JPH08509127A

JPH08509127A - セルロース結合ドメイン

Info

Publication number: JPH08509127A
Application number: JP6523460A
Authority: JP
Inventors: ショセヨヴ，オーデッド; シュピーグル，イタイ; エー．ゴールドスタイン，マーク; エイチドイ，ロイ
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア; イッサムリサーチディベロップメントカンパニーオブザヘブルーユニバーシティーオブエルサレム
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1994-04-14
Publication date: 1996-10-01
Also published as: US5496934A; KR100462856B1; EP0695311A1; AU6634794A; WO1994024158A1; CN1191270C; IL109323A0; AU691807B2; CA2160670A1; US5856201A; US5670623A; KR100330556B1; KR20030096452A; SG55151A1; NO954074L; CN1059214C; NO954074D0; US5738984A; KR20030096451A; FI954888A0

Abstract

(57)【要約】結晶性セルロースおよびキチンに対して高い親和性を有するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、その分子クローニング法、ならびに組換え体によるその生産を開示する。ＣＢＤと第２のタンパク質を含む融合産物も同様に記載する。ＣＢＤと融合産物の両方に対しては、薬剤送達（ドラッグデリバリー）、アフィニティー分離、診断技術を含めて多様な用途が意図される。

Description

【発明の詳細な説明】セルロース結合ドメイン本願は、1993年4月14日出願の米国特許出願第08/048,164号一部継続出願である。１．序本発明は、著しく高い親和性を持って可逆的な様式で水不溶性形態（結晶形態を含む）のセルロースおよびキチンと結合するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）に関する。ＣＢＤが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まない、単離された本発明のＣＢＤは、例えば多様な物質、特に生物学的に活性な分子のセルロースへのバイオ固定化において有用である。ＣＢＤおよび興味のある第２のタンパク質から含んでなる融合産物もまた、それらの調製方法における応用とともに開示される。これらの融合タンパク質は、分離、精製および診断法への適用を含む広範な用途を持つ。２．発明の背景２．１．タンパク質の固定化生物学的に活性なタンパク質を含む化学物質の固定化は、産業にとって非常に重要である。近年種々の固定化方法が開発されてきた。しかし、これらの方法の殆どは固相マトリックスの化学修飾を必要とする。典型的には、これらの修飾はマトリックスにリガンドを共有結合させることを必要とし、これは多くの場合リガンドの活性喪失ならびに、マトリックスを薬剤または食品加工に使用する前に除去しなければならない有毒な有機化合物の包含を引き起こす。広く使用されている製品の典型的な例はプロテインＡ−セファロース（Sepharose）である。この非常に高価な製品は、アフィニティークロマトグラフィーによるIgGの精製、および多くの診断的プロトコールに使用されている。キメラタンパク質、すなわち結合ドメインと共に機能性ドメイン（触媒的または他の）を有するタンパク質の使用は比較的新しいが、タンパク質精製法において特に非常に有用であることがすでに立証されている。例えば、グルタチオンS- トランスフェラーゼ遺伝子融合系は、グルタチオンS-トランスフェラーゼのC末端に融合した興味のある遺伝子を発現するように設計されている。組換えタンパク質はグルタチオン-セファロースカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。機能性ドメインおよび結合ドメインを有するキメラタンパク質の別の例は、大腸菌およびスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の両方の細胞において融合タンパク質の高レベルな発現を可能とするように設計されたプロテインＡ遺伝子融合ベクターである。B．Nilssonら，（1985）EMBO J．4（4 ）:1075-1080。プロテインＡのIgG結合ドメインは、IgG-セファロースカラムを用いる融合タンパク質の迅速な精製方法を提供する。IPTG-セファロースまたは金属キレートクロマトグラフィーによって精製されるβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質、またはNi-樹脂カラムを使用するヒスチジン六量体融合タンパク質に基づいて類似の系が開発されている。これらの方法はすべてコストの高い化学修飾および、多くの場合、高毒性化合物の使用を要する高価なマトリックス、例えばセファロース、アクリルビーズまたはガラスビーズ等を使用している。それに対し、セルロースは優れた物理的特性を有し、かつ安価であり、したがってタンパク質固定化のための魅力的な固相マトリックスを提供する。２．２．セルロースセルロースは、ワインおよびフルーツジュースの処理に使用される酵素であるエンド-β-グルコシダーゼの固定化に非常に有用であった（Shoseyovら，J．Agr ic．Food Chem．38:1387-1390［1990］）。しかし、固定化はセルロースの化学修飾を必要とし、充填カラムを含む用途には不適当なふわふわした圧縮性の素材をもたらす。リガンドを化学修飾という手段によらないで結合させる（例えば「バイオ固定化する（bioimmobilize）」）ことが可能なセルロース基質は、できあがった固相マトリックスが天然で、かつ非毒性（「きたない化学修飾」を必要としなかった）であるという利点を有するであろう。できあがった固相マトリックスが比較的安い価格とともにその物理的特性を保持するならば、さらに有利であろう。現在、セルロースの価格はグルタチオン-セファロースおよびIPTG-セファロースの価格の100〜500倍安く、セルロースを食品および医薬品産業において安全に使用できる魅力的で安価なマトリックスにしている。最近、Greenwoodら（FEBS Lett ．224（1）：127-131［1989］）はセルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）エンドグルカナーゼのセルロース結合領域を酵素アルカリホスファターゼに融合させた。組換え融合タンパク質は、ホスファターゼ活性およびセルロースに結合する能力の両方を保持していた。参照としてここに組み入れるKilburnらの米国特許第5,137,819号をも参照されたい。不運なことに、セルロモナス・フィミのセルロース結合領域はセルロースに対して比較的低い親和性を示す。例えば、融合タンパク質の30%以上が0.5M NaClに溶かした50mM Tris-HCl（pH7.5）によって洗い流される。セルロモナス・フィミセルロース結合領域の第２の不利な点は、セルロモナス・フィミ結合領域に結合するとセルロース繊維が破壊されることである（Dinら，Bio/Technology 9:1096 -1098［1991］）。したがって、たとえセルロモナス・フィミ結合領域は直接的なセルラーゼ活性を示さないかもしれないにせよ、セルロース基質繊維のこの破壊は（これは固相マトリックスの形態における物理的変化に殆ど等しい）同様に問題であり、望ましくない（さらに後述の第7.3節の議論を参照されたい）。２．３．セルラーゼ多くのセルラーゼおよび他の加水分解酵素、例えばキチナーゼ等はその基質に対し高い親和性を有する（Shoseyovら，PNAS USA 87:2192-2195［1990］；Cabib ，Methods Enzymol．161，pp．460-462［1988］）。結晶性セルロースとセルラーゼの間の強い結合はセルラーゼの結晶性セルロース分解能に直接関わっており（Klyosov，Biochemistry 29:10577-10585［1990］）、他方セルラーゼの無定形セルロース分解能にとって強い結合は必要でない、ということが以前に示されている。 Shoseyovら（PNAS USA 87:2192-2195［1990］）はクロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）由来のセルロース「複合体」の精製を報告している。このセルロース「複合体」はカルボキシメチルセルロースだけでなく結晶性セルロースに対してもセルラーゼ活性を示す。そしてこの「複合体」は数個の異なるペプチドから成る大きなタンパク質複合体である。触媒酵素が結晶性セルロースを分解するためには、明白な酵素活性を全く持たない、大きい（約200kDの）主要セルロース結合タンパク質（CbpA）が触媒酵素と協同しなければならないことが判明した。しかし、CbpAによるこのような協同は、無定形セルロースの酵素的分解には不要である。Shoseyovら（PNAS USA 89:3483-3487［199 2］）は、CbpA内の４つの別個な「推定上の」セルロース結合ドメインの記述を含め、CbpA遺伝子のクローニングおよびＤＮＡ配列決定を報告している。２．４．熱ショックタンパク質（HSP）熱ショックタンパク質（HSP）は、種々のストレス状態にある原核および真核種に生ずる。HSPはその分子質量に基づいて相同的タンパク質から成るいくつかのファミリーにグループ分けされる。評価の際に無比の高レベルの配列保存を保持した60 kD HSP（hsp 60）ファミリーは、自己免疫疾患における可能性のある抗原として興味の中心である。W．V an Eden（1991）Immunol．Rev．121:1，W．Van Eden，Thole R．Van der Zee，A ．Noordzij，J.D.A．Van Einbden，E.J．HensenおよびI.R．Cohen（1988）Natur e 331:171；M.B.J．Billingham，S．Carney，R．BulterおよびM.J．Colston（1990 ）J．Exp．Med．171:339参照。 hsp 60への応答は調節T細胞の制御を受けるという実験的証拠がある。T細胞反応性が、少なくとも部分的には哺乳動物の内因性HSPに向けられていることが示唆された。B．Hermanら，（1991）Eur．J．Immuno．21:2139参照。 hsp 60タンパク質ファミリーをコードする遺伝子がクローン化され、ヒト結核菌、癩菌、ウシ結核菌BCG、大腸菌、チャイニーズハムスター、ラット、マウスおよびヒト細胞を含む多数の異なる種から配列決定された。V．Meraら，（1986 ）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:7013；S．Jindalら，（1989）Mol．Cell ．Biol．9:2279；O.J．Pickettsら，（1989）J．Biol．Chem．264:12001；T.M． Shinnick（1987）J．Bacteriol．169:1080；T.M．Shinnickら，（1989）Infect ．Immun．56:446；T.J．VennerおよびR.S．Gupta（1990）Nucl．Acids．Res．18 :5309参照。後に記述するように、本発明によれば熱ショックタンパク質（HSP）、その一部分、抗-HSP抗体またはその一部分をＣＢＤ-融合産物に使用することができる。ミコバクテリアおよびヒトのhsp 60への免疫応答は、ヒトおよび動物モデルにおける自己免疫糖尿病の発症に関係があるとされてきた。種々の系におけるhsp 60ファミリーのタンパク質は、免疫優性の抗原であるのみならず、新規に合成されたポリペプチド鎖の適正な折りたたみ、および時にはそれらのオリゴマータンパク質複合体への構成において「分子の付き添い役（ch aperon）」の役割を果たすことが示されている。S.M．Hemmingsenら，Nature 333:330；R.J．Ellis （1990）Sem．Cell Biol．1:1-9参照。マウスを用いたインスリン依存性糖尿病（IDDM）のモデル系において、インスリン炎の発症時にhsp 60抗原に応答するTリンパ球が検出できる。そして、これらTリンパ球はベータ細胞hsp 65交差反応性抗原をも認識できるようである。D． Eliasら，（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87:1576-1580参照。かくして、セルロース、特に結晶性セルロースに対して高い、しかし可逆的な親和性を示すが、セルラーゼ活性も、また結晶性セルロース基質の繊維を破壊する能力も示さない（すなわち、「無定形化する」作用を示さない）セルロース結合タンパク質を発見するという要求が充足されずに残っている。３．発明の要約本発明者らはここに新規なセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）タンパク質の同定、分子クローニング、およびセルロース結合特性を記述する。また、ＣＢＤおよび興味のある第２のタンパク質からなる融合産物の生産のための発現系の構築も開示される。本発明は、ＣＢＤはそれが自然界で結合している他のタンパク質またはポリペプチドから独立して機能できるという発見に関するものである。さらに、予期せぬことに、ＣＢＤは結晶性セルロースおよびキチンに対して高い親和性を有し、約1.5μMから約0.5μMの範囲の、好ましくは約1.4μMから約0.8μMの範囲のK_d 値を持つことが判明した。特に、結晶性セルロースの種々のサンプルに対して、ＣＢＤは約1.2μM以下のK_dを持つ。ＣＢＤはセルラーゼ活性を殆ど全く持たないという点で、そして、極めて驚くべきことに、ＣＢＤは形態を変更するような特性を全く示さない（すなわち、無定形化する作用を全く示さない）という点で、さらに特徴付けることができる。また、ＣＢＤおよび第２のタンパク質からなるＣＢＤ-融合産物は、ＣＢＤのセルロースへの旺盛な結合能力を保持することが判明した。本発明はまた、以下の発見にも関連している。すなわち、ＣＢＤは広いpH範囲にわたって、かつ異なる緩衝条件のもとでセルロースとの絶対結合を示す；大量のＣＢＤが結晶性セルロースに結合する；および水に暴露してもＣＢＤはセルロースから解離されない、という発見である。著しく対照的に、主要CbpAタンパク質およびセルロモナス・フィミ由来の結合領域は、水に暴露されると容易にセルロースから解離される。実際、ＣＢＤをセルロースから解離するには６Mグアニジン-HCl、６M尿素または非イオン性界面活性剤等の変性溶液への暴露が必要である。したがって、ＣＢＤタンパク質は、セルロースへの結合において、それが自然界で結合している他の残りのタンパク質から全く独立して機能し、反応する。したがって、本発明は高い親和性をもってセルロースと結合可能な単離されたＣＢＤタンパク質であって、それが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤタンパク質を提供する。本発明の一つの態様において、ＣＢＤタンパク質は図１に記載のアミノ酸配列を含んでなる。本発明の別の態様において、ＣＢＤタンパク質は図１に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは80%の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる。本発明の他の側面においては、図１に記載の核酸と少なくとも60%、好ましくは70〜80%の相同性を有する核酸が意図される。本発明のさらに別な態様において、ＣＢＤタンパク質はセルロースに対して高い結合親和性を持つ。より好ましくは、本発明のＣＢＤは約1.5μM以下の、最も好ましくは1.0μM以下のK_dを持つ。さらに別の態様において、本発明は高い親和性を持ってセルロースと結合可能なＣＢＤタンパク質および第２のタンパク質から成るＣＢＤ融合タンパク質を提供する。ここで上記のＣＢＤタンパク質が天然に存在するタンパク質である場合は、このＣＢＤタンパク質はそれが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まない。本発明の特定の態様において、第２のタンパク質はプロテインＡである。本発明の別な態様において、第２のタンパク質はHSPタンパク質である。本発明のさらに別な態様において、ＣＢＤに融合させる第２のタンパク質は２つまたはそれ以上のポリペプチド領域から成ってもよい。例えば、ＣＢＤを抗体の可変部Ｌ鎖（Ｖ_L）および可変部Ｈ鎖（Ｖ_H）、またはそれらの機能性部分と融合させることができる。本発明のさらに別な態様は、ＣＢＤまたはＣＢＤ融合産物の生産方法を提供する。ＣＢＤ単独にもＣＢＤ融合産物にも適用可能であるが本明細書ではＣＢＤ融合産物用として記述されている具体的な生産手順は、以下の工程を含んでなることができる。すなわち、ＣＢＤおよび第２のタンパク質を含んでなるＣＢＤ融合産物をコードする核酸を提供し、ここで上記ＣＢＤは高い親和性を持ってセルロースまたはキチンと結合可能であり、かつそれが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まず；宿主細胞を上記核酸でトランスフェクトし、または上記核酸を宿主細胞に導入するために等価の手段を使用し；そして、（2）形質転換された宿主細胞をＣＢＤ融合タンパク質の発現に適切な条件下で培養する。上記の方法において、第２のタンパク質はさらにN末端アミノ酸およびC末端アミノ酸を含んでもよい。宿主細胞のトランスフェクションは、電気穿孔法、注入、塩化カルシウム沈殿法およびレトロウイルスによる導入を含むがこれらだけに限定されない、当業者に周知の多数の方法によって行なうことができる。更に、上記の核酸は宿主細胞のゲノムに組み込むことも、また、組み込まないことも可能である。本発明のさらに別な側面において、ＣＢＤ融合産物の精製方法が提供される。この方法は、セルロース及び組換え融合産物とを含んでなる不溶性結合体を形成させるのに適当な条件下で、組換えＣＢＤ融合産物を含む混合物を有効量のセルロースと接触させ；不溶性のセルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を混合物から単離し；上記セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体からＣＢＤ融合タンパク質を回収する、ことを含んでなる。本発明の特定の態様においては、本発明のＣＢＤ融合タンパク質の精製方法は、ＣＢＤ融合産物の第２タンパク質のＮ末端アミノ酸の上流にある開裂部位をコードする核酸の提供をさらに含む。本発明の別の態様においては、本発明のＣＢＤ融合タンパク質の精製方法は、ＣＢＤ融合タンパク質の第２タンパク質のＣ末端アミノ酸の下流にある開裂部位をコードする核酸の提供をさらに含む。本発明のさらに別の態様においては、本発明のＣＢＤ融合タンパク質の精製方法は、ＣＢＤ融合タンパク質の第２タンパク質のＮ末端アミノ酸の上流にある第１開裂部位およびＣＢＤ融合タンパク質の第２タンパク質のＣ末端アミノ酸の下流にある第２開裂部位をコードする核酸の提供をさらに含む。同様に、ＣＢＤはこれを含有する混合物を有効量のセルロースと接触させることにより精製される。その結果生ずる不溶性のＣＢＤ-セルロース結合体を単離し、次にこの複合体を解離剤で処理すると、精製ＣＢＤが得られる。本発明の別な側面は、高い親和性を持ってセルロースと結合可能なＣＢＤタンパク質であって、それが自然界で結合している他の核酸を実質的に含まないＣＢＤタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。本発明のタンパク質をコードする核酸は、cbd遺伝子と相同性を有する配列に関してｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする際にプローブとして有用でありうる。さらなる態様において、本発明は本発明のＣＢＤをコードする核酸を含有する宿主細胞を提供する。本発明の付加的側面は、測定対象物質の検出のための診断用キットに関する。このキットは、（a）（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能なＣＢＤであって、それが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii）測定対象物質と結合可能な第２のタンパク質、を含んでなるＣＢＤ融合産物；（b）検出可能な標識；ならびに（c）セルロースを含む。このような診断用キットにおいて、セルロースをキチンと置換することが可能である。本発明の特定の態様において、ＣＢＤ融合産物の第２のタンパク質はプロテインA、HSPタンパク質、HSP抗体、HSP-関連タンパク質、ペプチド、またはその抗原部分でありうる。