KR100776344B1

KR100776344B1 - 섬유소결합도메인을 이용한 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법

Info

Publication number: KR100776344B1
Application number: KR1020060057224A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 송재준; 반재구; 정흥채; 최수림
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-06-26
Filing date: 2006-06-26
Publication date: 2007-11-15

Abstract

본 발명은 섬유소결합도메인을 이용한 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)의 유전자 및 활성형 단백질의 유전자를 포함하고, 상기 두 유전자가 융합되어 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현되도록 배치된 재조합벡터, 상기 재조합벡터를 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합된 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법은 간단한 공정만으로도 쉽게 회수 및 재사용이 가능하고, 가교제를 처리함으로써 고정화율을 높일 수 있으며, 고정화 생물 촉매를 간편하게 확보할 수 있으므로 효소반응공정의 고속 최적화 등에 활용할 수 있다.

섬유소결합도메인, 활성형 단백질, 베타 글루코로니데아제, 베타 글리코시데아제.

Description

섬유소결합도메인을 이용한 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법{Preparation Method for the Production of Active Protein Complex Particles Using Cellulose Binding Domain}

도 1은 대장균에서 EGFP CBD 및 DsRed CBD 단백질 입자가 활성을 가지고 있다는 것을 형광현미경을 통하여 확인한 사진이다.

도 2는 gusA CBD, bglA CBD, EGFP CBD 및 DsRed CBD 단백질 입자가 발현된 대장균의 모습을 전자현미경(SEM)으로 확인한 사진이다.

도 3은 균주 파쇄 후에도 발현된 EGFP CBD 및 DsRed CBD 단백질 입자가 안정적으로 활성을 가지고 있다는 것을 형광현미경을 통하여 확인한 사진이다.

도 4는 gusA CBD 및 bglA CBD의 분해활성에 의해 기질(ONPG)이 분해되는 모식도(A)이고, 가교제를 처리한 경우 gusA 단백질 입자(B) 및 bglA 단백질 입자(C)를 안정적으로 재사용할 수 있다는 것을 나타내는 것이다.

발명의 분야

배경기술

고발현 플라스미드를 이용하여 재조합 단백질을 세포 내에서 고농도로 발현 시켰을 때, 많은 단백질들은 불가용성의 봉입체(inclusion body) 형태로 발현된다. 이러한 봉입체는 단백질의 급속한 발현으로 인하여 단백질의 구조적 접힘(protein folding)이 제대로 이루어지지 못하고 집합체를 형성하는 것으로서, 보통은 활성이 없다. 현재까지 보고되어 있는 바에 의하면 봉입체의 형성은 균주의 배양조건, 균주 내의 단백질분해효소에 의한 재조합 단백질의 반응성, 목적 단백질의 구조 및 물리적 특성, 목적 단백질의 안정성 문제 등 여러 가지 특성에 의하여 영향을 받는 것으로 알려져 있다 (Kane, et . al ., Trends Biotechnol., 6:95, 1988; Singh, et . al ., J. Biosci . Bioeng., 99:303, 2005).

여러 보고에 의하면, 베타구조 비율이 높은 단백질들은 균주 안에서 구조적 접힘 과정을 거쳐 발현된 후, 개별 베타구조 사이의 상호작용에 의하여 쉽게 불용 성 응집체를 형성하는 것으로 알려지고 있다 (Carrio, et . al ., J. Mol . Biol., 347:1025, 2005). 특히 광우병, 알츠하이머, 타입II의 당뇨병 등의 특정 질병에서 나타나는 베타구조의 응집체는 아밀로이드(amyloid)구조로 알려지고 있다. 최근에는 베타구조를 가지는 바이러스 캡시드 단백질의 응집현상을 이용하여 재조합 단백질의 입자발현을 유도한 결과 고유의 활성을 유지하고 있는 활성형 단백질의 입자를 제조한 연구결과가 보고된 바 있다 (Garcia-Fruitos, et . al ., Microb . Cell Fact., 4:27, 2005).

