができる。
【0093】
リンカーユニットの多糖成分は、PBDが結合しない多糖、またはPBDが低い親和性で結合する多糖であり得る。そのような多糖の例として、デンプンが挙げられる。さらに、PBD連結剤ユニットのリンカーユニットは、PBD以外の1つまたは2つ以上の多糖結合ドメインであり得る。一例として、図7aには、第1のCBDと、第2のCBDに連結した第2のデンプン結合ドメインと、第1のデンプン結合ドメインおよび第2のデンプン結合ドメインの両方に連結したデンプン成分とを含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。
【0094】
PBD連結剤ユニットのリンカーユニットはまた、1つまたは2つ以上のPBDを含むことができる。一例として、図7bには、複数のCBDを含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。この場合、リンカーユニットのそれぞれのCBDは、JUN/FOS架橋を介して隣接するCBDに連結されている(例えば、Gentz他、(1989)Science、243:1695〜1699を参照のこと)。図7cには、セルロースまたは関連ポリマーに結合しないか、またはセルロースまたは関連ポリマーに低い親和性で結合するだけであるペプチド成分またはタンパク質成分を含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。連結剤ユニット(例えば、リンカータンパク質)のペプチド成分またはタンパク質成分は、サイズが数百ダルトンから1メガダルトン以上まで変化し得る。一例して、図7cに表されるリンカーユニットは数アミノ酸の短いペプチドであり得るか、またはHMWGなどの比較的大きなリンカータンパク質であり得る。
【0095】
多量体PBD融合タンパク質は化学的または組換え的に作製することができる。例えば、当業者に知られている技術を使用して、多糖結合領域またはその複数体を思う通りに作製して、精製し、その後、機能化基を有するか、または機能化基を有しない第2のタンパク質に化学的に連結させることができる。タンパク質の結合方法には、多糖結合ドメインを改変するためのインビトロ結合化学反応が含まれる。これには、ドメインを多糖マトリックスに結合させながら、またはドメインを多糖マトリックスから遊離させながら、そのいずれかで行うことができる。例として、ReichlinによりMethods of Enzymology(1980)70:159〜165に記載されるようなグルタルアルデヒド結合の使用が挙げられる。多糖結合ドメインがマトリックスに結合する場合、マトリックスに実際に結合する部位を保護し、その一方で、他の残基が第2の成分(第2のPBDまたは機能化タンパク質のいずれか)と反応するようにしておくという利点が得られる。化学的成分を多糖結合ドメインに結合させることにより、多糖基質への結合能が損なわれる場合には、多糖マトリックスの存在を必要とする反応手順が、ドメインの結合特性を保持するためには好ましい。
【0096】
あるいは、多量体PBD融合タンパク質は組換え的に作製することができる。PBD融合タンパク質を組換え的に作製するために、PBD融合タンパク質の成分をコードするヌクレオチド配列が、PBD融合タンパク質を発現させることができる組換え発現ベクターを構築するために使用される。一般に、核酸構築物は、タンパク質のヌクレオチドコード配列に機能的に連結されている転写調節情報および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有する場合にタンパク質を発現させることができる。「機能的に連結されている」は、調節的なDNA配列および発現するDNAが、転写および翻訳を可能にするような方法で連結されている連結をいう。多糖結合ドメインをコードするフラグメントと、第2の多糖結合ドメインまたは機能化ポリペプチドをコードするDNAとは、PBDをコードする核酸が、第2のタンパク質をコードする核酸に連結され、その結果、PBDおよび第2のタンパク質が一緒になったオープンリーディングフレームが完全になり、これにより、PBD融合タンパク質全体の翻訳が生じ得るように連結される。PBD融合タンパク質がタンパク質連結剤ユニットを有する場合、ヌクレオチド配列が、PBDコード配列と第2のタンパク質をコードする配列との間において発現構築物に機能的に挿入される。得られた連結DNAは、その後、発現をもたらす様々な方法で操作することができる。
【0097】
核酸増幅および核酸発現の両方に使用されるベクターはこの分野では十分に知られている。適切なベクターを選択することは、目的とする機能(例えば、増幅または発現)、DNAインサートのサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞を含む様々なパラメーターに依存する。様々な発現ベクター/宿主系を、PBDタンパク質およびPBD融合タンパク質の組換え発現のために当業者は利用することができる。そのような系には、所望するPBDコード配列を含有する組換えファージDNA発現ベクター、組換えプラスミドDNA発現ベクターまたは組換えコスミドDNA発現ベクターで形質転換される細菌などの微生物;所望するPBDコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母;所望するPBDコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させられる昆虫細胞系;所望するPBDコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV);タバコモザイクウイルス(TMV))に感染させられる植物細胞系、または所望するPBDコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換される植物細胞系;または組換えウイルス発現ベクター(例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス)に感染させられる動物細胞系で、多コピーのPBD核酸を含有するように操作され、二重微小染色体において安定に増幅される細胞株(例えば、CHO/dhfr、CHO/グルタミン合成酵素)または二重微小染色体において安定に増幅されない細胞株(例えば、ネズミ細胞株)を含む動物細胞系が含まれる。
【0098】
上記に列挙された成分の1つまたは2つ以上を含有し、かつ所望するコード配列および制御配列を含む好適なベクターの構築には、標準的な連結技術が用いられる。単離されたプラスミドまたは核酸フラグメントは、必要とされるプラスミドを作製するために所望される形態で、切断され、調整され、そして再連結される(Current Protocols in Molecular Biology、第I巻〜第III巻、Ausubel,R.M.編(1994年)を参照のこと)。DNA構築物(例えば、プラスミド)における正しい配列を確認するために、連結混合物を使用して、大腸菌のXl−1株およびDH52株が形質転換され、成功した形質転換体が抗生物質(例えば、アンピシリン)耐性によって選択される。これらは適宜行われる。形質転換体に由来するプラスミドが調製され、制限によって分析され、かつ/または配列決定される(例えば、Messing他、Nucleic Acids Res.9:309(1981);Maxam他、Methods in Enzymology、65:499(1980)を参照のこと)。一般に、発現ベクターは宿主細胞において効率よく複製することができ、その結果、宿主細胞は多数コピーの発現ベクターを蓄積し、次に、高レベルの目的タンパク質を合成する。発現カセットは、適切な細胞宿主におけるエピソーム維持のために複製系に含ませることができるか、または発現カセットが宿主のゲノム内に組み込まれる場合には複製系を用いることなく提供され得る。
【0099】
PBD融合タンパク質をコードするDNAが得られると、DNAは宿主細胞において複製し得るベクターに入れられるか、あるいはPCRまたはロングPCRなどの技術によってインンビトロで増やされる。複製するベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、人工染色体などを挙げることができる。望ましいベクターには、目的遺伝子の変異誘発に有用なベクター、または目的遺伝子の宿主細胞における発現に有用なベクターが含まれる。ロングPCRの技術により、可能な長い構築物がインビトロで増やされており、その結果、変異誘発または発現シグナルの付加などの目的遺伝子の改変、および得られた構築物の増殖を、複製するベクターまたは宿主細胞を使用することなく完全にインビトロで行うことができる。
【0100】
PBD融合タンパク質を発現させるために、機能的な転写および翻訳の開始領域および終結領域が、PBD融合タンパク質をコードするDNAに機能的に連結される。融合タンパク質をコードする領域の発現をインビトロまたは宿主細胞内で行うことができる。転写および翻訳の開始領域および終結領域は、発現させられるDNA、所望する系で発現し得ることが知られている遺伝子、または所望する系で発現し得ることが考えられる遺伝子、発現ベクター、化学合成を含む様々な非限定的な供給源に由来し得るか、あるいは宿主細胞の内在性遺伝子座に由来する。
【0101】
インビトロ発現を、例えば、インビトロでの使用のために設計された発現ベクターにPBD融合タンパク質のコード領域を入れ、そしてウサギ網状赤血球溶解物および補助因子を加えることによって達成することができる。この場合、標識されたアミノ酸を、所望する場合には混合することができる。そのようなインビトロ発現ベクターは、使用される系において必要な発現シグナルの一部またはすべてを備えることができる。これらの方法はこの分野では十分に知られており、系の成分は市販されている。その後、反応混合物は、例えば、その結合活性を測定することによって融合タンパク質について直接アッセイすることができ、あるいは合成された融合タンパク質を精製して、その後アッセイすることができる。
【0102】
宿主細胞における発現は一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。一過的な発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含有するが、宿主細胞において複製せず、そして宿主細胞にほとんど組み込まれない導入された構築物から生じ得るか、または宿主細胞が増殖しない場合に生じ得る。一過的な発現はまた、目的遺伝子に機能的に連結されている調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成され得るが、そのような誘導可能な系は、しばしば、低い基底レベルの発現を示す。安定的な発現は、宿主ゲノムに組み込まれ得る構築物、または宿主細胞において自律的に複製する構築物を導入することによって達成することができる。目的遺伝子の安定的な発現は、発現構築物に存在する選択マーカーの使用によってマーカーを発現する細胞について選択され得るか、または発現構築でトランスフェクションされ、その後、マーカーを発現する細胞について選択され得る。安定的な発現が組み込みから生じる場合、構築物の組み込みは宿主ゲノム内にランダムに生じ得るか、または宿主の遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含有する構築物の使用によって標的化され得る。構築物が内因性の遺伝子座に標的化される場合、転写調節領域および翻訳調節領域のすべてまたは一部が内因性の遺伝子座によって提供され得る。
【0103】
供給源の生物におけるPBD融合タンパク質の増大した発現が所望される場合、いくつかの方法を用いることができる。PBD融合タンパク質をコードするさらなる遺伝子を宿主生物に導入することができる。発現はまた、例えば、より強力なプロモーターを使用することによって、または脱安定化配列をmRNAまたはコードされるタンパク質のいずれかから除くことによって、または宿主ゲノムからそのような情報を除くことによって、または安定化配列をmRNAに加えることによって増大させることができる(米国特許第4910141号)。
【0104】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、かつ目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流(5’)に存在し(一般には、開始コドンの約100bp〜1000bpのところ)、かつプロモーターが機能的に連結されている特定の核酸配列(PBD融合タンパク質をコードする配列など)の転写および翻訳を制御する非翻訳配列である。
【0105】
プロモーターは、典型的には、誘導的と構成的との2つのクラスに分けられる。誘導的プロモーターは、培養条件の何らかの変化(例えば、栄養素の存在または非存在あるいは温度の変化など)に応答してその制御下にある核酸からの増大したレベルの転写を開始させるプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される非常に多くのプロモーターがこの分野では十分に知られている。プロモーターは、制限酵素消化により供給源の核酸からプロモーターを除き、単離されたプロモーター配列を融合タンパク質のコード配列とともにベクターに挿入することによって、融合タンパク質をコードする核酸に機能的に連結される。プロモーターは、合成、半合成、(宿主細胞に対して)細胞本来のプロモーター配列または(宿主細胞に対して)異種のプロモーターとすることができ、融合タンパク質の増幅および/または発現を行わせるために使用することができる。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターはこの分野では十分に知られている(例えば、Chang他、(1978)Nature、275:615;Goeddel他、(1979)Nature、281:544;Goeddel、(1980)Nucleic Acids Res.8:4057;欧州特許庁特許出願公開第36,776号;H.de Boer他、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:21〜25を参照のこと)。そのようなプロモーターのヌクレオチド配列は一般に知られており、それにより、当業者は、何らかの必要な制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを使用して、融合タンパク質をコードするヌクレオチドにプロモーターを機能的に連結させることができる(Siebenlist他、(1980)Cell、20:269を参照のこと)。
【0106】
細菌系において使用されるプロモーターはまた、PBDコード核酸に機能的に連結されているシャイン−ダルガルノ(S.D.)配列を含有する。例示的な転写調節領域またはプロモーターには、細菌の場合、lacプロモーター、ラムダのレフトプロモーターおよびライトプロモーター、trpおよびlacのプロモーター、tacプロモーターなどが含まれる。転写調節領域は、融合された遺伝子の発現時期を調節することができる調節配列をさらに含むことができる(例えば、栄養素または発現産物の増殖培地における存在または非存在、温度など)。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージλPLプロモーター、バクテリオファージλOLオペレーターおよび温度感受性リプレッサーを含む調節配列を使用して温度によって調節することができる。プロモーターの調節は、リプレッサーとオペレーターとの相互作用によって達成される。真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に必要な配列、およびmRNAを安定化させる配列を含有する。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導剤(例えば、メタロチオネインプロモーターに対する亜鉛イオンおよびカドミウムイオン)の存在下で高めることができる。このように、PBD融合タンパク質の発現を制御することができる。発現を制御できることは、例えば、PBD融合タンパク質が宿主細胞に対して致死的である場合には重要であり得る。
【0107】
宿主細胞が酵母である場合、酵母細胞において機能的な転写領域および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば、解糖経路における遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなど)から、または調節可能な遺伝子(酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼなど)から得ることができる。構成的または誘導的な転写が所望されるかどうか、目的のオープンリーディングフレームと一緒になったプロモーターの特定の効率、強力なプロモーターと誘導的な転写を可能にする異なるプロモーターの制御領域とを結合させることができること、構築の容易さなどに依存して、多数の調節配列のいずれか1つを特定の状況において使用することができる。特に注目されるものは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトースにより誘導され得るプロモーター(GAL1、GAL7およびGAL10)が、酵母における高レベルの調節された発現のために広範囲に利用されている(Lue他、Mol.Cell.Biol.第7巻、3446頁、1987;Johnston、Microbiol.Rev.第51巻、458頁、1987)。GALプロモーターからの転写は、ガラクトースが存在するときには、プロモーター領域に結合して転写を活性化するGAL4タンパク質によって活性化される。ガラクトースが存在しない場合、アンタゴニストのGAL80がGAL4に結合して、GAL4が転写を活性化することを妨げる。ガラクトースの添加により、GAL80がGAL4による活性化を阻害することが妨げられる。
【0108】
翻訳開始コドンATGの周りのヌクレオチド配列は酵母細胞における発現に影響することが見出されている。所望するポリペプチドが酵母において良好に発現しない場合、外因性遺伝子のヌクレオチド配列を、最適な遺伝子発現を得るために効率的な酵母の翻訳開始配列を含むように改変することができる。サッカロミセス(Saccharomyces)における発現の場合、これは、内因性のサッカロミセス遺伝子(好ましくは、ラクターゼ遺伝子などの高発現の遺伝子)に読み枠を合わせて翻訳開始部位を融合することにより、効率的に発現しない遺伝子の部位特異的変異誘発によって行うことができる。終結領域は、開始領域が得られた遺伝子の3’領域に由来し得るか、または異なる遺伝子に由来し得る。非常に多くの終結領域が知られており、同じ属および種ならびに異なる属および種の様々な宿主において申し分ないことが見出されている。終結領域は、通常、何らかの特定の性質のためからではなく、むしろ便宜的に選択される。好ましくは、終結領域は酵母の遺伝子に由来する(特に、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)またはクルイベロミセス(Kluyveromyces))。2つの哺乳動物遺伝子(χインターフェロンおよびα2インターフェロン)の3’領域もまた、酵母において機能することが知られている。
【0109】
場合により、融合された遺伝子の分泌を規定するシグナル配列(分泌リーダー)を、構造遺伝子の上流に、構造遺伝子と読み枠を合わせて備えることが望ましいことがある。例示的な分泌リーダーには、ペニシリナーゼ、免疫グロブリン、T細胞受容体、外膜タンパク質などの分泌リーダーが含まれる。正しい読み枠で融合することによって、キメラなポリペプチドを培地中に分泌させることができる。
【0110】
融合タンパク質のコード配列を含む構築物は標準的な様々な技術によって宿主細胞に導入することができる。これらの技術には、形質転換、プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクション、形質導入、接合、感染、弾道学的衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、スクレイピング、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法が含まれる。使用される形質転換方法には、酢酸リチウム形質転換(Methods in Enzymology、第194巻、186頁〜187頁、1991)が含まれる。原核生物および真核生物の生物または細胞の遺伝子形質転換に対する様々な方法がこの分野では十分に知られている(例えば、Cohen他、(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69:2110;Current Protocols in Molecular Biology(上記)を参照のこと)。宿主細胞は、上記の本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いてトランスフェクションすることができ、好ましくは形質転換することができ、そして形質転換された細胞は、プロモーターを誘導するために、あるいは形質転換体を選択するために、あるいは所望するPBDまたはPBD融合タンパク質をコードする遺伝子を増幅するために適するように改変され得る従来の栄養培地で培養することができる。「形質転換」により、核酸が染色体外エレメントとして、または宿主生物のゲノム内への組み込みにより、そのいずれかで複製可能であるように、核酸が生物に導入されることが意味される。
【0111】
対象の宿主は、少なくとも1コピーの発現構築物を有し、そして遺伝子がゲノムに組み込まれるか、増幅されるか、または多数コピーを有する染色体外エレメントに存在するかどうかに依存して2つ以上の発現構築物を有することがある。対象の宿主が酵母である場合、下記の4つの基本的なタイプの酵母プラスミドベクターを使用することができる:酵母組み込みプラスミド(YIp)、酵母複製プラスミド(YRp)、酵母動原体プラスミド(YCp)および酵母エピソームプラスミド(YEp)。YIpは、酵母の複製起点を有しておらず、酵母ゲノムに組み込まれたエレメントとして増殖させなければならない。YRpは、染色体に由来する自律的な複製配列を有し、中程度のコピー数(20〜40)として増殖し、従って、自律的に複製し、不安定に分離するプラスミドである。YCpは、複製起点および動原体配列の両方を有し、低コピー数(10〜20)として増殖し、従って、自律的に複製し、安定に分離するプラスミドである。YEpは、酵母の2μプラスミドに由来する複製起点を有し、高コピー数として増殖し、従って、自律的に複製し、不規則に分離するプラスミドである。酵母におけるプラスミドの存在は、プラスミドに存在するマーカーに対する選択を維持することによって確保され得る。特に注目されるものは、pYES2(Invitrogenから得られるYEpプラスミドで、ウラシルプロトトロフィー(prototrophy)および発現させるためのGAL1ガラクトース誘導プロモーターを提供する)、pRS425−pG1(T.H.Chang博士(オハイオ州立大学、分子遺伝学の準教授)から得られ、構成的なGPDプロモーターを含有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するYEpプラスミド)、およびpYX424(構成的なTP1プロモーターを有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するYEpプラスミド;AlberおよびKawasaki(1982)、J.Mol&Appl.Genetics、1:419)の酵母ベクターである。
【0112】
形質転換された宿主細胞は、導入された構築物に含有されるマーカーに対する選択によって同定することができる。あるいは、別個のマーカー構築物を、多くの形質転換技術により多くのDNA分子が宿主細胞に導入されるように、所望する構築物とともに導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、選択培地におけるその生育能について選択される。選択培地には抗生物質を混合してもよく、あるいは選択培地は、形質転換されなかった宿主の生育に必要な因子(栄養素または成長因子など)を有しなくてもよい。そのために導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性をもたらし得るか、または不可欠な成長因子または酵素をコードして、形質転換された宿主で発現したときに選択培地における生育を可能にし得る。形質転換された宿主の選択はまた、発現したマーカータンパク質が直接的または間接的のいずれかで検出され得るときに行うことができる。マーカータンパク質は、単独で、または別のタンパク質との融合体として発現させることができる。マーカータンパク質はその酵素活性によって検出することができる;例えば、β−ガラクトシダーゼは基質X−galを着色産物に変換することができ、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することができる。マーカータンパク質はその発光特性または改変特性によって検出することができる;例えば、発光オワンクラゲ(Aequorea victoria)の緑色蛍光タンパク質(GFP)は、青色光で照らされたときに蛍光を発する。抗体を使用して、マーカータンパク質または分子標識(例えば、目的タンパク質に存在する分子標識)を検出することができる。マーカータンパク質または標識を発現する細胞は、例えば、視覚的に、または抗体を使用するFACSまたはパンニングなどの技術によって選択することができる。酵母の形質転換体を選択する場合、酵母において機能する任意のマーカーを使用することができる。望ましくは、カナマイシンおよびアミノグリコシドG418に対する耐性が、ウラシル、ロイシン、リシンまたはトリプトファンを含まない培地における生育能と同様に注目される。
【0113】
融合された遺伝子が適切な宿主に導入されると、宿主は、プロモーターを誘導するために、または形質転換体を選択するために、または遺伝子を増幅するために(適するように改変された)従来の栄養培地で生育させて、融合遺伝子を発現させることができる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を産生させるために使用される原核生物細胞は、Sambrook他(1989)、Bacterial Media in Molecular Cloning(Nolan,C.編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、A.1〜4頁(これは参考として本明細書中に組み込まれる)に一般的に記載されているような好適な培地で培養することができる。生成物が分泌される場合、栄養培地を回収して、多糖マトリックスに結合させることによって生成物を単離することができる。生成物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を集め、溶解し、そして多糖基質に結合させることによって、生成物を単離および精製することができる。活性なタンパク質を産生させるために、タンパク質をフォールディングさせることが必要になる場合がある。挿入された配列の発現を調節するか、所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞菌株が選ばれる。用語「宿主細胞」は、目的のPBDタンパク質またはPBD融合タンパク質を発現し得るそのような細胞として定義され得る。宿主細胞には、原核生物細胞(細菌)および真核生物細胞(哺乳動物、酵母、昆虫、植物など)が含まれる。タンパク質生成物の修飾(例えば、リン酸化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能には重要であると考えられる。種々の宿主細胞は、多くの場合、発現したタンパク質の翻訳後プロセシングに対する特徴的または特異的な機構を有する。適切な細胞系統または宿主系を、発現したPBDタンパク質またはPBD融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実に行うために選ぶことができる。一例として、組換え生成物は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ず、天然型グリコシル化または他のグリコシル化を有する。グリコシル化の量は、部分的には、生成物が産生される生物だけでなく、その特定のペプチドの配列に依存している。大腸菌細胞における生成物の発現は非グリコシル化生成物をもたらし、昆虫細胞における生成物の発現は、一般に、哺乳動物細胞における生成物の発現よりも少ないグリコシル化をもたらす。酵母における発現は過度なグリコシル化をもたらし得る。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが望ましい。発現が真核生物宿主(他、植物または哺乳動物)で行われる場合、構築物はどれも潜在的なグリコシル化部位を含まないことが好ましい。
【0114】
PBD融合タンパク質の産生は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかで行うことができる。目的とする原核生物細胞には、大腸菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、シアノバクテリアなどが含まれる。PBD融合タンパク質のクローニングおよび発現のために特に注目される原核生物細胞として、大腸菌BL2(DE3)PLYS株が挙げられる。真核生物細胞には、乳汁分泌動物の細胞などの哺乳動物細胞、ニワトリなどの鳥類の細胞、ならびに昆虫細胞、菌類細胞、植物細胞および藻類細胞を含む遺伝子操作が容易な他の細胞が含まれる。これらの細胞は培養することができ、あるいは動物を含む宿主生物の一部またはすべてとして形成させることができる。ウイルスおよびバクテリオファージもまた、遺伝子移入、細胞ターゲティングおよび選択の場合には特に、PBD融合タンパク質を産生させる際に細胞とともに使用することができる。宿主動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなどが含まれる。これらは、トランス遺伝子発現集団の迅速な拡大のために遺伝子操作およびクローニングを行うことが容易である。動物の場合、遺伝子調節領域を改変することにより、PBD融合タンパク質のコード配列を、標的とするオルガネラ、組織および体液(宿主動物の乳汁など)における発現のために適合させることができる。