「ペプチド」という用語は、２〜20アミノ酸から成る分子を含むものである。ここに開示する診断用キットのＣＢＤ融合産物は、第２のタンパク質にアフィニティー結合している、測定対象物質と結合可能なリガンドをさらに含むことができる。「リガンド」という用語は、任意の非共有結合手段によって第２の分子に結合可能な任意の分子を意味する。例えば、一次IgGはＣＢＤと融合しているプロテインＡにアフィニティー結合させることができる。そして、このIgGは特定のタンパク質、ペプチドまたはホルモンのリガンドとして働く。本発明の別な側面において、試験試料中の興味のある物質の存在を検出するイムノアッセイ法が開示される。この方法は、（a）測定対象物質を含有する可能性のある試験試料を、（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ ii）測定対象物質と結合可能な第２のタンパク質を含んでなるＣＢＤ融合産物の十分な量と共に、測定対象物質のＣＢＤ融合産物第２タンパク質への結合を可能とする条件下でインキュベートし；（b）上記工程（a）で使用した量のＣＢＤ融合産物と結合させるのに有効量のセルロースを加え、不溶性のセルロース-ＣＢＤ融合産物結合体をもたらし；（c）その不溶性セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を未結合成分から分離し；（d）不溶性セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を、十分な量の、測定対象物質と結合可能な検出しうる標識と共にインキュベートし；そして（e）上記工程（d）の不溶性セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を未結合成分から分離し、標識の存在または不在を確認して、試験試料中における測定対象物質の存在または不在の指示を提供する、ことを含んでなる。また、試験試料中における測定対象物質の検出のための別な方法が開示される。この方法は、（a）測定対象物質を含有する可能性のある試験試料を、その測定対象物質を固定化することのできる不溶性マトリックスと接触させ；（b）不溶性マトリックスを（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii ）固定化された測定対象物質と結合可能な第２のタンパク質を含んでなるＣＢＤ融合産物の十分な量と共に、固定化された測定対象物質のＣＢＤ融合産物第２タンパク質への結合を可能とする条件下でインキュベートし；（c）上記工程（b）の不溶性マトリックスを未結合成分から分離し；（d）上記工程（c）の不溶性マトリックスを、測定対象物質またはＣＢＤ融合産物と結合可能な検出しうる標識とともに、上記標識の測定対象物質またはＣＢＤ融合産物との結合を可能とする条件下でインキュベートし；そして（e）上記工程（d）の不溶性マトリックスを未結合成分から分離し、標識の存在または不在を確認して、試験試料中における測定対象物質の存在または不在の指示を提供する、ことを含む。この方法は、さらに（i）上記工程（c）の不溶性マトリックスを、セルロースのＣＢＤ融合産物への結合を可能としセルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を形成させる条件下で、十分な量のセルロースと接触させ、そして（ii）上記工程（i）の不溶性マトリックスを未結合セルロースを含む未結合成分から分離する、ことを含むことができる。この方法は、測定対象物質またはセルロース-ＣＢＤ融合タンパク質結合体、特に該複合体のセルロースに結合可能な標識を使用できる。試験試料は、血液、尿、精液、唾液、粘液、涙、膣分泌物を含むがこれらだけに限定されない体液、等でありうる。通常は、セルロースをキチンに置き換えることができる。また、不溶性マトリックスは電気泳動ゲルブロットであってもよい。本発明の特定の態様において、上記の方法はあるタンパク質またはペプチドの検出のために設計される。したがって、ＣＢＤ融合産物の第２タンパク質は上記タンパク質またはペプチドに対する抗体であり得る。この抗体はモノクローナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であってもよい。または、本発明のＣＢＤ融合産物を興味のある抗体に直接、またはリンカー部分を介して、結合させることができる。測定対象物質は、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸または他のプローブの標的となりうる分子と結合したビオチニル化プローブをさらに含むことができる。この場合、好ましい第２タンパク質はストレプトアビジンである。標識が酵素を含む場合、この方法は十分な量の上記酵素の基質を加えることをさらに含む。この基質は酵素によって検出可能な化合物に変換される。このアッセイは、競合的な様式で実施することも可能である。したがって、前述の方法は以下のように修正できる。すなわち、工程（d）は不溶性セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を標識化された測定対象物質から成る検出可能な標識（該標識は測定対象物質に結合しないまま残るＣＢＤ融合産物の任意の第２タンパク質と結合可能である）の十分量と共にインキュベートすることによって実施され、また工程（e）は上記工程（d）の不溶性セルロース-ＣＢＤ融合産物結合体を未結合成分から分離し、試験試料から観察されるシグナルを対照試料から観察されるシグナルと比較することによって実施される。本発明の好ましい態様において、ＣＢＤ融合産物はディップスティック（dip stick）に包含される。したがって、試験試料中における測定対象物質の検出に有用な、ＣＢＤ融合産物を含有するディップスティックの提供もまた本発明の目的である。上記ＣＢＤ融合産物は、（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii）測定対象物質と結合可能な第２のタンパク質から成る。好ましくは、上記第２のタンパク質は、プロテインA、HSPタンパク質、HSP抗体、交差反応性HSP-関連タンパク質またはペプチドまたはその抗原部分、酵素、ホルモン、抗原及び抗体から成る群より選択される。同様に、下記のものからなるシグナル増幅系を提供することもまた本発明の目的である。すなわち、（ａ）（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii）さらに測定対象物質と結合可能なキメラプローブと結合可能である第２のタンパク質、を含んでなる第１のＣＢＤ融合産物；および（ｂ）（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii）基質に作用し検出可能な化合物を生成することが可能な酵素、を含んでなる第２のＣＢＤ融合産物である。別の態様においては、下記のものから成るシグナル増幅系が提供される。すなわち、（ａ）（i）高い親和性を持ってセルロースと結合可能であり、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤ、および（ii）さらに測定対象物質と結合可能なキメラプローブと結合可能である第２のタンパク質、を含んでなるＣＢＤ融合産物；および（ｂ）高い親和性を持ってセルロースと結合する能力を保持し、かつ自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まない、標識化ＣＢＤである。これらのシグナル増幅系はそのキメラプローブを含むことができ、さらにセルロースヌトリクス、好ましくは玉石−粉砕した（pebble-milled）セルロースを含むことができる。これらのシグナル増幅系は、細胞または組織由来の核酸を同定するために設計された系、および同定された核酸の長さをどちらの方向にも伸長するために設計された、欠失配列のオリゴヌクレオチド特異的熱周期的ＤＮＡ増幅を採用した系を含むことができる。上記のＤＮＡ増幅においては、ＤＮＡ特異的プライマーと縮重的な、ベクター特異的またはオリゴ-dT-結合第2オリゴヌクレオチドの組み合わせが、特異的合成を開始させるのび使用できる。最後に、薬剤を伴うＣＢＤであって、該ＣＢＤは高い親和性を持ってセルロースと結合する能力を保持し、かつそれが自然界で結合している他のタンパク質を実質的に含まないＣＢＤから成る薬剤送達（ドラッグデリバリー）系を提供することが本発明のさらなる目的である。このような薬剤送達系において、薬剤は直接またはリンカー部分を介してＣＢＤに結合されている。多くの結合方法が存在し、当分野の技術では公知である。例えば、シクロヘキシルカルボジイミド等のアシル活性化剤が存在し、これはアミドまたはエステル結合を形成するために使用できる。したがって、アミノ基または水酸基等の求核基を有する薬剤はＣＢＤのカルボキシ末端に結合されうる。一つの態様において、このような薬剤送達系は、興味のある薬剤がセルロースに結合したＣＢＤからゆっくり放出される徐放性薬剤送達系であり得る。一つの態様において、送達すべき薬剤は抗真菌剤である。好ましい薬剤は、アンホテリシンB、ナイスタチン、およびウンデシレン酸を含むがこれらだけに限定されない。薬剤は一般的にはクロトイマゾール等のイミダゾールであってよい。このような薬剤送達系を、腹腔内、経口、局所または吸入投与が可能な組成物に組み込むことが意図されている。特に、投与経路は鼻腔内、経眼および膣内を含むがこれらだけに限定されない。さらに、上記組成物は個体、ゲル、液体またはエーロゾル形態でありうる。本明細書に記述する薬剤送達系は、細胞膜がセルロース性またはキチン性物質を含有する酵母、真菌等の感染または疾患を引き起こす病原体に薬剤を運んでいくのに有用である。このような病原体は、アスペルギルス・フミガツス（Asperg illus fumigatus）、カンジダ（Candida）またはモニリア（Monilia）属のメンバー、または表皮細胞を含むが、これらだけに限定されない。本発明の薬剤送達系を使用することにより、疾患または感染の効果的治療に必要とされる用量が大幅に減少することが予測され、したがって抗真菌剤または抗真菌症剤（これらは典型的には非常に毒性でもある）の有効性が改善されるであろう。したがって、副作用が最小限となる、または、より良くは除去されることが望まれる。本発明の別な側面は、植物組織の成長を加減（modify）するＣＢＤの能力に関する。このような能力は、例えば花粉管の成長および／または根の成長を促進することが望ましいことがある農業にその用途を見いだす。さらに、高濃度のＣＢＤは根の成長を阻害する能力を有するので、望ましくない植物（例えば雑草類）の発育を予防するのに有用である。別の例では、ＣＢＤはキノコ等の真菌類の増殖を促進するのに用途を見いだす。ここではＣＢＤはキチンに結合して、発生中の担子器果つまり子実体の増殖および／または発生を刺激する。本発明のさらに別な側面は、昆虫の外骨格または他の部分（中部栄養管を含む）のキチンに結合するＣＢＤの能力に関する。このような能力は、生物殺虫剤としてのＣＢＤの使用にその用途を見いだす。そこでは、ＣＢＤは害虫防除に有用な微生物、例えばバシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）（ BT）もしくはBT毒素遺伝子を発現する他の微生物等、またはキチナーゼを分泌する微生物または真菌に連結されている。ＣＢＤは上記の微生物を昆虫のキチン含有部分に結合させるように働く。そして、昆虫の体内では微生物が産生した毒素または酵素がその有害昆虫に死をもたらす。キチナーゼ活性を示す微生物にはエンテロバクター（Enterobacter）属およびストレプトミセス（Streptomyces）属由来の細菌株、ならびにアスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属およびトリコデルマ（Trichoderma）属由来の真菌株、等が含まれる。本発明のこの態様の一様式において、ＣＢＤ-微生物複合体は、害虫による体内侵入（infestation）が疑われる、またはその危険にされされている植物部分に直接塗布することができる。あるいは、ＣＢＤ-微生物複合体は、害虫が蔓延する圃場内または害虫に侵入された植物上に設置された餌場（bait station）に固定することができる。本発明のこの態様の別な様式においては、ＣＢＤ-微生物複合体は、木材を破壊する害虫による侵入を予防または防除するため、木材またはセルロースに基づく製品に塗布される。例えば、ＣＢＤ -微生物複合体は電柱または木材またはセルロースに基づく建築材に塗布され、そこではＣＢＤ成分は侵入してくる害虫にしっかり結合し、そして複合体の微生物はその害虫を防除するのに有効である。本発明のさらに別な側面は、生物による改善法（bioremediation）または毒性環境汚染物質の分解に有用な真菌類を含む、真菌類に見いだされるキチンに結合するＣＢＤの能力に関する。この態様の一つの様式によれば、第２成分が環境汚染物質を分解する酵素であるＣＢＤ融合タンパク質が使用される。ＣＢＤ-酵素融合タンパク質はセルロース基質上に固定化されうる。そしてこの装置は、地上水または地下水の流れの中に置くことにより、例えば酵素的分解によって環境から汚染物質を除去するのに使用できる。本発明のこの態様の別な様式によれば、ＣＢＤは生物仲介（biomediation）に有用な酵素、すなわち殺菌剤等の環境汚染物質を分解する酵素を分泌する真菌に結合される。次に、ＣＢＤ-真菌複合体はセルロース基質に固定化され、DDTを含む殺菌剤等または伐採あるいは製材作業で残された木を含有する製品等の環境汚染物質を酵素的に分解するための有用な装置を提供する。一つの例証的な例においては、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼを産生し、殺菌剤DDTを分解する白色腐朽菌（例えばフェネロキーテ・クリソスポリウム［Phanerochaete chryso sporium］）にＣＢＤを結合させる。このＣＢＤ-真菌複合体は、例えばDDT等の殺菌剤を環境から除去する生物による改善法に有用である。４．図面の説明図１：ＣＢＤのヌクレオチド配列（第１行、元の配列；第２行、相補体）および推定されるアミノ酸配列。図２：ＣＢＤをコードする遺伝子断片の調製およびクローニング。Ａ．Ｎ末端シグナルペプチドを含有するCbpAの一次構造、独特なＣＢＤ領域、４個の親水性繰り返し配列（白矢印）、および９個の疎水性繰り返し配列（黒矢印）の分析。Ｂ．cbpA遺伝子にそったPCRプライマーの配置。明確を期するため、PCRプライマー配列およびＣＢＤの隣の領域のcbpA ＤＮＡ配列をここに含める。PCR産物は下線を付したNcoIおよびBamHI部位を含有する。また、遺伝子断片のATG開始コドンがNcoI部位内に位置し、TAG終始コドンがBamHI部位に隣接することに注意されたい。Ｃ．pET-8cベクター中にクローン化されたＣＢＤ遺伝子断片を含有するpET-ＣＢＤの図。上記ベクターは、誘導性ＣＢＤ産生に必要な転写および翻訳シグナルを含有する。図３：ＣＢＤタンパク質の発現および精製。 pET-8cを含む細胞由来の全細胞タンパク質（レーン２）、pET-ＣＢＤを含む細胞由来の全細胞タンパク質（レーン３）、溶解したpET-ＣＢＤ細胞由来の細胞質ゾル断片（レーン４）、溶解したpET-ＣＢＤ細胞由来の、塩酸グアニジンで可溶化した膜／封入体断片（レーン５）、Avicel^TMペレットの最終PC緩衝液洗浄（レーン６）、および精製ＣＢＤタンパク質を15%アクリルアミドゲルに負荷した。各レーンには、各画分の全タンパク質の0.005%を負荷された。ただし、レーン６は10倍の濃度である。前もって染色した分子量マーカー（レーン１、８）は、約 2.6，5，12.7，18.1，29および44kDaの移動度を有する。図４：ＣＢＤ-Avicel^TM結合の経時変化。ＣＢＤ（2.0μmol全タンパク質）およびAvicel^TM（１mg/ml）を第７節に後述するように平衡化した。ただし、様々なタイムポイントで採取された試料を提供するのに、より大きい合計容量が用いられた。各タイムポイントの試料は、第７節に後述するように洗浄し、アッセイした。下記図９の表Ｉも参照されたい。図５：Avicel^TMに結合するＣＢＤの二重相互プロット。0.5mg Avicel^TMは黒塗りの四角で表され（B）、１mg Avicel^TMは黒塗りの円で表され（J）、２mgは黒塗りの三角で表されている（H）。挿入図：ＰＣ_max対使用したAvicel^TMの量。アッセイ容量は1.0mlであった。図６：Avicel^TMに結合するＣＢＤのスキャッチャード（Scatchard）プロット。３つの量のAvicel^TMについての［PC］/［P］対PC が示されている。［PC］/［P］は無次元の比として表現され、［PC］はμMを単位として示される。１mg Avicel^TMは黒塗りの円で、２mgAvicel^TMは白抜きの円で、３mgは黒塗りの四角で表されている。図７：Cellulon^TMに結合するＣＢＤの二重相互プロット。インキュベーション混合物は１mlあたり0.5mgのCellulon^TMを含有していた。図８：ＣＢＤ-ProtA融合タンパク質はセルロース及びIgGの両方に結合する。１Mの酢酸はＣＢＤ-ProtA:IgG「結合」を選択的に解離するが、ＣＢＤ-ProtA：セルロース「結合」は解離しない。図９：ＣＢＤタンパク質の不溶性基質への吸着。図１０：ＣＢＤの過剰発現および精製。図１１：標識化ＣＢＤが、ＣＢＤ融合産物が結合しているセルロースまたはキチンを検出するシグナル増幅系の図。次に、測定対象物質はキメラプローブに結合される。図１２：測定対象物質が３成分からなるＣＢＤ融合産物、つまりＣＢＤ-プロテインA（IgG）に結合されるシグナル増幅系の図。図１３：ゲル電気泳動を用いた試料の検出によって示されるＣＢＤ-ProtA-セルロースによるIgGの精製。レーンａはヒト血清である。レーンｂはＣＢＤ-Prot A-セルロースに結合しなかったヒト血清タンパク質である。レーンｃはIgGのプロテインAへの結合が起こった後の、PBSによる最初の試料洗浄であり、未結合タンパク質を示す。レーンｄは酢酸による洗浄によって回収されたIgG画分をである。図１４Ａおよび１４Ｂ：ＣＢＤで処理したセルロース繊維は無傷のままである、すなわちＣＢＤはセルロースを破壊する無定形化活性を持たないことの立証。図１４ＡはＣＢＤで処理した綿繊維を示す。図１４ＢはＣＢＤで処理していない綿繊維（対照）を示す。図１５：pH値およびNaCl濃度がＣＢＤ-ProtAのセルロースへの結合力に及ぼす効果の立証。図１６：ＣＢＤのアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）への結合の立証。レーンａはＣＢＤの存在下のアスペルギルス・ニガーである。レーンｂはＣＢＤの不在下のアスペルギルス・ニガーである（対照）。レーンｃはＣＢＤ単独である。図１７：ＣＢＤのスポドプテラ・リットラリス（Spodoptera littoralis）への結合の立証。レーンａはＣＢＤの不在下でのスポドプテラ・リットラリスの中部栄養管膜である（対照）。レーンｂはＣＢＤの存在下でのスポドプテラ・リットラリスの中部栄養管膜である。図１８：ＣＢＤのヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）への結合の立証。レーンａはＣＢＤの不在下でのヘリオチス・アルミゲラの中部栄養管膜である（対照）。レーンｂはＣＢＤの存在下でのヘリオチス・アルミゲラの中部栄養管膜である。図１９：花粉管の成長に及ぼすＣＢＤおよびBSA（対照）の効果の立証。図２０Ａおよび２０Ｂ：白色蛍光光沢剤（ホタル石）によって染色された花粉管の結晶性細胞壁成分に及ぼすＣＢＤの効果の立証。図２０Ａは、先端部に輝く色が存在しないことによって示されるように、ＣＢＤで処理した花粉管は非結晶性の花粉管先端をつくり出したことを示す。図２０Ｂは、輝く色によって示されるように、対照の花粉管先端がより多くの結晶性細胞壁成分を含有することを示す。図２１Ａおよび２１Ｂ：ＣＢＤで処理した花粉管の金-免疫標識化の立証。図２１Ａは、ＣＢＤで処理した花粉において、金-標識は花粉管に沿っているが、先端部の集中的な暗点によって示されるように、むしろ先端部に著しい。図２１Ｂは、対照つまりＣＢＤ処理をしていない花粉を示す。図２２：アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）の苗の成長に及ぼすＣＢＤの効果の立証。異なる文字は、根の長さの数値間の十分な有意差（p ≦0.05）を示す。図２３：ＣＢＤで処理したアラビドプシス・タリアナの苗の金-免疫標識化の立証。この図は、金標識化は根に限定され、茎には全く標識が見られないことを示している。図２４：白色蛍光光沢剤（ホタル石）を用いたアラビドプシス・タリアナの苗の染色の立証。この図は根のみが染色されるていることを示し、入手しやすいセルロースを示している。５．発明の詳細な説明および定義本発明は高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合可能なセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）タンパク質の同定に向けられている。