CN107142273B - 一种酶固定化方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酶固定化方法及其应用。该固定化方法利用磁感应蛋白与靶蛋白的直接融合，然后通过融合蛋白对纳米铁珠的吸附，从而实现酶的固定化。该方法可提高固定化酶的热稳定性和更强的pH耐受性，所制备的固定化酶在重复利用15次后，其相对活性仍然高达80％，在重复利用20次后，其相对活性仍然高达75％。本发明提供了一种操作简单的、效率提高的以及成本降低的酶固定化方法及其应用。

Description

一种酶固定化方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种酶固定化方法及其应用。
背景技术
动物是否能够检测到地球的磁场，以及它们如何通过感应磁场来实现定向或迁移，这是最有争议的话题之一。许多研究人员致力于识别磁感应，并寻找磁受体。最近，有研究人员发现并报道了一个磁蛋白生物指南针，它是一个多聚磁感应棒状蛋白复合体，这种磁敏复合体是由已鉴定的假定的磁感应蛋白MagR和已知的磁受体相关的光感受器隐花色素Cry组成，有Cry系统和铁基系统两者的特性，在包括地球在内的磁场中能自发排列。并且验证了蛋白质复合体具有固有磁矩。此外，这样的蛋白质复合体已被证明在物种之间广泛分布，并且相信会激发跨领域的技术创新。
磁感应蛋白MagR属于铁硫簇结合蛋白(简称铁硫蛋白)，每一个蛋白质单体都结合了一个二铁二硫形式的铁硫簇。磁感应蛋白MagR具有明显的内禀磁矩和清晰的物理模型，其必然掀起生物感磁研究的新一波热潮，推动整个生物磁感受能力研究的发展。
分离和纯化蛋白质是生物技术中的重要加工过程。等电点、十二烷基硫酸钠和凝胶过滤层析等传统方法已经应用于各种蛋白质的纯化。在低浓度蛋白质的情况下，分离和纯化意味着更具有挑战性。目前，已经开发的几种融合标签和亲和色谱法提供了一种有效方式来纯化目的融合蛋白。然而，高成本的亲和柱和耗时的操作限制了其大规模的可用性。通常而言，固定化酶能够回收和再利用昂贵的酶，并且提高成本效益。尽管进行了许多尝试来开发和优化固定化方法，但是终于发现，比表面积大和量子尺寸效应的氧化铁纳米颗粒提供了一种快速，方便和经济的固定化酶的方法。然而，先前的酶纯化是必要的，然后是磁性固定，这对工业应用造成沉重的负担。因此，实现酶的一步纯化和固定化是很必要的。虽然Ni2+官能化修饰的聚多巴胺包被的Fe3O4纳米粒子可以用于分离纯化his标签蛋白。氨基官能化的MCFs的生产是用于粘附醛标签酶。连接DNA配体的磁珠的制备是应用于β-葡萄糖醛酸酶的分离纯化。然而，氧化铁纳米颗粒的表面修饰应当在纯化和固定之前完成和评价，并且修饰后的纳米颗粒的不稳定性也限制了它的重复使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶固定化方法及其应用，从而解决现有技术中外源蛋白表达量低，分离纯化困难的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种利用磁感应蛋白作为纯化标签实现外源蛋白一步纯化与固定化的方法，所述方法包括以下步骤：1)以pET-28a(+)为载体质粒，向其中插入磁感应蛋白基因，构建一通用载体；2)将外源蛋白基因可操作地插入所述步骤1)中的通用载体中，构建含有外源蛋白基因的重组表达质粒，再将该重组表达质粒导入宿主细胞，获得重组菌株；以及3)培养所述重组菌株，诱导所述外源蛋白基因表达，收集表达产物，向所述表达产物中投入纳米铁珠，实现所述外源蛋白的一步分离纯化与固定化。
优选地，所述磁感应蛋白基因是一种来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因或一种来自果蝇的磁感应蛋白基因，其中来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，来自果蝇的磁感应蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
优选地，所述步骤1)中通用载体的构建还包括在所述磁感应蛋白基因序列的下游插入凝血酶切割位点。通过在通用载体中引入该凝血酶切割位点，在外源蛋白以及磁感应蛋白共表达之后，仅仅通过向表达产物中加入凝血酶，即可实现对磁感应蛋白标签的切割，获得更加接近天然序列的外源蛋白。