宿主微生物の例には、サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、あるいはカンジダ(Candida)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属または他の菌類などの他の酵母(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、アカパンカビ(Neurospora)属、ペニシリウム(Penicillium)属などの糸状菌類)が含まれる。宿主微生物の望ましい特徴は、例えば、宿主微生物が遺伝子的に十分に特徴付けられ、そして超高密度発酵を使用する生成物の高レベル発現のために使用できるということである。
【0115】
鳥類種および鳥類細胞(ニワトリ、七面鳥、ウズラおよびアヒルなど)においてPBD融合タンパク質を産生させる場合、この分野で知られている手順に従って、PBD融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入することによって遺伝子移入を行うことができる。トランスジェニック動物が所望される場合、胚の多能性幹細胞に、トランス遺伝子をコードするPBD融合タンパク質を有するベクターを導入して、多能性幹細胞を成体動物に発達させることができる(米国特許第5,162,215号;Ono他、(1996)Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3):287〜292;国際特許出願公開WO9612793;国際特許出願公開WO9606160)。ほとんどの場合において、トランス遺伝子は、高レベルのPBD融合タンパク質を発現させるように改変される。トランス遺伝子は、例えば、鳥類細胞において機能する転写調節領域および/または翻訳調節領域(特定の組織および卵部分(卵黄など)において発現を行わせるプロモーターなど)を備えることによって改変することができる。遺伝子の調節領域は、ニワトリ貧血症ウイルスまたはトリ白血病ウイルスまたは鳥類遺伝子(ニワトリのオバルブミン遺伝子など)を含む様々な供給源から得ることができる。
【0116】
昆虫細胞におけるPBD融合タンパク質の産生は、PBD融合タンパク質トランス遺伝子を有するバキュロウイルス発現ベクターを使用して行うことができる。バキュロウイルス発現ベクターは、Clonetechなどのいくつかの市販元から得ることができる。上記に記載される他の発現ベクターの場合と同様に、PBD融合タンパク質トランス遺伝子の発現時期、発現程度および活性を、ポリペプチドのコード配列を特定の使用のために選択された適切な転写調節領域および翻訳調節領域と合わせることによって調節することができる。特に注目されるものは、事前に選択された生育条件のもとで誘導され得るプロモーター領域である。例えば、温度感受性変異および/または代謝応答性変異をトランス遺伝子のコード配列に導入すること、および/またはその調節領域に導入すること、および/またはトランス遺伝子が導入される細胞のゲノムに導入することが、この目的のために使用することができる。
【0117】
形質転換された宿主細胞は、所望する最終結果に適合した適切な条件のもとで生育させられる。培養で生育させられる宿主細胞の場合、条件は、典型的には、最大収量または最も経済的な収量のPBD融合タンパク質を産生させるように最適化される。最適化され得る培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加される基質の最終濃度、添加される基質の形態、好気的生育または嫌気的生育、生育温度、誘導剤、誘導温度、誘導時の生育期、収穫時の生育期、pH、密度、および選択の維持が含まれる。例えば、酵母などの微生物は、好ましくは、目的の選択された培地を使用して生育させられる。そのような培地には、酵母ペプトンブロス(YPD)および最少培地(アミノ酸、酵母窒素基剤および硫酸アンモニウムを含有し、選択に必要な成分(例えば、ウラシル)を含まない)が含まれる。望ましくは、添加される基質は、最初にエタノールに溶解される。必要な場合には、目的とするポリペプチドの発現を、例えば、GALプロモーターからの発現を誘導させるためのガラクトースを含むか、またはガラクトースを添加することによって誘導させることができる。
【0118】
宿主動物の細胞における発現を、同様に、一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。導入された構築物の所望する発現レベルを維持するために、一過的な発現を知られている方法(例えば、感染またはリポフェクション)により達成することができ、そして繰り返すことができる(Ebert、PCT国際特許出願公開WO94/05782を参照のこと)。安定的な発現を宿主ゲノムへの構築物の組み込みによって達成することができ、これによりトランスジェニック動物が得られる。構築物は、例えば、受精卵の前核への構築物のマイクロインジェクションによって、あるいはトランスフェクション、レトロウイルス感染または他の技術によって導入することができ、それにより、構築物が、成体動物を形成し得る細胞系統または成体動物に取り込まれ得る細胞系統に導入される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他、(1997)Nature、385:810)。組換えられた卵または胚は代理母に移される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他(上記))。
【0119】
出生後、トランスジェニック動物は、例えば、導入されたマーカー遺伝子(毛の色に対する遺伝子など)の存在によって、あるいは導入された構築物を検出するための、血液サンプル、乳汁サンプルまたは組織サンプルからのPCRまたはサザンブロッティングによって、あるいは発現したタンパク質またはそれから産生される生成物を検出するための免疫学的アッセイまたは酵素学的アッセイによって同定される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他(上記))。得られたトランスジェニック動物は、完全なトランスジェニック体あり得るか、またはトランス遺伝子をその細胞の一部のみに有するモザイク体であり得る。核のある細胞を除核された卵と融合し、その後、代理母に移すことによって達成される哺乳動物クローニングの出現により、導入された構築物を含む「始祖」の動物または細胞を得ることに対する迅速で大規模な産生の可能性がもたらされる。これ以前では、トランス遺伝子を繁殖用の動物の生殖系列に存在させることが必要であった(Wilmut他(上記))。
【0120】
宿主動物における発現は、宿主が飼いならされた動物である場合には特に、ある程度の効率を示す。宿主動物から容易に得ることができる体液(乳汁など)にPBD融合タンパク質を産生させる場合、トランス遺伝子は、雌性宿主の乳腺細胞において発現させることができる。トランス遺伝子は、トランス遺伝子が乳腺細胞に保持されるか、または乳汁中に分泌されるように発現のために適合させて、乳汁に局在化するPBD融合タンパク質を形成させることができる(PCT国際特許出願公開WO95/24488)。発現は、特定の調節配列(ウシのα−ラクトアルブミン、α−カゼイン、β−カゼイン、χ−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリンまたは乳清酸性タンパク質の調節配列など)を使用して乳腺組織における発現のために標的化することができ、そして必要に応じて、1つもしくは2つ以上のイントロンおよび/または分泌シグナル配列を含むことができる(米国特許第5530177号;Rosen、米国特許第5565362号;Clark他、米国特許第5366894号;Garner他、PCT国際特許出願公開WO95/23868)。精製が必要な場合、PBD融合タンパク質は、基質多糖を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製される。
【0121】
本発明を使用する際、多糖構造物は、試薬、温度およびその他の適切な条件のもとで所望の改変を達成するために十分な時間にわたって多糖構造物を十分な量のPBD融合タンパク質と接触させることによってPBD融合タンパク質を使用して改変される。改変の条件は、一般に、Km、Vmaxおよびkcatおよび他の生化学的パラメーター(PBDの至適pHなど)を規定するように最適化される。PBDと基質との相互作用は一般に極めて早い。従って、所望する効果を達成するために、PBD融合タンパク質の様々な濃度、ならびに/あるいは所望する効果を達成するための処理時間および/または処理温度を評価することが必要である。使用される条件は経験的に決定されるが、使用されるPBD融合タンパク質および所望する最終結果の要求に基づく。一例として、エンドグルカナーゼに由来するPBDを含むPBD融合タンパク質に対して典型的な条件には、mMリン酸塩(pH7.0)、一般には、綿などのセルロース繊維の25mgあたり約0.1mg/ml〜10mg/mlのPBD濃度が含まれる。温度は、一般的には約20℃〜37℃であり、好ましくは約25℃である。処理時間は、5分から12時間までの範囲であるが、多糖構造物が損傷を受けない限り、それよりも長い処置を使用することができる。一般には、適するように、混合物は、構造物の均一な処理を容易にするために穏やかに攪拌される。構造物の処理を行った後、構造物は乾燥され、その後、紙または織物などの最終製品を調製するために使用される。あるいは、またはさらに、紙または織物などの最終製品は、上記に列挙された事項に類似する事項を考慮に入れてPBDによって処理される。
【0122】
改変の進行または反応速度のアッセイは、改変処理の途中で形成され得る阻害的な最終生成物を検出するために、そして処理の途中に生成される中間的または最終的な望ましい性質を検出するために使用することができる。例えば、繊維を完全に架橋しないことが望ましい場合がある。むしろ、構造物の不完全な架橋によって存在する、望ましい性質を有する多糖構造物を得るために、例えば、製織のためにあまり剛直でない糸を得るために、反応を中間点で停止させることが望ましい場合がある。多数の客観的な試験が、PBD処理を評価するために当業者には知られており、これには、ヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性が含まれる。
【0123】
達成される多糖構造物の改変のタイプは、少なくも部分的には、結合ドメインに融合されるタンパク質の性質に依存する。PBDによる改変は、多糖の構造物における観測可能(検出可能)な変化として定義される。これには、増大した湿潤強度などの観測可能な改変をもたらす多糖構造物の凝集、疎水性、親水性、濡れ性、表面性状およびその他などの表面性質における変化が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の電気的性質には、表面電荷(陽電荷または陰電荷)および電気伝導度が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の化学的性質には、様々な化学的反応性化学基および光化学的反応性化学基を少なくとも多糖含有材料の表面に導入することが含まれる。変化させることができる多糖含有材料の機械的性質には、引張り強度、剪断耐性、耐摩耗性、摩擦係数および弾性が含まれる。一例として、多糖構造物がセルロースである場合、1分子あたり2つ以上のPBDを有する試薬または組成物を使用して、セルロース繊維を架橋することができる。図9a〜図9cには、本発明のCBD連結剤ユニットが多糖のポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる方法がいくつか概略的に示されている。図9aには、第1のポリマー構造ユニットに結合した第1のCBDと、第2のポリマー構造ユニットに結合した第2のCBDとを有するCBD連結剤ユニットが概略的に示されている。柔軟度が大きいリンカーユニットが使用される場合には少なくとも、CBD連結剤ユニットの第1および第2のCBDはともに同じポリマー構造ユニットに結合し得ることが予想されるはずである。図9bには、第1および第2の両方のCBDが1個のポリマー構造ユニットに結合している柔軟なリンカーユニットを有するCBD連結剤ユニットが示されている。図9cには、ポリマー材料の三次元網目構造を形成させるために、複数のポリマー構造ユニットが複数のCBD連結剤ユニットによってどのように架橋されるかが概略的に示されている。このようにして、フィラメント状の多糖(例えば、セルロースフィラメント)の凝集体を形成させることができる。CBD連結剤ユニットを介して架橋されたセルロース材料から組み立てられる材料(紙、綿糸および綿織物(織布および不織布の両方)など)は、ヤング率などの変化した機械的性質を有する。セルロース材料の架橋は、セルロース含有材料を製造する際の様々な段階で行うことができる。例えば、紙製品の場合、架橋は、製紙プロセスにおける様々な段階でセルロース繊維をCBD連結剤ユニット組成物で処理することによって行うことができ、あるいは得られた紙製品をCBD連結剤ユニットで処理することができる。同様に、綿糸または綿織物は、改善された表面性質および/または機械的性質を有する糸または綿織物を得るために、CBD連結剤ユニット組成物で架橋することができる。
【0124】
機能的成分を含むPBD融合タンパク質で多糖構造物または多糖含有材料を処理することによって、様々な新規な物理的性質、電気的性質、化学的性質および機械的性質を有する新規な材料を得ることができる。図8には、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを含むCBD機能化成分が概略的に示されている。機能的成分は多数の化学種のいずれかであり得る。これには、濡れ性を低下させて、水分および水に対する材料の増大した耐性をもたらす疎水性アミノ酸の配列またはペプチドあるいは脂肪酸誘導体などの疎水性成分;親水性成分;電気的荷電成分またはイオン性成分;ケイ素結合性成分;ポリマー結合性成分;金属、または金属基質に対する結合をもたらす金属結合性成分(金属結合性成分の例には、細菌シドロホア、メタロチオネインおよびメタロチオネイン様タンパク質(Slice他、(1990)J.Biol.Chem.265:256〜263)、フェリチン(Spanner他、(1995)Bone17:161〜165)、ならびに設計された金属結合性タンパク質(例えば、Pessi他、(1993)Nature、362:367〜369)が含まれる);化学的反応性基;光化学的反応性基;またはチオール基が含まれる。本発明の化学的反応性基には、例えば、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシドまたはカルボジイミドが含まれ得る。本発明の光化学的反応性基には、フェニルアジドが含まれ得る。
【0125】
同様に、疎水性成分(例えば、疎水性ポリペプチド、長鎖の炭化水素または炭化水素誘導体)を有する組成物を使用して、セルロース繊維またはセルロース繊維から作製された製造物に疎水性を付与することができる。疎水性は、改変されたセルロース繊維から組み立てられた材料の低下した濡れ性をもたらし、そして間接的には、水の存在下における材料の増大した耐久性をもたらす。一方で、セルロース繊維の架橋は、直接的には、材料の増大した湿潤強度をもたらす。簡略化するために、紙または他のセルロース含有材料の強度に対する本明細書中での参照は、そのような材料の湿潤強度を含むように限定的には使用されない。
【0126】
本発明のプロセスを使用して改変することができる多糖材料のタイプは様々である。例には、木材製品、セルロース繊維に由来する紙製品、および綿またはラミーに由来する製品(糸および織物など)が含まれる。用語「紙」には、繊維状のセルロース材料およびセルロース材料と合成材料との組合せから作製されるシート様の塊および成形された製造物が含まれる。紙の例には、ティッシュペーパー、事務用紙、新聞印刷用紙、波形加工用紙、ペーパータオル、ラミネート紙および板紙が含まれる。用語「多糖材料」または用語「多糖含有材料」は、セルロースまたはキチンなどの少なくとも1つの多糖(一般には、実質的な量の少なくとも1つの多糖)を含む材料をいう。
【0127】
CBD含有組成物はまた、製紙プロセスにおいて適用することができる。本発明により、CBD含有組成物は、製紙プロセスの種々の段階でセルロース材料を処理するために使用することができる。例えば、処理は、成形段階またはサイズ剤処理段階で行うことができる。製紙の成形段階における処理は、CBD架橋組成物(例えば、CBD連結剤ユニット組成物またはセルロース架橋(融合)タンパク質(CCP))をセルロース繊維の懸濁物に加えることによって行うことができる。好ましくは、セルロース材料のCBD含有組成物による処理は、成形段階時またはその前に行われる。機能的成分は、CBD連結剤ユニットを得るためにリンカーユニットをCBDに結合させることに関して本明細書中上記に記載される方法に従ってCBDに結合(attach)、結合(conjugate)または連結することができる(図4a〜4g、図5a〜5b)(例えば、米国特許第5,962,289号もまた参照のこと)。
【0128】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記の実施例を検討したときに当業者には明らかになる。下記の実施例は、限定であることを意図するものではない。さらに、本明細書中上記に記載され、そして下記の請求項において特許請求されている本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、下記の実施例において実験的に裏付けられている。
【0129】
実施例
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明を例示する。
【0130】
一般に、本明細書中で使用されている用語法、および本発明において利用される実験室手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学技術および組換えDNA技術を含む。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、下記を参照のこと:「Molecular Cloning:A laboratory Manual」、Sambrook他(1989);「Current Protocols in Molecular Biology」、第I巻〜第III巻、Ausubel,R.M.編(1994);Ausubel他、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore、Maryland(1989);Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、John Wiley&Sons、New York(1988);Watson他、「Recombinant DNA」、Scientific American Books、New York;Birren他(編)、「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」、第1巻〜第4巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1998);米国特許第4666828号、同第4683202号、同第4801531号、同第5192659号および同第5272057号に示される方法論;「Cell Biology:A Laboratory Handbook」、第I巻〜第III巻、Cellis,J.E.編(1994);Freshneyによる「Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique」、Wiley−Liss、N.Y.(1994)、第3版;「Current Protocols in Immunology」、第I巻〜第III巻、Coligan J.E.編(1994);Stites他(編)、「Basic and Clinical Immunology」(第8版)、Appleton&Lange、Norwalk、CT(1994);MishellおよびShiigi(編)、「Selected Methods in Cellular Immunology」、W.H.Freeman and Co.、New York(1980);利用可能な免疫アッセイは特許および科学的文献に詳細に記載されている、例えば、米国特許第3791932号、同第3839153号、同第3850752号、同第3850578号、同第3853987号、同第3867517号、同第3879262号、同第3901654号、同第3935074号、同第3984533号、同第3996345号、同第4034074号、同第4098876号、同第4879219号、同第5011771号および同第5281521号を参照のこと;「Oligonucleotide Synthesis」、Gait,M.J.編(1984);「Nucleic Acid Hybridization」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編(1985);「Transcription and Translation」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編(1984);「Animal Cell Culture」、Freshney,R.I.編(1986);「Immobilized Cells and Enzymes」、IRL Press(1986);「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal,B.(1984)および「Methods in Enzymology」、第1−317巻、Academic Press;「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、Academic Press、San Diego、CA(1990);Marshak他、「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」、CSHL Press(1996)。これらはすべて、全体が本明細書中に示されているかのように参考として組み込まれる。他の一般的な参考文献が本明細書中に示されている。それらにおける手順は、この分野では十分に知られていると考えられ、そして読者の便宜のために示されている。それらに含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【0131】
生物学的材料の寄託
大腸菌pET−CBDは、American Type Culture Collection(ATCC)(10801 University Boulevard、M、VA20110−2209)に1993年4月12に寄託され、アクセション番号75444が割り当てられている。
【0132】
実施例1
CBDおよびCBD融合タンパク質の構築および発現
様々なCBDおよびCBD融合タンパク質の構築および発現を開示する下記の米国特許の内容は参考として本明細書中に組み込まれる:米国特許第5496934号、米国特許第5670623号、米国特許第5719044号、米国特許第5738984号、米国特許第5837814号および米国特許第5856201号(すべて、Shoseyov他);米国特許第5137819号、米国特許第5202247号、米国特許第5340731号、米国特許第5928917号および米国特許第5962289(すべて、Kilburn他);米国特許第5821358号(Gilkes他)。
【0133】
1.1 C.cellulovoransのセルロース結合ドメイン(CBDclos)の構築および発現:
C.cellulovoransのセルロース結合タンパク質Aのセルロース結合ドメインの構築およびpET−CBDプラスミド(図1a〜1cを参照のこと)を有する大腸菌BL21(DE3)におけるその過剰発現はM.A.Goldstein他(1993)(J.Bacteriol.175:5762〜5768)により記載されている。米国特許第5496934号および米国特許第5719044号もまた参照のこと(これらはともに、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0134】
1.2 CCP−180の構築および発現:
pET−CCP−180(図2a〜2e)を、pET−CBD(図1a〜1c、M.A.Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768)およびpET−CBD−180(図1d〜1g、E.Shpigel他、(1999)Biotech.Bioeng.65:17〜23から構築した[pET−CBDおよびpET−CBD−180をNcoIおよびBamHIで消化し、得られたDNAフラグメントをそれぞれ1.2%アガロースゲルおよび0.6%アガロースで分離した。pET−CBDの500bpフラグメントおよびpET−CBD−180の5Kbフラグメントを、QiaexDNAゲル抽出キット(Qiagen,Inc.、California)を使用してゲルから抽出して、この2つのフラグメントを連結した。連結混合物を大腸菌XL1−blueコンピテント細胞に形質転換し、その後、発現宿主の大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。読み枠が一致して融合された2つのCBDを含有する陽性クローンをpET−CCP−180と名付け、配列決定によって確認した。CCP−180の発現を、CBDclosについて、M.A.Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768によって記載されているように行った。
【0135】
1.3 プロテインA−CBDのクローニングおよび発現:
CBDを、テンプレートとしてのcbpA遺伝子(Shoseyov他、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:3483〜3487);EcoRI部位を含むプライマーA(N端プライマー):5’−GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT−3’(配列番号11);およびBamHI部位が続く停止コドンを含むプライマーB(C端プライマー):5’−GGGGGATCCTATGGTGCT−3’(配列番号12)を使用してPCR増幅した。これらのプライマーは、プロテインA遺伝子のC末端に読み枠を合わせて融合される500bpのDNAフラグメントのプラスミドpRIT2へのEcoRI/BamHIの強制的クローニングを可能にするように設計された。PCR条件は、Innis他、PCR Protocols:A Guide to Methods&Applications(Innis他編、Academic Press、San Diego、1990)に記載されている通りであったが、下記の改変を行った:2ngのテンプレートDNAおよび1mMのMgCl2を反応混合物において使用した。反応をプログラム可能なサーマルコントローラー(M&J Research,Inc.)を使用して行った。標準的なDNA操作を、Sambrook他編、(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)に従って行った。
【0136】
PCR増幅された生成物をEcoRIおよびBamHIで消化し、予想される500bpのDNAフラグメントを、Qiaexゲル抽出キット(Qiagen,Inc.)を使用して1.5%アガロースゲルから単離した。EcoRI/BamHIフラグメントを、EcoRI/BamHIで事前に消化されたpRIT2に、T4リガーゼを使用して連結した。連結混合物を使用して、大腸菌菌株2097コンピテント細胞を形質転換し、そして形質転換されたコロニーを、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天平板で選択した。目的のDNAインサートを含有する成功した構築物をpRIT2−CBDと名付けた。
【0137】
ProtA−CBDを、T7により媒介される過剰発現ベクターpET3d(F.Studier他、(1986)J.Mol.Biol.189:113〜130)にクローン化した。ProtA−CBDを、下記のプライマーを使用し、テンプレートとしてpRIT2−CBDを使用してPCR増幅した:上記に記載されるC末端プライマー(すなわち、5’−GGGGGATCCTATGGTGCT−3’、配列番号12);およびNcoI部位内に開始部位を含むN末端プライマー:5’−GGGGGGTACCATGGAACAACGC−3’(配列番号13)。PCR産物をNcoIで部分消化した。回収されたDNAをBamHIで消化し、1.3KbのDNAフラグメントをpET3dにクローン化した。連結混合物を使用して、大腸菌XL1−Blueコンピテント細胞を形質転換し、形質転換されたコロニーを、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天平板で選択した。DNAインサートを含有する成功した構築物をpET−ProtA−CBDと名付けた(図3a〜3g)。pET−ProtA−CBDを大腸菌BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換した。融合タンパク質の発現を、Nilsson他、(1985)EMBO J.4:1075〜1080によって記載されるように行った。50mg/Lのアンピシリンが補充され、そしてpRIT2−CBDを含有する大腸菌2097の一晩培養物の400μlが接種された40mL容量のLBにおいて、すべての細胞を振とうフラスコにおいて250rpmで生育させた。培養物を、0.4のO.D.600nmが得られるまで30℃の温度で生育させた。その後、温度を42℃に上げて45分間保ち、その後、37℃に下げてさらに2時間保った。
【0138】