本発明のＣＢＤは、例えば、生物学的に活性な分子のセルロースへのバイオ固定化に使用することができる。本発明のＣＢＤは第２のタンパク質と融合させてＣＢＤ融合タンパク質を形成させることができる。ＣＢＤ融合タンパク質におけるＣＢＤタンパク質の存在は、セルロースと共にインキュベートすることによる容易で選択的なＣＢＤ融合タンパク質の精製を可能とする。第２のタンパク質の例は、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、アビジン、Taqポリメラーゼおよび他のポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、種々の制限酵素、ペルオキシダーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、エンド −１，３−β−グルカナーゼ、キチナーゼ等のグルカナーゼ、β−およびα−グルコシダーゼ、β−およびα−グルコロニダーゼ、アミラーゼ、グルコシル−トランスフェラーゼ、ホスホ−トランスフェラーゼ、クロラムフェニコール−アセチル−トランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼおよび他の抗生物質を修飾または分解する酵素、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、バクテリオシン、抗生物質、酵素阻害剤、異なる増殖因子、ホルモン、受容体、膜タンパク質、核タンパク質、転写および翻訳因子、ならびに核酸を修飾する酵素を含む。特に、ＣＢＤタンパク質を抗体または抗原決定基に融合させ、診断用キットおよびイムノアッセイに有用なＣＢＤ融合タンパク質を形成させることが可能である。したがって、例えば、ＣＢＤおよびHSPエピトープを利用することにより特定の抗体（例、熱ショックタンパク質［HSP］抗体）の存在に関して体液を試験することが可能である。逆に、ＣＢＤ−ＨＳＰ抗体融合タンパク質を使用して、HS Pタンパク質、交差反応性HSP-関連タンパク質、またはその抗原部分を検出することが可能である。「ＣＢＤ」または「ＣＢＤタンパク質」または「セルロース結合ドメインタンパク質」という用語は、図１に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を指し、その機能性相同体および機能性誘導体が高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力を有するならば、該機能性相同体および機能性誘導体をも包含する。本発明のＣＢＤは、それが自然界で結合している他のタンパク質（例えば、先に論じた主要ＣｂｐＡタンパク質の残り）を実質的に含まない形で提供される。さらに、例えば向上させた生物学的特性を有するＣＢＤを作成するため、または結合および発現レベルを変えるため、ポリペプチド内の前もって決めておいた１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換、挿入、または除去することができる。本発明の範囲内に入る望ましいＣＢＤタンパク質のいくつかは、場合により天然に存在する分子の共有または非共有修飾を持つことができる。この修飾にはグリコシル化修飾が含まれるが、それだけに限定されない。組換えＤＮＡ技術の使用により、アミノ酸残基の欠失、置換および／または挿入を有する本発明のＣＢＤタンパク質は、基礎となっている核酸を変更することによって調製できる。本発明のＣＢＤをコードするＤＮＡにおいてなされるかもしれない修飾または変異は、読み枠を変えてはならず、また、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補領域を作り出さない（ヨーロッパ特許公報EP 75,444号参照）。本発明のＣＢＤタンパク質は、図１に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するタンパク質である。「Ｘ％の相同性」という表現は、タンパク質の全長にわたってＸ％の相同性を有する配列に限定することを意図するものではない。７０％の相同性もまた、図１のＣＢＤタンパク質内の同定された機能性領域において存在するＸ％の相同性を含むことが意図されている。機能性領域の一例は、高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力を有する、明確に定められた一組のアミノ酸であろう。このようなタンパク質相同体は、本明細書において「ＣＢＤ機能性相同体」とも呼ばれる。本発明の一つの態様において、このような機能性領域は約100個のアミノ酸を持つことができる。本発明の別の態様において、このような機能性領域は約50個のアミノ酸を持つことができる。本発明の最も望ましいＣＢＤタンパク質は、図１に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。本明細書に使用される「ＣＢＤ機能性誘導体」という用語は、高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力を保持し、また好ましくは長さが約２から約160アミノ酸、より好ましくは約25から約125アミノ酸、最も好ましくは約50から約100アミノ酸である、図１に記載のＣＢＤタンパク質アミノ酸配列の任意の「断片」、「変異体」、「類似体」または「化学誘導体」を指す。「断片」という用語は、図１に記載のＣＢＤタンパク質から誘導されるＣＢＤタンパク質で、天然に存在する配列を持つタンパク質を指すのに使用されている。このような断片は、全長タンパク質のタンパク質分解開裂によって作成することができる。または、このような断片はＣＢＤタンパク質をコードするＤＮＡ配列を適切に修飾し、Ｃ末端、Ｎ末端の１つまたはそれ以上の部位で、かつ天然に存在する配列内で、１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠失させることにより組換え手段によって取得される。ＣＢＤタンパク質の断片は、機能性誘導体に相違ないこと、つまり機能性誘導体の有効性を確認するため、高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力についてスクリーニングすることができる。本明細書で使用される「変異体」という用語は、天然に存在する分子のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、または他の特徴が共有的または非共有的に修飾されている分子と定義され、突然変異体を含むことが意図される。本発明の範囲内にある変異体のいくつかは、もし最終構築物が高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合するという所望の能力を持つならば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有する。ＣＢＤタンパク質におけるアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいてなされる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含む；非荷電の極性ヘッド（頭部）基または非極性ヘッド（頭部）基を持ち、類似した親水性値を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンを含む。Ｃ末端、Ｎ末端の１つまたはそれ以上の部位において、かつ天然に存在するＣＢＤ配列内に、付加的アミノ酸を有するタンパク質もまた、もしその変異体が高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力を保持するならば、変異体の定義のうちに含まれる。本明細書に使用される「化学誘導体」という用語は、天然に存在するＣＢＤタンパク質または変異体ＣＢＤタンパク質を化学的に修飾することにより作成されるＣＢＤタンパク質を指す。化学修飾の実例は、アルキル基、アシル基、またはアミノ基によるＨの置換であろう。本明細書に使用される「高い親和性を持ってセルロースと結合する」という句は、約1.5から約0.5、好ましくは約1.4から約0.8のＫ_d値（μM単位）を持ってセルロースと結合するＣＢＤタンパク質の能力を指す。より好ましくは、高親和性結合は、約1.1以下、最も好ましくは約1.0以下のＫ_d値を持って結晶性セルロースと結合する本発明のＣＢＤタンパク質の能力を指す。本明細書に使用される「可逆的な様式でセルロースと結合する」という句は、６M尿素、６Mグアニジン-HCl等の解離剤または溶液、および他の変性試薬（非イオン性界面活性剤を含む）によって、セルロース-CBDタンパク質結合体から解離されるＣＢＤタンパク質の能力を指す。しかし、好ましくは、解離されたＣＢＤまたは融合産物が再構成されるのを可能とするような変性試薬が用いられる。例えば、変性タンパク質を下記第6.1.4，7.1.1，7.2.1および8.1.4節に記載の再生条件下に置くことによって、６M尿素または６Mグアニジン-HClによる処理からＣＢＤを再構成することが可能である。本明細書に使用される「ＣＢＤ融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つのタンパク質、すなわちＣＢＤタンパク質および第２のタンパク質が合体することを指す。本発明のいくつかの態様において、第２のタンパク質は第３のタンパク質に融合または結合させることができる。本発明において、第２のタンパク質の例は核酸修飾酵素、プロテアーゼ等の酵素、ホルモンまたはホルモン前駆体、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗原、それらの抗原決定基および変異体を含む。本発明のいくつかの好ましい態様において、第２のタンパク質はプロテインＡである。本発明の別の好ましい態様において、第２のタンパク質はＨＳＰタンパク質である。本発明の一つの好ましい態様は、ＣＢＤタンパク質と、プロテインＡまたは抗-HSP組換えIgGを含んでなる融合タンパク質である。本発明のＣＢＤ融合タンパク質は第２のタンパク質の上流に、好ましくはＮ末端に隣接して酵素的または化学的開裂部位を含有しおよび／または第２のタンパク質の下流に、好ましくはＣ末端に隣接して酵素的または化学的開裂部位を含有することが可能で、これによって開裂剤の使用により第２のタンパク質をＣＢＤ融合タンパク質から回収する手段を提供する。本明細書に使用される「ＣＢＤ融合タンパク質-セルロース結合体」という用語は、セルロースがＣＢＤ融合タンパク質のＣＢＤタンパク質に結合する時に形成される複合体を指す。「核酸」は、5'と3'がホスホジエステル結合で結ばれている一連の核酸から成る、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列であるヌクレオチド配列を指す。核酸がＤＮＡであるならば、ヌクレオチド配列は１本鎖または２本鎖である。ＣＢＤをコードする核酸とは、高い親和性を持ってセルロースと結合可能なＣＢＤタンパク質をコードし、そのようなＣＢＤタンパク質をコードする核酸配列と相補的であるか、またはそのようなＣＢＤタンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズし、ストリンジェント条件下でもそこに安定に結合したままであるＲＮＡまたはＤＮＡである。「本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸」という句は、コードされるＣＢＤが高い親和性を持ってセルロースに結合する能力を保持しさえすれば、ゲノム、ｃＤＮＡ、合成および半合成に由来する核酸であって、その起源または操作により、それが天然において関連しているポリヌクレオチドのいかなる部分も伴わず、またそれが天然において連結していたポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結可能な上記核酸を含み、また、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはそれらの組合せの１本または２本鎖ポリマーを含む。上記の「本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸」という句は、核酸によってコードされるＣＢＤが高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力を保持しさえすれば、当分野の技術で公知の種々の修飾をも含む。これらの修飾には以下のものが含まれるが、これらだけに限定されない。すなわち、放射性および化学標識、メチル化、キャップ、荷電結合（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、等）および非荷電結合（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、カルバマイト、等）による修飾ならびにペンダント（pendant）部分を含有する修飾、等のヌクレオチド間修飾、挿入剤、キレート化剤、等である。ＣＢＤをコードする核酸は、本発明のＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質を発現可能な組換え発現ベクターの構築のために使用することができる。核酸構築物は、もしそれが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含有し、そしてその配列がヌクレオチドコード配列に「機能しうる形で連結されている」ならば、タンパク質を発現することができる。「機能しうる形で連結されている」という表現は、制御ＤＮＡ配列および発現すべきＤＮＡ配列が転写および最終的な翻訳を可能とするような方法で結合されている連結を指す。ＣＢＤ融合タンパク質発現ベクターを構築する際は、ＣＢＤタンパク質と第２のタンパク質のオープンリーディングフレームが無傷で、ＣＢＤ融合タンパク質の翻訳が起こることを可能とするように、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸を第２のタンパク質をコードする核酸に連結または結合する。ＣＢＤ核酸は、高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合するセルロース結合ドメインを産生する、またはＣＢＤをコードするｍＲＮＡを産生する種々の細胞源から得ることができる。ＣＢＤをコードする核酸の好ましい供給源は、クロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）である。ＣＢＤをコードする核酸は、第6.1節に記載の方法にしたがって取得することができる。本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸は、細胞源由来の単離され精製されたＤＮＡから、またはゲノムクローニングによって得ることができる。クローンのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、周知の技法を用いて調製することができる。また、ＣＢＤをコードする特定の核酸について、その遺伝子の任意の部分に対して実質的に相補的なヌクレオチドプローブを用いて上記ライブラリーをスクリーニングすることができる。ＣＢＤタンパク質をコードする保存されたヌクレオチド領域の検出を所望するならば、ヌクレオチドプローブは種から種へと保存されてきたＣＢＤヌクレオチド配列に基づくものでなければならない。ＣＢＤタンパク質をコードする独特のヌクレオチド領域の検出を所望するならば、ヌクレオチドプローブは独特のＣＢＤヌクレオチド配列に基づくものでなければならない。または、ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡをPCRクローニングの鋳型として適切なオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用することができる。発現ベクターの構築のため、全長クローン、すなわち所望のＣＢＤタンパク質の全コード領域を含有するクローンを選択することができる。または、オーバーラップする複数のｃＤＮＡを共に連結して完全なコード領域を形成することが可能である。または、当分野の技術で標準的とされている技法を使用して、ＣＢＤをコードするＤＮＡを全体として、または部分的に合成することができる。多くのベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は１）それが核酸増幅に使用されるべきものか、または核酸発現に使用されるべきものか、２）ベクターに挿入される核酸の大きさ、および３）ベクターによって形質転換される宿主細胞、によるであろう。各ベクターはその機能（核酸の増幅または核酸の発現）およびそれが適合する宿主細胞によって種々の構成要素を含有する。「宿主細胞」という用語は、培養によって増殖可能であり、かつＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質を発現可能な細胞を指す。本発明の宿主細胞は、in vitro培養下の細胞を包含し、原核、真核および昆虫細胞を含む。挿入配列の発現を変調する、または遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾またはプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質（例えばメタロチオネインプロモーターに対する亜鉛およびカドミウムイオン）の存在下で促進されうる。したがってＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質の発現を制御することができる。もしＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質が宿主細胞にとって致命的であるならば、その発現を制御する能力は重要である。タンパク質産物の修飾（例えばリン酸化）およびプロセシング（例えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングおよびタンパク質修飾のための特徴的で特異的な作用機構をそれぞれ持っている。発現されたＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするための適切な細胞系または宿主系の選択が可能である。好ましくは、宿主細胞はタンパク質分解酵素の分泌量が最小限のものでなければならない。本発明において、高い親和性を持ってセルロースと結合可能な本発明のＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質をコードする核酸を含有する宿主細胞が提供される。本発明のＣＢＤタンパク質のクローニングおよび発現のために好ましい宿主細胞は、原核細胞である。原核細胞は、大量の核酸の迅速な生産、部位特異的突然変異誘発に使用する１本鎖核酸鋳型の生産、多数の突然変異体の同時スクリーニング、および創出された突然変異体の核酸の配列決定には特に有用である。本発明のＣＢＤタンパク質のクローニングおよび発現のために有用な原核細胞の一例は、Stratageneより入手可能な大腸菌の菌株XL1-blueである。ＣＢＤ融合タンパク質のクローニングおよび発現のために有用な原核細胞のもう一つの例は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphy lococcus aureus）である。ＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質のクローニングおよび発現のために有用な系のさらに別な例は、Invitrogen Corpora tion（San Diego，CA）より入手可能なPichia発現キットである。当業者は、ＣＢＤタンパク質およびＣＢＤ融合タンパク質の組換え発現のために、種々の発現ベクター／宿主系を等しくよく使用しうる。このような系は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、所望のＣＢＤコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌；所望のＣＢＤコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換された酵母、等の微生物；所望のＣＢＤコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）によって感染させられる昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）によって感染させた、または所望のＣＢＤコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞系；または、組換えウイルス発現ベクター（例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス）によって感染された動物細胞系である。