이러한 베타구조 단백질들의 응집 특성에 비추어 볼 때, 전체 단백질도메인이 베타구조로 구성되어 있고 물에 대한 용해도가 매우 낮은 섬유소결합도메인의 경우도 활성형 단백질의 응집을 유도하는 응집 유도체로 사용될 수 있는 가능성이 매우 클 것으로 기대되었다. 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)은 탄수화물 분해와 관련된 다양한 효소군인 셀룰라아제(cellulase), 자일란나아제(xylenase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 엔도-만나나아제(endo-mannanase), 아세틸-자일렌에스터라제(acetyl-xylanesterase), 에스터라아제(esterase), 펙테이트리아제(pectate lyase), 베타-글리코시다아제(β-glycosidase), 엔도글루카나아제(endoglucanse) 등 다양한 효소에 포함되는 단백질 구조이며, 단백질이 섬유소에 결합되도록 하는 기능을 한다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum), 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi), 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)를 비롯한 세균 유래의 것과, 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 트리코더마 비리 디(Trichoderma viride) 등의 곰팡이 유래의 것들이 알려져 있으며, 크기 및 구조에 있어서도 다양한 것들이 알려져 있다 (Tomme, P., et . al., J. Chromatogr B. Biomed Sci . Appl . 11:715(1):283, 1998).

셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)로부터 생산되는 엑소글루칸네아제(exoglucanase)에서 분리시킨 섬유소결합도메인은 3차 구조상으로 베타시트 구조를 가지고 있으며, 아미노산 서열 중 트립토판 17, 트립토판 54, 트립토판 72가 결정형 섬유소에 강력한 결합을 하는 특징을 가지고 있다. 섬유소결합도메인은 예전부터 효소고정화의 방법으로 이용되고 있으며, 최근에는 섬유소결합도메인의 섬유소 친화력 성질을 이용하여 단백질 정제방법으로 응용하고자 하는 연구가 진행되었고, 노바젠(Novagen, Inc.)에서는 섬유소결합단백질이 삽입된 벡터를 제조하여 상품화한 적도 있다 (Ong, et . al ., Biotechnology (N.Y.), 7:604, 1989; Ong, et . al ., Enzyme Microb . Technol., 13:91, 1991; Greenwood, et . al ., Protein Eng ., 5:361, 1992).

본 발명자들은 유전자 조작을 통하여 섬유소 결합도메인과 여러 가지 단백질을 융합시키고, 가용성 단백질을 회수하여 면섬유의 정련도 검정 등에 이용하는 방법을 발명한 바 있다 (대한민국 특허출원번호 10-2005-40679).

한편, 활성형 가용성 목적 단백질을 효과적으로 제조하기 위해서는 원핵세포에서 작동가능한 프로모터를 포함하는 재조합벡터로 원핵세포를 형질전환한 후, 형질전환체를 배양하여 배양물로부터 가용성 단백질을 회수하는 방법(대한민국 등록특허 제10-0484653)이 주로 이용되고 있으나, 이는 가용성 활성단백질을 회수하는 과정에서 세포파쇄, 세포성분의 제거, 단백질의 분리 등 복잡한 단계를 필요로 할 뿐만 아니라, 사용한 활성단백질을 재사용하기 어려운 단점을 가지고 있다.

또한, 가교제에 의한 고정효소제제의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-0038993)은 효소제제에 가교제를 넣어 가교반응이 일어나게 함으로써 고정화 효소제제를 제조하는 방법에 관한 것이고, 고정화효소의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-0132544)은 1차 또는 2차 아민기를 가진 담체에 가교제를 첨가함으로써 담체표면에 효소를 고정화시키는 방법에 관한 것이나, 이는 고정화효소 제조시 많은 양의 고정화담체 및 가교제가 필요하고, 비교적 가혹한 조건에서 반응을 시키기 때문에 활성이 낮은 고정화 효소밖에 얻을 수 없다는 문제점을 가지고 있다. 특히, 효과적인 고정화를 위하여서는 활성형 가용성효소의 생산, 효소 및 담체의 전처리, 고정화 수행 등 별도의 다단계 과정을 거치게 된다.