ProtA−CBDの過剰発現が、pET−ProtA−CBDを有する大腸菌BL21(DE3)で得られた。接種物を、50μg/mlのアンピシリンを含有するM9最少培地(0.65 Na2HPO4、0.3%KH2PO4、0.255 NaCl、0.5%NH4Cl、20%グルコース、2mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2、および1mMのチアミン−HCl)で細胞を一晩生育させることによって調製した。接種物を、100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(1.2%バクト−トリプトン、2.4%バクト−酵母抽出物、0.4%(v/v)グリセロール、0.17MのKH2PO4、および0.72MのK2HPO4)で1:50に希釈した後、1.5のO.D.600nmになるまで細胞を37℃で生育させ、その後、0.5mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えた。細胞を37℃でさらに4時間生育させた。細胞を、2,000gで10分間の遠心分離によって集めた。
【0139】
1.4 ProtA−CBDの精製:
細胞を、50mMのTris/HCl、10mMのEDTA(pH8)に0.1g/mlの濃度で懸濁して、実験室用のRANNIE高圧ホモジナイザー(MINI/LABタイプ8.30H)で破壊した。懸濁物を遠心分離し、タンパク質濃度が5mg/mlである1リットルの上清をセルロース(アビセル200、Sigma)カラム(2.6x32cm)に加えた。カラムはPBS(15mMリン酸塩緩衝液、150mMのNaCl、3mMのKCl、pH7.4)で平衡化された。280nmの吸光度が0.05未満になるまで、カラムを5ml/分の流速で洗浄した。ProtA−CBDを50mMのTris/NaOH溶液(pH12.5)で溶出した。溶出されたProtA−CBDをHClで直ちにpH8にして、凍結乾燥した。総大腸菌タンパク質(セルロースカラムに適用する前)、およびセルロースカラムから溶出したピーク(ProtA−CBD)を、Laemmli(U.K.Laemmli、(1970)Nature、227:680〜685)に従って12.5%SDS−PAGEで分析した。ProtA−CBDのピークは、約45kDで単一バンドを示した。
【0140】
実施例2
処理(CBD改変)材料および未処理材料の機械的性質の測定
機械的性質を万能試験機(図11、Instron、High Wycombe、英国)Interfaceタイプ:1011シリーズを使用して測定した。サンプル速度:10pts/秒。クロスヘッド速度:5mm/分。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
【0141】
2.1 ヤング率:
縦弾性係数(すなわち、ヤング率)は材料の重要な性質である。ヤング率は、大ざっぱには、材料を不可逆的に伸長させない比較的小さい力を使用する弾性的な方法で材料を伸ばすために必要な力として定義することができる。
【0142】
2.2 紙の処理:
ティッシュペーパーの長方形片(大きさ:45mmx10mmx0.1mm)を、20mMのTris塩基(pH7)における、CBDclos、CCP、ProtA−CBD、Ab−ProtA−CBDの各溶液(濃度がそれぞれ2.5mg/mlおよび2.0mg/ml)に10分間浸すことによって処理した。コントロール処理は、20mMのTris塩基(pH7)の溶液に同様に10分間浸すことからなった。浸漬後、処理片およびコントロール片を液体から取り出して、真空下で2日間乾燥した。
【0143】
2.3 紙処理の結果:
2.3.1 ヤング率:
コントロール紙、CBDclos処理サンプル紙およびCCP−180処理サンプルに対するヤング率の値を図10aに示す。CBDで処理された紙は、コントロール(未処理)紙のヤング率よりも著しく大きいヤング率を有した。CCPで処理された紙は、CBD処理紙のヤング率よりもさらに大きいヤング率を有した。これらの結果は、CBDまたはCCPによる紙の処理は紙の少なくとも1つの機械的性質を変えることを示している。より詳細には、CBDまたはCCPのいずれかによる紙の処理は、未処理の紙と比較した場合、処理された紙の(ヤング率の値によって測定される)引張り強度を増大させた。
【0144】
2.3.2 最大負荷時のひずみ:
紙サンプルのCBDclos処理およびCCP−180処理に対する最大負荷時のひずみを示す結果を図10bに示す。CBD処理またはCCP処理はいずれも、コントロールの値と比較した場合、最大負荷時のひずみにおける実質的な変化を生じさせなかった。これらの結果は、CBDまたはCCPによる紙の処理はその弾性を著しく変化させなかったことを示している。
【0145】
2.3.3 破壊到達エネルギー:
CBDまたはCCP−180で処理された紙サンプルに対する破壊到達エネルギーを示す結果を図10cに示す。CBDで処理された紙の破壊到達エネルギーは、コントロールの破壊到達エネルギーと実質的に同じであった。しかし、架橋タンパク質のCCP−180で処理された紙は、コントロールと比較した場合、破壊到達エネルギーが著しく増大したことを示した。
【0146】
2.3.4 靱性:
CBDおよびCCPで処理された紙サンプルに対する靱性を示す結果を図10dに示す。CBDで処理された紙の靱性はコントロールの靱性と実質的に同じであった。しかし、CCPで処理された紙は、再度ではあるが、コントロールと比較した場合、靱性が著しく増大したことを示した。
【0147】
2.4 糸の処理:
この研究で使用された綿糸は、低いT.P.U(1インチあたりのターン数)を有する100%グレーコットン二重糸繊維(34/2)であった。糸の直径は0.5mmであり、長さあたりの重量は0.8mg/cmであった。それぞれの処理において、糸サンプルを、この分野で知られているタイプの特別仕様の糸処理装置(YTA)を用いてタンパク質溶液に浸漬した。この糸処理装置は図11に概略的に示されている。装置は、フィーダーホイール、回収ホイール、第1浴A、第2浴B、および回収ホイールとかみ合う動力部を含む。フィーダーホイールおよび回収ホイールは相互に交換可能であり、それにより、糸を浴Aおよび浴Bに再び通すことができる。動力部は様々な選択された速度で運転することができ、それにより、糸サンプルの浸漬時間を決定することができる。糸の長さはフィーダーホイールと回収ホイールとの間で関係し得るし、そして糸は、浴Aおよび浴Bに含有される液体に糸を通すことによってフィーダーホイールから回収ホイールに移動させることができる。このようにして、糸を1つの液体(両方の浴に存在する)または2つの異なる液体に特定の時間にわたって浸けることができる。
【0148】
ある長さの綿糸(3m〜4m)がYTAのフィーダーホイールに巻き付けられ、糸の一端が回収ホイールに接続され、そして糸が動力部によって浴Aおよび浴Bを通って進められた。糸の浸漬継続時間は約45秒であった。
【0149】
上記に記載される綿糸の処理は下記の通りであった:
(i)CCP−180による処理:糸繊維をCCP−180の溶液(20mMのTris塩基(pH8)での1mg/ml)に浸けた(浴A)。
(ii)プロテインA−CBD(CBD−PA)による処理:糸繊維をCBD−PA溶液(20mMのTris塩基(pH8)での0.75mg/ml)に浸け(浴A)、その後、1XTBSで洗浄した(浴B)(45秒の浸漬時間)。
(iii)プロテインA−CBDおよび抗体による二重処理;糸繊維をCBD−PA溶液(20mMのTris塩基(pH8)での0.75mg/ml)に浸け(浴A)、そして1XTBSで洗浄した(浴B)(45秒の浸漬時間)。その後、回収ホイールをフィーダーホイールと交換し、糸を抗血清溶液(0.75mg/mlのIgG)に浸け(浴A)、そして1XTBSで洗浄した(浴B)。
(iv)コントロール:糸繊維を20mMのTris塩基(pH8)に45秒間浸けた(浴A)。
【0150】
処理後、3つの処理されたサンプルすべておよびコントロールを室温で数時間乾燥した。
【0151】
2.5 糸処理の結果:
2.5.1 ヤング率:
コントロール糸、CCP−180処理サンプル糸、プロテインA−CBD処理サンプル糸およびAb−プロテインA−CBD処理サンプル糸に対するヤング率の値を図12aに示す。CCP−180およびAb−プロテインA−CBDで処理された糸は、コントロール(未処理)糸の値よりも著しく大きいヤング率の値を有した。これらのデータは、Ab−プロテインA−CBDおよびCCPによる糸の処理により、コントロールと比較した場合、処理された糸の(ヤング率の値によって測定される)引張り強度が増大したことを示している。興味深いことに、CBD−PAで処理された糸は、コントロール糸の値よりもはるかに小さいヤング率の値を有した。理論によって限定されることを意図しないが、CBD−PAで処理された糸について低下したヤング率に対する考えられる説明は、CBD−PAによりセルロース繊維がゆるむことである(例えば、米国特許第5,821,358号(その内容は参考として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。
【0152】
2.5.2 最大負荷時のひずみ:
CCP−180、CBD−PAおよびCBD−PA−Abで処理された糸サンプルに対する最大負荷時のひずみを示す結果を図12bに示す。CCP−180またはCBD−PA−Abのいずれかで処理された糸は、コントロールと比較した場合、最大負荷時のひずみのより小さい値を有した。従って、このことは、コントロールと比較した場合、これらの処理により、糸があまり弾性的にならなかったことを示している。CBD−PAで処理された糸は、コントロールの最大負荷時のひずみと類似する最大負荷時のひずみを有した。
【0153】
実施例3
材料の機能化
3.1 重金属種を液体から除くためのフィルター媒体の機能化:
CBD機能的成分(例えば、図9a〜9cを参照のこと)を、重金属に対する親和性を有する機能的成分(金属結合性タンパク質など)にCBDを結合させることによって調製する。セルロース材料(綿繊維など)を含む基質を、CBD機能的成分のCBD成分が基質に結合するような条件(pH、温度、イオン強度など)のもとでCBD機能的成分で処理し、それにより、基質が、金属結合性の基質またはフィルター媒体をもたらす金属結合性の機能的成分によって機能化される。過度なレベルの重金属を含有する液体の流れが金属結合性のフィルター媒体に通され、それにより、液体流における重金属の濃度が非毒性レベルにまで大きく低下させられる。
【0154】
3.2 濡れ性を低下させた包装紙製品を製造するためのセルロース繊維の機能化:
CBD機能的成分を、疎水性の機能的成分にCBDを結合させることによって調製する。製紙に好適なセルロース繊維を、CBD機能的成分のCBD成分がセルロース繊維に結合して、疎水性成分がそれに結合しているセルロース繊維が得られるような条件(pH、温度、イオン強度)のもとでCBD疎水性機能的成分で処理する。処理されたセルロース繊維から製造された紙は疎水性であり、耐水性である。
【0155】
代わりの例では、未処理(非機能化)のセルロース繊維から製造された紙が、紙を乾燥する前またはその後で、CBDに結合した疎水性成分で機能化される。CBD疎水性機能的成分で処理された紙は疎水性であり、耐水性である。
【0156】
3.3 濡れ性を増大させたティッシュペーパーを製造するためのセルロース繊維の機能化:
CBD機能的成分を、親水性の機能的成分にCBDを結合させることによって調製する。ティッシュペーパーを、製紙プロセスの第1または第2の乾燥段階の前またはその後のいずれかで、CBD親水性機能的成分で処理(機能化)する。CBD親水性機能的成分で処理されたティッシュペーパーは親水性であり、水および水性液体の増大した吸収を示す。
【0157】
実施例4
Sタンパク質−CBD−Sペプチド(SSC)の発現
図13は、SCSを大腸菌において発現させた結果を示す。IPTGで誘導される前の大腸菌のタンパク質がレーン2に示され、IPTGで誘導された後の大腸菌の総タンパク質がレーン3に示され、これに対して、SCSタンパク質を含有する封入体がレーン4に示されている。
【0158】
実施例5
予め成形された紙のCBD、CCPまたはSCSによる処理:
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。CBDまたはCCPによるワットマン紙の処理は、試験したすべての濃度において、ヤング率が増大したことに留意すること。
【0159】
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示している。2.5mg/mlの濃度でCCPを使用することにより、破壊到達エネルギーが約30%増大したことに留意すること。さらに、SCSによる処理は、試験したすべての濃度において、破壊到達エネルギーが増大した。
【0160】
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示している。2.5mg/mlの濃度でCCPを使用することにより、靱性が約40%増大したことに留意すること。さらに、SCSによる処理は、試験したすべての濃度において、靱性が増大した。
【0161】
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示している。試験したすべての処理により、最大負荷時の応力が増大したことに留意すること。最も著しい効果が、2.5mg/mlの濃度のCCPで得られた。最大負荷時の応力が増大することにより、紙の強度が増大していることが明らかにされる。
【0162】
もう一組の実験において、予め成形されたワットマン紙に対するCBDおよびCCPの影響を明らかにした。
【0163】
ワットマン紙No.1の長方形片(40x10mm、0.18mm厚)(Whatman、Maidstone、英国)を2.5mg/mlのCBDまたはCCPを含有する溶液(20mM Tris塩基、pH7)に10分間浸けた。その後、サンプルを65%の相対湿度において23℃で24時間乾燥した。紙の最終水分含有量は3.2%であった。機械的性質を、紙および板紙の引張り特性に関する国際的な標準試験法(ISO1924−4)に従って評価した。処理された紙の引張り試験を、Instron万能試験装置(UTM)モデル1011(High Wycombe、英国)を引張りモードで使用して行った。長方形の紙を、引張り実験中にわたって正しくつかむことを可能にする上部引張りグリップおよび下部引張りグリップ(ねじ作動型グリップ、Instron Corp.、Canton、MA)に入れた。すべての測定値は、23℃、65%相対湿度、および20mm/分の一定した変形速度で得られた。測定された引張り特性には、破壊時応力、破壊時ひずみ、破壊点までの伸び、およびエネルギー吸収が含まれた。すべての計算を、Hayden,W.、Moffatt,W.G.&Wulff,J.、Mechanical Behavior、1〜22(Johan Wiley&Sons,Inc.、N.Y.、1956年);Dufresne,A.、Cavaille,J.Y.&Vignon,M.R.、テンサイのセルロース微小細繊維から調製されたシートの物理的挙動、J.Appl.Polym.Sci.64、1185〜1194(1996)に従って行った。
【0164】
応力(σ)は式1に従って計算された:
σ=F/S (1)
式中、Fは、加えられた負荷であり、Sは断面積である。Sは、サンプルの総容量が一定であり続けると仮定することによって求められる。従って、
S=S0xl0/l (2)
式中、S0は、時間0での断面積である。ひずみ(ε)は、下記の式によって計算することができる:
ε=ln(l/l0) (3)
式中、lおよびl0は、それぞれ、試験中の長さおよび時間0での長さである。データは、応力対ひずみ曲線をプロットすることができ、ヤング率(E)の計算を可能にする:
E=Δσ/Δε (4)
【0165】
下記に報告されている値は、少なくとも15回の測定の平均である。
【0166】
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示している。加えられた負荷のもとでの処理された紙の変形挙動を応力−ひずみ曲線から推定することができる。ひずみが0.02までは、応力とひずみとの直線的な関係が認められた。しかし、ひずみが0.02よりも大きい場合、直線的な関係は見出されなかった。引張り応力がコントロールからCBDまで、そしてCCPまで、それぞれ、増大していることが図18から明かである。CCPで処理された紙の引張り強度の値は、未処理の紙よりも約40%大きく、そしてCBDで処理された紙よりも14%大きかった。CBDで処理された紙の強度は、未処理の紙の強度よりも約25%大きかった。両方の処理において、違いは統計学的に有意であった(表6)。
表 6
* ヤング率は3%の変形において計算した。異なる上付き文字を伴う列の値はp=0.01で有意に異なる。
【0167】
紙破壊ひずみの変化もまた重要である。CCPで処理された紙において、破壊までのひずみは、未処理の紙に対して約50%増大した。CBDの作用は、あまり大きくなく、12%の増大にすぎなかった。CBDまたはCCPで紙を処理することにより、脆さが低下した紙が得られた。処理された紙のヤング率は、(変形が3%までは直線的である)応力−ひずみ曲線の初期の傾きから得られ、表6にまとめられている。CCPで紙を処理することにより、それらのヤング率は17%増大したが、CBD処理は7.5%の増大をもたらしただけであった。エネルギー吸収は、応力−ひずみ曲線下の面積を計算することによって求められ、その結果が表6にまとめられている。引張り強度に対するデータにおいて認められた傾向はエネルギー吸収について当てはまった。しかし、その大きさはより大きかった。CCPで処理された紙のエネルギー吸収は、コントロールのエネルギー吸収よりも約100%大きかったが、CBDで処理された紙のエネルギー吸収は23%大きいだけであった。CCPで処理された紙の値は、CBDで処理されたその対応物の値よりも約64%大きかった。すべての試験されたパラメーターにおいて、CCPの作用は統計学的に有意であったが、これに対して、CBDによる処理は、破壊時応力およびエネルギー吸収についてだけ統計学的な有意をもたらした(表6)。
【0168】
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。蒸留水(10μl)を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した。水の吸収はまた、光学的接触角度計CAM2000(KSV Instruments、Helsinki、フィンランド)を使用して可視化された。1滴の水を紙サンプルに滴下し、写真を20msの経時露出で撮影した。最初のフレームは、水が紙に接触した25ms後に撮影された。未処理の紙では、吸収時間は1秒未満であった。CBD処理紙およびCCP処理紙の水吸収時間は、タンパク質の量が増大するととも増大した。CCPが2.5mg/mlの濃度で適用された場合、水吸収時間は、同じ濃度のCBDで処理された紙の場合よりも2桁大きく(CBDの場合の5秒に対してCCPの場合の580秒)、そして未処理紙よりも少なくとも4桁大きかった(コントロールの場合の1秒未満に対してCCPの場合の580秒)。
【0169】
光学的接触角度計(CAM)を使用して、CCP処理紙に滴下された水の動力学を視覚化した。図20(写真F)は、25ms後の未処理紙について水滴の接触を例示する。水が、接触後、直ちに紙に吸収されていることが明かである。図20(写真A〜E)は、経過時間に対するCCP処理紙による滴下された水の吸収をさらに例示する。最初の2つのフレームにおいて、吸収は検出されず、接触角は>90oで維持された。4分後に、紙への吸収が認められただけであった。8分後でさえ、水は紙によって完全に吸収されなかった。紙への完全な吸収は10分後に観測されただけであった(図19)。
【0170】
実施例6
製紙プロセスの成形工程に先立つ微細セルロース繊維の架橋
CBD連結剤ユニット組成物またはCBD連結剤ユニット試薬を、少なくとも2つのCBDをリンカーユニットと連結することによって調製する。成形用織物(フィルター)を通過し得る相当量の微細なセルロース繊維を含むセルロース繊維の懸濁物を、成形用織物に懸濁物を通過させる前にCBD連結剤ユニット組成物で処理する。CBD連結剤ユニット組成物のCBD連結剤ユニットは微細なセルロース繊維と架橋して、セルロース繊維の三次元凝集体を多数形成する。処理された懸濁物を成形用織物に通した後、セルロース繊維の三次元凝集体はろ紙によって保持され、それにより、原料(セルロース繊維)の回収を大きく高めることができる。
【0171】
上記の結果は、二重または二量体のPBDを含むPBD融合タンパク質(例えば、2つのCBDの融合産物、例えば、セルロース架橋タンパク質(CCP))、CBDとプロテインAとの融合産物、およびSペプチド−CBD−Sタンパク質融合体が、多糖構造物を改変するために調製および使用され得ることを明らかにしている。
【0172】
異なる様々な実施形態に関連して明確化のために記載されている本発明のいくつかの特徴はまた1つの実施形態において組合せられてもたらされ得ることが理解される。逆に、1つの実施形態に関連して簡潔化のために記載されている本発明の様々な特徴はまた別々にもたらされ得るか、または任意の好適な部分的な組合せで提供され得る。
【0173】
本発明はその特定の実施形態とともに記載されているが、多くの代替、改変および変化が当業者には明かであることは明白である。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替、改変および変化を包含するものとする。本明細書中において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれることを具体的かつ個々に示されているのと同じ程度にその全体が参考として本明細書中に組み込まれる。さらに、本明細書中における何らかの参考の引用および同定は、そのような参照が本発明に対する先行技術として利用できることの許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1aは、pET−CBDプラスミドの概略図である。
図1b〜1cは、CBDclosのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
図1dは、pET−CBD−180の概略図である。
図1e〜1gは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCBD−180のヌクレオチド配列(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図2】
図2aは、1コピーのCBD−180と、それに読み枠を合わせて融合させた1つのCBDとを含むpET−CCP−180の概略図である。
図2b〜2eは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCCP(セルロース架橋タンパク)のヌクレオチド配列(配列番号5)およびアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図3】
図3aは、pET−ProtA−CBDの概略図である。
図3b〜3gは、ProtA−CBDのヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
【図4】
図4aは、pET29−Spep−CBD−Sprotの概略図である。
図4b〜4gは、Spep−CBD−Sprotのヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図5】
図5aは、1分子あたり2つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図5bは、1つのセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、第2のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している図5aのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
【図6】
図6は、一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示す。
【図7】
図7a〜7cはそれぞれ、CBD連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図7aは、それぞれがCBDに結合している1対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7bは、それぞれが隣接するCBDにJUN/FOS架橋を介して結合している複数のCBDを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7cは、大きなタンパク質成分により連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。
【図8】
図8は、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを有するCBD機能的成分(CBDC)を概略的に示す。
【図9】
図9a〜9cは、CBD連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
【図10】
図10a〜10dは、コントロール紙片、CBD処理紙片およびCCP処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
【図11】
図11は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
【図12】
図12a〜12bは、コントロール糸、CCP処理糸、ProtA−CBD処理糸およびAb−ProtA−CBD処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
【図13】
図13は、大腸菌においてSタンパク質−CBD−Sペプチド(SCS)を発現させた結果の写真を示す。
【図14】
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。
【図15】
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。
【図16】
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。
【図17】
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。
【図18】
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。
【図19】
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。
【図20】
図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。
発明の分野および背景
本発明は、生物学的実体または化学的実体に融合または連結した多糖結合ドメインの多量体構造物に基づく生物学的架橋剤を使用して、多糖材料の構造的性質、化学的性質、物理的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物、ならびにそれによって得られる生物学的組成物に関する。本発明は、ティッシュペーペー、ろ紙および綿糸の機械的性質(湿潤強度など)を高めるために、2つのセルロース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン−プロテインA−Ab複合体またはSペプチド−セルロース結合ドメイン−Sタンパク質融合体を含有するセルロース結合ドメイン(CBD)融合タンパク質を使用することによって例示される。
【0002】
多糖は、自然界の至るところに見出される安定な構造的成分である。多くの生物は、3次元形状および表面構造を提供するためにその細胞の内外における構造的材料として多糖を使用している。天然供給源から得られる多糖の構造的一体性は、多くの場合、多糖が単離された後でも保持されており、多糖を様々な商業目的に使用することを可能にしている。その望ましい物理的特性のために、多糖はまた、商業目的のために合成的方法によっても製造されている。いずれの場合においても、合成的供給源または非合成的供給源のいずれかに由来するセルロースなどの多糖は、紙パルプおよび織物繊維などの様々な商業的に重要な製品に必要な原料を含んでいる。
【0003】
製紙プロセスは、従来的には4つの主要な工程を含んでいる:一般にはパルプとして知られているセルロース繊維の水性懸濁物を得る工程;様々な加工物質および紙強化物質(強化剤および/またはサイズ剤など)をパルプスラリーに加える工程;大部分の水がろ過して除かれる成形用織物に得られた懸濁物を注ぐことによって紙をシート状にし、繊維を乾燥して、所望するセルロースウェブを形成させる工程;および様々な所望する特性を得られた紙に与えるために紙の初期乾燥の後でウェブを後処理する工程(紙の乾燥強度を増大させるサイズ剤の表面塗布を含む)。水性スラリーのパルプに適用されるそのような添加剤はウェットエンド添加剤として知られており、これには、微細物および填剤を保持するための歩留まり向上剤(例えば、ミョウバン、ポリエチレンイミン、カチオン性デンプンなど);ポリエチレンイミンなどのドレネージ助剤;消泡剤;ならびにピッチ、またはマイクロファイバーおよび吸着填剤などの添加剤が含まれる。他のウェットエンド添加剤には、紙の乾燥強度だけでなく、湿潤強度を改善するために添加される、カチオン性ポリアリールアミドおよびポリ(アミドアミン/エピクロロヒドリン)などのポリマーが含まれる。デンプン、グアルゴムおよびポリアクリルアミドもまた、乾燥強度を改善させるために添加される。サイズ剤が、時々、疎水性を親水性のセルロース繊維に付与するために添加される。このようなサイズ剤は、液体容器(例えば、ミルクまたはジュース)用の紙を製造する際に使用され、紙コップおよび紙表面が水性インクで印刷される。この場合、インクが広がらないことが望ましい。そのようなサイズ剤には、松の木から得られるロジンサイズ剤、ワックスエマルション、そしてより近年においては、セルロース反応性サイズ剤が含まれる。シートの初期乾燥の後、スプレー、毛細管吸着、浸漬およびロールコーティングなどによって添加剤を紙に適用することは、多くの場合、ドライエンド添加と呼ばれている。ポリ(ビニルアルコール)、アクリルまたは酢酸ビニルのエマルション、デンプン、サイズ剤、ポリウレタンおよびSBRラテックスがドライエンドにおいて一般に添加される。
【0004】