上記動物細胞系には、ＤＭ染色体中で安定的に増幅される（例えばCHO/dhfr，CHO/グルタミンシンセターゼ）、または不安定に増幅される（例えばマウス細胞系）ＣＢＤ核酸の多数コピーを含有するように工学的に操作された細胞系が含まれる。ベクターの構成要素は一般的には以下のものを１つまたはそれ以上含むが、それらだけに限定されない。すなわち、シグナル配列、複製起点、１つまたはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列である。これらのベクターの発現エレメントは強度および特異性において様々である。使用する宿主／ベクター系によって、多数の適切な転写および翻訳エレメントの任意のものが使用できる。例えば、原核細胞系を使用してクローニングを行う場合は、原核細胞ゲノムから単離されたプロモーター（例えば、細菌トリプトファンプロモーター）が使用できる。組換えＤＮＡまたは合成技法により作成されたプロモーターもまた挿入配列の転写を引き出すために使用できる。シグナル配列はベクターの構成要素であり得る。または、それはベクターに挿入されるＣＢＤ核酸配列一部であり得る。シグナル配列はＣＢＤ配列に先立つ天然に存在する配列であってもよいし、または天然に存在しない配列であってもよい。シグナル配列は宿主細胞によって認識され、処理されるものでなければならない。複製起点は、宿主生物の独自の複製開始部位を指す。クローニングおよび発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することが望ましい。この遺伝子は、選択培地で培養されている形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。この選択遺伝子を含有するベクターによって形質転換されなかった宿主細胞は、その培地では生存できない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素（例えばアンピシリン）に対する耐性を付与する；栄養要求性欠陥を補う；または複合培地から得ることができない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択機構の一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を使用する。異種遺伝子によって首尾よく形質転換される細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を発現し、したがって選択摂生（regimen）に生き残る。発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識される、そして興味のあるポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、特定の核酸配列（例えば、プロモーターがそこに機能しうる形で連結しているＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質をコードする配列等）の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般に約100 〜1000bp）の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には誘導性および構成的という２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化（例えば、ある栄養素の存在または不在）または温度変化に応答して、自らの制御下で増大したレベルの核酸からの転写を開始させる。現在、宿主細胞となる可能性のある種々の細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素による切断によってプロモーターを供給源の核酸から除去し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することにより、興味のあるポリペプチドをコードする核酸に機能しうる形で連結される。天然に存在するプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方が、興味のあるポリペプチドの増幅および／または発現を引き出すのに使用できる。しかし、異種プロモーターの方が好ましい。なぜなら、異種プロモーターは一般に天然に存在するプロモーターと較べてより大量の転写、および発現された興味のあるポリペプチドのより高い収率を可能とするからである。一般に、宿主細胞に適合する種から誘導されるプロモーターおよび制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主とともに使用される。このベクターは普通、複製部位および、形質点肝細胞において表現型的選択を提供可能なマーカー配列を担持する。例えば、大腸菌は典型的にはある大腸菌種から誘導したプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（ Bolivarら，Gene 2:95［1972］）。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、したがって形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の細菌プラスミドは、組換えＤＮＡ構築に通常使用されるプロモーターおよび他の制御エレメントをも含有するか、または含有するように変更されなければならない。原核宿主と共に使用するのに適切なプロモーターの例は、β- レクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（Changら，Nature 275:615［197 8］;およびGoeddelら，Nature 281:544［1979］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel，Nucleic Acids Res．8:4057 ［1980］およびEPO特許出願公報第36,776号）およびtacプロモーター（H．de Bo erら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:21-25［1983］）等のハイブリッドプロモーターを含む。しかし、他の機能性細菌プロモーターが適切である。それらのヌクレオチド配列は一般公知であり、それによって当業者がプロレラクシン（ prorelaxin）をコードする核酸（Siebenlistら，Cell 20:269［1980］）に、必要とされる任意の制限部位を供給するたリンカーまたはアダプターを用いてそれらのプロモーターを機能しうる形で連結するのを可能とする。細菌系に使用するためのプロモーターもまた、プロレラクシンをコードする核酸に機能しうる形で連結されるShine-Dalgarno（S.D.）配列を含有する。原核宿主細胞に使用される発現ベクターは転写の終結およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列をも含有する。上に掲げた構成要素の１つまたはそれ以上を含有し、また所望のコード配列および制御配列を含む適切なベクターの構築は、標準的連結技法を使用する。単離したプラスミドまたは核酸断片を開裂し、整え（tailored）、必要とするプラスミドを作成するのに望ましい形に再連する。本発明の実施において特に有用なのは、ＣＢＤタンパク質をコードする核酸の原核細胞による発現を提供する発現ベクターである。一般に、発現は、宿主が発現ベクターの多数コピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主中で効率的に複製可能な発現ベクターの使用を伴う。宿主細胞は、上に記載の本発明の発現またはクローニングベクターによりトランスフェクトおよび好ましくは形質転換されて、プロモーターを誘導し、形質転換細胞を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように修正された常用の栄養培地で培養される。「形質転換」は、染色体外因子として、または染色体への組み込みにより、核酸を複製可能なように生体に導入することを意味する。別途記載しない限り、本明細書において宿主細胞の形質転換に使用する方法はCohen，F.N.ら、Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A．69:2110（1972）に記述される塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認する分析のために、連結混合物を使用して大腸菌K12菌株294（ATCC 31446）を形質転換し、成功した形質転換細胞を場合に応じてアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換細胞由来のプラスミドを調製し、制限酵素により分析し、および／またはMessingら、Nucleic Acids Res．9:309（1981）の方法またはMaxamら、Meth ods in Enzymology 65:499（1980）の方法によって配列決定する。宿主細胞を本発明の発現ベクターにより形質転換して、プロモーターを誘導し、形質転換細胞を選択し、または遺伝子を増幅するのに適切なように修正された常用の栄養培地で培養することができる。温度、pH等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用された条件であり、当業者には明らかであろう。本発明のポリペプチドを産生するのに使用される原核細胞は、Sambrookら（19 89）Electrophoresis buffers in Molecular Cloning（Nolan，C.編），Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，NY，pp．B.23-24；Sambrookら（1989）Bacteri al Media in Molecular Cloning（Nolan，C.編），Cold Spring Harbor Laborat ory Press，NY，pp．A.1-4に総説されている適切な培地で培養される。本発明のＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質を産生する宿主細胞の選択は、少なくとも４つの一般的アプローチにより同定できる：（ａ）DNA-DNA，DNA-RNAまたはRNAアンチセンスRNAハイブリダイゼーション：本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸の存在は、ＣＢＤコード配列に相同的なヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブおよび／またはPCR反応用プライマーを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出可能である；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不在：本発明のＣＢＤタンパク質をコードする核酸を持つ宿主細胞の選択は、特定のマーカー遺伝子機能（例えば抗生物質への耐性）の存在または不在に基づいて同定および選択することができる。例えば、ＣＢＤコード配列をクローニングまたは発現ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合は、上記コード配列を含有する組換え体はマーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。または、マーカー遺伝子はＣＢＤコード配列の発現を制御するために使用されるのと同一のまたは異なるプロモーターの制御下で、ＣＢＤ核酸配列と縦列配置することができる。誘導または選択に応答してのマーカーの発現は、ＣＢＤコード配列の発現を示す。（ｃ）宿主細胞におけるＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質ｍＲＮＡ転写産物の発現によって測定される転写レベルの評価：ＣＢＤコード領域の転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイによって評価できる。例えば、ポリアデニル化ＲＮＡを単離し、ＣＢＤコード配列またはその特定部分に相同的なプローブを用いるノーザンブロット法により分析することが出来る。または、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションをアッセイすることができる；および（ｄ）イムノアッセイ、および高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合するタンパク質の能力によって測定されるＣＢＤタンパク質またはＣＢＤ融合タンパク質の検出。ＣＢＤタンパク質の発現は、例えばウェスタンブロット法またはＲＩＡｓ等のイムノアッセイによって、免疫学的にアッセイすることができる。ＣＢＤタンパク質の発現は、発現されたタンパク質の高い親和性を持って、かつ可逆的な様式でセルロースと結合する能力によってアッセイすることができる。「細胞」および「細胞培養物」という表現は相互に取り換え可能に使用されており、このような呼称はすべて子孫および先祖を含む。故意の、または意図しない突然変異により、すべての子孫はＤＮＡの内容において正確に同一ではないかもしれないこともまた理解される。上記細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は、上記の表現に含まれる。本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」の用語は、（1）洗浄のために低いイオン強度及び高い温度、例えば、0.015M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1% SDSを50℃で使用するか、（2）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドのような変成剤、例えば、50%（vol/vol）ホルムアミドを0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウムバッファー、pH6.5と、750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウムとを42℃で使用するか、あるいは（3）50%ホルムアミド、５ x SSC（0.75M NaCl，0.075Mピロリン酸ナトリウム、５ x デンハート溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg/ml）、0.1% SDS、及び10%硫酸デキストランを42℃で、0.2 x SSC及び0.1% SDS中42℃ での洗浄とともに使用する、ハイブリダイゼーション条件を示すものである。本明細書で使用する「復元（recovery）」の用語は、一定の条件下でセルロース-CBDタンパク質結合体からCBDタンパク質を放出するセルロースCBDタンパク質複合体の能力をいうものであり、上記条件としては、放出剤、例えば６M尿素又は６Mグアニジン-HClのような変成剤の使用を含む。セルロース-CBDタンパク質結合体からCBDタンパク質を放出する能力を有する任意の放出剤を使用して、CDB タンパク質を復元することができる。好ましくは、CBDは一時的にだけ変成され、放出剤での処理により不可逆的に分解されないものである。従って、7.1.1、7 .2.1あるいは8.1.4の項に記載したように、CBDは溶出タンパク質の再構成により復元される。本明細書で使用される「開裂剤」の用語の使用は、CBDタンパク質又はCBD融合タンパク質を特異的に開裂し、所望により特定の成分、例えばC BD融合タンパク質の第２タンパク質を放出又は切り出すのに使用される試薬を示すものである。ここで適当な開裂剤としては、酵素、例えばエンドプロテアーゼ、プロホルモンコンバーターゼ、例えばPC1、PC2、フリン、Kex2、ズブチリシン、又はその変異体、並びに化学的試薬、例えば有機及び無機酸、ヒドロキシルアミン、N-ブロモスクシンイミド、及びシアノゲンブロミド等が挙げられる。種々のタンパク質分解酵素によって触媒されるペプチド結合の加水分解は、The Enzy mes，3rd Edition，Boyer，Ed.，Academic Press，Vol．III［1971］；Meth．En zymology.，Vol．XIX，Perlman and Lorand，Ed.，New York：Academic Press［ 1970］；Meth．Enzymol.，Vol．XLV，Lorand，Ed.，New York：Academic Press ［1976］；Drapeau，J．Biol．Chem.，253:5899-5901［1978］及びDrapeau，Met h．Enzymology.，47:89-91［1977］に教示されている。化学的試薬の広範なリストについては、Witcop，Advances in Protein Chemistry，Anfinsen et al.，ed .，16:221-321，Academic Press，New York［1961］，p．226の表III等を参照されたい。ここで適当なその他の開裂剤は、開裂についての所望の接合、及び試薬がCBD融合タンパク質の還元又は酸化された形態に作用し得るかどうかを考慮して、当業者に理解されるであろう。CBD融合タンパク質の開裂に使用する条件は使用した開裂剤に依存することとなり、条件は使用する開裂剤を与えられた当業者により容易に理解されるであろう。本発明のCBD融合タンパク質は、融合タンパク質の第２タンパク質が融合タンパク質の内部アミノ酸である場合には、所望の位置、即ち上流、好ましくはCBD融合タンパク質の第２タンパク質のN-末端に隣接する位置、もしくは下流、そして好ましくは第２タンパク質のC-末端に隣接する位置、又はその両方において所望の開裂剤により開裂を得るのに必要なコドンを含むように設計され構築されている。本明細書で使用される「グリコシル化」及びその文法的な変形は、一連の糖残基をタンパク質に付加して糖タンパク質を生成する、翻訳後の改変工程を示すものである。グリコシル化は、哺乳類細胞の細胞質、細胞質内網状構造、又はゴルジ体で起こり得る。あるいは、グリコシル化は、合成的方法、例えば適当なグリコシル供与体を与えることによって得ることができる。例えば、Kahne，et al． J．Am．Chem．Soc.，111:6881-2［1989］を参照。本発明は、本発明のCBD融合タンパク質を使用することによる、試験試料中、特に組織抽出物又は血清もしくは尿のような生物学的流体等の生物学的試料中の対象となるタンパク質の診断的検出にも係わる。生物学的試料は好ましくは哺乳類起源のものであり、最も好ましくはヒト起源のものである。哺乳類の生物学的試料中で検出されるべき好ましい対象のタンパク質は、HSPタンパク質、HSP抗体、交差反応性HSP関連タンパク質、あるいはその抗原性部分である。哺乳類の生物学的試料中のHSP抗体の存在は、例えば、インシュリン依存性糖尿病（IDDM）を予測させるもの、又はそれを示すものとなり得る。本発明の１つの態様においては、CBDタンパク質Ａ融合タンパク質は第３のタンパク質、IgG抗体、例えばIg G抗-HSPを含み、これは当分野で周知の種々の免疫アッセイ形式を使用して、生物学的試料中の抗原、例えばHSPの存在を検出するのに使用される。あるいは、CBD融合タンパク質の第２のタンパク質は抗原決定基であるエピトープを含み、これはその抗原決定基を認識する抗体の検出において有用である。好ましいエピトープはHSPタンパク質である。タンパク質Ａは、Staphylococcus aureusの細胞壁中に発見されたタンパク質であり、IgG分子のFc部分に結合し、従ってこの抗体を沈降させる。タンパク質Ａは、免疫アッセイ、例えばRIA又はELISAにおいて有用性を有し、これらの免疫アッセイにおいて抗体又は抗原−抗体複合体を単離するのに使用される。本発明においては、タンパク質ＡはCBD融合タンパク質の好ましい第２のタンパク質である。CBD-タンパク質Ａ融合タンパク質は、抗体又は抗体−抗原複合体の存在を検出し、又はその量もしくは濃度を測定する、診断的免疫アッセイにおいて有用である。本発明のCBD-タンパク質Ａ複合体タンパク質は、セルロース及びCBD-融合タンパク質を含み、CBD融合タンパク質成分がセルロース、及び第２の成分（例えば抗体−抗原複合体又は抗体のIgGの両方）に結合する能力を有する診断キットにおいても有用である。本発明のCBD融合タンパク質は、抗体又は抗原決定基、即ちエピトープのアフィニティ精製のための手段としても有用である。好ましい本発明の抗原決定基は、HSPタンパク質、その関連タンパク質又は抗原部分である。CBD融合タンパク質の好ましい第２のタンパク質はHSPタンパク質又は抗-HSP I gGを含む。