이에 본 발명자들은 일체의 전처리나 고정화 과정 없이 대장균에서 단백질을 발현시키는 간단한 과정만으로 고정화효소로 사용가능한 활성형 단백질 응집체 입자를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 섬유소결합도메인을 응집체로 사용하여 활성형 단백질 응집체 입자를 고속 제조할 수 있으며, 간편한 원심분리법으로 이를 분리하여 낮은 농도의 가교제를 처리함으로써 매우 안정성이 높은 활성형 단백질 응집체 입자를 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)의 유전자 및 활성형 단백질의 유전자를 포함하고, 상기 두 유전자가 융합되어 활성형 단백질의 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현되도록 배치된 재조합벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 숙주세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합된 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법 및 활성형 단백질 응집체 입자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 활성형 단백질 응집체 입자에 가교제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 활성형 단백질 응집체 입자의 고정화 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD) 유전자 및 활성형 단백질의 유전자를 포함하고, 상기 두 유전자가 융합되어 활성을 보유하는 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현되도록 배치된 재조합벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 섬유소결합도메인은 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 베타시트의 응집을 나타내는 한 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 활성형 단백질은 효소인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, gusA) 또는 β-글리코시다아 제(β-glycosidase, bglA)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 상기 효소 이외의 모든 효소를 사용하는 것이 가능하다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 할 수 있다. 특히, 하기 실시예에서는 형질전환된 재조합 미생물로서 대장균(E. coli)만을 예시하였으나, 본 발명의 재조합벡터를 박테리아, 효모, 곰팡이, 동물세포 및 식물세포에 도입할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 발명에서, “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서 박테리아, 효모, 곰팡이, 동물세포 및 식물세포 등이 숙주세포로서 이용될 수 있다.

형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 활성형 단백질 입자를 효과적으로 정제할 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결(operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합된 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합되어 활성형 단백질의 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 활성형 단백질 응집체 입자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 활성형 단백질 응집체 입자에 제니핀(genipin) 또는 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하여 가교시키는 것을 특징으로 하는 가교화에 의한 활성형 단백질 응집체 입자의 고정화 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 "활성형"이라는 용어는 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환체에서 안정하게 발현되어 완전한 폴딩을 이루는 것으로, 별도의 변성 또는 리폴딩 과정을 거치지 않고도 생물학적으로 활성을 가지는 가용성 단백질을 의미한다. 또한, "가용성"이란 단백질이 수용액에서 쉽게 침전되지 않고 내포체나 기타 응집체를 잘 형성하지 않는 성질을 의미한다.

삭제

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 섬유소결합도메인과 활성형 단백질의 유전자 획득

셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)인 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex, 서열번호 1)를 활성형 단백질 입자 제조에 사용하였다. 효소활성 단백질로는 대장균(E. coli) 유래인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, gusA, 서열번호 2) 및 써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) 유래 β-글리코시다아제(β-glycosidase, bglA, 서열번호 3) 유전자를 사용하였고, 활성검증 단백질로는 해파리 유래의 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP, 서열번호 4) 및 해조 유래의 적색형광단백질(Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed, 서열번호 5)을 사용하였다. gusA 및 bglA 유전자와 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex) 사이에 24 bp의 프롤린-트레오닌(proline-threonine, PT, 서열번호 6) 서열을 삽입하였으며, 이 펩타이드 구조는 CBDcex 도메인과 활성형 단백질의 구조적, 기능적 구획을 제공하며, 효소의 기질 친화성을 높이는 spacer로써 작용한다.

실시예 1-1. 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex)의 유전자 획득

Nutrient 배지(펩톤 10 g/ℓ, meat extract 10 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ)에 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi , GeneBank number: M15824)를 접종하여 30℃에 48시간 동안 배양하였다. 배양액으로부터 균체를 회수하고, 염색체 DNA를 얻은 후, 각각 EcoRI과 HindⅢ 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 7 및 8의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex) 유전자를 포함하는 395bp 크기의 DNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 30초)을 총 27회 실시하였다.