製紙産業の主要な製品は、中しん原紙、中しん原紙において使用される中央波形加工用紙である。デンプンは波形加工用紙の総重量の2%〜5%を構成する。様々な技術が、中しん原紙の湿潤強度を改善するために使用されている。これには、ホルムアルデヒド樹脂などの化学的な架橋剤の使用、またはワックスなどの疎水性物質の塗布が含まれる。しかし、そのような化合物の紙への添加またはそのような化合物による紙の処理は、多くの場合、処理された紙の再利用性に対するこれらの化合物の好ましくない影響のために中断されている。使用される他の技術では、1平方メートルあたりの紙の重量および強度を増大させるために、半化学的パルプなどのより高価な原料が用いられている。この後者の方法は、出発材料および製造プロセス自体の両方のコストを増大させる。
【0005】
例えば、製紙のように、綿繊維のようなセルロース材料を織物に加工することにもまた数工程が含まれる:繊維を糸に紡ぐこと;糸からの織布またはメリヤス生地の組み立て、その後の調製、染色および仕上げの各操作。織物製品は織物組み立ての一般的な形態である。糸は、一般にサイズボックスにおいてサイズ処理され、その後、水が蒸気缶で除かれ、そして糸は、シートを個々の糸に折れ込ませるためにバストロッドに広がるシートにされる。その後、糸は織られる。これは、一連のたて糸の間によこ糸を織ることによって行われる。調製に含まれる部分工程は、サイズ剤除去、スカーリングおよび漂白である。1工程の複合型スカーリング/漂白プロセスもまた業界で使用されている。
【0006】
様々な化合物が、製織時における糸の切断を防止するために、たて糸に対するサイズ剤として使用されている。良好な糸サイズ剤は、サイズ処理されている糸に保護を提供する十分な強度を有する薄膜を形成するが、糸がサイズ剤の薄膜の下で切れるほど強くないサイズ剤である。サイズ剤は、強度を提供し、かつ糸を摩耗から保護するために、製織に先立ってたて糸に施される。綿を含有する糸に対する従来からのサイズ剤には、一般に、デンプン、デンプン誘導体、ポリビルアルコール、ポリエステル樹脂、ワックス、アクリルポリマーおよびアクリルコポリマーおよびそれらの塩などの薄膜形成剤、湿潤化剤、静電気防止剤、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。従来の熱硬化性樹脂システム(後硬化型または前硬化型のいずれか)は、耐摩耗性、破壊強度および引裂き強度が多くの場合に深刻なほどに損なわれるような程度にまで、セルロース繊維の微細構造ユニットを脆化させ、そしてその可動性を低下させる。多くの場合、耐摩耗性が75%〜85%低下し、破壊強度が50%〜60%低下し、引裂き強度が約50%低下する。さらに、セルロース繊維を含有する糸が上記の従来的な方法によってサイズ処理された場合、サイズ処理された糸から完全にサイズ剤を除くことは困難である。サイズ処理された糸から完全に脱サイズ剤が除かれるとしても、サイズ剤除去プロセスは複雑であるか、または費用がかかる。
【0007】
最近、サイズ剤の除去を、汚染を伴うことなく簡便なプロセスで行うことがますます重要な要件になっている。従って、潜在的に毒性の化学的架橋剤の使用を軽減または回避し、かつ使用が費用的および時間的に効果的である添加剤を多糖含有材料(紙および織物材料など)に対して開発することは注目される。
【0008】
関連文献:
細菌セルラーゼの結合ドメインによるセルロース繊維の破壊が、Din他(1991)Bio/Technology、9:1096〜1099によって記載されている。Kim他(1993、Protein Science、2:348〜356)は、Sペプチドキャリア、プロテアーゼ認識配列を有するオリゴペプチドスペーサー、およびガラクトシダーゼ標的を有する組換え融合タンパク質を記載している。C.cellulovoransのCBDのN末端またはC末端のいずれかに融合したヘパリナーゼI(例えば、フラボバクテリウム・ヘパリヌム(Flavobacterium heparinum))の融合タンパク質の発現がShpigel他(1999)Biotech.Bioeng.65:17〜23によって記載された。
【0009】
米国特許第5137819号(Kilburn他)は、セルラーゼ基質結合領域を含む融合タンパク質、ならびにポリペプチドの固定化および精製におけるそれらの使用を開示している。米国特許第5928917号(Kilburn他)は、タンパク質でない化学的成分と、セルロース結合領域を有するポリペプチドとの結合体を開示している。多糖に結合するタンパク質および結合体が米国特許第5962289号(Kilburn他)に記載されている。米国特許第5821358号(Gilkes他)は、ポリサッカリダーゼに由来する結合ドメインおよび/または触媒ドメインを使用して多糖構造物(例えば、綿繊維およびラミー繊維)を改変するための方法および組成物を開示している。
【0010】
米国特許第5837814号(Shoseyov他)は、結晶性セルロースおよびキチンに対して大きな親和性を有するCBDを、CBDと別のタンパク質との融合産物とともに開示している。CBDおよび融合産物に対する応用には、薬物送達、アフィニティー分離および診断的技術が含まれるが、これらもまた開示されている。米国特許第5719044号;米国特許第5496934号;および米国特許第5856201号もまた参照のこと(これらはすべてShoseyov他に対するものである;これらのそれぞれの内容は参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0011】
紙添加剤の利用性の総説が、B.B.Spence、Encyclopedia of Polymer Science and Technology、第2版、Wiley−Interscience、第10巻、761頁〜786頁、New York(1987年)により示される。
【0012】
発明の要約
本発明は、少なくとも1つの多糖結合ドメインを含む組成物を使用してポリマー材料または多糖材料を架橋および/または機能化するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、多糖結合ドメイン(PBD)融合タンパク質、PBD連結剤ユニット、PBD機能的成分、およびこのような組成物を使用して改変された多糖を含む。本発明のPBD連結剤ユニットは、それぞれが独立的に多糖に結合することができる1つまたは2つ以上のPBD、および必要に応じて、PBD間に連結された1つまたは複数のリンカーユニットを含む。本発明の方法は、多糖構造物を含む多糖材料の1つまたは複数の特性を改変するために十分な条件および時間で、多糖構造物を十分な量のPBD融合タンパク質と接触させる工程を含む。本発明の方法および組成物は、変化した機械的性質、化学的性質、電気的性質および/または物理的性質を有する多糖含有材料を製造する際に使用される。
【0013】
本発明の1つの側面により、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【0014】
本発明の別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料をもたらす組成物が提供される。
【0015】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前に行われる。
【0016】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する途中において行われる。
【0017】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触は、多糖構造物を多糖含有材料に加工する後に行われる。
【0018】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖含有材料は、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される。
【0019】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、構造的性質は、多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される。
【0020】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、化学的性質は、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および所定の表面張力からなる群から選択される。
【0021】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、物理的性質は、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される。
【0022】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、電気的性質は、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される。
【0023】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、機械的性質は、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される。
【0024】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも1つのさらなる多糖結合ドメインとを含む。
【0025】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む。
【0026】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む。
【0027】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む。
【0028】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む。
【0029】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む。
【0030】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む。
【0031】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む。
【0032】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む。
【0033】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む。
【0034】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインA抗体とを含む。
【0035】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む。
【0036】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む。
【0037】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む。
【0038】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む。
【0039】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む。
【0040】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む。
【0041】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む。
【0042】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む。
【0043】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む。
【0044】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む。
【0045】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む。
【0046】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む。
【0047】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む。
【0048】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む。
【0049】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む。
【0050】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む。
【0051】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む。
【0052】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む。
【0053】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む。
【0054】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む。
【0055】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む。
【0056】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【0057】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む。
【0058】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0059】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0060】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む。
【0061】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、グルカン結合ドメイン(例えば、β−1,3−グルカン結合ドメイン)である多糖結合ドメインを含む。
【0062】
記載される好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴により、多糖結合ドメイン含有組成物は、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む。
【0063】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖含有材料の多糖構造物を架橋する多糖結合ドメイン連結剤を形成する少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む組成物が提供される。
【0064】
本発明のさらに別の側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している機能化成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、機能化成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0065】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している疎水性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、疎水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0066】
本発明のなおさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している親水性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、親水性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0067】
本発明のさらにさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している化学的反応性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0068】
本発明のさらなる側面により、多糖構造物を含む多糖含有材料と、多糖含有材料の多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物とを含む組成物であって、多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している光化学的反応性成分とを含み、少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、光化学的反応性成分が多糖含有材料の多糖構造物に結合している組成物が提供される。
【0069】
本発明のなおさらなる側面により、少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む多糖結合ドメイン連結剤を含む組成物が提供される。
【0070】
本発明のさらにさらなる側面により、少なくとも2つの多糖結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。好ましくは、核酸構築物は、少なくとも2つの多糖結合ドメインを結合する少なくとも1つのリンカーペプチドをコードする少なくとも1つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含む。
【0071】
本発明のさらなる側面により、少なくとも1つの所望する構造的性質、化学性質的、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメインとの接触を、多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、その後、少なくとも1つの成分または基を多糖結合ドメインに共有結合させ、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法が提供される。
【0072】
本発明は、紙および織物材料などの優れた多糖構造物含有材料を製造するための方法および試薬を提供することによって、現在知られている形態の短所を解決する。
【0073】
図面の簡単な説明
本発明は、添付された図面を参照して例としてのみ本明細書中に記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示された詳細は、本発明の好ましい実施形態の例として、また本発明の好ましい実施形態の説明的な議論のためだけであり、そして本発明の原理的で概念的な側面の最も有用で、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されていることが強調されている。この点に関して、本発明を根本的に理解するために必要である以上に詳しく本発明の構成的細部を示すことはなされておらず、図面とともに理解される説明により、当業者には、本発明のいくつかの形態が実際にどのように組み立てられ得るかが明らかになる。
図1aは、pET−CBDプラスミドの概略図である。
図1b〜1cは、CBDclosのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
図1dは、pET−CBD−180の概略図である。
図1e〜1gは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCBD−180のヌクレオチド配列(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
図2aは、1コピーのCBD−180と、それに読み枠を合わせて融合させた1つのCBDとを含むpET−CCP−180の概略図である。
図2b〜2eは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCCP(セルロース架橋タンパク)のヌクレオチド配列(配列番号5)およびアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
図3aは、pET−ProtA−CBDの概略図である。
図3b〜3gは、ProtA−CBDのヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
図4aは、pET29−Spep−CBD−Sprotの概略図である。
図4b〜4gは、Spep−CBD−Sprotのヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
図5aは、1分子あたり2つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図5bは、1つのセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、第2のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している図5aのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図6は、一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示す。
図7a〜7cはそれぞれ、CBD連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図7aは、それぞれがCBDに結合している1対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7bは、それぞれが隣接するCBDにJUN/FOS架橋を介して結合している複数のCBDを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7cは、大きなタンパク質成分により連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。
図8は、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを有するCBD機能的成分(CBDC)を概略的に示す。
図9a〜9cは、CBD連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
図10a〜10dは、コントロール紙片、CBD処理紙片およびCCP処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
図11は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
図12a〜12bは、コントロール糸、CCP処理糸、ProtA−CBD処理糸およびAb−ProtA−CBD処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
図13は、大腸菌においてSタンパク質−CBD−Sペプチド(SCS)を発現させた結果の写真を示す。タンパク質マーカー(レーン1)、IPTGで誘導される前の総大腸菌タンパク質(レーン2)、IPTGで誘導された後の総大腸菌タンパク質(レーン3)、およびSCSタンパク質を含有する封入体(レーン4)。
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。すべての測定値は、23℃、65%の相対湿度、および20mm/分の一定の変形において得られた。四角−コントロール;丸−2.5mg/mlのCBD;三角−2.5mg/mlのCCP。
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。すべての測定値は23℃で得られた。蒸留水(10μl)を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した(コントロール−黒棒;CBD−点刻棒;CCP−白棒)。
図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。水滴(それぞれ20μl)をCCP処理紙に滴下して、写真を25ms毎に撮影した。最初のフレーム(A)は、水が紙に接触する前に撮影された。フレームB〜Eは、それぞれ、2分後、4分後、6分後および8分後に撮影された。最後のフレーム(F)は、処理されなかった紙に対して、水が紙と接触した25ms後に撮影された。水の吸収は、光学的接触角度計を使用して視覚化された。
【0074】
好適な実施形態の詳細な説明
本発明により、多糖材料の表面性質、化学的性質、電気的性質および機械的性質を変化させるための方法および組成物が提供される。
【0075】
本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施形態により例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施され得るか、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられている表現法および用語法は説明のためであり、限定であると見なすべきではないことを理解しなければならない。
【0076】
繊維およびフィラメントなどの多糖構造物は、構造物を多糖含有材料に加工する途中またはその後においてPBD含有組成物で処理され、それにより、多糖構造物および/またはそれらの製品(織物および紙など)は架橋および/または機能化される。PBD含有組成物は万能的な生物学的架橋剤として機能し、その構造は、多糖を含有する最終製品の増大した弾性または疎水性などの所望する結果を得るために変化させることができる。このような生物学的架橋剤は、大きさが数百ダルトンから数百万ダルトンまでの範囲にある1つまたは2つ以上の生物学的実体または化学的実体に融合または連結(「融合または連結」=共有結合)したセルロース結合ドメインなどのPBDを少なくとも1つ含有する多量体タンパク質である。一般に、そのような生物学的実体は1つまたは2つ以上の第2のタンパク質である。第2のタンパク質は、セルロース結合ドメイン、またはデンプン結合ドメイン、または疎水性基もしくは酵素(特に、多糖構造物の処理および/または多糖含有最終製品の特性を改善および/または促進し得る酵素、例えば、リパーゼまたはラッカーゼなどの酵素)に結合したPBDなどの機能化PBDなどの別のPBDであり得る。あるいは、第2のタンパク質は、プロテインA−抗体複合体などの非PBDタンパク質であり得る。
【0077】
改変された多糖含有材料を調製するために、多糖構造物は、多糖材料に加工している途中またはその後において、十分な量の生物学的架橋剤と、多糖構造物を含有する多糖材料の1つまたは2つ以上の特性を改変するのに十分な条件および時間で接触させられる。一例として、セルロース繊維を紙に加工するか、または綿を糸に加工する途中における従来のサイズ処理工程の代わりに、またはそのような工程とともに、PBD融合タンパク質を使用して、多糖構造物を凝集させ、かつ/または多糖繊維およびフィラメントなどの多糖構造物を架橋して、加工時における構造物自体および/または製造される多糖含有材料の湿潤強度を増大させるようにすることができる。好ましくは、PBD融合タンパク質による処理は従来のサイズ処理工程の代わりである。しかし、いくつかの適用においては、この2つの手順を、例えば、デンプンサイズ処理と、そしてデンプンおよび繊維を架橋するデンプン結合タンパク質を含むPBD融合タンパク質と組み合わせることは有用であると考えられる。さらに、機能的成分を含むPBDは、例えば、紙などの多糖含有材料の濡れ性を低下させるために疎水性成分(脂肪酸誘導体または疎水性アミノ酸配列など)で多糖含有材料(セルロースマトリックスなど)を機能化するために使用することができる。
【0078】
本発明は、例えば、商業的な製紙プロセスおよび織物プロセスにおいて使用されているような多糖構造物を処理する既存の方法を上回るいくつかの利点を提供する。セルロース繊維などの好適な多糖含有材料を生物学的架橋剤で処理することによって、処理されない材料、および/またはPBD融合タンパク質以外の強化剤を使用して処理された材料と比較して、改善された機械的性質(例えば、増大した強度および耐久性)を有する製品を得ることができる。さらに、波形加工用紙を製造する際、PBD試薬を、紙の湿潤強度を増大させるために、成形段階において、あるいはサイズ処理段階の前またはその後において、そのいずれかで適用することができる。成形段階で適用された場合、十分な湿潤強度が得られ、その結果、サイズ処理工程を省略することができる。これにより、紙を加工するために使用される装置の約1/3を省略することができるために、時間が節約されるだけでなく、紙の製造コストが大きく低下する。化学的架橋剤および疎水性材料とは対照的に、生物学的架橋剤の使用により、このプロセスを使用して作製される紙製品の再利用性もまた改善される。
【0079】
本発明の別の利点は、製紙の成形工程において、多くの微細繊維が、成形用織物を通過するために失われるということである。PBD試薬により、それらは紙スラリー中に維持され、その結果、原料のより良好な回収がもたらされる。さらに、段ボール容器を製造する最終加工工程において、アルカリ糊が、波形加工用紙を壁板に結合するために使用される。PBD分子は強アルカリ条件によって溶出され、これにより、アルカリ糊が紙に浸透し得る能力が高められる。
【0080】