本発明においては、CBD-HSPエピトープ融合タンパク質は、ヒト哺乳動物の血清中に見られるHSP抗体の量を測定するように設計された免疫アッセイにおいて有用である。本発明の別の態様においては、CBD-融合タンパク質は、セルロース又はキチンに結合する能力を有するCBD成分と、その触媒活性を有する酵素である第２成分とを含む。この態様のCBD-融合タンパク質は、セルロース又はキチンの固体基体上での酵素触媒反応を可能とする手段としての有用性を有する。上記したように、CBD-酵素融合タンパク質は、標準的な化学的方法により精製CBDを精製酵素調製物に結合するか、あるいは組換え技術によるCBD及び酵素をコードする核酸の発現により調製することができる。本発明のこの態様の１つの例においては、CB D-融合タンパク質の第２の成分はヘパリナーゼ酵素である。CBD-ヘパリナーゼは、セルロース基体上に固定されることができ、ヘパリンの成分糖部分への変換を触媒する。また別の本発明の形態は、CBDの植物組織の成長を改変させる能力に関する。そのような能力は、農業、例えば花粉管及び／または根の成長を促進することが望ましいような場合に用途がある。さらに、高濃度のCBDは根の成長を阻害する能力を有するので、望ましくない植物、例えば「雑草」植物の発達を阻害するのに有用である。他の例においては、CBDは真菌類、例えばキノコの成長を促進する用途があり、この場合CBDはキチンに結合し、発生中の子実体の増殖及び／または発達を刺激する。また別の本発明の形態は、昆虫の外骨格又は中腸を含むその他の部分のキチンに結合するCBDの能力に関する。そのような能力は、CBDを生物的殺虫剤として使用することに用途があり、この場合CBDは、昆虫有害生物をコントロールするのに有用な微生物、例えばBacillus thuringiensis（BT）もしくはその他のBTトキシン遺伝子を発現する微生物、又はキチナーゼを分泌する真菌に結合される。CBD は微生物を昆虫のキチン部分に結合するように機能し、微生物が生産したトキシン又は酵素により昆虫有害生物を死亡させる。本発明のこの態様の１つの形態においては、CBD-微生物複合体を、昆虫有害生物が蔓延しやすい、又はその危険がある植物の部分に直接施用するか、あるいはCBD-微生物複合体を、昆虫有害生物が蔓延する圃場に置かれる誘引餌置場又は昆虫有害生物が蔓延する植物上に固定することができる。本発明のこの態様の別の１つの形態においては、CBD-微生物複合体を、木材又はセルロースをベースとする製品に施用して、木材を破壊する昆虫有害生物の蔓延を防止しコントロールする。例えば、CBD-微生物複合体を、電信柱、木材又はセルロースをベースとする構造の部材に施用すると、CBD成分は侵入する昆虫にしっかりと結合し、複合体の微生物が有効に昆虫有害生物を制御する。本発明のさらに別の形態は、有毒な環境汚染物質の生物学的改善又は分解に有用な真菌類を含む真菌類に見られるキチンに結合するCBDの能力に関する。この態様の１つの形態によれば、第２の成分が環境汚染物質を分解する酵素であるCB D融合タンパク質を使用する。CBD-酵素融合タンパク質は、セルロース基体又は酵素分解により環境から汚染物質を除去するのに使用される装置に固定することができ、例えば該装置を地上水又は地下水の流れの中に置くことにより汚染物質を除去する。本発明のこの態様の代替的な形態によれば、生物学的仲介に有用な酵素、即ち殺虫剤のような環境汚染物質を分解する酵素を分泌する真菌にCBDを結合する。CBD-真菌複合体はその後セルロース基体上に固定され、DD Tのような殺虫剤、又は伐採、製材作業から出た木材含有生成物等の環境汚染物質を酵素的に分解するのに有用な装置が提供される。１つの具体的な例においては、CBDは白腐れ病菌、例えばPhanerochaete chrysosporiumと複合化され、これはリグニンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼを生成し、殺虫剤DDT を分解する。CBD-真菌複合体は、例えばDDTのような殺虫剤を環境から除去する生物学的改善手段として有用である。本明細書中で使用する「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（MAb）、人体に適合化された又はキメラ化された抗体、単鎖抗体、抗−イディオタイプ（抗-Id）抗体、及び上記のもののいずれかのエプトープ結合フラグメントを包含することを意味するものである。エピトープは抗原性分子の抗原決定基をいうものである。 IgGの用語は、抗体の種類を示すものである。IgGは２つの軽鎖と２つの重鎖を含むテトラマーであり、全免疫グロブリンの80%を占める。本明細書で使用する「検出可能な標識」の用語は、直接的に又は間接的に検出可能な信号を与えるあらゆる標識をいうものであり、例えば、酵素、放射活性標識分子、蛍光剤、粒子、化学発光物質、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、磁気粒子等を含む。本発明において検出可能な標識として有用な酵素の例は、アルカリホスファターゼ及び西洋わさびパーオキシダーゼである。種々の方法により検出可能な標識を対象のタンパク質に結合することができ、例えば、西洋わさびパーオキシダーゼのような酵素を対象のタンパク質に結合するための4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロ - フェニルスルホンのような２官能試薬の使用がある。結合された酵素は基質と反応させられ、検出可能な反応生成物を生成する。 CBDタンパク質を含む検出可能な標識を使用することにより対象の物質のフェムトグラム量の検出を可能とする信号増幅方法も本発明の範囲内に含まれるものである。この方法においては、第１のCBDタンパク質はCBD融合産物の部分であり、これはセルロース-CBD融合産物結合体を形成するのに適した条件下にセルロース繊維とともにインキュベートされる。過剰な標識化CBD、例えば西洋わさびパーオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼのような酵素、又は蛍光剤もしくは化学的染料に融合又は結合したCBDは、過剰な標識化CBDの結合を可能とするのに適した条件下にセルロース-CBD融合産物結合体とともにインキュベートされる。過剰な標識化CBDのセルロース-CBD融合産物結合体に対する結合は、対象の物質の非常に小さい量の検出を実質的に可能とする。本発明の信号増幅方法においては、好ましいセルロース繊維は小石で粉砕した（pebble-milled）セルロース繊維である。小石で粉砕したセルロース繊維は種々の化学染料で染色することができ、あるいはセルロースと結合するほたる石（calcofluor）と混合することができ、UV照射時に強く明るい青い蛍光を生成する。第１のCBDタンパク質が、セルロース-CBD融合産物結合体の形成に適した条件下にセルロース繊維とインキュベートされるCBD融合産物の部分であり、結合体に温度循環的増幅反応が起こされる、固相ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）も本発明の範囲内に含まれる。ストレプトアビジン／ビオチン検出系を使用することも本発明の範囲に含まれる。ビオチンはストレプトアビジンと強固で実質的に付加逆的な複合体を形成することができる。本発明のこの形態においては、ストレプトアビジンに融合したCBDタンパク質を含むCBD融合産物が与えられる。当分野の技術者には日常的なものと考えられる技術によりヌクレオチドまたはタンパク質をビオチニル化して、対象の物質に結合することができるビオチニル化キメラプローブを形成する。このビオチニル化プローブを対象の物質とインキュベートし、CBD- ストレプトアビジンをビオチニル化プローブとインキュベートし、検出可能な標識を使用してビオチニル化プローブ、従って対象の物質を測定する。検出可能な標識は信号増幅法において上記したようなものであってもよく、あるいは蛍光剤又は染料のような任意の標識であってもよい。 CBDの融合相手がモノクローナル抗体であるCBD融合産物を治療的又は診断的に使用することも本発明の範囲内にあるものである。例えば、（i）高いアフィニティでセルロースに結合でき、それと自然において関連しているその他のタンパク質を実質的に含まないCBD、及び（ii）抗原と結合できるモノクローナル抗体を含むCBD融合産物を、薬剤／セルロース複合体又はイメージング剤／セルロース複合体を前記抗原を生成する癌細胞に指向させる方法に使用することができる。この態様においては、CBD-モノクローナル抗体（あるいは類似の抗体フラグメント、scFvフラグメント又はその抗原結合部位）融合産物を哺乳動物に投与する。CBD融合産物の投与と同時に又はその後に、薬剤／セルロースまたはイメージング剤／セルロース複合体を投与する。薬剤／セルロースまたはイメージング剤／セルロース複合体の抗原の部位に局所化されたCBD-融合産物に対する結合は、薬剤またはイメージング剤を所望の治療的又は診断的活性に関連した部位に向かわせる。６．実施例：推定セルロース結合ドメインのクローン化のための実験方法 6.1. 材料及び方法 6.1.1. 細菌株及びプラスミド StrateGene（La Jolla，CA）からのE．Coli Xl１Blue株を全てのクローン化実験に使用した。E．Coli BL21（DE3）及びpET-8cは記載されたものであった（Stu dier et al.，J．Mol．Biol．189:113-130［1986］）。 6.1.2. 材料 PCバッファー、pH7は50mM KH₂PO₄、10mM Na₃3C₆H₅O₇（クエン酸ナトリウム）及び１mM NaN₃を含むものであった。TEDGバッファー（Chang et al.，J．Bacter iol．172:3257-3263［1990］）は、10mMトリス、pH7、0.1mM EDTA、0.1mMジチオトレイトール及び5% v/vグリセロールを含むものであった。トリスはpH7において低いバッファー能力しか有していないが、水素イオンが生成されずまた使用されないのでこのバッファーが適している。制限エンドヌクレアーゼはBRL（Bethe sda，MD）からのものであった。その他の全ての使用した化学物質は、市販されているものの最も rp．（Philadelphia，PA）からのものであった。吸着綿はSeamless 繊維はWeyerhaeuser（Tacoma，WA）からのものであった。カニ甲羅からの顆粒状キチンはSigmaから入手できる。その他の全ての結合基体はSigma Chemical Co. ，St．Louis，MOから購入した。多糖類のそれぞれは使用の前にPCバッファーで２回洗浄した。多ら供給されたままのその乾燥重量を示すものである。上記の３種の結合基体は大きな粒子径を有しておりアッセイを阻害するものであった。ニゲランはその固体を熱水に溶解して再結晶し、濾過 Woodミニミルで５分間処理することにより小さくした。 6.1.3. 推定セルロース結合ドメインのクローン化推定CBD（CbpA残基28-189）に隣接するcbpAの領域（Shoseyov et al.，PNAS U SA 89:3483-3487（1992））に相補的なDNAプライマーをGene Assembler Plus（P harmacia）により合成した。フォワードプライマーはNcoI制限部位（認識配列： CCATGG）とともに遺伝子フラグメントを有するフレーム内のATGを含んでおり、これはpET-8cベクタークローン化部位中にクローン化されたときに翻訳開始コドンとして機能する。リバースプライマーは停止コドンとBamHI部位を含んでいた。20pmolの各プライマー、200μM dNTPを使用し、１ng cbpA DNA［（Shoseyov e t al.，1992,上出）のようにベクターpGEMEX-1（Promega）中にクローン化したもの］を鋳型として使用して、全容量100μlでポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。TaqポリメラーゼはAmershamからのものであり、製造者の推奨するバッファー条件を使用した。PCRはこれまでに記載されたように40サイクル行った（Innis et al.，Optimization of PC Rs，PCR Protocols Ed．Innis et al.，Pub．Academic Press，San Diego，pp． 3-12［1990］）。PCR生成物をフェノール／クロロホルム抽出により精製し、その後エタノール沈降を行い、70%エタノールで洗浄し、次いで真空下に乾燥し、2 7μlの蒸留水中に再懸濁した。次にDNAをNcoI及びBamHIにより切断し、TBAバッファー中の2.5%低融点アガロース（Nuseieve GTG，FMC）ゲル上に流した（Sambr ook et al．（1989）Electrophoresis buffers，Molecular Cloning（Nolan，C ．ed.），Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，pp．B.23-24）。エチジウムブロミドで染色されたDNAバンドを長波長紫外光で可視化し、ゲルから切断した。ベクターのプラスミドpET-8cは、１μgのpET-8c DNAをNcoI/BamHIで切断し、直鎖化されたDNAバンドをゲルから切断することにより製造した。ベクター及び挿入DNAを、100ngのベクターDNA及び300ngの挿入物を使用してTakara Ligat ionキットで連結した。連結されたプラスミドを使用してコンピテントなE．Coli XL1-Blue株を形質転換し、これを100μg/mlアンピシリン及び12.5μg/mlテトラサイクリンを含むLBプレート（Sambrook et al．（1989）Bacterial Media，Mol eculaer Cloning（Nolan，C．ed.），Cold Spring Harbor Laboratory Press，N Y，pp．A.1-4.）上にプレート化した。37℃における一晩のインキュベートの後、コロニーを選択し、アンピシリン及びテトラサイクリンを含む液体LB培地中で増殖させた。各培養物からのプラスミドDNAをこれまでに記載されたようにして回収し（Sambrook et al．（1989），Molecular Cloning（Nolan，C．ed.），Co ld Spring Harbor Laboratory Press，NY）、制限酵素で消化して前記遺伝子フラグメントの挿入を確認した。挿入配列を、Shoseyov et al．（1992）PNAS USA 89:3483-3487に報告されたものと同じ方法を使用したDNA配列決定により確認した。 6.1.4. CBDの発現過剰発現ベクター（pET-CBD）により、E．Coli株BL21（DE3）中で17kDa CBDを過剰生産することが可能となる。CBDは封入小体中に少なくとも70mg/リットルまで蓄積された。しかし、約20mg/リットルの追加的な量の水溶性CBDが前記E．Col iの水溶性超音波抽出物から回収できた。透明にした抽出物を（Sigmacell 20）セルロースと混合し、次にCBD-セルロース複合体を１M NaCl溶液及び蒸留水で洗浄し、非特異的なタンパク質を除去し、その後6Mグアニジン-HClにより純粋なCB Dを溶出した。CBDは室温におけるゆっくりとした透析により完全に復元され、セルロースに結合するその能力を回復した（図10、レーン２）。７．実施例：CBDタンパク質の精製 7.1. CBDタンパク質の製造 7.1.1. CBDタンパク質の精製前記挿入物を含むプラスミドDNAを使用してE．Coli BL21（DE3）を形質転換した。プラスミドを含む培養物を37℃においてアンピシリン（100μg/ml）を含むN ZCYM（Sambrook et al．（1989），Molecular Cloning（Nolan，C．ed.），Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY）培地中でKelett読み取り量160（グリーンフィルター）まで振盪しながら増殖させた。この時点で、１mMの最終濃度までIPTGを加えた。４時間後、遠心分離により細胞を回収し、10μg/mlのRNアーゼAと１μg /mlのDNアーゼIを含む、50mMリン酸/12mMクエン酸pH7（PC）バッファー中に再懸濁し、氷上でBiosonic II ソニケーターで最大出力により45秒間超音波処理し、 15秒間冷却期間をとり、これを全部で４回繰り返すことにより溶解した。１Ｌ細胞培養物の不溶性フラクションを遠心分離（12,000ｇ、４℃で30分）で回収し、 20mlの6MグアニジンHCl中に再懸濁した。これをときどき攪拌してペレットを分散させながら30分間氷上に保持した。不溶性断片を遠心分離（12,000ｇ、４℃で 30分）で除去した。TEDG復元バッファーで可溶性グアニジンHCl抽出物を400mlの全容量まで４℃で２時間かけて徐々に希釈した。80%飽和まで硫酸アンモニウムを添加した。４℃で４時間の後、沈降したタンパク質を遠心分離（12,000ｇ、４ ℃で30分）で回収し、40mlのPCバッファー中に再懸濁し、PCバッファーに対して透析した。以下のようにしてセルロース上のアフィニティークロマトグラフィーによりCb pAのCBDタンパク質フラグメントをさらに精製しにより溶液からCBDタンパク質を除去した。各添加の後、懸濁液を平衡に達するようにした（室温で１時間ゆっくりと回転させる）。その後次の添加の前に遠心分離によりセルロースを回収して除いた。３グラムのセルロースを１M NaCl/PC バッファーで１回、PCバッファーで２回洗浄した。10mlの6M尿素で３回洗浄することにより、精製したCBDをセルロースから溶出した。尿素フラクションを集め、PCバッファー（４℃〜ほぼ室温）に対して透析した。最終的な精製フラクション中のタンパク質濃度を、MicroBCAタンパク質アッセイキット（Pierce，Rockford，IL）により、ウシ血清アルブミン（BSA）標準を使用して、比色法で分析した。 7.1.2. CBD-セルロース解離定数及びセルロース結合能の測定 CBDタンパク質の試料（典型的には０〜100μg）を、１mg/mlBSAと所望量のセルロースを補充したPCバッファー（典型的にはPCバッファー中に10mg/mlセルロース及び１mg/ml BSAを含むストックスラリーから添加された１mg）を含む1.5ml 容量のマイクロフュージ管に入れた。可能性のある競合物、例えばセロビオース（４mg/ml）あるいはカルボキシメチルセルロース（CMC，４mg/ml）を、PC/BSA バッファー中の20mg/mlストック溶液の200μｌを加えることにより含有させた。最終容量は常に１mlとした。バッファーのpHは特に記載しない限り7.0とした。他のpHでの実験のために、濃HClまたはNaOHを添加することによりPC/BSAバッファーを調整した。 37℃において垂直方向に１時間回転させることにより（30RPM）アッセイ管を混合した。その後試料をマイクロフュージ管中で１分回転させてセルロース及びセルロース−タンパク質複合体を沈殿させた。バッファーを除去した後、１mlの PCバッファー中に再懸濁することによりペレットを洗浄した。洗浄液を遠心分離により分離し、捨てた。ペレットを最終的な１mlのPCバッファー中に再懸濁した。（［C］及び［PC］は同程度に濃縮されているので、遠心分離工程により平衡が乱されることはないと考えられる。）非特異的吸着はなくペレット中の液体容量は10μlであるとして、アッセイ管中の最初のBSA（約１mg/ml）のうち約0.1μgのみが洗浄工程の後に残存した。この残留BSAによる発色も全て0 CBD対照管により考慮した。このよく混合された懸濁液のアリコート（150μl）をMicroBCAキットによるタンパク質測定のために採取した。試料容量をPCバッファーで0.5mlにし、これに0.5mlのBCA作用試薬を加えたこと以外は、製造者の指示に従った。アッセイ混合物を60℃で30分間インキュベートした。タンパク質濃度を透明にされた上清から562nmにおいてShimadzu 160U分光光度計で比色測定により測定した。CBDタンパク質を加えなかったアッセイ管を使用して、セルロース及び残留BSAにより起こった少量の発色を補正した。データをBSA標準と比較し、各試料においてセルロースに結合したタンパク質の量を測定するために作成した希釈物を収容するように調整した。このアッセイの実用的な検出限界は約0.2μg/mlであった。希釈物についての補正の後には、これはアッセイ管中のセルロースに結合したCBDの約0.034nmolに相等する。遊離のCBDタンパク質濃度［P］は、結合タンパク質濃度［PC］を管に加えた全CBD ［P］₁から差し引くことにより決定した。［P］=［P］_c-［PC］（1）系は単純な平衡相互反応（Segel，1975）を想定することにより分析した。ここで解離定数K_dは以下のように定義される。データは、セルロースの異なる固定レベル（式４）及びＷにおける1/［PC］対 1/［P］の二重逆数プロット、及び［PC］/［P］対［PC］のScatchardプロット、により分析した。セルロースは可溶性の成分ではなく、［C］は単位容量当たりのバッファーに露出されたセルロース表面上の結合部位の濃度を示すことに留意しなければならない。