서열번호 7:

5'-GGAATTCGGTCGGTCCTCCGACGCCGACCCCGACTAGTGGTCCGGCCGGGTGCCAGG

서열번호 8: 5'-CCCAAGCTTGCCGACCGTGCAGGGCGTG

실시예 1-2. β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, gusA)의 유전자 획득

대장균 염색체를 주형으로 하고, 각각 NdeI 제한효소 절단 염기서열 및 CBDcex 유전자와 결합할 수 있게 제작된 염기서열이 도입된 서열번호 9 및 10의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 대장균 유래의 gusA 유전자를 포함하는 1845 bp크기의 DNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 2분)을 총 28회 실시하였다.

서열번호 9: 5'-GATCCATATGTTACGTCCTGTAGAAACC

서열번호 10: 5'-ACTAGTCGGGGTCGGCGTCGGAGGTTGTTTGCCTCCCTGCTG

실시예 1-3. β-글리코시다아제(β-glycosidase, bglA)의 유전자 획득

써머스 칼도필러스(Thermus caldophilus , AF322365) 염색체를 주형으로 하고, 각각 NdeI 제한효소 절단 염기서열 및 CBDcex 유전자와 결합할 수 있게 제작된 염기서열이 도입된 서열번호 11 및 12의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 써머스 칼도필러스 유래의 bglA 유전자를 포함하는 1329bp 크기의 DNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 2분)을 총 28회 실시하였다.

서열번호 11: 5'-GATCCATATGACCGAGAACGCCGAAAAG

서열번호 12: 5'-ACTAGTCGGGGTCGGCGTCGGAGGGAGCTGGGCCCGCGCGATCCG

실시예 1-4. 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP)의 유전자 획득

pEGFP 벡터(Clontech, USA)를 주형으로 하고, 각각 NdeI 및 NdeI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, EGFP 유전자를 포함하는 796bp 크기의 DNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 50℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 1.5분)을 총 25회 실시하였다.

서열번호 13: 5'-GATCATATGGTGAGCAAGGGCGAG

서열번호 14: 5'-GATCATATGTGCGCCGGCCGACTTGTACAGCTCGTCCAT

실시예 1-5. 적색형광단백질(Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed)의 유전자 획득

pDsRed2(Clontech, USA) 벡터를 주형으로 하고, 각각 NdeI 및 NdeI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 15 및 16의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, DsRed 유전자를 포함하는 767bp 크기의 DNA를 증폭하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 94℃에서 5분간 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 30초), 결합(annealing, 50℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 1.5분)을 총 25회 실시하였다.

서열번호 15: 5'-GATCCATATGGCCTCCTCCGAGAACGT

서열번호 16: 5'-GATCCATATGTGCGCCGGCTGACAGGAACAGGTGGTGGCGG

실시예 2: 섬유소결합 도메인과 활성형 단백질의 융합벡터 제작

실시예 2-1: 섬유소결합도메인 융합 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, gusA)의 벡터 제작

상기 실시예 1에서 증폭된 CBDcex 및 gusA를 주형으로 하고, 각각 NdeI 및 HindⅢ 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 17 및 18인 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 2.5분)을 총 28회 실시하였다.

서열번호 17: 5'-GATCCATATGTTACGTCCTGTAGAAACC

서열번호 18: 5'-CCCAAGCTTGCCGACCGTGCAGGGCGTG

그 결과, CBDcex의 N-말단에 gusA 유전자가 결합된 2167 bp 크기의 DNA가 증폭되었다. 상기 증폭된 DNA 산물을 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고, NdeI 및 HindⅢ로 절단된 pET21a(+) 발현벡터(Novagen, Madison, WI, 5443bp)에 삽입하여 pET21 gusA CBD 벡터를 제작하였다.

실시예 2-2: 섬유소결합도메인 융합 β-글리코시다아제(β-glycosidase, bglA)의 벡터 제작

상기 실시예 1에서 증폭된 CBDcex 및 bglA를 주형으로 하여, 각각 NdeI 및 HindⅢ 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 19 및 20의 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 수행하였다. PCR의 조건은 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 3분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 결합(annealing, 55℃에서 30초), 연장(extension, 72℃에서 2.5분)을 총 28회 실시하였다.