本発明の多量体PBD融合タンパク質は、PBDと第2のタンパク質との2つの基本的な構成単位を有する。この場合、第2のタンパク質はPBDであってもよく、またはPBDでなくてもよい。PBDは、セルロースなどの多糖に結合するアミノ酸配列、またはPBDが結合する多糖基質の基本的な構造ユニット(骨格糖および/または末端糖および糖自体のいずれかを含み、単糖および二糖を含む)を含むポリマーに結合するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドであり得る。PBDの定義には、天然に存在するPBDの変異体、変化体およびその他が含まれる。その唯一の条件は、それらが多糖含有基質に結合するということである。PBDは可逆的または不可逆的のいずれかで基質多糖に結合することができ、基質は天然物または合成物であり得る。PBD融合タンパク質は、同じポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質あるいは異なるポリサッカリダーゼまたはスカホールドタンパク質に由来し得る複数の多糖結合ドメインを有し、かつ同じ多糖または異なる多糖に結合し得る複数の多糖結合ドメインを有するタンパク質分子であり得る。複数のPBDが存在する場合、それらは、好ましくは、PBD融合タンパク質内において別個のドメインを占め、そして、互いに独立して機能し得る。用語CBDは、セルロース結合に関与している天然タンパク質から得ることができるドメインをいうか、あるいは自身がセルロースに結合する天然タンパク質の単離されたアミノ酸配列またはフラグメントをいう(例えば、Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768;Gilkes他、(1988)J.Biol.Chem.263:10401〜10407を参照のこと。これらの両方の内容は参考として本明細書中に組み込まれる)。PBDおよびCBDは、天然物、合成物または部分合成物であり得る。
【0081】
多糖結合ドメイン(多糖結合ドメインを含む触媒活性なポリサッカリダーゼおよび触媒不活性なポリサッカリダーゼの両方を含む)は、生化学的技術および/または遺伝子工学的技術を含む様々な技術のいずれかにより得ることができる。従って、多糖結合ドメインは、タンパク質分解(例えば、Gilkes他、J.Biol.Chem.(1988)213:10401〜10407を参照のこと)によって、または当業者に知られている技術を使用する遺伝子操作(ランダム変異、部位特異的変異誘発法またはDNAシャフリングなど)によって得ることができる。部位特異的変異誘発法を使用して、ポリサッカリダーゼの触媒活性に関連する特定のアミノ酸を変異させ、そして触媒活性を阻害または阻止するが、多糖の結合を妨げないアミノ酸によって置換することができる。例えば、CenAでは、283位のアスパラギン酸を置換することができる。そのような方法は、元のポリサッカリダーゼ配列に極めて類似するアミノ酸配列を効果的にもたらすが、触媒活性を含有する機能的ドメインは変異誘発法または生化学的改変によって機能不能にされる。結合ドメインのみが依然として機能的である。変化型PBDまたは変異型PBDを得るために、1つまたは2つ以上の所定のアミノ酸残基が置換され得るか、または様々なPBDのアミノ酸配列に挿入され得るか、または様々なPBDのアミノ酸配列から欠失され得る。PBDタンパク質配列またはPBDポリペプチド配列におけるアミノ酸置換は、例えば、対象となるアミノ酸残基の極性、電荷、疎水性および親水性などの類似性または相違に基づいて合理的な様式で行うことができる。タンパク質において一般的に見出されるすべてのアミノ酸の極性および疎水性などの特性は、アミノ酸配列を特異的に変化(変異)させる技術が十分に知られているようにこの分野では十分に知られている。得られた変化型PBDまたは変異型PBDは本発明の範囲内であると見なされる。置換、挿入および/または欠失を、例えば、特定の多糖含有材料を架橋または機能化するために複数の望ましい属性を有する変化型PBDを得るために行うことができる。
【0082】
特定の変異または改変を有するポリサッカリダーゼ配列全体ではなく、多糖結合ドメインだけに対応するアミノ酸配列を使用することができる。この場合、PBDが、ポリサッカリダーゼを機能的ドメインに切断することによって得られる。例えば、単離されたポリサッカリダーゼは、機能的ドメインからなる2つ以上のフラグメントにタンパク質を切断するプロテアーゼ処理に供される。ときには、ポリサッカリダーゼは特異的なプロテアーゼ部位を含む。例えば、C.finiのエンドグルカナーゼA(CenA)は、立体配座に特異的なC.finiプロテアーゼにより切断されるPTボックスを含む。その反応の生成物は、PT配列を有する多糖結合ドメインと、ポリサッカリダーゼ触媒ドメインとである。ポリサッカリダーゼが非常に特異的配列なプロテアーゼにより切断されない場合、ポリサッカリダーゼは、特異性が低いプロテアーゼに供され、そして活性なフラグメントを、当業者に知られているクロマトグラフィーおよび他のペプチド精製技術によって単離することができる。
【0083】
結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするDNA配列をクローニングするためのプローブを作製するためにアミノ酸配列情報を使用することが含まれる。これらのクローン化された配列は、多糖結合ドメインのみをコードする欠失変異体を作製するために使用することができる。逆に、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質をコードするcDNA配列が知られている場合、他のポリサッカリダーゼに対する配列相同性に基づいて、多糖結合ドメインの位置を予測するために生化学的データ、アミノ酸データおよびDNA配列データを使用することによって、多糖結合ドメインに対応するDNA配列を特異的に構築することができる。ポリサッカリダーゼ遺伝子および多糖結合タンパク質を単離する際に使用される技術はこの分野では知られており、これには、合成、ゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、またはそれらの組合せが含まれる。多糖結合ドメインを得るために使用され得る他の技術には、遺伝子融合、ファージディスプレイ、DNAシャフリング、およびランダム変異誘発法または部位特異的変異誘発法が含まれる。遺伝子操作の様々な技術が十分に知られており、これには、制限、消化、切り出し、連結、インビトロ変異誘発法、プライマー修復、リンカーおよびアダプターを用いることなどが含まれる(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、Sambrook他(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY(1989年)を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる)。本発明のPBDタンパク質をコードする核酸は、単離および精製されたRNAから、またはゲノムクローニングによって得ることができる。cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーのいずれかを、この分野で十分に知られている技術を使用して調製することができ、そしてコード配列の任意の部分に対して実質的に相補的なプローブを用いて特定のPBDヌクレオチド配列についてスクリーニングすることができる。あるいは、cDNAまたはゲノムDNAを、好適なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRクローニングのテンプレートとして使用することができる。全長のクローン、すなわち、所望するPBDタンパク質のコード配列全体を含むクローンを、発現ベクターを構築するために選択することができ、または重複するcDNAを連結して、完全なコード配列またはその所望する部分(結合ドメインなど)を形成させることができる。あるいは、PBDをコードするDNAは、この分野で十分に知られている固相技術を使用して化学合成によって全体または一部を合成することができる。
【0084】
PBDは、本発明において使用されるオリゴ糖に結合する酵素を含む様々な供給源から得ることができる。下記の表5には、可溶性グルカン(α、βおよび/または混合結合体)に対する親和性を有するすべての結合ドメインを含む、1つまたは2つ以上の可溶性/不溶性の多糖に結合するそのような結合ドメインが列挙されている。C.fimiのエンドグルカナーゼCenCに由来するN1セルロース結合ドメインは、可溶性のセロサッカリドに結合し、そしていずれかの可溶性多糖に結合することが知られている小さなタンパク質集団の1つである。また、表1〜表4には、仮想的なβ−1,3−グルカン結合ドメインを含有するタンパク質の例(表1);連鎖球菌のグルカン結合反復を含有するタンパク質(Cplスーパーファミリー)の例(表2);キチン結合ドメインを有する酵素の例(表3);およびデンプン結合ドメインを有する酵素の例(表4)が列挙されている。セルロース結合ドメインタンパク質を含む様々なスカホールドタンパク質、例えば、クロストリジウム・セルロボランス(Clostridium cellulovorans)によって産生されるスカホールドタンパク質(Shoseyov他、国際特許出願PCT/US94/04132)などもまた、PBPを調製するために使用することができる。トリコデルマ(Trichodenma)種およびその他を含むいくつかの菌類もまた、PBPが単離され得るポリサッカリダーゼを産生する。
【表1】
【表2】
【0085】
注目される結合特性および結合特異性を有する新しいPBPを様々な方法で同定およびスクリーニングすることができる。そのような方法には、例えば、NMR分光法(Zhu他、(1995)Biochemistry、34;Gehring他、(1991)Biochemistry、30:5524〜5531)、UV差分光法(Beishaw他、(1993)Eur.J.Biochem.211:717〜724)、蛍光(滴定)分光法(Miller他、(1983)J.Biol.Chem.258:13665〜13672)、UVまたは蛍光によるストップフロー分析(De Boeck他、(1985)Eur.J.Biochem.149:141〜415)、アフィニティー方法(アフィニティー電気泳動(Mimura他、(1992)J.Chromatography、597:345〜530)あるいは固定化された単糖またはオリゴ糖でのアフィニティークロマトグラフィーなど)、沈殿または凝集による分析(濁度法的または比濁法的な分析(Knibbs他、(1993)J.Biol.Chem.14940〜14947)を含む)、競合的阻害アッセイ(定量的なIC50決定を伴うかまたは伴わない)および様々な物理的または物理化学的な方法(示差走査熱測定法または等温滴定熱測定法を含む)(Sigurskjold他、(1992)J.Biol.Chem.267:8371〜8376;Sigurskjold他、(1994)Eur.J.Biol.225:133〜141)、あるいは熱CD分光法または熱蛍光分光法を使用するオリゴ糖の非存在下または存在下でのタンパク質安定性の比較アッセイ(融解)などの分光学的(滴定)方法が含まれる。
【0086】
一般に、PBPがオリゴ糖に結合するKaは、少なくとも弱い抗体−抗原抽出物の範囲内にあり、すなわち、10−3であり、好ましくは10−4であり、最も好ましくは10−6である。PBPのオリゴ糖に対する結合が発熱性または吸熱性である場合、多糖構造物を処理している時の温度を調節する手段を提供することにより、結合は、より低い温度で、それぞれ、増大または低下する。
【表3】
【表4】
a生デンプン消化アミラーゼ、bマルト生成α−アミラーゼ、cマルトテトラオース生成アミラーゼ(1,4−α−マルトテトラヒドロラーゼ)、dマルトペンタオース生成アミラーゼ、e熱安定性α−アミラーゼ、f以前のClostridium thermosulfurogenes。AMYG、GAMおよびGLA:グルコアミラーゼ、AMYまたはAML:α−アミラーゼ、CGT:β−シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼまたはシクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ORF:オープンリーディングフレーム。A.:Aspergillus、B.:Bacillus、C.:Corticium、D.:Dictiosteium、H.grisea:Humicola grisea、H.resinea:Hormoconis resinea(Amorphotheca resinea)、K.:Klebsiella、N.:Neurospora、S.:Streptomyces、Th.curvata:Thermomonospora curvata、Th.:Thermoanaerobacter。
表 5
【0087】
多数のCBDが知られており、これらは少なくとも12のファミリーに分類されており、そのいずれも、CBDの目的とする使用に依存してCBDの供給源として役立ち得る。ファミリーIは菌類の酵素のCBDのみを含む。残る11ファミリーにおける大多数のCBDは細菌起源である。最もよく理解されているCBDは、ファミリーI、II、IIIおよびIVに属するCBDであり、それらのCBDは、長さが、平均して、それぞれ、36アミノ酸、105アミノ酸、150アミノ酸および150アミノ酸である。ファミリーI、II、IIIおよびIVのいくつかのCBDは、ロールカステラ状に折り畳まれた複数の反平行なβシートを含むとして特徴付けられており、ファミリーI、IIおよびIIIのCBDは非晶質セルロースおよび結晶性セルロースの両方に結合し、これに対して、ファミリーIVのCBDは非晶質セルロースに結合するが、結晶性セルロースには結合しない。ファミリーIVのCBDのみが可溶性のセルロース誘導体およびセロオリゴ糖に結合する。結晶性セルロースおよびキチンに結合するCBDは、類似する親和性で結合し、マイクロモル濃度の範囲の結合定数を有する。ファミリーIのCBDはセルロースに可逆的に結合し、これに対して、ファミリーIIおよびファミリーIIIのCBDは非変性条件のもとで不可逆的に結合する。好ましいCBDには、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)、トリコデルマ・レーセイ(Trichoderma reesei)およびM.Bisporaのそれぞれの種に属する菌株から得ることができるCBD(N.R.Gilkes他、(1988)J.Biol.Chem.263:10401〜10407;N.R.Gilkes他、(1991)Microbiol.Rev.55:303〜315);セルロモナス・フィミから得られるセルラーゼ遺伝子(Whittle他、(1982)Gene、17:139〜145;Gilkes他、(1984)J.Gen.Microbiol.130:1377〜1384);C.fimiから得られるエキソグルカナーゼ(Cex)およびエンドグルカナーゼ(CenA)ならびにそれらの遺伝子配列(cexおよびcenA)(Wong他、(1986)Gene、44:315〜324;O’Neill他、(1986)Gene、44:325〜330);Shoseyov他(1992)(Proc.Natl.Acad.Sci.89:3483〜3487)により記載されるクロストリジウム・セルロボランス(Clostridium cellulovorans)に由来する17KD(ペプチド)CBDが含まれる。このCBDの組換え形態はセルロースおよびキチンに対して強い親和性を示す(Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768)。
【0088】
PBDタンパク質はまた、ポリサッカリダーゼまたは多糖結合タンパク質の多糖結合領域の機能的部分を少なくともコードするDNAを含むDNA構築物を宿主細胞に形質転換することによって調製することができる。PBDのDNA配列は真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかの宿主細胞で発現させることができる。発現して単離されたPBDは、その後、他のPBDおよび/または1つもしくは2つ以上の機能化タンパク質に結合させることができる。
【0089】
これらの場合のいずれにおいても、単離された多糖結合ドメインは、一般に、ポリサッカリダーゼ活性が目的とする融合タンパク質の所望する特徴である場合を除いて、触媒的なポリサッカリダーゼ活性を除くために十分に純粋である。好ましくは、そのような調製物の触媒活性は、ポリサッカリダーゼを発現する細胞から得られた粗抽出物の活性よりも小さい。より好ましくは、触媒活性は、1000個の機能的な結合ドメインあたり1個未満の機能的な触媒ドメインの化学量論を反映する。所望する発現産物の活性を試験するために、PBDの結合活性を、例えば、アビセル(微結晶性セルロース)などの微結晶性セルロースに対する結合によって、そして仮想的な結合ドメインが溶液から除かれることを示すことによって明らかにすることができる。所望する活性を有するポリペプチドは、高度に精製された形態でセルロースから容易に単離される。アビセルに対する結合は、天然型セルラーゼ(Gilkes他、J.Biol.Chem.(1984)259:10455〜10459)および組換えセルラーゼ(Owolabi他、Appl.Environ.Microbiol.(1988)54:518〜523)の両方を精製するために使用されている。
【0090】
多量体PBD融合タンパク質の第2の基本的な構成単位は、第1の構成単位であるPBDと同じであり得る第2のPBD、または第1の構成単位とは異なり得る第2のPBDであり得るタンパク質である。従って、多量体融合タンパク質は、それぞれがPBDをコードする1対のヌクレオチド配列によってコードされ、そしてこの分野で十分に知られているように読み枠を合わせて連結されている二量体PBD融合タンパク質であり得る(例えば、米国特許第5856201号および米国特許第5837814号(ともにShoseyov他、これらはともにその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。図5aには、第1および第2の両方のタンパク質がCBDであり、従って二量体CBDを形成するPBD融合タンパク質の一例が示されている。この場合、CBDは同じであってもよく(ホモ二量体CBD)、または異なっていてもよい(ヘテロ二量体CBD)。図5bには、図5aのセルロース架橋タンパク質の使用が示されている。この場合、一方のセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、そしてもう一方のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している。図6は、リンカーユニットを介して連結された1対のCBDを含む一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示している。
【0091】
あるいは、第2の構成単位は、1つまたは2つ以上の機能化基を必要に応じて含むPBDであり得る。機能化基により、多糖含有材料の1つまたは2つ以上の性質を改変することができる機能的な基が意味される。一般に、機能化基は、ケイ素結合性ペプチド、ポリマー結合性ペプチドまたは金属結合性ペプチドなどのタンパク質またはペプチドである(Ljungquist他、(1989)Eur.J.Biochem.86:563〜569;Spanner他、(1995)Bone17:161〜165;Slice他、(1990)J.Biol.Chem.265:256〜263;Pessi他、(1993)Nature、362:367〜369)。機能化ポリペプチドの他の例には、多糖繊維およびデンプン分子を架橋する手段を提供するデンプン結合ドメインが含まれる;デンプンは、繊維の内因性成分であり得るし、またはサイズ剤として適用され得る。デンプン結合ドメインは、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)のグルコアミラーゼから得ることができる(Chen他、(1991)Gene、99:121〜126)。同様に、多糖分子およびグルテン分子は、マトリックスタンパク質(高分子量グルチニン(HMWG)など)を別のポリペプチドとして使用することによって架橋することができる。特定の適用には、機能化基はまた、1つまたは2つ以上のチオール基などの化学基、発色基、色素、反応性基(アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシ、カルボジイミドなど)、または光反応性基(PBDに結合したフェニルアジドなど)を含むことができる。様々な化学的実体をPBDに結合させる方法が米国特許第5,962,289号に記載されている(これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0092】
PBD融合タンパク質の第1の構成単位は、必要に応じて、リンカーユニットを介して第2の構成単位に連結させることができる。PBD連結剤ユニットのリンカーユニットは、生物学的ポリマー(タンパク質、ポリペプチドまたは多糖など)ならびに合成ポリマー(アクリルポリマーなど)およびマトリックスタンパク質(高分子量グルチニン)を含む様々な天然分子または合成分子を含むことができる。リンカーユニットのペプチド成分またはタンパク質成分の例には、JUNタンパク質およびFOSタンパク質(例えば、Gentz他、(1989)Science、243:1695〜1699を参照のこと);デンプン結合ドメイン(SBD)(例えば、Chen他、(1991)Gene、99:121〜126を参照のこと)、およびSペプチドまたはSタンパク質(例えば、Kim他、(1993)Protein Science、2:348〜356を参照のこと)が含まれる。融合タンパク質における第1および第2のポリペプチド(あるいは複数の第1および/または第2のポリペプチド)は、融合タンパク質の目的とする使用に部分的に依存して、ペプチド結合を介して、またはより大きなリンカーユニットを介して直接連結させることができる。図8は、第1のCBDと、第2のCBDと、第1および第2のCBDを連結するリンカーユニット(LU)とを有するCBD連結剤ユニットを概略的に示している(図中ではCUと示される)。第1および第2のCBDは末端性であるとして、そしてリンカーユニットの反対側の極に存在するとして図8には描かれているが、CBDおよびリンカーユニットの他の数および配置も考えられ、そして本発明の範囲内である。リンカーユニットは、共有結合的結合、イオン性結合、疎水性結合、水素結合、タンパク質翻訳およびタンパク質伸長を含む様々な手段の1つまたはその組合せによってPBD連結剤ユニットのそれぞれのPBDに結合させることができる。
【0093】
リンカーユニットの多糖成分は、PBDが結合しない多糖、またはPBDが低い親和性で結合する多糖であり得る。そのような多糖の例として、デンプンが挙げられる。さらに、PBD連結剤ユニットのリンカーユニットは、PBD以外の1つまたは2つ以上の多糖結合ドメインであり得る。一例として、図7aには、第1のCBDと、第2のCBDに連結した第2のデンプン結合ドメインと、第1のデンプン結合ドメインおよび第2のデンプン結合ドメインの両方に連結したデンプン成分とを含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。
【0094】
PBD連結剤ユニットのリンカーユニットはまた、1つまたは2つ以上のPBDを含むことができる。一例として、図7bには、複数のCBDを含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。この場合、リンカーユニットのそれぞれのCBDは、JUN/FOS架橋を介して隣接するCBDに連結されている(例えば、Gentz他、(1989)Science、243:1695〜1699を参照のこと)。図7cには、セルロースまたは関連ポリマーに結合しないか、またはセルロースまたは関連ポリマーに低い親和性で結合するだけであるペプチド成分またはタンパク質成分を含む連結剤ユニットによって連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットが示されている。連結剤ユニット(例えば、リンカータンパク質)のペプチド成分またはタンパク質成分は、サイズが数百ダルトンから1メガダルトン以上まで変化し得る。一例して、図7cに表されるリンカーユニットは数アミノ酸の短いペプチドであり得るか、またはHMWGなどの比較的大きなリンカータンパク質であり得る。
【0095】
多量体PBD融合タンパク質は化学的または組換え的に作製することができる。例えば、当業者に知られている技術を使用して、多糖結合領域またはその複数体を思う通りに作製して、精製し、その後、機能化基を有するか、または機能化基を有しない第2のタンパク質に化学的に連結させることができる。タンパク質の結合方法には、多糖結合ドメインを改変するためのインビトロ結合化学反応が含まれる。これには、ドメインを多糖マトリックスに結合させながら、またはドメインを多糖マトリックスから遊離させながら、そのいずれかで行うことができる。例として、ReichlinによりMethods of Enzymology(1980)70:159〜165に記載されるようなグルタルアルデヒド結合の使用が挙げられる。多糖結合ドメインがマトリックスに結合する場合、マトリックスに実際に結合する部位を保護し、その一方で、他の残基が第2の成分(第2のPBDまたは機能化タンパク質のいずれか)と反応するようにしておくという利点が得られる。化学的成分を多糖結合ドメインに結合させることにより、多糖基質への結合能が損なわれる場合には、多糖マトリックスの存在を必要とする反応手順が、ドメインの結合特性を保持するためには好ましい。
【0096】
あるいは、多量体PBD融合タンパク質は組換え的に作製することができる。PBD融合タンパク質を組換え的に作製するために、PBD融合タンパク質の成分をコードするヌクレオチド配列が、PBD融合タンパク質を発現させることができる組換え発現ベクターを構築するために使用される。一般に、核酸構築物は、タンパク質のヌクレオチドコード配列に機能的に連結されている転写調節情報および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有する場合にタンパク質を発現させることができる。「機能的に連結されている」は、調節的なDNA配列および発現するDNAが、転写および翻訳を可能にするような方法で連結されている連結をいう。多糖結合ドメインをコードするフラグメントと、第2の多糖結合ドメインまたは機能化ポリペプチドをコードするDNAとは、PBDをコードする核酸が、第2のタンパク質をコードする核酸に連結され、その結果、PBDおよび第2のタンパク質が一緒になったオープンリーディングフレームが完全になり、これにより、PBD融合タンパク質全体の翻訳が生じ得るように連結される。PBD融合タンパク質がタンパク質連結剤ユニットを有する場合、ヌクレオチド配列が、PBDコード配列と第2のタンパク質をコードする配列との間において発現構築物に機能的に挿入される。得られた連結DNAは、その後、発現をもたらす様々な方法で操作することができる。
【0097】
核酸増幅および核酸発現の両方に使用されるベクターはこの分野では十分に知られている。適切なベクターを選択することは、目的とする機能(例えば、増幅または発現)、DNAインサートのサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞を含む様々なパラメーターに依存する。様々な発現ベクター/宿主系を、PBDタンパク質およびPBD融合タンパク質の組換え発現のために当業者は利用することができる。そのような系には、所望するPBDコード配列を含有する組換えファージDNA発現ベクター、組換えプラスミドDNA発現ベクターまたは組換えコスミドDNA発現ベクターで形質転換される細菌などの微生物;所望するPBDコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換される酵母;所望するPBDコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させられる昆虫細胞系;所望するPBDコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV);タバコモザイクウイルス(TMV))に感染させられる植物細胞系、または所望するPBDコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換される植物細胞系;または組換えウイルス発現ベクター(例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス)に感染させられる動物細胞系で、多コピーのPBD核酸を含有するように操作され、二重微小染色体において安定に増幅される細胞株(例えば、CHO/dhfr、CHO/グルタミン合成酵素)または二重微小染色体において安定に増幅されない細胞株(例えば、ネズミ細胞株)を含む動物細胞系が含まれる。
【0098】
上記に列挙された成分の1つまたは2つ以上を含有し、かつ所望するコード配列および制御配列を含む好適なベクターの構築には、標準的な連結技術が用いられる。単離されたプラスミドまたは核酸フラグメントは、必要とされるプラスミドを作製するために所望される形態で、切断され、調整され、そして再連結される(Current Protocols in Molecular Biology、第I巻〜第III巻、Ausubel,R.M.編(1994年)を参照のこと)。DNA構築物(例えば、プラスミド)における正しい配列を確認するために、連結混合物を使用して、大腸菌のXl−1株およびDH52株が形質転換され、成功した形質転換体が抗生物質(例えば、アンピシリン)耐性によって選択される。これらは適宜行われる。形質転換体に由来するプラスミドが調製され、制限によって分析され、かつ/または配列決定される(例えば、Messing他、Nucleic Acids Res.9:309(1981);Maxam他、Methods in Enzymology、65:499(1980)を参照のこと)。一般に、発現ベクターは宿主細胞において効率よく複製することができ、その結果、宿主細胞は多数コピーの発現ベクターを蓄積し、次に、高レベルの目的タンパク質を合成する。発現カセットは、適切な細胞宿主におけるエピソーム維持のために複製系に含ませることができるか、または発現カセットが宿主のゲノム内に組み込まれる場合には複製系を用いることなく提供され得る。
【0099】
PBD融合タンパク質をコードするDNAが得られると、DNAは宿主細胞において複製し得るベクターに入れられるか、あるいはPCRまたはロングPCRなどの技術によってインンビトロで増やされる。複製するベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、人工染色体などを挙げることができる。望ましいベクターには、目的遺伝子の変異誘発に有用なベクター、または目的遺伝子の宿主細胞における発現に有用なベクターが含まれる。ロングPCRの技術により、可能な長い構築物がインビトロで増やされており、その結果、変異誘発または発現シグナルの付加などの目的遺伝子の改変、および得られた構築物の増殖を、複製するベクターまたは宿主細胞を使用することなく完全にインビトロで行うことができる。