同様に、［PC］は単位容量当たりの結合部位−タンパク質複合体の濃度を示す。DeltaGraphProfessionalプロットアプリケーション（Deltapoint，Inc.， Montere y，CA）を使用して、最小自乗法によりデータの点に直線を合わせた。各点は、同じ結合アッセイ管からの３回の独立したタンパク質アッセイの平均とした。実験は２回ずつ行った。K_d及びPC_max/gセルロースを求めるために少なくとも２種の異なるセルロースの量を使用した。これらの値を平均して表Ｉ、図９に挙げた値を得た。セルロースに対するCBDの結合についての温度の影響を測定する実験を行った。200μlのCBD（40μg）を300μlの50mM PCバッファーpH６、１M NaCl（最終濃度）及び１mgのセルロースに加えた。CBD/セルロース混合物のいくつかの混合物を異なる温度（16〜60℃）でときどき攪拌しながら１時間インキュベートし、その後10,000gで５分間遠心分離した。ペレットを１M NaClを含むPCバッファーpH ６で２回洗浄した。40μlの６Mグアニジン-HClを懸濁したペレットに加え、室温でさらに30分間インキュベートした。遠心分離の後、20μlの試料を780μlのddH₂ O中に希釈し、Bio Radキットを使用してタンパク質濃度を測定した。 7.1.3. その他の多糖類に対する結合の測定イに使用して、これらがCBDタンパク質の基体となるかどうかを調べた。すべての場合について、使用した方法は、セルロースに対する結合を測定するのに使用したものと同じものとした。キチンはMicroBCAアッセイにおいて非常に高いバックグラウンドを示し、これは60℃でのインキュベート時間に比例して増加し、発色時間は15分に減少した。キチンの高いバックグラウンドのために、まったく異なる２つの濃度のみを使用した。 7.2. 結果 7.2.1. ビンディングアッセイ用ＣＢＤの精製ＣｂｐＡ（残基２８〜１８９）の推定ＣＢＤ領域を選択的に生成させるために、ＣｂｐＡの塩基６７〜８６及び５５８〜５７９に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした（図１）。図２に示すように、これらプライマーを、ＰＣＲ産物の一端にＮｃｏＩ部位とＡＴＧ開始コドンを作り、他端にＴＡＧ停止コドンとその後に続くＢａｍＨＩ部位を作るために、ミスマッチを有するようにデザインした。次いで、この遺伝子断片をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドｐＥＴ−８ｃ内にクローン化して、プラスミドｐＥＴ−ＣＢＤを得た。Studie r，F．とB.A.Moffatt（1986）J．Mol．Biol．189:113-130を参照のこと。このクローン化遺伝子断片はＣＢＤのＮ末端でメチオニンをコードするが、ＣＢＤａａ配列の残りはＣｂｐＡの残基２８〜１８９に対応する。このタンパク質断片は１７６３４の分子量を有する。その挿入はＤＮＡ配列分析により証明された。ＣＢＤタンパク質をｐＥＴ−ＣＢＤを収容する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞により産生させた。ＩＰＴＧを添加すると、この宿主株はｐＥＴベクター内のＴ７プロモーターを認識するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを産生する。このｃｂｄ遺伝子断片は誘発可能なプロモーターの制御下にあったので、誘発後にＣＢＤタンパク質が大量に合成された（図３）。４時間産生後、溶解した細胞からの可溶性抽出物は少量のＣＢＤタンパク質しか含有しなかったが、殆どは不溶性画分中に見出された。このタンパク質は、濃塩酸グアニジンに容易に溶けるものであり、ＴＥＤＧ緩衝液中にゆっくり希釈することにより復元された。このようにして調製したタンパク質はあることを証明するものである。この画分は殆どＣＢＤタンパク質であるが、記載したアッセイはこのタンパク質が高純度であることを必要とする。この純度は、第７．１．１．節に記載した単一セルロース−アフィニティー結合工程により提供される。アフィニティー精製ＣＢＤタンパク質は、クマシーブリリアントブルーで染色すると、アクリルアミドゲル上で単一バンドとして現れる。１Ｌの培養液から採取した細胞から約７０ｍｇのＣＢＤタンパク質を回収することができる。 7.2.2. セルロースへのＣＢＤの結合の時間的推移及び温度の作用過程の幾つかの特徴を明らかにしている：度（即ち、［Ｐ］_O）で、１．２μＭ複合体の平坦域値（即ち、［ＰＣ］）は６０分で達成される。別の実験では、このセルロースサンプルの最大ＣＢＤ結合能力は、２．１μモル×ｇ^-1であることが証明されたが、これは２．１μＭ全セルロース部位の有効濃度に（即ち、［Ｃ］_O）に相当する。平衡が達成されたと仮定すると（このこと以下で証明された）、［Ｐ］［Ｃ］／［ＰＣ］として定義されるＫ_dは約０．６μＭである。（b）可逆的Bi Uni反応（Cepellos & Bielski，1980；Wilkinson，1980）についての積分速度式から計算される会合についての二次速度定数（ｋ₁）は約２．７×１０⁴Ｍ^-1×分^-1 （５０〜６０分の数ポイントについての平均値）である。ｋ¹Ｋ_dとして計算された複合体の解離についての速度定数（ｋ_-1）は、１．６×１０^-2×分^-1（ｔ_1/2 ＝４３分）であった。複合体解離についてのこの比較的長いｔ_1/2で、結合ＣＢＤを大きく損失することなくＣ＋ＰＣペレットを１回洗浄することができた。（初期ペレットの再懸濁及び再遠心分離は１分未満で終了した。この間に３％未満の結合ＣＢＤが失われたであろう。）インキュベーションを長くした後では、測定される［ＰＣ］は下り坂となり、１８時間後には最大値の約５０％のレベルまで低下することも認められた。この減衰は、タンパク質が徐々に変性することにより起こるらしい。これら作用から生じる人為的結果を少なくするために、我々は平衡が“完了”すると考えられる最短インキュベーション時間を用いた。（６０分を越える結合のあらゆる更なる増加は実験誤差により打ち消されるであろう。）セルロースへのＣＢＤ結合は４．５±０．５ｍｇ／ｇセルロースであり、約１６〜約６０℃の温度範囲によっては影響を受けなかった。 7.2.3. ＣＢＤ−セルロース結合親和性及び結合能力の分析典型的な診断プロットを示す。実験誤差の範囲内でこれらプロッは一次であり、約０．６μＭのＫ_d及び２．１μモルＣＢＤ結合のｇ当たり約３７ｍｇのＣＢＤタンパク質に相当する。この診断プロットの一次性は、１タイプだけのＣＢＤ−セルロース相互作用が起こっていることを示唆している。調べた。表１、つまり図９は、それぞれの基質について見出されたＫ_d及びＰＣ_m _ax の値を示す。Sigmacell 20及び50は、微結晶型のセルロースとして記載されており、これら物質もＣＢＤ維（アセトバクター・キシリナム）（Acetobactor xylinum）からの結晶性セルロース）の如き高度に結晶型のセルロースは、実質的により多くのＣＢＤ（基質ｇ当たり６．４μmol ＣＢＤまで）に結合することができる。しかしながら、より処理が進んでいるために天然結晶型をあまり含有していない繊維状及び微粒子状セルロースは、より少量のＣＢＤにしか結合しないことが分かった。ＣＢＤ− セルロース解離定数は全ての型のセルロースについて大体同様であったが、ＰＣ_max は３０倍幅で変動した。 7.2.4. 結合部位競合性するかどうか確認するために、セロビオース（β−１，４結合グルコース二量体）及びＣＭＣ（セルロースの可溶性誘導体）をイに含めた。表１、つまり図９に示すように、Ｋ_d又はＰＣ_maxにおいて有意差は認められず、これら可溶性炭水化物はAvicel 7.2.5. 解離定数へのｐＨの影響Ｃ．セルロボランス（cellulovorans）は、ｐＨ７当たりでしか生育しない中性好性の微生物である（Sleatら，1984）ので、殆どの結合アッセイについてこのｐＨを用いた。しかしながら、他の実験で５．０〜８．０の範囲にかけてのｐＨではＫ_d及びＰＣ_maxは大して変化しなかったことが証明された。加えて、ｐＨ３．５程度の酸性又はｐＨ９．５程度の塩基性のＰＣ緩衝液は、ることが注目された。 7.2.6. 他のポリサッカライドへのＣＢＤの結合ＣＢＤの結合特異性を調べた。これらのうち、キチンだけがＣＢＤペプチドの測定可能な結合を示した（表１、図９）。キチン− た。 7.3. 結果我々の結果は、ＣｂｐＡがセルロース結合を担うドメインを含有すること、及びこのドメインがＣｂｐＡの残りの部分から独立に機能することを示している。精製手順で変性及び復元工程を用いたので、その精製タンパク質が機能性であるという事実は、ＣＢＤタンパク質配列がそのタンパク質断片の正確な折り畳みにとって十分なものであることを示している。我々は、アッセイ試験管へのＣＢＤの非特異性結合が平衡結合実験を行うのに問題となることが分かったので、ＣＢＤとセルロースを過剰ＢＳＡの存在下で平衡にするアッセイを開発した。ＢＳＡは、試験管との非特異性ＣＢＤ相互作用を効果的に排除する。平衡に達した後、セルロース及びセルロース−タンパク質複合体を集めて洗浄してから、結合したタンパク質をアッセイする。先に記載したように、ＣＢＤ−セルロースの解離はゆっくりしているので、速やかな洗浄工程の間に検出可能な量が離れることはない。結合したＣＢＤをタンパク質アッセイにより直接測定し、そして第7.1.2.節の等式１に示す通りにその結合したＣＢＤを総ＣＢＤから差し引くことにより遊離のＣＢＤを計算した。この方法は、低い親和性でセルロースに非特異的に吸着されたあらゆるＣＢＤ分子がこの洗浄工程で除去されるので、ＣＢＤとセルロース表面との間の特異的な高親和性相互作用をより正確に反映するデータをもたらすという利点を有する。図５に示すように、このタイプのアッセイを用いて収集したデータは（実験誤差の範囲内で）一次診断プロットを生じる。二重逆数プロットは、可逆的Bi Uni系について結合親和性及び結合能力を決めるのに便利で慣用的な方法である。このアッセイの妥当性は、用いたセルロースの量と共にＰＣ_ma _x が一次的に増加する一方で、Ｋ_dはセルロース量に非依存的であるという観察結果により支持される。表１、つまり図９は、幾つかの型のセルロースと他の炭水化物とで得られたデータを示す。これら結果は、“結晶性”と記載されたタイプのセルロースが、それらの結晶性の多くを失ってしまった高度処理セルロースよりも高いＣＢＤ結合能力を有することを示している。セルロースサンプルのＰＣ_max はセルロースのタイプが相違すると大きく変動するが、Ｋ_dは一定のままであるという事実は、我々がＣＢＤとセルロースとの間で起こる１つのタイプの強いタンパク質−セルロース相互作用を測定したことを示している。より高度に処理されたセルロースのより低いＰＣ_maxは、そのサンプル中の潜在的タンパク質相互作用部位のより少ない数を反映しているので、そのサンプルの結晶性と相関するように思われる。理論により限定されることを望まないが、この結果は、結晶性セルロースには、それを結合基質として受容性にする幾つかの格別な特徴があるのに対して、非晶質セルロースにはそれが欠けているということを示していよう。ＣＢＤの基質特異性の特徴を更に明らかにするために、我々はセルロース結合への添加可溶性基質（セロビオース又はＣＭＣ）の作用を測定した。過剰のセロビオース又はＣＭＣは、表１、つ何の作用も有さなかった。この競合性の欠如は、ＣＢＤ認識部位が簡単なグルコース又はセロビオース部分の繰り返し体よりもっと複雑な何かに特異的であることを示唆しており、そして更には、おそらく、セルロース鎖の特別な三次元配置が必要であろうことを示唆している。結晶性セルロースに対するＣＢＤの特異性は、キチンに堅く結合することが知られているキチナーゼ、つまりＮ−アセチルグルコサミンのβ−１，４結合でのポリマーを思い起こさせる。セルロースと同じく、キチンは、供給源及びそれの単離に際して用いられる精製方法に依って種々の型をとる（Cabib（1988）Metho ds Enzymol．161:460-462；Blackwell（1988）Methods Enzymol．161:435-442）。キチナーゼのアフィニティー精製に用いられるキチンは、鎖がアンチパラレルに配列しているα−キチンである。この型のキチンは結晶性で、天然結晶性セルロース（しばしばセルロースＩといわれる）の構造と類似の構造を有する。セルロースＩは、セルロース鎖がアンチパラレル配置にあるセルロースIIとは対照的に、セルロース鎖がパラレルな束に配列した型である。苛酷な条件下でセルロースＩを処理するとその分断が起こってセルロースIIができる。両方の型とも、広範囲の水素結合形成のために結晶性である。我々が単離したＣＢＤはあまり処理されていない型のセルロース、即ち、大きなセルロースＩに結合するので、我々はＣＢＤが類似の結晶構造を有するとはいえ鎖の方向が反対のα−キチンに結合するかどうかを見ることに興味を持った。驚いたことに、我々は、ＣＢＤがキチンを結合基質として受け入れ、セルロースと非常に類似するＫ_dを有することを見出した。Xylan（β−１，４キシロース）、ニゲラン（α−１，４及びα 75（α−１，３分枝を有するα−１，６グルコース）（Coutinhoら，（1992）Mo l．Microbiol．6:1243-1252）も試験したが、ＣＢＤはそれらのいずれに対してもこのアッセイ条件下で測定可能な結合を示さなかった。キチンはこれら基質のうちで唯一結晶性であるので、我々は、このことは基質中の結晶性の重要性を証明するものであると考える。確かにこれが硬い基質結合の利益の一部であるが、最近の研究（Dinら，（199 1）Bio/Technol．9:1096-1099）は、単離した非酵素性ＣＢＤによるセルロースへの結合が非加水分解的にセルロース繊維の分断を起こすことを示した。タンパク質−セルロース結合が結晶の表面の近くの鎖間水素結合の度合いを低下させ、続いてこれらセルロース鎖を広範に水和すると考えられる。その結末は結晶性の低下である。“非晶質性誘発”といわれるこの過程は、より多くのセルロース繊維をエンド−β−１，４−グルカナーゼにとって接近可能にする。我々が発見したように、ＣＢＤはかかる非晶質性誘発的作用を示さない。 7.4. アスペルギルス・ニガー、スポドプテラ・リトラリス、及びヘリオチス・アルミゲラへのＣＢＤ結合アスペルギルス・ニガー菌糸（約２０ｍｇ）を４００μｌＣＢＤ（１２０μ ｇ）と共に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７）中で室温で１時間インキュベートした。この菌糸を同緩衝液で２回洗浄してから、β−メルカプトエタノール及びＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル適用緩衝液に再懸濁した。その混合液を５分間煮沸してタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１６は、ＣＢＤがアスペルギルス・ニガーの菌糸に結合することを示す。スポドプテラ・リトラリス（Spodoptera littoralis）及びヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armigera）（農業における主要昆虫病原体）の中腸膜を顕微鏡で分離した。約２０ｍｇを４００μｌＣＢＤ（１２０μｇ）と共に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７）中で室温で１時間インキュベートした。このキチン含有膜を同緩衝液中の１ＭＮａＣｌで１回洗浄してからＮａＣｌなしの同緩衝液で２回洗浄し、次いで、β−メルカプトエタノール及びＳＤＳを含有するＳＤＳ −ＰＡＧＥサンプル適用緩衝液に再懸濁した。この混合液を４分間煮沸してタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。その結果を図１７及び１８に示す。これら結果は、ＣＢＤがスポドプテラ・リトラリス及びヘリオチス・アルミゲラの中腸膜に結合することを示している。８．ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ遺伝子の構築及び大腸菌内でのその発現 8.1. 材料及び方法 8.1.1. 酵素及び化学物質化学物質は、他に断らない限りSigma Chemicals Inc．から購入した。制限酵素はNew England Biolabs，Inc．から購入した。ＴａｑポリメラーゼはPromega ，Inc．から購入した。 8.1.2. プラスミド及び細菌ＣｂｐＡを保有するプラスミドｐＣＢ１（Shoseyovら，1992）を用いてＰＣＲ法によりＣｂｄを増幅した。発現ベクターｐＲＩＴ２（Nilssonら，（1985）EMB O J．4（4）:1075-1080）をこの融合遺伝子の構築に用いた。最初の形質転換は、大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Strategene）を用いて行った。ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの発現は温度感受性レプレッサー含有株２０９７内で行った。また、大腸菌株Ｎ４８３０−１も温度感受性レプレッサーｃ１８５７を保有するので大腸菌株２０９７と同等である。この大腸菌株Ｎ４８３０−１は、Pharmacia，Inc．から入手できる。 8.1.3. ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡのクローニング鋳型としてＣｂｐＡ遺伝子を用いてＣＢＤをＰＣＲ増幅した。プライマーＡ（Ｎ末端プライマー；5'-GGGGGAATTCCATGGCAGCGACAT-3'）はＥｃｏＲＩ部位を含有し、プライマーＢ（Ｃ末端プライマー；5'-GGGGGGATCCTATGGTGCT-3'）は停止コドンとその後に続くＢａｍＨＩ部位を含有する。プロテインＡ遺伝子のＣ末端部分に“インフレイム（in frame）”融合したプラスミドｐＲＩＴ２内でのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ５００ｂｐＤＮＡのクローニングを無理にさせることができるようにこれらプライマーをデザインして合成した。ＰＣＲ条件は、次のように手を加えただけでInnisとGelfand（1990）により記載された通りであった：２ｎｇ鋳型ＤＮＡ（ｃｂｐＡ）及び１ｍＭＭｇＣｌ₂を反応混合液中に用いた。反応はプログラム可能な熱制御装置（M & JResearch In c.）を用いて行った。標準的なＤＮＡ操作は、Molecular Cloning（Nolan，C.編），Cold Spring Harbor Laboratory Press，NYのSambrookら（1989）に従って行った。そのＰＣＲ増幅産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して、予想５００ｂｐＤＮＡ断片（図１）をQIAEXゲル抽出キット（Qiagen Inc.）を用いて１．５％アガロースゲルから単離した。このＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ直鎖化ｐＲＩＴ２内にＴ４リガーゼを用いて連結した。この連結混合液を用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換し、形質転換コロニーを１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上で選択した。うまく行ったＤＮＡ挿入体含有構築体をｐＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ１と名付けた。 8.1.4. ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの発現及び精製この融合タンパク質の発現を他の文献（Nilssonら（1985）EMBO J．4（4）:10 75-1080）に記載された通りに行った。５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有する４０ｍｌＬＢに、ｐＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ１を含有する大腸菌株２０９７の一晩培養液４００μｌを接種した。この培養液を３０℃で100Klett（グリーンフィルター）まで増殖させてから４５分間で４２℃までシフトさせ、次いで４０℃で更に２時間増殖させた。２，０００ｇで１０分間の遠心分離により細胞を採取して１０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中に再懸濁した。Ｗ−３８５音波破砕器（Heat Systems-Ultrasonic，Inc.）を用いて最大出力で１分間した後に３０秒間冷却するのを３回繰り返して細胞を溶解した。その溶解産物を遠心分離（４，０００ｇで１０分間）により透明にして５００ｍｇのセルロース粒子（Sigmacell 20，２０ミクロンの平均粒子サイズ）を添加した。