서열번호 19: 5'-GATCCATATGACCGAGAACGCCGAAAAG

서열번호 20: 5'-CCCAAGCTTGCCGACCGTGCAGGGCGTG

그 결과, bglA 유전자의 C-말단에 CBDcex가 결합된 1647bp 크기의 DNA를 증폭하였다. 상기 증폭된 DNA 산물을 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고, NdeI 및 HindⅢ로 절단된 pET21a(+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, 5443bp)에 삽입하여 pET21 bglA CBD 벡터를 제작하였다.

실시예 2-3: 섬유소결합도메인 융합 녹색형광단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP)의 벡터 제작

상기 실시예 1에서 증폭된 EGFP를 NdeI 제한효소로 절단하고, NdeI으로 절단된 pET21a(+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, 5443bp)에 삽입하여 pET21 EGFP 벡터를 제작하였다. 상기 실시예 1에서 증폭된 CBDcex 유전자를 EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고, EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 절단된 pET21 EGFP 발현 벡터에 삽입하여, 최종적으로 1191bp 크기의 pET21 EGFP CBD 발현 벡터를 제작하였다.

실시예 2-4: 섬유소결합도메인 융합 적색형광단백질(Discosoma sp. red fluorescent protein, DsRed)의 벡터 제작

상기 실시예 1에서 증폭된 DsRed를 NdeI 제한효소로 절단하고, NdeI으로 절단된 pET21a(+) 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, 5443bp)에 삽입하여 pET21 DsRed 벡터를 제작하였다. 상기 실시예 1에서 증폭된 CBDcex 유전자를 EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고, EcoRI 및 HindⅢ 제한효소로 절단된 pET21 DsRed 발현 벡터에 삽입하여, 최종적으로 1162bp 크기의 pET21 DsRed CBD 발현 벡터를 제작하였다.

실시예 3: 섬유소결합 도메인과 활성형 단백질의 융합벡터의 형질전환

상기 실시예 2에서 제작된 pET21 gusA CBD 벡터, pET21 bglA CBD 벡터, pET21 EGFP CBD 벡터 및 pET21 DsRed CBD 벡터를 각각 대장균(E. coli)에 일렉트로포레이션(electroporation) 방법으로 도입하여 재조합 대장균을 제조하였다. pET21 gusA CBD 및 pET21 bglA CBD는 E. coli BL21(DE3)에, pET21 EGFP CBD 및 pET21 DsRed CBD는 E. coli JM109(DE3)에 도입하였다.

실시예 4: 섬유소결합 도메인을 이용한 활성형 단백질 응집체 입자 제조

상기 실시예 3에서 제조된 재조합 대장균 내에서 섬유소결합도메인과 융합된 활성형 단백질을 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현시키기 위하여, pET21 gusA CBD 벡터 및 pET21 bglA CBD 벡터로 각각 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 항생제(앰피실린 100 ㎍/㎖) 함유 루니아-버타니 한천배지(LB배지, 효모액기스 5 g/ℓ, 트립톤 10 g/ℓ, 소금 5 g/ℓ)에 접종하여 37℃에서 진탕배양하다가 OD₆₀₀에서 흡광도가 0.4일 때 1 mM의 이소프로필 베타-디-티오갈락토사이드(isopropyl beta-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가한 후, 6시간 동안 배양하고 원심분리하여 균주를 수집하였다.

또한, pET21 EGFP CBD 벡터 및 pET21 DsRed CBD 벡터로 각각 형질전환된 E. coli JM109(DE3)를 동일한 배지로 30℃에서 진탕배양하다가 OD₆₀₀에서 흡광도가 0.4일 때 1 mM의 IPTG를 첨가한 후, 20시간 동안 배양하고 원심분리하여 균주를 수집하였다. 수집된 균주는 lysis buffer(50 mM Tris-HCl buffer(pH 8), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)로 1회 세척하고, 극저온냉장고(deep freezer)에 5배 농축하여 1 ㎖씩 분주하여 보관하였다.