【0100】
PBD融合タンパク質を発現させるために、機能的な転写および翻訳の開始領域および終結領域が、PBD融合タンパク質をコードするDNAに機能的に連結される。融合タンパク質をコードする領域の発現をインビトロまたは宿主細胞内で行うことができる。転写および翻訳の開始領域および終結領域は、発現させられるDNA、所望する系で発現し得ることが知られている遺伝子、または所望する系で発現し得ることが考えられる遺伝子、発現ベクター、化学合成を含む様々な非限定的な供給源に由来し得るか、あるいは宿主細胞の内在性遺伝子座に由来する。
【0101】
インビトロ発現を、例えば、インビトロでの使用のために設計された発現ベクターにPBD融合タンパク質のコード領域を入れ、そしてウサギ網状赤血球溶解物および補助因子を加えることによって達成することができる。この場合、標識されたアミノ酸を、所望する場合には混合することができる。そのようなインビトロ発現ベクターは、使用される系において必要な発現シグナルの一部またはすべてを備えることができる。これらの方法はこの分野では十分に知られており、系の成分は市販されている。その後、反応混合物は、例えば、その結合活性を測定することによって融合タンパク質について直接アッセイすることができ、あるいは合成された融合タンパク質を精製して、その後アッセイすることができる。
【0102】
宿主細胞における発現は一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。一過的な発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含有するが、宿主細胞において複製せず、そして宿主細胞にほとんど組み込まれない導入された構築物から生じ得るか、または宿主細胞が増殖しない場合に生じ得る。一過的な発現はまた、目的遺伝子に機能的に連結されている調節可能なプロモーターの活性を誘導することによって達成され得るが、そのような誘導可能な系は、しばしば、低い基底レベルの発現を示す。安定的な発現は、宿主ゲノムに組み込まれ得る構築物、または宿主細胞において自律的に複製する構築物を導入することによって達成することができる。目的遺伝子の安定的な発現は、発現構築物に存在する選択マーカーの使用によってマーカーを発現する細胞について選択され得るか、または発現構築でトランスフェクションされ、その後、マーカーを発現する細胞について選択され得る。安定的な発現が組み込みから生じる場合、構築物の組み込みは宿主ゲノム内にランダムに生じ得るか、または宿主の遺伝子座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性を有する領域を含有する構築物の使用によって標的化され得る。構築物が内因性の遺伝子座に標的化される場合、転写調節領域および翻訳調節領域のすべてまたは一部が内因性の遺伝子座によって提供され得る。
【0103】
供給源の生物におけるPBD融合タンパク質の増大した発現が所望される場合、いくつかの方法を用いることができる。PBD融合タンパク質をコードするさらなる遺伝子を宿主生物に導入することができる。発現はまた、例えば、より強力なプロモーターを使用することによって、または脱安定化配列をmRNAまたはコードされるタンパク質のいずれかから除くことによって、または宿主ゲノムからそのような情報を除くことによって、または安定化配列をmRNAに加えることによって増大させることができる(米国特許第4910141号)。
【0104】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物により認識され、かつ目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流(5’)に存在し(一般には、開始コドンの約100bp〜1000bpのところ)、かつプロモーターが機能的に連結されている特定の核酸配列(PBD融合タンパク質をコードする配列など)の転写および翻訳を制御する非翻訳配列である。
【0105】
プロモーターは、典型的には、誘導的と構成的との2つのクラスに分けられる。誘導的プロモーターは、培養条件の何らかの変化(例えば、栄養素の存在または非存在あるいは温度の変化など)に応答してその制御下にある核酸からの増大したレベルの転写を開始させるプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞によって認識される非常に多くのプロモーターがこの分野では十分に知られている。プロモーターは、制限酵素消化により供給源の核酸からプロモーターを除き、単離されたプロモーター配列を融合タンパク質のコード配列とともにベクターに挿入することによって、融合タンパク質をコードする核酸に機能的に連結される。プロモーターは、合成、半合成、(宿主細胞に対して)細胞本来のプロモーター配列または(宿主細胞に対して)異種のプロモーターとすることができ、融合タンパク質の増幅および/または発現を行わせるために使用することができる。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターはこの分野では十分に知られている(例えば、Chang他、(1978)Nature、275:615;Goeddel他、(1979)Nature、281:544;Goeddel、(1980)Nucleic Acids Res.8:4057;欧州特許庁特許出願公開第36,776号;H.de Boer他、(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:21〜25を参照のこと)。そのようなプロモーターのヌクレオチド配列は一般に知られており、それにより、当業者は、何らかの必要な制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを使用して、融合タンパク質をコードするヌクレオチドにプロモーターを機能的に連結させることができる(Siebenlist他、(1980)Cell、20:269を参照のこと)。
【0106】
細菌系において使用されるプロモーターはまた、PBDコード核酸に機能的に連結されているシャイン−ダルガルノ(S.D.)配列を含有する。例示的な転写調節領域またはプロモーターには、細菌の場合、lacプロモーター、ラムダのレフトプロモーターおよびライトプロモーター、trpおよびlacのプロモーター、tacプロモーターなどが含まれる。転写調節領域は、融合された遺伝子の発現時期を調節することができる調節配列をさらに含むことができる(例えば、栄養素または発現産物の増殖培地における存在または非存在、温度など)。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージλPLプロモーター、バクテリオファージλOLオペレーターおよび温度感受性リプレッサーを含む調節配列を使用して温度によって調節することができる。プロモーターの調節は、リプレッサーとオペレーターとの相互作用によって達成される。真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に必要な配列、およびmRNAを安定化させる配列を含有する。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導剤(例えば、メタロチオネインプロモーターに対する亜鉛イオンおよびカドミウムイオン)の存在下で高めることができる。このように、PBD融合タンパク質の発現を制御することができる。発現を制御できることは、例えば、PBD融合タンパク質が宿主細胞に対して致死的である場合には重要であり得る。
【0107】
宿主細胞が酵母である場合、酵母細胞において機能的な転写領域および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば、解糖経路における遺伝子(アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GPD)、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼなど)から、または調節可能な遺伝子(酸性ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼなど)から得ることができる。構成的または誘導的な転写が所望されるかどうか、目的のオープンリーディングフレームと一緒になったプロモーターの特定の効率、強力なプロモーターと誘導的な転写を可能にする異なるプロモーターの制御領域とを結合させることができること、構築の容易さなどに依存して、多数の調節配列のいずれか1つを特定の状況において使用することができる。特に注目されるものは、ガラクトースの存在下で活性化されるプロモーターである。ガラクトースにより誘導され得るプロモーター(GAL1、GAL7およびGAL10)が、酵母における高レベルの調節された発現のために広範囲に利用されている(Lue他、Mol.Cell.Biol.第7巻、3446頁、1987;Johnston、Microbiol.Rev.第51巻、458頁、1987)。GALプロモーターからの転写は、ガラクトースが存在するときには、プロモーター領域に結合して転写を活性化するGAL4タンパク質によって活性化される。ガラクトースが存在しない場合、アンタゴニストのGAL80がGAL4に結合して、GAL4が転写を活性化することを妨げる。ガラクトースの添加により、GAL80がGAL4による活性化を阻害することが妨げられる。
【0108】
翻訳開始コドンATGの周りのヌクレオチド配列は酵母細胞における発現に影響することが見出されている。所望するポリペプチドが酵母において良好に発現しない場合、外因性遺伝子のヌクレオチド配列を、最適な遺伝子発現を得るために効率的な酵母の翻訳開始配列を含むように改変することができる。サッカロミセス(Saccharomyces)における発現の場合、これは、内因性のサッカロミセス遺伝子(好ましくは、ラクターゼ遺伝子などの高発現の遺伝子)に読み枠を合わせて翻訳開始部位を融合することにより、効率的に発現しない遺伝子の部位特異的変異誘発によって行うことができる。終結領域は、開始領域が得られた遺伝子の3’領域に由来し得るか、または異なる遺伝子に由来し得る。非常に多くの終結領域が知られており、同じ属および種ならびに異なる属および種の様々な宿主において申し分ないことが見出されている。終結領域は、通常、何らかの特定の性質のためからではなく、むしろ便宜的に選択される。好ましくは、終結領域は酵母の遺伝子に由来する(特に、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、カンジダ(Candida)またはクルイベロミセス(Kluyveromyces))。2つの哺乳動物遺伝子(χインターフェロンおよびα2インターフェロン)の3’領域もまた、酵母において機能することが知られている。
【0109】
場合により、融合された遺伝子の分泌を規定するシグナル配列(分泌リーダー)を、構造遺伝子の上流に、構造遺伝子と読み枠を合わせて備えることが望ましいことがある。例示的な分泌リーダーには、ペニシリナーゼ、免疫グロブリン、T細胞受容体、外膜タンパク質などの分泌リーダーが含まれる。正しい読み枠で融合することによって、キメラなポリペプチドを培地中に分泌させることができる。
【0110】
融合タンパク質のコード配列を含む構築物は標準的な様々な技術によって宿主細胞に導入することができる。これらの技術には、形質転換、プロトプラスト融合、リポフェクション、トランスフェクション、形質導入、接合、感染、弾道学的衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、スクレイピング、または目的遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法が含まれる。使用される形質転換方法には、酢酸リチウム形質転換(Methods in Enzymology、第194巻、186頁〜187頁、1991)が含まれる。原核生物および真核生物の生物または細胞の遺伝子形質転換に対する様々な方法がこの分野では十分に知られている(例えば、Cohen他、(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)69:2110;Current Protocols in Molecular Biology(上記)を参照のこと)。宿主細胞は、上記の本発明の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いてトランスフェクションすることができ、好ましくは形質転換することができ、そして形質転換された細胞は、プロモーターを誘導するために、あるいは形質転換体を選択するために、あるいは所望するPBDまたはPBD融合タンパク質をコードする遺伝子を増幅するために適するように改変され得る従来の栄養培地で培養することができる。「形質転換」により、核酸が染色体外エレメントとして、または宿主生物のゲノム内への組み込みにより、そのいずれかで複製可能であるように、核酸が生物に導入されることが意味される。
【0111】
対象の宿主は、少なくとも1コピーの発現構築物を有し、そして遺伝子がゲノムに組み込まれるか、増幅されるか、または多数コピーを有する染色体外エレメントに存在するかどうかに依存して2つ以上の発現構築物を有することがある。対象の宿主が酵母である場合、下記の4つの基本的なタイプの酵母プラスミドベクターを使用することができる:酵母組み込みプラスミド(YIp)、酵母複製プラスミド(YRp)、酵母動原体プラスミド(YCp)および酵母エピソームプラスミド(YEp)。YIpは、酵母の複製起点を有しておらず、酵母ゲノムに組み込まれたエレメントとして増殖させなければならない。YRpは、染色体に由来する自律的な複製配列を有し、中程度のコピー数(20〜40)として増殖し、従って、自律的に複製し、不安定に分離するプラスミドである。YCpは、複製起点および動原体配列の両方を有し、低コピー数(10〜20)として増殖し、従って、自律的に複製し、安定に分離するプラスミドである。YEpは、酵母の2μプラスミドに由来する複製起点を有し、高コピー数として増殖し、従って、自律的に複製し、不規則に分離するプラスミドである。酵母におけるプラスミドの存在は、プラスミドに存在するマーカーに対する選択を維持することによって確保され得る。特に注目されるものは、pYES2(Invitrogenから得られるYEpプラスミドで、ウラシルプロトトロフィー(prototrophy)および発現させるためのGAL1ガラクトース誘導プロモーターを提供する)、pRS425−pG1(T.H.Chang博士(オハイオ州立大学、分子遺伝学の準教授)から得られ、構成的なGPDプロモーターを含有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するYEpプラスミド)、およびpYX424(構成的なTP1プロモーターを有し、ロイシンプロトトロフィーを提供するYEpプラスミド;AlberおよびKawasaki(1982)、J.Mol&Appl.Genetics、1:419)の酵母ベクターである。
【0112】
形質転換された宿主細胞は、導入された構築物に含有されるマーカーに対する選択によって同定することができる。あるいは、別個のマーカー構築物を、多くの形質転換技術により多くのDNA分子が宿主細胞に導入されるように、所望する構築物とともに導入することができる。典型的には、形質転換された宿主は、選択培地におけるその生育能について選択される。選択培地には抗生物質を混合してもよく、あるいは選択培地は、形質転換されなかった宿主の生育に必要な因子(栄養素または成長因子など)を有しなくてもよい。そのために導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質耐性をもたらし得るか、または不可欠な成長因子または酵素をコードして、形質転換された宿主で発現したときに選択培地における生育を可能にし得る。形質転換された宿主の選択はまた、発現したマーカータンパク質が直接的または間接的のいずれかで検出され得るときに行うことができる。マーカータンパク質は、単独で、または別のタンパク質との融合体として発現させることができる。マーカータンパク質はその酵素活性によって検出することができる;例えば、β−ガラクトシダーゼは基質X−galを着色産物に変換することができ、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光性産物に変換することができる。マーカータンパク質はその発光特性または改変特性によって検出することができる;例えば、発光オワンクラゲ(Aequorea victoria)の緑色蛍光タンパク質(GFP)は、青色光で照らされたときに蛍光を発する。抗体を使用して、マーカータンパク質または分子標識(例えば、目的タンパク質に存在する分子標識)を検出することができる。マーカータンパク質または標識を発現する細胞は、例えば、視覚的に、または抗体を使用するFACSまたはパンニングなどの技術によって選択することができる。酵母の形質転換体を選択する場合、酵母において機能する任意のマーカーを使用することができる。望ましくは、カナマイシンおよびアミノグリコシドG418に対する耐性が、ウラシル、ロイシン、リシンまたはトリプトファンを含まない培地における生育能と同様に注目される。
【0113】
融合された遺伝子が適切な宿主に導入されると、宿主は、プロモーターを誘導するために、または形質転換体を選択するために、または遺伝子を増幅するために(適するように改変された)従来の栄養培地で生育させて、融合遺伝子を発現させることができる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質を産生させるために使用される原核生物細胞は、Sambrook他(1989)、Bacterial Media in Molecular Cloning(Nolan,C.編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY、A.1〜4頁(これは参考として本明細書中に組み込まれる)に一般的に記載されているような好適な培地で培養することができる。生成物が分泌される場合、栄養培地を回収して、多糖マトリックスに結合させることによって生成物を単離することができる。生成物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を集め、溶解し、そして多糖基質に結合させることによって、生成物を単離および精製することができる。活性なタンパク質を産生させるために、タンパク質をフォールディングさせることが必要になる場合がある。挿入された配列の発現を調節するか、所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞菌株が選ばれる。用語「宿主細胞」は、目的のPBDタンパク質またはPBD融合タンパク質を発現し得るそのような細胞として定義され得る。宿主細胞には、原核生物細胞(細菌)および真核生物細胞(哺乳動物、酵母、昆虫、植物など)が含まれる。タンパク質生成物の修飾(例えば、リン酸化)およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能には重要であると考えられる。種々の宿主細胞は、多くの場合、発現したタンパク質の翻訳後プロセシングに対する特徴的または特異的な機構を有する。適切な細胞系統または宿主系を、発現したPBDタンパク質またはPBD融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実に行うために選ぶことができる。一例として、組換え生成物は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ず、天然型グリコシル化または他のグリコシル化を有する。グリコシル化の量は、部分的には、生成物が産生される生物だけでなく、その特定のペプチドの配列に依存している。大腸菌細胞における生成物の発現は非グリコシル化生成物をもたらし、昆虫細胞における生成物の発現は、一般に、哺乳動物細胞における生成物の発現よりも少ないグリコシル化をもたらす。酵母における発現は過度なグリコシル化をもたらし得る。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが望ましい。発現が真核生物宿主(他、植物または哺乳動物)で行われる場合、構築物はどれも潜在的なグリコシル化部位を含まないことが好ましい。
【0114】
PBD融合タンパク質の産生は原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかで行うことができる。目的とする原核生物細胞には、大腸菌、バチルス属細菌、ラクトバチルス属細菌、シアノバクテリアなどが含まれる。PBD融合タンパク質のクローニングおよび発現のために特に注目される原核生物細胞として、大腸菌BL2(DE3)PLYS株が挙げられる。真核生物細胞には、乳汁分泌動物の細胞などの哺乳動物細胞、ニワトリなどの鳥類の細胞、ならびに昆虫細胞、菌類細胞、植物細胞および藻類細胞を含む遺伝子操作が容易な他の細胞が含まれる。これらの細胞は培養することができ、あるいは動物を含む宿主生物の一部またはすべてとして形成させることができる。ウイルスおよびバクテリオファージもまた、遺伝子移入、細胞ターゲティングおよび選択の場合には特に、PBD融合タンパク質を産生させる際に細胞とともに使用することができる。宿主動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなどが含まれる。これらは、トランス遺伝子発現集団の迅速な拡大のために遺伝子操作およびクローニングを行うことが容易である。動物の場合、遺伝子調節領域を改変することにより、PBD融合タンパク質のコード配列を、標的とするオルガネラ、組織および体液(宿主動物の乳汁など)における発現のために適合させることができる。
宿主微生物の例には、サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、あるいはカンジダ(Candida)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属または他の菌類などの他の酵母(例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、アカパンカビ(Neurospora)属、ペニシリウム(Penicillium)属などの糸状菌類)が含まれる。宿主微生物の望ましい特徴は、例えば、宿主微生物が遺伝子的に十分に特徴付けられ、そして超高密度発酵を使用する生成物の高レベル発現のために使用できるということである。
【0115】
鳥類種および鳥類細胞(ニワトリ、七面鳥、ウズラおよびアヒルなど)においてPBD融合タンパク質を産生させる場合、この分野で知られている手順に従って、PBD融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入することによって遺伝子移入を行うことができる。トランスジェニック動物が所望される場合、胚の多能性幹細胞に、トランス遺伝子をコードするPBD融合タンパク質を有するベクターを導入して、多能性幹細胞を成体動物に発達させることができる(米国特許第5,162,215号;Ono他、(1996)Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3):287〜292;国際特許出願公開WO9612793;国際特許出願公開WO9606160)。ほとんどの場合において、トランス遺伝子は、高レベルのPBD融合タンパク質を発現させるように改変される。トランス遺伝子は、例えば、鳥類細胞において機能する転写調節領域および/または翻訳調節領域(特定の組織および卵部分(卵黄など)において発現を行わせるプロモーターなど)を備えることによって改変することができる。遺伝子の調節領域は、ニワトリ貧血症ウイルスまたはトリ白血病ウイルスまたは鳥類遺伝子(ニワトリのオバルブミン遺伝子など)を含む様々な供給源から得ることができる。
【0116】
昆虫細胞におけるPBD融合タンパク質の産生は、PBD融合タンパク質トランス遺伝子を有するバキュロウイルス発現ベクターを使用して行うことができる。バキュロウイルス発現ベクターは、Clonetechなどのいくつかの市販元から得ることができる。上記に記載される他の発現ベクターの場合と同様に、PBD融合タンパク質トランス遺伝子の発現時期、発現程度および活性を、ポリペプチドのコード配列を特定の使用のために選択された適切な転写調節領域および翻訳調節領域と合わせることによって調節することができる。特に注目されるものは、事前に選択された生育条件のもとで誘導され得るプロモーター領域である。例えば、温度感受性変異および/または代謝応答性変異をトランス遺伝子のコード配列に導入すること、および/またはその調節領域に導入すること、および/またはトランス遺伝子が導入される細胞のゲノムに導入することが、この目的のために使用することができる。
【0117】
形質転換された宿主細胞は、所望する最終結果に適合した適切な条件のもとで生育させられる。培養で生育させられる宿主細胞の場合、条件は、典型的には、最大収量または最も経済的な収量のPBD融合タンパク質を産生させるように最適化される。最適化され得る培地条件には、炭素源、窒素源、基質の添加、添加される基質の最終濃度、添加される基質の形態、好気的生育または嫌気的生育、生育温度、誘導剤、誘導温度、誘導時の生育期、収穫時の生育期、pH、密度、および選択の維持が含まれる。例えば、酵母などの微生物は、好ましくは、目的の選択された培地を使用して生育させられる。そのような培地には、酵母ペプトンブロス(YPD)および最少培地(アミノ酸、酵母窒素基剤および硫酸アンモニウムを含有し、選択に必要な成分(例えば、ウラシル)を含まない)が含まれる。望ましくは、添加される基質は、最初にエタノールに溶解される。必要な場合には、目的とするポリペプチドの発現を、例えば、GALプロモーターからの発現を誘導させるためのガラクトースを含むか、またはガラクトースを添加することによって誘導させることができる。
【0118】
宿主動物の細胞における発現を、同様に、一過的な様式または安定的な様式で達成することができる。導入された構築物の所望する発現レベルを維持するために、一過的な発現を知られている方法(例えば、感染またはリポフェクション)により達成することができ、そして繰り返すことができる(Ebert、PCT国際特許出願公開WO94/05782を参照のこと)。安定的な発現を宿主ゲノムへの構築物の組み込みによって達成することができ、これによりトランスジェニック動物が得られる。構築物は、例えば、受精卵の前核への構築物のマイクロインジェクションによって、あるいはトランスフェクション、レトロウイルス感染または他の技術によって導入することができ、それにより、構築物が、成体動物を形成し得る細胞系統または成体動物に取り込まれ得る細胞系統に導入される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他、(1997)Nature、385:810)。組換えられた卵または胚は代理母に移される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他(上記))。
【0119】
出生後、トランスジェニック動物は、例えば、導入されたマーカー遺伝子(毛の色に対する遺伝子など)の存在によって、あるいは導入された構築物を検出するための、血液サンプル、乳汁サンプルまたは組織サンプルからのPCRまたはサザンブロッティングによって、あるいは発現したタンパク質またはそれから産生される生成物を検出するための免疫学的アッセイまたは酵素学的アッセイによって同定される(米国特許第4873191号;米国特許第5530177号;米国特許第5565362号;米国特許第5366894号;Wilmut他(上記))。得られたトランスジェニック動物は、完全なトランスジェニック体あり得るか、またはトランス遺伝子をその細胞の一部のみに有するモザイク体であり得る。核のある細胞を除核された卵と融合し、その後、代理母に移すことによって達成される哺乳動物クローニングの出現により、導入された構築物を含む「始祖」の動物または細胞を得ることに対する迅速で大規模な産生の可能性がもたらされる。これ以前では、トランス遺伝子を繁殖用の動物の生殖系列に存在させることが必要であった(Wilmut他(上記))。
【0120】
宿主動物における発現は、宿主が飼いならされた動物である場合には特に、ある程度の効率を示す。宿主動物から容易に得ることができる体液(乳汁など)にPBD融合タンパク質を産生させる場合、トランス遺伝子は、雌性宿主の乳腺細胞において発現させることができる。トランス遺伝子は、トランス遺伝子が乳腺細胞に保持されるか、または乳汁中に分泌されるように発現のために適合させて、乳汁に局在化するPBD融合タンパク質を形成させることができる(PCT国際特許出願公開WO95/24488)。発現は、特定の調節配列(ウシのα−ラクトアルブミン、α−カゼイン、β−カゼイン、χ−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリンまたは乳清酸性タンパク質の調節配列など)を使用して乳腺組織における発現のために標的化することができ、そして必要に応じて、1つもしくは2つ以上のイントロンおよび/または分泌シグナル配列を含むことができる(米国特許第5530177号;Rosen、米国特許第5565362号;Clark他、米国特許第5366894号;Garner他、PCT国際特許出願公開WO95/23868)。精製が必要な場合、PBD融合タンパク質は、基質多糖を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製される。
【0121】