その懸濁液を室温で１０分間インキュベートして遠心分離した（２，０００ｇで１０分間）。上澄み液を除去してペレットを５ｍｌの１ＭＮａＣｌで１回洗浄して非特異的結合タンパク質を除去し、１０ｍｌの脱イオン水で２回洗浄した。５ｍｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌによりＣＢＤ−ＰｒｏｔＡをセルロースから離した。次いで、遠心分離（２，０００ｇ，１０分間）後にその溶液を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）に対して透析した。Laemmli（197 0）に従って１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質を分析した。 8.1.5. ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの結合分析ＩｇＧへのＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの結合を次のようにして確認した：ＰＢＳ（食塩加リン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で予め洗浄したウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）-Sepha rose（８ｍｇ／ｍｌ，Bio-Makor Inc.）の１００μｌ懸濁液を１ｍｌの単離ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ（５０μｇ／ｍｌ）と混合した。この混合液を８℃で１時間インキュベートしてから遠心分離（２，０００ｇ，５分間）した。上澄み液を除去してペレットを５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。次いで、このＣＢＤ−ＰｒｏｔＡを２００μｌの１Ｍ酢酸で溶離させた。そのペレットを１５μｌのサンプル適用緩衝液（ＳＡＢ；１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール及び０．００２％ブロモフェノールブルー）と混合し、異なる画分の１５μｌサンプルを１５μｌのＳＡＢと混合してから、５分間煮沸してＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。セルロースへのＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの結合を次のようにして確認した：２０ｍｇのセルロース（Sigmacell 20）を２００μｌの単離ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ（５０ μｇ／ｍｌ）と混合した。この混合液を室温で１５分間インキュベートしてから２，０００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを２００μｌの１Ｍ酢酸で洗浄してそのペレットを４０μｌのＳＡＢ中に再懸濁した。このセルロース懸濁液を（１５μｌのＳＡＢと混合した）１５μｌの酢酸洗浄液と一緒に煮沸してＳＤＳ− ＰＡＧＥ上で分析した。 8.1.6. 結果ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡは大腸菌内で発現することができ、そしてセルロースを用いて１工程精製で精製できることが分かった。その融合タンパク質は４５ｋＤａの予想サイズを有する（図８）。ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡは、セルロースだけでなくＩｇＧに対してもその親和性を保持した。１Ｍ酢酸はＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ：ＩｇＧ結合を解き放すがＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ：セルロース結合を解き放さないことが分かった。この発現ベクターを用いて、我々は１リッターの培養液当たり６ｍｇのＣＢＤ −ＰｒｏｔＡを生産した。Ｔ７過剰発現系での我々の経験で、我々は純粋なＣＢＤの量の１０倍を越える量（７０ｍｇ／ｌ）を生産することができた（図１０）。９．ＣＢＤ−ＨＳＰ融合タンパク質のクローニングＣＢＤ−ＨＳＰ融合タンパク質のクローニングの例：ＨＳＰ遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマーを、プラスミドＳＪ６０を鋳型として用いて調製する。このベクターは、Jindalら（1989），Mol．Cell．Biol．9:2279により記載された。これらプライマーは、ＨＳＰのＮ末端においてＫｐｎＩ部位を含有し、Ｃ末端において停止コドンとその後に続くＢａｍＨＩ部位を含有するであろう。ＨＳＰのＮ末端部分へのＣＢＤのＣ末端部分の翻訳上の融合を可能にするために、我々はｃｂｄ遺伝子の３’末端においてＫｐｎＩ部位を導入する。この導入は、鋳型としてｐＥＴ−ＣＢＤを用い、そして次のプライマーを用いるｃｂｄのＰＣＲ増幅により行われる。増幅したＤＮＡをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化してから、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで予め消化したｐＥＴ８ｃベクター内に連結する。次いで、この連結混合液を用いてＸＬ１Ｂｌｕｅを形質転換し、この新たなプラスミドをｐＥＴ−ＣＢＤＫと名付ける。このプラスミドをＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化して、先程のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ制限ＨＳＰ−ＰＣＲ増幅断片を連結し、ＸＬ１Ｂｌｕｅ内に形質転換し、そしてこの構築物を確認した後、ＣＢＤ−ＨＳＰの過剰産生のためにＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換するのに用いることになる。１０．ＮＨ₂−Ｖ_H−Ｖ_L−ＣＢＤ−ＣＯ₂の構築組換え抗体に融合したＣＢＤを、所望のＶ_H−Ｖ_Lを“Recombinant Phase Anti body System”（Pharmacia Inc.）を用いてクローニングすることにより完成する。得られたＶ_H−Ｖ_Lを保有するｐＣＡＮＴＡＢ５プラスミドを、次のプライマーを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として用いる。これらプライマーは、Ｖ_H−Ｖ_Lの５’末端においてＮｃｏＩ部位を導入し、３ ’末端においてＫｐｎＩ部位を導入する。この増幅断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで（必要なら部分的に）消化して、以下でＣＢＤのＣ末端融合体の発現ベクターに用いる。Ｖ_H−Ｖ_LのＣ末端部分へのＣＢＤのＮ末端部分の翻訳上の融合を可能にするために、我々はｃｂｄ遺伝子の３’末端においてＫｐｎＩ部位を導入する。この導入は、鋳型としてｐＥＴ−ＣＢＤを用い、そして次のプライマーを用いるｃｂｄのＰＣＲ増幅により行われる。これらプライマーは、ｃｂｄ遺伝子の５’末端においてＫｐｎＩ部位をＮｃｏＩ部位の後ろに導入し、３’末端において停止コドンとその後に続くＢａｍＨＩ部位を維持する。この増幅ＤＮＡをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化してから、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで予め消化したｐＥＴＳｃベクター内に連結する。この連結混合液を用いてＸＬ１Ｂｌｕｅを形質転換し、この新たなプラスミドをｐＥＴ−ＫＣＢＤと名付ける。このプラスミドをＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化してから、先程のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ制限Ｖ_H−Ｖ_L増幅断片を連結し、ＳＬ１Ｂｌｕｅ内に形質転換し、そしてこの構築物を確認した後、Ｖ_H−Ｖ_L−ＣＢＤ融合タンパク質の過剰産生のためにＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換するのに用いる。上の開示内容及び当該技術分野で広く知られている事柄からみて、当業者にはＣＢＤ及び既知配列の第２タンパク質を含む多種多様なＣＢＤ融合産物を調製できることが分かるであろう。１１．ＣＢＤ−ＰｒｏｔＡセルロースによるＩｇＧ精製この例は、ＩｇＧの精製にＣＢＤを使用できることを証明するものである。ヒト血清（５００μｌ，食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で１：１０に希釈したもの）をＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ−セルロース（４μｇ／ｍｇ）の２０ｍｇ懸濁液に添加した。この混合液を８℃で１時間インキュベートしてから未結合タンパク質を素早い遠心分離により除去して５００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。ＩｇＧを２００μｌの１Ｍ酢酸洗浄（室温で１５分間）により回収したがＣＢＤ−ＰｒｏｔＡはセルロースに結合したままであった。１２．ＣＢＤの特性決定この例は、ＣＢＤがセルロースを分断しないことを証明するものである。ＣＢＤはセルロース分断／非晶質性誘発活性を持たない。約１ｍｇのＣＢＤを１０ｍｇの２つの異なるタイプのセルロｌ緩衝液（ｐＨ７）中で３７℃で一晩インキュベートした。これらセルロースサンプルを金コーティング走査電子顕微鏡で観察した。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＣＢＤ処理セルロース繊維がコントロール、つまり未処理コットンに比べて無傷のままであることを明瞭に示している。セルロースへのＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの結合能力へのｐＨ及びＮａＣｌ濃度の作用を調べた。４５０μｌのＣＢＤ−ＰｒｏｔＡ（１００μｇ）を、５５０μｌの異なる緩衝液（異なるＮａＣｌ濃度、即ち、０、０．２５、０．５、１ＭＮａＣｌを含有する５０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液）、１ｍｇのセルロース（Sigmac ell 20）、及び１ｍｇのＢＳＡを含有する試験管に添加した。これら試験管を時折混合しながら３７℃で１時間インキュベートして１０，０００ｇで５分間遠心分離した。ペレットをそれらの対応する緩衝液で２回洗浄した。４０μｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌをこのペレットに添加して懸濁し、更に室温で３０分間インキュベートした。遠心分離後、２０μｌのサンプルを７８０μｌのｄｄＨ₂Ｏで希釈し、BioRadキットによりタンパク質濃度を出した。図１５は、低ｐＨ値でＮａＣｌの濃度を高くしてゆくとセルロースへのＣＢＤ−ＰｒｏｔＡの結合が７０ｍｇ／ｇセルロースまで増してゆくことを示している。１３．ＣＢＤは植物組織の成長を修飾する 13.1. 材料及び方法 13.1.1. 植物材料桃の花（Prunus persica cv．テキサス州）をRehovot近郊の果樹園から得た。開花の初日に花から採取した葯を花糸から切り離して３０℃で少なくとも２４時間脱水した。放たれた花粉をすぐに用いたか又は−２０℃で貯蔵した。アラビドプシス・タリアナ（Arabidop sis thaliana）の種子を大学のストックから得た。 13.1.2. in vitroでの花粉発芽花粉粒子を各エッペンドルフ試験管中の１００μｌの成長培地の液体培養液中で発芽させた。これら成長培地は次のようにして作った：桃花粉粒子を１５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００μｇ／ｍｌＨ₃ＢＯ₃、２００１２μｇ／ｍｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ及び２００μｇ／ｍｌＣａ（ＮＯ₃）₂・４Ｈ₂Ｏを含有する成長培地中で発芽させた。異なる濃度のＣＢＤ又はＢＳＡをこれら試験管に添加した。各試験管内の花粉粒子の量は約１０００であった。各処理について３回の繰り返しを行った。暗室内で２５℃で一晩インキュベーションした後、各検体中の最少１００花粉粒子の集団中の花粉を調べた（処理当たり３００）。 13.1.3. 種子発芽アラビドプシス・タリアナの種子を蒸留水で洗浄した。処理当たり約１００個の種子を２ｃｍ径１０ｃｍ長のガラス製培養管中の１ｍｌの蒸留水中に浸した。これら培養管を温度が２５℃で一定で明期／暗期それぞれが１６／８時間の光周期である成長室内に入れた。４日後、実生苗、若枝、根及び根毛（各苗において最も長いもの）の長さを測定して、異なる処理の植物器官への作用を調べた。 13.1.4. 組織化学的観察ＣＢＤ有り又は無しで成長させた桃花粉管を１０，０００ｇで１分間沈降させることにより成長培地を洗い落とし、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％グルタルアルデヒドを用いて一晩固定した。花粉管を同緩衝液で洗浄してから、同じ容量の同緩衝液中の４％グルタルアルデヒド中に注意して再懸濁させて４℃で一晩保持した。花粉管を再度沈降させて、同緩衝液で洗浄し、蒸留水で洗浄してから白色蛍光増白剤（calc ofluor，０．１ＭＫ₃ＰＯ₃中０．１％）で染色し、結晶性細胞壁成分を指示させた。蛍光光学顕微鏡（RA Zeiss Oberkochen）により顕微鏡観察を行った。沈降させることなく溶液を交換した以外は同じようにしてアラビドプシス苗を処理した。桃花粉管及びアラビドプシス苗を免疫金銀染色（ＩＧＧＳＳ）により検査してセルロースへのＣＢＤ結合を指示させた。この植物材料をまずＰＢＳＴ（食塩加リン酸緩衝液TWEEN２^TM）中の４％グルタルアルデヒドで一晩固定した。これら検体をＰＢＳＴで１時間洗浄し、１％スキムミルク中に１時間浸してから、ＰＢＳＴで１：５００に希釈したポリクローナルウサギ抗ＣＢＤ抗体と共に１時間インキュベートした。これら検体をＰＢＳＴで３×１０分間洗浄してから、ＰＢＳＴで１：１００に希釈した５ｎｍの金粒子と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧと共に１時間インキュベートした。これら検体をＰＢＳＴで２×１０分間洗浄し水でもう一度洗浄した。この反応の最終発色のために銀染色キット（BioCell Research Laboratories）を用いた。これら検体をこのキットの合一溶液に約１０分間浸してから多量の蒸留水で洗浄した。これら検体を光学顕微鏡で観察した。 13.2. 結果 13.2.1. 花粉管成長へのＣＢＤの作用図１９は、ＢＳＡ（コントロールタンパク質）と比較したＣＢＤの花粉管長への作用を示す。異なる文字は、各花粉管長値間の統計的に有意な差（ｐ≦０．０５）を示す。ＣＢＤが花粉管成長を促すことが明らかになった。ＢＳＡは、おそらく浸透圧作用により花粉管成長を阻害したのであろう。その点で、５０μｇ／ｍｌにおける結果が最も有意である。そこでは、ＣＢＤ処理花粉粒子が５０μｇ／ｍｌＢＳＡで処理した花粉粒子の花粉管のサイズのほぼ２倍の花粉管を生成した。ＣＢＤの作用様式を確認しようと、花粉管（ＣＢＤ処理及びコントロール）を白色蛍光増白剤（calcofluor）で染色して、結晶性細胞壁成分を指示させた。図２０Ａ及び２０Ｂは、ＣＢＤ処理花粉管が非結晶性花粉管先端部を生成したことを証明しており、それはその先端域に明色が存在しないことにより示される。その先端域に硬質結晶性細胞壁が存在しないことで伸長を容易にするという潜在性を有する。ＣＢＤ処理花粉管の金免疫標識（図２１Ａ及び２１Ｂを参照のこと）は、ＣＢＤは花粉管に沿って結合したが、先端域における強い暗色点により示されるように、好ましくはその先端域において結合したことを証明した。やはり、先端域に硬質結晶性細胞壁が存在しないということを強く示したのがＣＢＤの結果であった。セルロース線維が形成されながらＣＢＤに入り込み、それによって結晶化過程が阻害されるというメカニズムが考えられる。 13.2.2. 根及び根毛成長へのＣＢＤの作用アラビドプシス・タリアナ苗の根の成長へのＣＢＤの作用を確認した（図２２）。低濃度ではＣＢＤは根の伸長を促した。高濃度ではＣＢＤは根の長さを劇的に短くしたのに反して、同じ濃度（１００μｇ／ｍｌ）のＢＳＡは何の作用も有さなかった。異なる文字は、根の長さの各値間の統計的に有意な差（ｐ≦０．０５）を示す。若枝の長さへの作用は類似の傾向を明らかにしたが、各処理間の差は根についてほど劇的ではなく、統計的に有意なものではなかった。ＣＢＤ処理アラビドプシス・タリアナ苗の金免疫標識（図２３）は、金標識が根に限られたものであって若枝上には標識が見られないことを示した。白色蛍光増白剤（calcofluor）でアラビドプシス・タリアナ苗を染色して根だけが染色されることが示されたが、これは接近可能なセルロースであることを示している（図２４）。若枝に明色が存在しないのは、染色剤がろう状の小皮を浸透できないことを示しており、何故ＣＢＤが根に有効で若枝にはそうでなかったかを明らかにしている。高濃度（１×１０^-6〜１×１０^-4μｇ／ｍｌ）のＣＢＤによる根の伸長への阻害作用は、セルロースフィブリルの立体障害により説明することができ、かくしてエンド−グルカナーゼ若しくはキシログルカントランスフェラーゼの如き酵素又は硬質セルロースフィブリル網状構造を解きほぐすことにより細胞伸長を調節する他のタンパク質の接近を阻止するのであろう。低濃度では、ＣＢＤは細胞壁の結晶性を低下させることも、またキシログルカンセルロース相互作用を妨害することもでき、かくしてセルロース網状構造の架橋を阻止するのであろう。これら結果は、この用途において、セルロースを不溶性固体マトリックスとして用いるタンパク質及び酵素のアフィニティー精製についてのＣＢＤ融合タンパク質の有用性を明瞭に証明している。更には、このＣＢＤ融合産物は、上の開示内容からみて当業者にとって明らかであろう広範囲の潜在的用途を与えるものであり、それらにはアフィニティー分離法及び診断用キットにおける用途が含まれるがこれらに限定されない。１４．微生物の寄託次のものをメリーランド州ロックビルの１２３０１パークロウン（Parklawn）ドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９３年４月１２日に寄託し、以下に示した受託番号が割り当てられた。ここに記載しかつ特許請求する発明は、ここに開示した具体的態様によって範囲を限定されてはならない。というのは、これら態様は本発明の幾つかの側面の説明として意図されたものだからである。あらゆる均等な態様がこの発明の範囲内のものとして意図されている。事実、ここに示しかつ説明したものに加えて本発明の種々の修飾が、これまでの記載から当業者に明らかになるであろう。かかる修飾も添付の請求の範囲内に属することが意図されている。ヌクレオチド及びペプチドに付与された全ての塩基対及びアミノ酸残基の番号及びサイズはおおよそのものであり説明を目的として用いられている。多くの文献をここに引用したが、その全開示内容はそっくりそのまま参照によりここに組み入れられるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9452−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/00 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/564 Ｃ１２Ｎ 1/21 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 9455−4Ｃ 37/48 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 9455−4Ｃ 37/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｇ０１Ｎ 33/564 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ショセヨヴ，オーデッドイスラエル国 72910 シムソンカルメヨゼフディー．エヌ．ハエレズストリート５番地 (72)発明者シュピーグル，イタイイスラエル国 12335 ノースガリレアキブッツアミアド（番地なし) (72)発明者ゴールドスタイン，マークエー. アメリカ合衆国 95616 カリフォルニア州デイヴィス，＃227 レイクヴールヴァード，1959番地 (72)発明者ドイ，ロイエイチアメリカ合衆国 95616 カリフォルニア州デイヴィス，レモンレーン 1520番地

Claims