상기 수집된 균주를 형광현미경을 통해 관찰한 결과, pET21 EGFP CBD 벡터 및 pET21 DsRed CBD 벡터로 형질전환된 대장균 내에서 강한 활성을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다 (도 1). 또한 상기 수집된 균주를 전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과, pET21 gusA CBD 벡터, pET21 bglA CBD 벡터, pET21 EGFP CBD 벡터 및 pET21 DsRed CBD 벡터로 형질전환된 대장균 내에서 활성형 단백질 응집체 입자형태로 발현된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

실시예 5: 활성형 단백질 응집체 입자의 활성 분석

상기 실시예 4에서 발현된 gusA CBD 및 bglA CBD 단백질 응집체 입자의 활성량을 측정하였다. 극저온 냉장고에서 보관중이던 분주샘플을 2 ㎖의 lysis buffer로 부유화시키고, 균주의 세포벽을 분해시키기 위해서 0.2 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme), 2 Unit/㎖ DNA분해효소를 첨가하여 1시간 동안 실온(약 25℃)에서 약하게 흔들면서 반응시켰다. 균주 파쇄후 원심분리를 이용하여 상등액과 침전물을 분리하였고, 상등액상의 가용성 효소의 활성과 침전물속의 불가용성 단백질 입자의 활성을 비교하였다.

gusA CBD 및 bglA CBD 활성 분석은 0.5 mM 오르토-니트로페닐-베타-디-갈락토피라노사이드(Ortho-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside, ONPG)와 0.5 mM MgCl₂가 포함된 기질 용액을 사용하였고, PCR에서 37℃로 반응 온도를 유지하면서 10분 동안 적당량의 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 β-글리코시다아제(β-glycosidase) 효소를 사용하여 당분해반응을 진행하였다. 반응 후 흡광도가 1.0 이하가 되도록 효소량을 조정하여 사용하였다. 효소반응 후 효소반응액에 동량의 탄산나트륨(Na₂CO₃)을 첨가하여 반응을 정지시키고 분광계(Spectrophotometer)를 사용하여 420 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 1 Unit은 37℃에서 1분 동안에 1 ㎛의 오르토-니트로페놀(Ortho-nitrophenol, ONP)을 생성시키는 효소량으로 정의하였다.

그 결과, gusA CBD 단백질 입자의 활성(Unit/㎖)은 가용성 효소의 활성에 비해 약 713% 높았고, 비활성(Unit/㎎)은 172% 높았다. 또한, bglA CBD 단백질 입자의 활성(Unit/㎖)은 가용성 효소의 활성에 비해 약 289% 높고, 비활성(Unit/㎎)으 로는 105%로 비슷한 값을 나타내었다. gusA 및 bglA가 결합된 단백질 입자의 활성을 비교하였을 때 gusA CBD 단백질 입자의 활성이 높았는데, 이는 단량체 단백질(bglA）보다 다량체 단백질(gusA)이 섬유소결합도메인에 결합하였을 때 단백질 입자가 안정적이고 활성이 높기 때문이라고 판단된다 (표 1).

활성형 단백질 응집체 입자와 상등액 내 가용성 효소의 활성 비교

	단백질 입자		가용성 단백질		전체활성중 단백질 입자의 효소활성 비율(%)	가용성 단백질 대비 단백질 입자의 활성 비율(%)	가용성 단백질 대비 단백질 입자의 비활성 비율(%)
	Unit/㎖	Unit/㎎	Unit/㎖	Unit/㎎	전체활성중 단백질 입자의 효소활성 비율(%)	가용성 단백질 대비 단백질 입자의 활성 비율(%)	가용성 단백질 대비 단백질 입자의 비활성 비율(%)
gusA-CBD	6.06±0.23	0.60±0.01	0.85±0.01	0.35±0.01	94	713	172
bglA-CBD	1.27±0.10	0.2±0.02	0.44±0.00	0.19±0.001	86	289	105

또한, 발현된 EGFP CBD 및 DsRed CBD가 세포 파쇄 후에도 안정하게 활성을 유지하는지 측정하였다. 극저온 냉장고에서 보관중이던 분주샘플을 2 ㎖의 lysis buffer로 부유화시키고 0.2 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme), 2 Unit/㎖ DNA분해효소를 첨가하여 1시간 동안 실온(약 25℃)에서 약하게 흔들어서 균주를 파쇄한 후, 형광현미경을 통하여 단백질 응집체 입자가 활성을 나타내는지 확인하였다.