本発明を使用する際、多糖構造物は、試薬、温度およびその他の適切な条件のもとで所望の改変を達成するために十分な時間にわたって多糖構造物を十分な量のPBD融合タンパク質と接触させることによってPBD融合タンパク質を使用して改変される。改変の条件は、一般に、Km、Vmaxおよびkcatおよび他の生化学的パラメーター(PBDの至適pHなど)を規定するように最適化される。PBDと基質との相互作用は一般に極めて早い。従って、所望する効果を達成するために、PBD融合タンパク質の様々な濃度、ならびに/あるいは所望する効果を達成するための処理時間および/または処理温度を評価することが必要である。使用される条件は経験的に決定されるが、使用されるPBD融合タンパク質および所望する最終結果の要求に基づく。一例として、エンドグルカナーゼに由来するPBDを含むPBD融合タンパク質に対して典型的な条件には、mMリン酸塩(pH7.0)、一般には、綿などのセルロース繊維の25mgあたり約0.1mg/ml〜10mg/mlのPBD濃度が含まれる。温度は、一般的には約20℃〜37℃であり、好ましくは約25℃である。処理時間は、5分から12時間までの範囲であるが、多糖構造物が損傷を受けない限り、それよりも長い処置を使用することができる。一般には、適するように、混合物は、構造物の均一な処理を容易にするために穏やかに攪拌される。構造物の処理を行った後、構造物は乾燥され、その後、紙または織物などの最終製品を調製するために使用される。あるいは、またはさらに、紙または織物などの最終製品は、上記に列挙された事項に類似する事項を考慮に入れてPBDによって処理される。
【0122】
改変の進行または反応速度のアッセイは、改変処理の途中で形成され得る阻害的な最終生成物を検出するために、そして処理の途中に生成される中間的または最終的な望ましい性質を検出するために使用することができる。例えば、繊維を完全に架橋しないことが望ましい場合がある。むしろ、構造物の不完全な架橋によって存在する、望ましい性質を有する多糖構造物を得るために、例えば、製織のためにあまり剛直でない糸を得るために、反応を中間点で停止させることが望ましい場合がある。多数の客観的な試験が、PBD処理を評価するために当業者には知られており、これには、ヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性が含まれる。
【0123】
達成される多糖構造物の改変のタイプは、少なくも部分的には、結合ドメインに融合されるタンパク質の性質に依存する。PBDによる改変は、多糖の構造物における観測可能(検出可能)な変化として定義される。これには、増大した湿潤強度などの観測可能な改変をもたらす多糖構造物の凝集、疎水性、親水性、濡れ性、表面性状およびその他などの表面性質における変化が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の電気的性質には、表面電荷(陽電荷または陰電荷)および電気伝導度が含まれる。変化させることができる多糖含有材料の化学的性質には、様々な化学的反応性化学基および光化学的反応性化学基を少なくとも多糖含有材料の表面に導入することが含まれる。変化させることができる多糖含有材料の機械的性質には、引張り強度、剪断耐性、耐摩耗性、摩擦係数および弾性が含まれる。一例として、多糖構造物がセルロースである場合、1分子あたり2つ以上のPBDを有する試薬または組成物を使用して、セルロース繊維を架橋することができる。図9a〜図9cには、本発明のCBD連結剤ユニットが多糖のポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる方法がいくつか概略的に示されている。図9aには、第1のポリマー構造ユニットに結合した第1のCBDと、第2のポリマー構造ユニットに結合した第2のCBDとを有するCBD連結剤ユニットが概略的に示されている。柔軟度が大きいリンカーユニットが使用される場合には少なくとも、CBD連結剤ユニットの第1および第2のCBDはともに同じポリマー構造ユニットに結合し得ることが予想されるはずである。図9bには、第1および第2の両方のCBDが1個のポリマー構造ユニットに結合している柔軟なリンカーユニットを有するCBD連結剤ユニットが示されている。図9cには、ポリマー材料の三次元網目構造を形成させるために、複数のポリマー構造ユニットが複数のCBD連結剤ユニットによってどのように架橋されるかが概略的に示されている。このようにして、フィラメント状の多糖(例えば、セルロースフィラメント)の凝集体を形成させることができる。CBD連結剤ユニットを介して架橋されたセルロース材料から組み立てられる材料(紙、綿糸および綿織物(織布および不織布の両方)など)は、ヤング率などの変化した機械的性質を有する。セルロース材料の架橋は、セルロース含有材料を製造する際の様々な段階で行うことができる。例えば、紙製品の場合、架橋は、製紙プロセスにおける様々な段階でセルロース繊維をCBD連結剤ユニット組成物で処理することによって行うことができ、あるいは得られた紙製品をCBD連結剤ユニットで処理することができる。同様に、綿糸または綿織物は、改善された表面性質および/または機械的性質を有する糸または綿織物を得るために、CBD連結剤ユニット組成物で架橋することができる。
【0124】
機能的成分を含むPBD融合タンパク質で多糖構造物または多糖含有材料を処理することによって、様々な新規な物理的性質、電気的性質、化学的性質および機械的性質を有する新規な材料を得ることができる。図8には、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを含むCBD機能化成分が概略的に示されている。機能的成分は多数の化学種のいずれかであり得る。これには、濡れ性を低下させて、水分および水に対する材料の増大した耐性をもたらす疎水性アミノ酸の配列またはペプチドあるいは脂肪酸誘導体などの疎水性成分;親水性成分;電気的荷電成分またはイオン性成分;ケイ素結合性成分;ポリマー結合性成分;金属、または金属基質に対する結合をもたらす金属結合性成分(金属結合性成分の例には、細菌シドロホア、メタロチオネインおよびメタロチオネイン様タンパク質(Slice他、(1990)J.Biol.Chem.265:256〜263)、フェリチン(Spanner他、(1995)Bone17:161〜165)、ならびに設計された金属結合性タンパク質(例えば、Pessi他、(1993)Nature、362:367〜369)が含まれる);化学的反応性基;光化学的反応性基;またはチオール基が含まれる。本発明の化学的反応性基には、例えば、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジド、エポキシドまたはカルボジイミドが含まれ得る。本発明の光化学的反応性基には、フェニルアジドが含まれ得る。
【0125】
同様に、疎水性成分(例えば、疎水性ポリペプチド、長鎖の炭化水素または炭化水素誘導体)を有する組成物を使用して、セルロース繊維またはセルロース繊維から作製された製造物に疎水性を付与することができる。疎水性は、改変されたセルロース繊維から組み立てられた材料の低下した濡れ性をもたらし、そして間接的には、水の存在下における材料の増大した耐久性をもたらす。一方で、セルロース繊維の架橋は、直接的には、材料の増大した湿潤強度をもたらす。簡略化するために、紙または他のセルロース含有材料の強度に対する本明細書中での参照は、そのような材料の湿潤強度を含むように限定的には使用されない。
【0126】
本発明のプロセスを使用して改変することができる多糖材料のタイプは様々である。例には、木材製品、セルロース繊維に由来する紙製品、および綿またはラミーに由来する製品(糸および織物など)が含まれる。用語「紙」には、繊維状のセルロース材料およびセルロース材料と合成材料との組合せから作製されるシート様の塊および成形された製造物が含まれる。紙の例には、ティッシュペーパー、事務用紙、新聞印刷用紙、波形加工用紙、ペーパータオル、ラミネート紙および板紙が含まれる。用語「多糖材料」または用語「多糖含有材料」は、セルロースまたはキチンなどの少なくとも1つの多糖(一般には、実質的な量の少なくとも1つの多糖)を含む材料をいう。
【0127】
CBD含有組成物はまた、製紙プロセスにおいて適用することができる。本発明により、CBD含有組成物は、製紙プロセスの種々の段階でセルロース材料を処理するために使用することができる。例えば、処理は、成形段階またはサイズ剤処理段階で行うことができる。製紙の成形段階における処理は、CBD架橋組成物(例えば、CBD連結剤ユニット組成物またはセルロース架橋(融合)タンパク質(CCP))をセルロース繊維の懸濁物に加えることによって行うことができる。好ましくは、セルロース材料のCBD含有組成物による処理は、成形段階時またはその前に行われる。機能的成分は、CBD連結剤ユニットを得るためにリンカーユニットをCBDに結合させることに関して本明細書中上記に記載される方法に従ってCBDに結合(attach)、結合(conjugate)または連結することができる(図4a〜4g、図5a〜5b)(例えば、米国特許第5,962,289号もまた参照のこと)。
【0128】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、下記の実施例を検討したときに当業者には明らかになる。下記の実施例は、限定であることを意図するものではない。さらに、本明細書中上記に記載され、そして下記の請求項において特許請求されている本発明の様々な実施形態および態様はそれぞれ、下記の実施例において実験的に裏付けられている。
【0129】
実施例
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明とともに、非限定的な様式で本発明を例示する。
【0130】
一般に、本明細書中で使用されている用語法、および本発明において利用される実験室手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学技術および組換えDNA技術を含む。そのような技術は文献に詳しく説明されている。例えば、下記を参照のこと:「Molecular Cloning:A laboratory Manual」、Sambrook他(1989);「Current Protocols in Molecular Biology」、第I巻〜第III巻、Ausubel,R.M.編(1994);Ausubel他、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons、Baltimore、Maryland(1989);Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」、John Wiley&Sons、New York(1988);Watson他、「Recombinant DNA」、Scientific American Books、New York;Birren他(編)、「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」、第1巻〜第4巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1998);米国特許第4666828号、同第4683202号、同第4801531号、同第5192659号および同第5272057号に示される方法論;「Cell Biology:A Laboratory Handbook」、第I巻〜第III巻、Cellis,J.E.編(1994);Freshneyによる「Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique」、Wiley−Liss、N.Y.(1994)、第3版;「Current Protocols in Immunology」、第I巻〜第III巻、Coligan J.E.編(1994);Stites他(編)、「Basic and Clinical Immunology」(第8版)、Appleton&Lange、Norwalk、CT(1994);MishellおよびShiigi(編)、「Selected Methods in Cellular Immunology」、W.H.Freeman and Co.、New York(1980);利用可能な免疫アッセイは特許および科学的文献に詳細に記載されている、例えば、米国特許第3791932号、同第3839153号、同第3850752号、同第3850578号、同第3853987号、同第3867517号、同第3879262号、同第3901654号、同第3935074号、同第3984533号、同第3996345号、同第4034074号、同第4098876号、同第4879219号、同第5011771号および同第5281521号を参照のこと;「Oligonucleotide Synthesis」、Gait,M.J.編(1984);「Nucleic Acid Hybridization」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編(1985);「Transcription and Translation」、Hames,B.D.およびHiggins S.J.編(1984);「Animal Cell Culture」、Freshney,R.I.編(1986);「Immobilized Cells and Enzymes」、IRL Press(1986);「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal,B.(1984)および「Methods in Enzymology」、第1−317巻、Academic Press;「PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications」、Academic Press、San Diego、CA(1990);Marshak他、「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」、CSHL Press(1996)。これらはすべて、全体が本明細書中に示されているかのように参考として組み込まれる。他の一般的な参考文献が本明細書中に示されている。それらにおける手順は、この分野では十分に知られていると考えられ、そして読者の便宜のために示されている。それらに含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【0131】
生物学的材料の寄託
大腸菌pET−CBDは、American Type Culture Collection(ATCC)(10801 University Boulevard、M、VA20110−2209)に1993年4月12に寄託され、アクセション番号75444が割り当てられている。
【0132】
実施例1
CBDおよびCBD融合タンパク質の構築および発現
様々なCBDおよびCBD融合タンパク質の構築および発現を開示する下記の米国特許の内容は参考として本明細書中に組み込まれる:米国特許第5496934号、米国特許第5670623号、米国特許第5719044号、米国特許第5738984号、米国特許第5837814号および米国特許第5856201号(すべて、Shoseyov他);米国特許第5137819号、米国特許第5202247号、米国特許第5340731号、米国特許第5928917号および米国特許第5962289(すべて、Kilburn他);米国特許第5821358号(Gilkes他)。
【0133】
1.1 C.cellulovoransのセルロース結合ドメイン(CBDclos)の構築および発現:
C.cellulovoransのセルロース結合タンパク質Aのセルロース結合ドメインの構築およびpET−CBDプラスミド(図1a〜1cを参照のこと)を有する大腸菌BL21(DE3)におけるその過剰発現はM.A.Goldstein他(1993)(J.Bacteriol.175:5762〜5768)により記載されている。米国特許第5496934号および米国特許第5719044号もまた参照のこと(これらはともに、その全体が参考として本明細書中に組み込まれる)。
【0134】
1.2 CCP−180の構築および発現:
pET−CCP−180(図2a〜2e)を、pET−CBD(図1a〜1c、M.A.Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768)およびpET−CBD−180(図1d〜1g、E.Shpigel他、(1999)Biotech.Bioeng.65:17〜23から構築した[pET−CBDおよびpET−CBD−180をNcoIおよびBamHIで消化し、得られたDNAフラグメントをそれぞれ1.2%アガロースゲルおよび0.6%アガロースで分離した。pET−CBDの500bpフラグメントおよびpET−CBD−180の5Kbフラグメントを、QiaexDNAゲル抽出キット(Qiagen,Inc.、California)を使用してゲルから抽出して、この2つのフラグメントを連結した。連結混合物を大腸菌XL1−blueコンピテント細胞に形質転換し、その後、発現宿主の大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。読み枠が一致して融合された2つのCBDを含有する陽性クローンをpET−CCP−180と名付け、配列決定によって確認した。CCP−180の発現を、CBDclosについて、M.A.Goldstein他、(1993)J.Bacteriol.175:5762〜5768によって記載されているように行った。
【0135】
1.3 プロテインA−CBDのクローニングおよび発現:
CBDを、テンプレートとしてのcbpA遺伝子(Shoseyov他、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:3483〜3487);EcoRI部位を含むプライマーA(N端プライマー):5’−GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT−3’(配列番号11);およびBamHI部位が続く停止コドンを含むプライマーB(C端プライマー):5’−GGGGGATCCTATGGTGCT−3’(配列番号12)を使用してPCR増幅した。これらのプライマーは、プロテインA遺伝子のC末端に読み枠を合わせて融合される500bpのDNAフラグメントのプラスミドpRIT2へのEcoRI/BamHIの強制的クローニングを可能にするように設計された。PCR条件は、Innis他、PCR Protocols:A Guide to Methods&Applications(Innis他編、Academic Press、San Diego、1990)に記載されている通りであったが、下記の改変を行った:2ngのテンプレートDNAおよび1mMのMgCl2を反応混合物において使用した。反応をプログラム可能なサーマルコントローラー(M&J Research,Inc.)を使用して行った。標準的なDNA操作を、Sambrook他編、(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)に従って行った。
【0136】
PCR増幅された生成物をEcoRIおよびBamHIで消化し、予想される500bpのDNAフラグメントを、Qiaexゲル抽出キット(Qiagen,Inc.)を使用して1.5%アガロースゲルから単離した。EcoRI/BamHIフラグメントを、EcoRI/BamHIで事前に消化されたpRIT2に、T4リガーゼを使用して連結した。連結混合物を使用して、大腸菌菌株2097コンピテント細胞を形質転換し、そして形質転換されたコロニーを、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天平板で選択した。目的のDNAインサートを含有する成功した構築物をpRIT2−CBDと名付けた。
【0137】
ProtA−CBDを、T7により媒介される過剰発現ベクターpET3d(F.Studier他、(1986)J.Mol.Biol.189:113〜130)にクローン化した。ProtA−CBDを、下記のプライマーを使用し、テンプレートとしてpRIT2−CBDを使用してPCR増幅した:上記に記載されるC末端プライマー(すなわち、5’−GGGGGATCCTATGGTGCT−3’、配列番号12);およびNcoI部位内に開始部位を含むN末端プライマー:5’−GGGGGGTACCATGGAACAACGC−3’(配列番号13)。PCR産物をNcoIで部分消化した。回収されたDNAをBamHIで消化し、1.3KbのDNAフラグメントをpET3dにクローン化した。連結混合物を使用して、大腸菌XL1−Blueコンピテント細胞を形質転換し、形質転換されたコロニーを、100mg/Lのアンピシリンを含有するLB寒天平板で選択した。DNAインサートを含有する成功した構築物をpET−ProtA−CBDと名付けた(図3a〜3g)。pET−ProtA−CBDを大腸菌BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換した。融合タンパク質の発現を、Nilsson他、(1985)EMBO J.4:1075〜1080によって記載されるように行った。50mg/Lのアンピシリンが補充され、そしてpRIT2−CBDを含有する大腸菌2097の一晩培養物の400μlが接種された40mL容量のLBにおいて、すべての細胞を振とうフラスコにおいて250rpmで生育させた。培養物を、0.4のO.D.600nmが得られるまで30℃の温度で生育させた。その後、温度を42℃に上げて45分間保ち、その後、37℃に下げてさらに2時間保った。
【0138】
ProtA−CBDの過剰発現が、pET−ProtA−CBDを有する大腸菌BL21(DE3)で得られた。接種物を、50μg/mlのアンピシリンを含有するM9最少培地(0.65 Na2HPO4、0.3%KH2PO4、0.255 NaCl、0.5%NH4Cl、20%グルコース、2mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2、および1mMのチアミン−HCl)で細胞を一晩生育させることによって調製した。接種物を、100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(1.2%バクト−トリプトン、2.4%バクト−酵母抽出物、0.4%(v/v)グリセロール、0.17MのKH2PO4、および0.72MのK2HPO4)で1:50に希釈した後、1.5のO.D.600nmになるまで細胞を37℃で生育させ、その後、0.5mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えた。細胞を37℃でさらに4時間生育させた。細胞を、2,000gで10分間の遠心分離によって集めた。
【0139】
1.4 ProtA−CBDの精製:
細胞を、50mMのTris/HCl、10mMのEDTA(pH8)に0.1g/mlの濃度で懸濁して、実験室用のRANNIE高圧ホモジナイザー(MINI/LABタイプ8.30H)で破壊した。懸濁物を遠心分離し、タンパク質濃度が5mg/mlである1リットルの上清をセルロース(アビセル200、Sigma)カラム(2.6x32cm)に加えた。カラムはPBS(15mMリン酸塩緩衝液、150mMのNaCl、3mMのKCl、pH7.4)で平衡化された。280nmの吸光度が0.05未満になるまで、カラムを5ml/分の流速で洗浄した。ProtA−CBDを50mMのTris/NaOH溶液(pH12.5)で溶出した。溶出されたProtA−CBDをHClで直ちにpH8にして、凍結乾燥した。総大腸菌タンパク質(セルロースカラムに適用する前)、およびセルロースカラムから溶出したピーク(ProtA−CBD)を、Laemmli(U.K.Laemmli、(1970)Nature、227:680〜685)に従って12.5%SDS−PAGEで分析した。ProtA−CBDのピークは、約45kDで単一バンドを示した。
【0140】
実施例2
処理(CBD改変)材料および未処理材料の機械的性質の測定
機械的性質を万能試験機(図11、Instron、High Wycombe、英国)Interfaceタイプ:1011シリーズを使用して測定した。サンプル速度:10pts/秒。クロスヘッド速度:5mm/分。すべての測定値は23℃および65%相対湿度で得られた。
【0141】
2.1 ヤング率:
縦弾性係数(すなわち、ヤング率)は材料の重要な性質である。ヤング率は、大ざっぱには、材料を不可逆的に伸長させない比較的小さい力を使用する弾性的な方法で材料を伸ばすために必要な力として定義することができる。
【0142】
2.2 紙の処理:
ティッシュペーパーの長方形片(大きさ:45mmx10mmx0.1mm)を、20mMのTris塩基(pH7)における、CBDclos、CCP、ProtA−CBD、Ab−ProtA−CBDの各溶液(濃度がそれぞれ2.5mg/mlおよび2.0mg/ml)に10分間浸すことによって処理した。コントロール処理は、20mMのTris塩基(pH7)の溶液に同様に10分間浸すことからなった。浸漬後、処理片およびコントロール片を液体から取り出して、真空下で2日間乾燥した。
【0143】
2.3 紙処理の結果:
2.3.1 ヤング率:
コントロール紙、CBDclos処理サンプル紙およびCCP−180処理サンプルに対するヤング率の値を図10aに示す。CBDで処理された紙は、コントロール(未処理)紙のヤング率よりも著しく大きいヤング率を有した。CCPで処理された紙は、CBD処理紙のヤング率よりもさらに大きいヤング率を有した。これらの結果は、CBDまたはCCPによる紙の処理は紙の少なくとも1つの機械的性質を変えることを示している。より詳細には、CBDまたはCCPのいずれかによる紙の処理は、未処理の紙と比較した場合、処理された紙の(ヤング率の値によって測定される)引張り強度を増大させた。
【0144】
2.3.2 最大負荷時のひずみ:
紙サンプルのCBDclos処理およびCCP−180処理に対する最大負荷時のひずみを示す結果を図10bに示す。CBD処理またはCCP処理はいずれも、コントロールの値と比較した場合、最大負荷時のひずみにおける実質的な変化を生じさせなかった。これらの結果は、CBDまたはCCPによる紙の処理はその弾性を著しく変化させなかったことを示している。
【0145】
2.3.3 破壊到達エネルギー:
CBDまたはCCP−180で処理された紙サンプルに対する破壊到達エネルギーを示す結果を図10cに示す。CBDで処理された紙の破壊到達エネルギーは、コントロールの破壊到達エネルギーと実質的に同じであった。しかし、架橋タンパク質のCCP−180で処理された紙は、コントロールと比較した場合、破壊到達エネルギーが著しく増大したことを示した。
【0146】
2.3.4 靱性:
CBDおよびCCPで処理された紙サンプルに対する靱性を示す結果を図10dに示す。CBDで処理された紙の靱性はコントロールの靱性と実質的に同じであった。しかし、CCPで処理された紙は、再度ではあるが、コントロールと比較した場合、靱性が著しく増大したことを示した。
【0147】
2.4 糸の処理:
この研究で使用された綿糸は、低いT.P.U(1インチあたりのターン数)を有する100%グレーコットン二重糸繊維(34/2)であった。糸の直径は0.5mmであり、長さあたりの重量は0.8mg/cmであった。それぞれの処理において、糸サンプルを、この分野で知られているタイプの特別仕様の糸処理装置(YTA)を用いてタンパク質溶液に浸漬した。この糸処理装置は図11に概略的に示されている。装置は、フィーダーホイール、回収ホイール、第1浴A、第2浴B、および回収ホイールとかみ合う動力部を含む。フィーダーホイールおよび回収ホイールは相互に交換可能であり、それにより、糸を浴Aおよび浴Bに再び通すことができる。動力部は様々な選択された速度で運転することができ、それにより、糸サンプルの浸漬時間を決定することができる。糸の長さはフィーダーホイールと回収ホイールとの間で関係し得るし、そして糸は、浴Aおよび浴Bに含有される液体に糸を通すことによってフィーダーホイールから回収ホイールに移動させることができる。このようにして、糸を1つの液体(両方の浴に存在する)または2つの異なる液体に特定の時間にわたって浸けることができる。
【0148】
ある長さの綿糸(3m〜4m)がYTAのフィーダーホイールに巻き付けられ、糸の一端が回収ホイールに接続され、そして糸が動力部によって浴Aおよび浴Bを通って進められた。糸の浸漬継続時間は約45秒であった。
【0149】
上記に記載される綿糸の処理は下記の通りであった:
(i)CCP−180による処理:糸繊維をCCP−180の溶液(20mMのTris塩基(pH8)での1mg/ml)に浸けた(浴A)。
(ii)プロテインA−CBD(CBD−PA)による処理:糸繊維をCBD−PA溶液(20mMのTris塩基(pH8)での0.75mg/ml)に浸け(浴A)、その後、1XTBSで洗浄した(浴B)(45秒の浸漬時間)。
(iii)プロテインA−CBDおよび抗体による二重処理;糸繊維をCBD−PA溶液(20mMのTris塩基(pH8)での0.75mg/ml)に浸け(浴A)、そして1XTBSで洗浄した(浴B)(45秒の浸漬時間)。その後、回収ホイールをフィーダーホイールと交換し、糸を抗血清溶液(0.75mg/mlのIgG)に浸け(浴A)、そして1XTBSで洗浄した(浴B)。
(iv)コントロール:糸繊維を20mMのTris塩基(pH8)に45秒間浸けた(浴A)。
【0150】
処理後、3つの処理されたサンプルすべておよびコントロールを室温で数時間乾燥した。
【0151】
2.5 糸処理の結果:
2.5.1 ヤング率:
コントロール糸、CCP−180処理サンプル糸、プロテインA−CBD処理サンプル糸およびAb−プロテインA−CBD処理サンプル糸に対するヤング率の値を図12aに示す。CCP−180およびAb−プロテインA−CBDで処理された糸は、コントロール(未処理)糸の値よりも著しく大きいヤング率の値を有した。これらのデータは、Ab−プロテインA−CBDおよびCCPによる糸の処理により、コントロールと比較した場合、処理された糸の(ヤング率の値によって測定される)引張り強度が増大したことを示している。興味深いことに、CBD−PAで処理された糸は、コントロール糸の値よりもはるかに小さいヤング率の値を有した。理論によって限定されることを意図しないが、CBD−PAで処理された糸について低下したヤング率に対する考えられる説明は、CBD−PAによりセルロース繊維がゆるむことである(例えば、米国特許第5,821,358号(その内容は参考として本明細書中に組み込まれる)を参照のこと)。
【0152】
2.5.2 最大負荷時のひずみ:
CCP−180、CBD−PAおよびCBD−PA−Abで処理された糸サンプルに対する最大負荷時のひずみを示す結果を図12bに示す。CCP−180またはCBD−PA−Abのいずれかで処理された糸は、コントロールと比較した場合、最大負荷時のひずみのより小さい値を有した。従って、このことは、コントロールと比較した場合、これらの処理により、糸があまり弾性的にならなかったことを示している。CBD−PAで処理された糸は、コントロールの最大負荷時のひずみと類似する最大負荷時のひずみを有した。