【特許請求の範囲】１．図１に示したアミノ酸配列を含んでなる、単離されたセルロース結合ドメイン。２．図１に示したアミノ酸配列の連続した部分に対して少なくとも８０％のアミノ酸相同を有するアミノ酸配列を含んでなるセルロース結合ドメイン。３．約１．５〜０．５μＭの範囲のＫ_dにより特徴づけられるセルロースまたはキチンに対する結合親和性を有する、請求項１に記載のセルロース結合ドメイン。４．前記のセルロースまたはキチンが結晶性である、請求項３に記載のセルロース結合ドメイン。５．１．２μＭ以下のＫ_dを有する、請求項４に記載のセルロース結合ドメイン。６．１．０μＭ以下のＫ_dを有する、請求項４に記載のセルロース結合ドメイン。７．図１に示したアミノ酸配列の連続した部分に対して８０％を越えるアミノ酸相同を有する少なくとも約１００個のアミノ酸を含んでなる、請求項２に記載のセルロース結合ドメイン。８．図１に示したアミノ酸配列の連続した部分に対して８０％を越えるアミノ酸相同を有する少なくとも約５０個のアミノ酸を含んでなる、請求項２に記載のセルロース結合ドメイン。９．図１に示したアミノ酸配列の連続した部分に対して９０％を越えるアミノ酸相同を有する、請求項７に記載のセルロース結合ドメイン。 10．図１に示したヌクレオチド配列またはその相補配列を含んでなるセルロース結合ドメインをコードする組換え核酸。 11．図１に示したヌクレオチド配列またはその相補配列の連続した部分に対して少なくとも６０％の相同を有する核酸配列を含んでなるセルロース結合ドメインをコードする組換え核酸。 12．ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の組換え核酸。 13．ＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の組換え核酸。 14．ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡ合成を開始させることができる一対のプライマーを含んでなり、各プライマーが請求項１２のポリヌクレオチドまたはその相補鎖であることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キット。 15．図１に示したセルロース結合ドメインヌクレオチド配列またはその相補配列の連続した部分に対して６０％を越える相同を有する少なくとも約３００ヌクレオチドの配列を含んでなる組換え核酸。 16．図１に示したセルロース結合ドメインヌクレオチド配列またはその相補配列の連続した部分に対して６０％を越える相同を有する少なくとも約１５０ヌクレオチドの配列を含んでなる組換え核酸。 17．図１に示したセルロース結合ドメインヌクレオチド配列またはその相補配列の連続した部分に対して８０％を越える相同を有する、請求項１５または１６に記載の組換え核酸。 18．ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドｐＥＴ−cellulose binding domain。 19．請求項１、２、８、９または１０のセルロース結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター。 20．請求項１９の組換えベクターでトランスフェクションされた宿主細胞。 21．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号６９２８２を有する組換え大腸菌ｐＥＴ−ce llulose binding domain／ＢＬ２１（ＤＥ３）。 22．図１のアミノ酸配列を含むセルロース結合ドメインおよび第２のタンパク質を含むセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 23．第２のタンパク質がプロテインＡ、ヘパリナーゼまたは環境汚染物質を分解することができる酵素である、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 24．第２のタンパク質がＨＳＰタンパク質、ＨＳＰ抗体、交差反応性ＨＳＰ関連タンパク質もしくはペプチド、またはその抗原部分である、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 25．第２のタンパク質が組換え抗体である、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 26．セルロース結合ドメイン−Ｖ_L−Ｖ_Hを含んでなる、請求項２５に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 27．第２のタンパク質がホルモンである、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 28．第２のタンパク質が酵素である、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 29．第２のタンパク質がプロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、アビジン、Ｔａｑポリメラーゼ、非Ｔａｑポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、制限酵素、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、キチナーゼ、βおよびαグルコシダーゼ、βおよびαグルクロニダーゼ、アミラーゼ、トランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、非β−ラクタマーゼ抗生物質修飾および分解酵素、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、バクテリオシン、抗生物質、酵素阻害剤、成長因子、ホルモン、受容体、膜タンパク質、核タンパク質、転写および翻訳因子、および核酸修飾酵素よりなる群から選ばれる、請求項２２に記載のセルロース結合ドメイン融合タンパク質。 30．ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドｐcellulose binding domain−ProtAl。 31．請求項２２または２３のセルロース結合ドメイン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクター。 32．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５４４３を有する組換え大腸菌ｐcellulos e binding domain-ProtAl/2097。 33．セルロース結合ドメイン融合産物の生産方法であって、（a）セルロース結合ドメインと第２のタンパク質を含むセルロース結合ドメイン融合産物をコードする核酸を用意し、その際、該セルロース結合ドメインは高親和性でもってセルロースまたはキチンを結合することができかつ自然界でそれと結合している他のタンパク質類を実質的に含んでおらず、また、該第２のタンパク質はＮ末端とＣ末端を含むものであり；（b）該核酸を用いて宿主細胞をトランスフェクションし；そして（c）セルロース結合ドメイン融合産物の発現に適した条件下で形質転換宿主細胞を培養する；ことを含んでなる方法。 34．前記の核酸がセルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質のＮ末端アミノ酸の上流にある開裂部位をさらにコードしている、請求項３３に記載の方法。 35．前記の核酸がセルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質のＣ末端アミノ酸の下流にある開裂部位をさらにコードしている、請求項３３に記載の方法。 36．前記の核酸がセルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質のＮ末端アミノ酸の上流にある第１開裂部位と、セルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質のＣ末端アミノ酸の下流にある第２の開裂部位をさらにコードしている、請求項３３に記載の方法。 37．セルロース結合ドメイン融合産物の精製方法であって、（a）組換えセルロース結合ドメイン融合産物を含む混合物と有効量のセルロースとを、セルロースと組換えセルロース結合ドメイン融合産物からなる不溶性の結合体を形成させるのに適した条件下で接触させ；（b）該不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を単離し；そして（c）該不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体からセルロース結合ドメイン融合産物を回収する；ことを含んでなる方法。 38．前記のセルロースをキチンに置き換える、請求項３７に記載の方法。 39．前記の回収が、不溶性のセルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を放出試薬にさらし、放出されたセルロース結合ドメイン融合産物をセルロースまたはキチンから単離することを含む、請求項３７または３８に記載の方法。 40．前記の放出試薬が６Ｍ尿素または６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含むものである、請求項３９に記載の方法。 41．前記のセルロース結合ドメイン融合産物を第１もしくは第２の開裂部位または両方の開裂部位を開裂することができる開裂試薬にさらすことをさらに含む、請求項３４、３５または３６に記載の方法。 42．前記の開裂試薬が酵素である、請求項４１に記載の方法。 43．前記の開裂試薬が化学開裂試薬である、請求項４１に記載の方法。 44．バクテリア宿主細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。 45．哺乳動物宿主細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。 46．測定対象物質を検出するための診断キットであって、（a）（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと、（ii）測定対象物質を結合することができる第２のタンパク質、を含むセルロース結合ドメイン融合産物；（b）検出可能な標識；および（c）セルロース；を含んでなる診断キット。 47．前記のセルロースをキチンに置き換える、請求項４６に記載の診断キット。 48．前記の第２のタンパク質がプロテインＡまたは酵素である、請求項４６または４７に記載の診断キット。 49．前記の第２のタンパク質がＨＳＰタンパク質、ＨＳＰ抗体、交差反応性ＨＳＰ関連タンパク質もしくはペプチド、またはその抗原部分である、請求項４６または４７に記載の診断キット。 50．セルロース結合ドメイン融合産物が第２のタンパク質に親和結合されたリガンドをさらに含み、該リガンドが測定対象物質と結合することができる、請求項４６または４７に記載の診断キット。 51．前記のリガンドが抗体である、請求項５０に記載の診断キット。 52．被験サンプル中の測定対象物質の存在を検出するためのイムノアッセイ法であって、（a）測定対象物質を含みうる被験サンプルを、（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと（ii）測定対象物質を結合することができる第２のタンパク質とを含む十分量のセルロース結合ドメイン融合産物とともに、該セルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質への測定対象物質の結合を可能とする条件下でインキュベートし；（b）工程（a）で使用した量のセルロース結合ドメイン融合産物と結合するのに有効な量のセルロースを加えて、不溶性のセルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を形成させ；（c）該不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を未結合成分から分離し；（d）該不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を十分量の検出可能な標識とともにインキュベートし、該標識は測定対象物質に結合できるものであり；そして（e）工程（d）の該不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を未結合成分から分離し、被験サンプル中の測定対象物質の有無の指標として該標識の有無を測定する；ことを含んでなる方法。 53．被験サンプル中の測定対象物質の存在を検出する方法であって、（a）測定対象物質を含みうる被験サンプルを、測定対象物質を固定化することができる不溶性マトリックスと接触させ；（b）該不溶性マトリックスを、（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと（ii）固定化された測定対象物質を結合することができる第２のタンパク質とを含むセルロース結合ドメイン融合産物の十分量とともに、該セルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質への固定化測定対象物質の結合を可能とする条件下でインキュベートし；（c）工程（b）の不溶性マトリックスを未結合成分から分離し；（d）工程（c）の不溶性マトリックスを、測定対象物質またはセルロース結合ドメイン融合産物を結合することができる検出可能な標識とともに、測定対象物質またはセルロース結合ドメイン融合産物への該標識の結合を可能とする条件下でインキュベートし；そして（e）工程（d）の不溶性マトリックスを未結合成分から分離し、被験サンプル中の測定対象物質の有無の指標として該標識の有無を測定する；ことを含んでなる方法。 54．（i）工程（c）の不溶性マトリックスと十分量のセルロースとを、該セルロースをセルロース結合ドメイン融合産物へ結合させてセルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を形成させる条件下で接触させ、そして（ii）工程（ i）の不溶性マトリックスを、未結合セルロースを含む未結合成分から分離することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。 55．前記の標識が測定対象物質またはセルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を結合することができる、請求項５４に記載の方法。 56．前記の標識がセルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体のセルロースに結合することができる、請求項５５に記載の方法。 57．被験サンプルが体液を含むものである、請求項５２、５３または５５に記載の方法。 58．前記のセルロースをキチンに置き換える、請求項５２または５４に記載の方法。 59．不溶性マトリックスが電気泳動ゲルブロットである、請求項５３または５４に記載の方法。 60．測定対象物質がタンパク質またはペプチドであり、第２のタンパク質が該タンパク質またはペプチドに対する抗体である、請求項５２、５３または５４に記載の方法。 61．測定対象物質が抗体であり、第２のタンパク質がプロテインＡである、請求項５２、５３または５４に記載の方法。 62．測定対象物質がタンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸または他のプローブ標的分子に結合されたビオチニル化プローブを含み、第２のタンパク質がストレプトアビジンである、請求項５２または５４に記載の方法。 63．前記の標識が放射性同位元素、蛍光分子または酵素を含むものである、請求項５２、５３または５４に記載の方法。 64．前記の標識がセルロース結合ドメインとアルカリホスファターゼを含むセルロース結合ドメイン融合産物を含むものである、請求項５６に記載の方法。 65．前記の標識がセルロース結合ドメインと西洋ワサビペルオキシダーゼを含むセルロース結合ドメイン融合産物を含むものである、請求項５６に記載の方法。 66．前記の酵素に対する十分量の基質を加えることをさらに含み、該基質が該酵素によって検出可能な化合物に変換される、請求項６４または６５に記載の方法。 67．工程（d）は不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を標識された測定対象物質からなる検出可能な標識とともにインキュベートすることにより実施され、該標識は測定対象物質にまだ結合していないセルロース結合ドメイン融合産物の第２のタンパク質に結合できるものであり、そして工程（e）は工程（d）の不溶性セルロース-セルロース結合ドメイン融合産物結合体を未結合成分から分離し、被験サンプルから観察されたシグナルと対照サンプルから観察されたシグナルとを比較することにより実施される、請求項５２に記載の方法。 68．セルロース結合ドメイン融合産物がディップスティック（dipstick）に保持されている、請求項５２に記載の方法。 69．（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと（ii）測定対象物質を結合することができる第２のタンパク質とを含むセルロース結合ドメイン融合産物を含んでなる、被験サンプル中の測定対象物質を検出するのに有用なディップスティック。 70．第２のタンパク質がプロテインＡ、ＨＳＰタンパク質、ＨＳＰ抗体、交差反応性ＨＳＰ関連タンパク質もしくはペプチドまたはその抗原部分、酵素、ホルモン、抗原および抗体よりなる群から選ばれる、請求項６９に記載のディップスティック。 71．（a）（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと、（ii）測定対象物質と結合可能なキメラプローブを結合することができる第２のタンパク質、を含む第１のセルロース結合ドメイン融合産物；および（b）（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと、（ii）基質に作用して検出可能な化合物を生成することができる酵素、を含む第２のセルロース結合ドメイン融合産物；を含んでなるシグナル増幅系。 72．（a）（i）高親和性でもってセルロースに結合することができかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないセルロース結合ドメインと、（ii）測定対象物質と結合可能なキメラプローブを結合することができる第２のタンパク質、を含むセルロース結合ドメイン融合産物；および（b）高親和性でもってセルロースに結合する能力を保持しかつ自然界で下記ドメインと結合している他のタンパク質類を実質的に含まない、標識されたセルロース結合ドメイン；を含んでなるシグナル増幅系。 73．前記のプローブをさらに含む、請求項７１または７２に記載のシグナル増幅系。 74．ペブル粉砕（pebble-milled）セルロースをさらに含む、請求項７１または７２に記載のシグナル増幅系。 75．前記のプローブがビオチニル化されており、第２のタンパク質がストレプトアビジンである、請求項７１または７２に記載のシグナル増幅系。 76．前記の酵素がアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼよりなる群から選ばれる、請求項７１または７２に記載のシグナル増幅系。 77．前記の標識が放射性同位元素、蛍光分子または酵素を含むものである、請求項７２に記載のシグナル増幅系。 78．薬剤と結合させたセルロース結合ドメインを含んでなり、該セルロース結合ドメインが高親和性でもってセルロースに結合する能力を保持し、かつ自然界でそれと結合している他のタンパク質類を実質的に含まないことを特徴とする薬剤送達系。 79．前記の薬剤がセルロース結合ドメインに直接またはリンカー成分を介して結合されている、請求項７８に記載の薬剤送達系。 80．前記の薬剤が抗真菌剤である、請求項７８に記載の薬剤送達系。 81．前記の薬剤がアンホテリシンＢ、ニスタチン、ウンデシレン酸およびクロトリマゾールよりなる群から選ばれる、請求項７８に記載の薬剤送達系。 82．前記の薬剤がイミダゾールである、請求項７８に記載の薬剤送達系。 83．非経口的、経口的、局所的または吸入により投与することができる、請求項７８に記載の薬剤送達系。 84．鼻腔内、眼内または膣内に投与することができる、請求項７８に記載の薬剤送達系。 85．固体、ゲル、液体またはエアゾールの形態である、請求項７８に記載の薬剤送達系。 86．前記の薬剤がセルロース質またはキチン質の物質を細胞膜中に含む酵母または真菌物質により引き起こされる疾患または感染症に対して有効である、請求項７８に記載の薬剤送達系。 87．前記の物質がアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）、カンジダ（Candida）もしくはモニリア（Monilia）属の仲間、または表皮細胞である、請求項８６に記載の薬剤送達系。