그 결과, EGFP CBD 및 DsRed CBD 단백질 입자는 세포 내에서와 같이 강한 형광을 나타내었고 안정한 단백질 입자임을 확인할 수 있었다 (도 3).

실시예 6: 활성형 단백질 응집체 입자의 회수 및 재사용

활성형 단백질 응집체 입자가 고정화 효소로서 회수, 재사용이 가능한지 여부 및 가교제를 처리하여 고정화율을 높일 수 있는지에 대해서 측정하였다. 상기 실시예 4의 방법으로 gusA CBD 및 bglA CBD의 단백질 입자를 준비하였고, 100 mM phosphate buffer(pH 8)로 부유화시킨 후, 가교제인 1 mM 제니핀(genipin) 및 0.01% 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 사용하여 가교반응을 4℃에서 12시간 동안 진행하였다. 활성 분석은 상기 실시예 5와 같은 방법으로 진행하였다. 실시간으로 효소활성을 관찰하기 위하여 37℃로 유지되는 분광기에서 반응을 진행하면서 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 기질용액 안에 있는 기질이 효소반응에 의해 100% 분해가 되면 다시 원심분리(14000 rpm, 30분)하여 활성형 단백질 응집체 입자를 회수하였고, 다시 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8)로 부유화시켜 반복실험을 진행함으로써 활성형 단백질 입자를 재사용하였다.

그 결과, 활성형 단백질 응집체 입자는 원심분리와 같은 간단한 작업에 의해서 회수 및 재사용이 가능하였으며, 가교제의 첨가로 고정화율을 높일 수 있었다 (도 4).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)의 유전자 및 활성형 단백질의 유전자를 포함하고 상기 두 유전자가 융합되어 활성을 보유하는 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현되도록 배치된 재조합벡터를 숙주세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물을 배양하여 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합되어 있는 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법 및 활성형 단백질 응집체 입자의 고정화 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 섬유소결합도메인을 이용한 활성형 단백질 응집체 입자 제조방법은 쉽게 제조가 가능하고, 원심분리와 같은 간단한 공정만으로도 간편하게 회수 및 재사용이 가능하므로 생물공정에 쉽게 적용할 수 있다. 특히 고정화 생물 촉매를 간편하게 확보할 수 있으므로 효소반응공정의 고속 최적화 등에 활용할 수 있을 것으로 기대되며, 세포독성이 강하여 대량제조가 곤란한 단백질의 제조에도 응용할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD) 유전자 및 활성형 단백질의 유전자를 포함하고, 상기 두 유전자가 융합되어 활성을 보유하는 활성형 단백질 응집체 입자 형태로 발현되도록 배치된 재조합벡터.
제1항에 있어서, 상기 섬유소결합도메인은 엑소글루카나제(exoglucanase, CBDcex)인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제1항에 있어서, 상기 활성형 단백질은 효소인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제3항에 있어서, 상기 효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase, gusA) 또는 β-글리코시다아제(β-glycosidase, bglA)인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 벡터를 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물.
제5항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제5항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합된 활성형 단백질 응집체 입자의 제조방법.
제7항의 방법으로 제조되고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 유래의 섬유소결합도메인과 활성형 단백질이 융합되어 활성형 단백질의 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 활성형 단백질 응집체 입자.
제8항의 활성형 단백질 응집체 입자에 제니핀(genipin) 또는 글루타알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하여 가교시키는 것을 특징으로 하는 가교화에 의한 활성형 단백질 응집체 입자의 고정화 방법.
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