【0153】
実施例3
材料の機能化
3.1 重金属種を液体から除くためのフィルター媒体の機能化:
CBD機能的成分(例えば、図9a〜9cを参照のこと)を、重金属に対する親和性を有する機能的成分(金属結合性タンパク質など)にCBDを結合させることによって調製する。セルロース材料(綿繊維など)を含む基質を、CBD機能的成分のCBD成分が基質に結合するような条件(pH、温度、イオン強度など)のもとでCBD機能的成分で処理し、それにより、基質が、金属結合性の基質またはフィルター媒体をもたらす金属結合性の機能的成分によって機能化される。過度なレベルの重金属を含有する液体の流れが金属結合性のフィルター媒体に通され、それにより、液体流における重金属の濃度が非毒性レベルにまで大きく低下させられる。
【0154】
3.2 濡れ性を低下させた包装紙製品を製造するためのセルロース繊維の機能化:
CBD機能的成分を、疎水性の機能的成分にCBDを結合させることによって調製する。製紙に好適なセルロース繊維を、CBD機能的成分のCBD成分がセルロース繊維に結合して、疎水性成分がそれに結合しているセルロース繊維が得られるような条件(pH、温度、イオン強度)のもとでCBD疎水性機能的成分で処理する。処理されたセルロース繊維から製造された紙は疎水性であり、耐水性である。
【0155】
代わりの例では、未処理(非機能化)のセルロース繊維から製造された紙が、紙を乾燥する前またはその後で、CBDに結合した疎水性成分で機能化される。CBD疎水性機能的成分で処理された紙は疎水性であり、耐水性である。
【0156】
3.3 濡れ性を増大させたティッシュペーパーを製造するためのセルロース繊維の機能化:
CBD機能的成分を、親水性の機能的成分にCBDを結合させることによって調製する。ティッシュペーパーを、製紙プロセスの第1または第2の乾燥段階の前またはその後のいずれかで、CBD親水性機能的成分で処理(機能化)する。CBD親水性機能的成分で処理されたティッシュペーパーは親水性であり、水および水性液体の増大した吸収を示す。
【0157】
実施例4
Sタンパク質−CBD−Sペプチド(SSC)の発現
図13は、SCSを大腸菌において発現させた結果を示す。IPTGで誘導される前の大腸菌のタンパク質がレーン2に示され、IPTGで誘導された後の大腸菌の総タンパク質がレーン3に示され、これに対して、SCSタンパク質を含有する封入体がレーン4に示されている。
【0158】
実施例5
予め成形された紙のCBD、CCPまたはSCSによる処理:
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。CBDまたはCCPによるワットマン紙の処理は、試験したすべての濃度において、ヤング率が増大したことに留意すること。
【0159】
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示している。2.5mg/mlの濃度でCCPを使用することにより、破壊到達エネルギーが約30%増大したことに留意すること。さらに、SCSによる処理は、試験したすべての濃度において、破壊到達エネルギーが増大した。
【0160】
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示している。2.5mg/mlの濃度でCCPを使用することにより、靱性が約40%増大したことに留意すること。さらに、SCSによる処理は、試験したすべての濃度において、靱性が増大した。
【0161】
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示している。試験したすべての処理により、最大負荷時の応力が増大したことに留意すること。最も著しい効果が、2.5mg/mlの濃度のCCPで得られた。最大負荷時の応力が増大することにより、紙の強度が増大していることが明らかにされる。
【0162】
もう一組の実験において、予め成形されたワットマン紙に対するCBDおよびCCPの影響を明らかにした。
【0163】
ワットマン紙No.1の長方形片(40x10mm、0.18mm厚)(Whatman、Maidstone、英国)を2.5mg/mlのCBDまたはCCPを含有する溶液(20mM Tris塩基、pH7)に10分間浸けた。その後、サンプルを65%の相対湿度において23℃で24時間乾燥した。紙の最終水分含有量は3.2%であった。機械的性質を、紙および板紙の引張り特性に関する国際的な標準試験法(ISO1924−4)に従って評価した。処理された紙の引張り試験を、Instron万能試験装置(UTM)モデル1011(High Wycombe、英国)を引張りモードで使用して行った。長方形の紙を、引張り実験中にわたって正しくつかむことを可能にする上部引張りグリップおよび下部引張りグリップ(ねじ作動型グリップ、Instron Corp.、Canton、MA)に入れた。すべての測定値は、23℃、65%相対湿度、および20mm/分の一定した変形速度で得られた。測定された引張り特性には、破壊時応力、破壊時ひずみ、破壊点までの伸び、およびエネルギー吸収が含まれた。すべての計算を、Hayden,W.、Moffatt,W.G.&Wulff,J.、Mechanical Behavior、1〜22(Johan Wiley&Sons,Inc.、N.Y.、1956年);Dufresne,A.、Cavaille,J.Y.&Vignon,M.R.、テンサイのセルロース微小細繊維から調製されたシートの物理的挙動、J.Appl.Polym.Sci.64、1185〜1194(1996)に従って行った。
【0164】
応力(σ)は式1に従って計算された:
σ=F/S (1)
式中、Fは、加えられた負荷であり、Sは断面積である。Sは、サンプルの総容量が一定であり続けると仮定することによって求められる。従って、
S=S0xl0/l (2)
式中、S0は、時間0での断面積である。ひずみ(ε)は、下記の式によって計算することができる:
ε=ln(l/l0) (3)
式中、lおよびl0は、それぞれ、試験中の長さおよび時間0での長さである。データは、応力対ひずみ曲線をプロットすることができ、ヤング率(E)の計算を可能にする:
E=Δσ/Δε (4)
【0165】
下記に報告されている値は、少なくとも15回の測定の平均である。
【0166】
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示している。加えられた負荷のもとでの処理された紙の変形挙動を応力−ひずみ曲線から推定することができる。ひずみが0.02までは、応力とひずみとの直線的な関係が認められた。しかし、ひずみが0.02よりも大きい場合、直線的な関係は見出されなかった。引張り応力がコントロールからCBDまで、そしてCCPまで、それぞれ、増大していることが図18から明かである。CCPで処理された紙の引張り強度の値は、未処理の紙よりも約40%大きく、そしてCBDで処理された紙よりも14%大きかった。CBDで処理された紙の強度は、未処理の紙の強度よりも約25%大きかった。両方の処理において、違いは統計学的に有意であった(表6)。
表 6
* ヤング率は3%の変形において計算した。異なる上付き文字を伴う列の値はp=0.01で有意に異なる。
【0167】
紙破壊ひずみの変化もまた重要である。CCPで処理された紙において、破壊までのひずみは、未処理の紙に対して約50%増大した。CBDの作用は、あまり大きくなく、12%の増大にすぎなかった。CBDまたはCCPで紙を処理することにより、脆さが低下した紙が得られた。処理された紙のヤング率は、(変形が3%までは直線的である)応力−ひずみ曲線の初期の傾きから得られ、表6にまとめられている。CCPで紙を処理することにより、それらのヤング率は17%増大したが、CBD処理は7.5%の増大をもたらしただけであった。エネルギー吸収は、応力−ひずみ曲線下の面積を計算することによって求められ、その結果が表6にまとめられている。引張り強度に対するデータにおいて認められた傾向はエネルギー吸収について当てはまった。しかし、その大きさはより大きかった。CCPで処理された紙のエネルギー吸収は、コントロールのエネルギー吸収よりも約100%大きかったが、CBDで処理された紙のエネルギー吸収は23%大きいだけであった。CCPで処理された紙の値は、CBDで処理されたその対応物の値よりも約64%大きかった。すべての試験されたパラメーターにおいて、CCPの作用は統計学的に有意であったが、これに対して、CBDによる処理は、破壊時応力およびエネルギー吸収についてだけ統計学的な有意をもたらした(表6)。
【0168】
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。蒸留水(10μl)を処理された紙にピペットで置き、完全に吸収されるまでの時間を秒単位で測定した。水の吸収はまた、光学的接触角度計CAM2000(KSV Instruments、Helsinki、フィンランド)を使用して可視化された。1滴の水を紙サンプルに滴下し、写真を20msの経時露出で撮影した。最初のフレームは、水が紙に接触した25ms後に撮影された。未処理の紙では、吸収時間は1秒未満であった。CBD処理紙およびCCP処理紙の水吸収時間は、タンパク質の量が増大するととも増大した。CCPが2.5mg/mlの濃度で適用された場合、水吸収時間は、同じ濃度のCBDで処理された紙の場合よりも2桁大きく(CBDの場合の5秒に対してCCPの場合の580秒)、そして未処理紙よりも少なくとも4桁大きかった(コントロールの場合の1秒未満に対してCCPの場合の580秒)。
【0169】
光学的接触角度計(CAM)を使用して、CCP処理紙に滴下された水の動力学を視覚化した。図20(写真F)は、25ms後の未処理紙について水滴の接触を例示する。水が、接触後、直ちに紙に吸収されていることが明かである。図20(写真A〜E)は、経過時間に対するCCP処理紙による滴下された水の吸収をさらに例示する。最初の2つのフレームにおいて、吸収は検出されず、接触角は>90oで維持された。4分後に、紙への吸収が認められただけであった。8分後でさえ、水は紙によって完全に吸収されなかった。紙への完全な吸収は10分後に観測されただけであった(図19)。
【0170】
実施例6
製紙プロセスの成形工程に先立つ微細セルロース繊維の架橋
CBD連結剤ユニット組成物またはCBD連結剤ユニット試薬を、少なくとも2つのCBDをリンカーユニットと連結することによって調製する。成形用織物(フィルター)を通過し得る相当量の微細なセルロース繊維を含むセルロース繊維の懸濁物を、成形用織物に懸濁物を通過させる前にCBD連結剤ユニット組成物で処理する。CBD連結剤ユニット組成物のCBD連結剤ユニットは微細なセルロース繊維と架橋して、セルロース繊維の三次元凝集体を多数形成する。処理された懸濁物を成形用織物に通した後、セルロース繊維の三次元凝集体はろ紙によって保持され、それにより、原料(セルロース繊維)の回収を大きく高めることができる。
【0171】
上記の結果は、二重または二量体のPBDを含むPBD融合タンパク質(例えば、2つのCBDの融合産物、例えば、セルロース架橋タンパク質(CCP))、CBDとプロテインAとの融合産物、およびSペプチド−CBD−Sタンパク質融合体が、多糖構造物を改変するために調製および使用され得ることを明らかにしている。
【0172】
異なる様々な実施形態に関連して明確化のために記載されている本発明のいくつかの特徴はまた1つの実施形態において組合せられてもたらされ得ることが理解される。逆に、1つの実施形態に関連して簡潔化のために記載されている本発明の様々な特徴はまた別々にもたらされ得るか、または任意の好適な部分的な組合せで提供され得る。
【0173】
本発明はその特定の実施形態とともに記載されているが、多くの代替、改変および変化が当業者には明かであることは明白である。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替、改変および変化を包含するものとする。本明細書中において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参考として本明細書中に組み込まれることを具体的かつ個々に示されているのと同じ程度にその全体が参考として本明細書中に組み込まれる。さらに、本明細書中における何らかの参考の引用および同定は、そのような参照が本発明に対する先行技術として利用できることの許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1aは、pET−CBDプラスミドの概略図である。
図1b〜1cは、CBDclosのヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
図1dは、pET−CBD−180の概略図である。
図1e〜1gは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCBD−180のヌクレオチド配列(配列番号3)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図2】
図2aは、1コピーのCBD−180と、それに読み枠を合わせて融合させた1つのCBDとを含むpET−CCP−180の概略図である。
図2b〜2eは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位とともにCCP(セルロース架橋タンパク)のヌクレオチド配列(配列番号5)およびアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図3】
図3aは、pET−ProtA−CBDの概略図である。
図3b〜3gは、ProtA−CBDのヌクレオチド配列(配列番号7)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
【図4】
図4aは、pET29−Spep−CBD−Sprotの概略図である。
図4b〜4gは、Spep−CBD−Sprotのヌクレオチド配列(配列番号9)およびアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図5】
図5aは、1分子あたり2つのセルロース結合ドメインを有するセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
図5bは、1つのセルロース結合ドメインが第1のポリマー構造ユニットに結合し、第2のセルロース結合ドメインが第2のポリマー構造ユニットに結合している図5aのセルロース架橋タンパク質を概略的に示す。
【図6】
図6は、一般的なCBD連結剤ユニットを概略的に示す。
【図7】
図7a〜7cはそれぞれ、CBD連結剤ユニットの様々な実施形態を概略的に示す。図7aは、それぞれがCBDに結合している1対のデンプン結合ドメインを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDと、両方のデンプン結合ドメインに結合しているデンプン成分とを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7bは、それぞれが隣接するCBDにJUN/FOS架橋を介して結合している複数のCBDを含むリンカーユニットにより連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。図7cは、大きなタンパク質成分により連結されている1対の末端CBDを有するCBD連結剤ユニットを示す。
【図8】
図8は、少なくとも1つのCBDと、それに結合した機能的成分(FM)とを有するCBD機能的成分(CBDC)を概略的に示す。
【図9】
図9a〜9cは、CBD連結剤ユニットがポリマー構造ユニットと相互作用して、それに結合させることができる様々な方法を概略的に示す。
【図10】
図10a〜10dは、コントロール紙片、CBD処理紙片およびCCP処理紙片に対するヤング率、最大負荷時のひずみ、破壊到達エネルギーおよび靱性のそれぞれの棒グラフである。
【図11】
図11は、試験配合物で糸を処理するために使用される糸コーティング装置を概略的に示す。
【図12】
図12a〜12bは、コントロール糸、CCP処理糸、ProtA−CBD処理糸およびAb−ProtA−CBD処理糸に対するヤング率および最大負荷時のひずみのそれぞれの棒グラフである。
【図13】
図13は、大腸菌においてSタンパク質−CBD−Sペプチド(SCS)を発現させた結果の写真を示す。
【図14】
図14は、CBD、CCPまたはSCSでワットマン紙を処理した結果のヤング率マップを示す。
【図15】
図15は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の破壊到達エネルギーを示す。
【図16】
図16は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の靱性試験の結果を示す。
【図17】
図17は、CBD処理ワットマン紙、CCP処理ワットマン紙およびSCS処理ワットマン紙の最大負荷時の応力を示す。
【図18】
図18は、CBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の典型的な応力対ひずみ曲線を示す。
【図19】
図19は、種々の濃度のCBDまたはCCPで処理された、予め成形されたワットマン紙の水吸収時間を示す。
【図20】
図20は、CCPで処理された、予め成形されたワットマン紙に対する水吸収の経時露出写真を示す。
Claims (105)
- 少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメイン含有組成物との接触を、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法。
- 多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前に行われる、請求項1に記載の方法。
- 多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する途中において行われる、請求項1に記載の方法。
- 多糖含有材料の前記多糖構造物と前記多糖結合ドメイン含有組成物との接触が、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する後に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖含有材料が、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記構造的性質が、前記多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、前記多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記化学的性質が、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および所定の表面張力からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記物理的性質が、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記電気的性質が、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記機械的性質が、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも1つのさらなる多糖結合ドメインとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した生物学的成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインA抗体とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したイオン性成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したケイ素結合性成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属結合性成分とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、グルカン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖含有材料に少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質をもたらす組成物。
- 前記多糖含有材料が、紙、織物材料、糸および繊維からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記構造的性質が、前記多糖含有材料の多糖構造物間の所定レベルの架橋、前記多糖含有材料の多糖構造物の所定の凝集、および多糖含有材料の所定の表面性状からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記化学的性質が、所定の疎水性、所定の親水性、所定の濡れ性、所定の化学的反応性、所定の光化学的反応性、所定の機能性、および指定の表面張力からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記物理的性質が、所定のヤング率、最大負荷における所定のひずみ、所定の破壊到達エネルギー、所定の水吸収性、所定の膨潤性、および所定の靱性からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記電気的性質が、所定の表面電荷および所定の電気伝導度からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記機械的性質が、所定の引張り強度、所定の剪断耐性、所定の耐摩耗性、所定の摩擦係数、所定の弾性、および所定の湿潤強度からなる群から選択される、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した少なくとも1つのさらなる多糖結合ドメインとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した別のタンパク質とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した疎水性基とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した親水性基とを含む、請求項50に記載の組成物。
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- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した酵素とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的反応性基とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した化学的光反応性基とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したリパーゼとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したラッカーゼとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したプロテインA抗体とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したペプチドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリペプチドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した炭化水素または炭化水素誘導体とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した脂肪酸誘導体とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した電気的荷電成分とを含む、請求項50に記載の組成物。
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- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したポリマー結合性成分とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した金属とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネイン様タンパク質とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェリチンとを含む、請求項50に記載の組成物。
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- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合した細菌シデロホアとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したメタロチオネインとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したチオール基とを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したアルデヒドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したマレイミドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したヒドラジドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したエポキシドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したカルボジイミドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、多糖結合ドメインと、それに共有結合したフェニルアジドとを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロース結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、セルロースに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、デンプンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、キチンに結合し得る多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、グルカン結合ドメインである多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 前記多糖結合ドメイン含有組成物が、連鎖球菌のグルカン結合反復を含む多糖結合ドメインを含む、請求項50に記載の組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、前記多糖含有材料の前記多糖構造物を架橋する多糖結合ドメイン連結剤を形成する少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している機能化成分とを含み、前記少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、前記機能化成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している疎水性成分とを含み、前記少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、前記疎水性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している親水性成分とを含み、前記少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、前記親水性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している化学的反応性成分とを含み、前記少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、前記化学的反応性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
- 多糖構造物を含む多糖含有材料;および前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している多糖結合ドメイン含有組成物を含む組成物であって、前記多糖結合ドメイン含有組成物が、少なくとも1つの多糖結合ドメインと、それに共有結合している光化学的反応性成分とを含み、前記少なくとも1つの多糖結合ドメインにより、前記光化学的反応性成分が前記多糖含有材料の前記多糖構造物に結合している組成物。
- 少なくとも2つの共有結合した多糖結合ドメインを含む多糖結合ドメイン連結剤を含む組成物。
- 少なくとも2つの多糖結合ドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
- 前記少なくとも2つの多糖結合ドメインを連結する少なくとも1つのリンカーペプチドをコードする少なくとも1つのさらなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項103に記載の核酸構築物。
- 少なくとも1つの所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する方法であって、多糖含有材料の多糖構造物と多糖結合ドメインとの接触を、前記多糖構造物を多糖含有材料に加工する前、その途中および/またはその後に行い、その後、少なくとも1つの成分または基を前記多糖結合ドメインに共有結合させ、それにより、所望する構造的性質、化学的性質、物理的性質、電気的性質および/または機械的性質を有する多糖含有材料を製造する工程を含む方法。
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