可选地，所述步骤2)中重组表达质粒的构建中，所述外源蛋白基因与所述通用载体上的磁感应蛋白基因直接连接。
优选地，所述步骤2)中重组表达质粒的构建中，所述外源蛋白基因与所述通用载体上的磁感应蛋白基因通过一段刚性linker连接，所述刚性linker具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
还优选地，所述步骤2)中重组表达质粒的构建中，所述外源蛋白基因与所述通用载体上的磁感应蛋白基因通过一段柔性linker连接，所述柔性linker具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
作为举例而非限制，所述宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
所述外源蛋白包括：脂肪酶、糖苷酶或普鲁兰酶等等。本发明通过上述三种外源蛋白验证了磁感应蛋白作为纯化标签的通用性，但是应当理解，此处仅作为举例而非限制，外源蛋白实际并不仅限于上述三种。
所述步骤3)中还包括：向所述表达产物中加入适量凝血酶，实现磁蛋白标签与外源蛋白的分离。
根据本发明的第二方面，还提供一种根据上述方法获得的通用载体，所述通用载体以pET-28a(+)为载体质粒，插入连接有凝血酶切割位点的磁感应蛋白基因，所述通用载体依次包括：T7启动子、磁感应蛋白基因、凝血酶切割位点、linker、多克隆位点以及T7终止子。
根据本发明的第三方面，还提供一种利用磁感应蛋白作为纯化标签实现外源蛋白一步纯化与固定化的方法在制备工业酶制剂、蛋白质药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
根据本发明提供的方法，首次利用磁感应蛋白作为纯化标签，然后通过磁感应蛋白对纳米铁珠的吸附，一步实现了外源蛋白的分离纯化与固定化，该方法与传统的纯化方法相比，纯化的步骤非常简便、快速，节约了大量的人力、物力以及时间成本。
根据本发明提供的方法，一步实现了外源蛋白，比如脂肪酶的纯化与固定化，并且固定化的脂肪酶相对于游离的脂肪酶提高了热稳定性与pH的耐受性，增加了可重复利用性。
根据本发明提供的方法，直接采用纳米铁珠对蛋白的磁性吸附即可实现对外源蛋白的一步分离纯化，避免了现有技术需在分离纯化前对纳米铁珠进行表面修饰，而修饰后的纳米铁珠的不稳定性又限制了其重复使用的缺陷，而本发明所提供的方法中纳米铁珠不仅无需修饰，也不存在重复使用率低的缺陷，节约了成本。
根据本发明提供的通用载体，磁蛋白纯化标签位于一环化质粒(即通用质粒)上，易于保存和DNA操作。
本发明所采用的磁感应蛋白，只有14.5KDa，其单体只有130个氨基酸左右(不同物种略有差异)，更方便进行基因操作，对目标生物的负担也会更小。
本发明提供的通用载体中带有纯化标签和凝血酶切割位点，有利于纯化标签的去除，获得更加接近天然序列的目的蛋白。
本发明提供的通用载体的多克隆位点中含有稀有接口，兼容绝大多数异源基因的连接，节约操作时间提高工作效率。
总之，本发明提供了一种以磁感应蛋白作为纯化标签，一步实现外源蛋白的纯化与固定化的方法，并且该方法步骤简便、快速，相比传统方法节约了大量的人力、物力和时间成本，为外源蛋白的一步分离、纯化、固定化开辟了新的道路。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例构建的通用质粒p28aMagR的物理图谱；其中，包括T7启动子；clMagR：磁蛋白纯化标签；MCS：多克隆酶切位点；T7终止子；KanR抗性标记。
图2是clMagR的蛋白电泳图；其中，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-pET28a-clMagR细胞破碎液的上清、沉淀；5:铁珠纯化的clMagR蛋白。
图3是linker模式下和无linker模式下融合clMagR标签的GFP的蛋白电泳图；其中，(a)图，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-pET28a-clMagR-刚性linker-GFP细胞破碎液的上清、沉淀；5：铁珠纯化后clMagR-刚性linker-GFP蛋白；6、7：BL21-pET28a-clMagR-柔性linker-GFP细胞破碎液的上清、沉淀；8：铁珠纯化后clMagR-柔性linker-GFP蛋白。(b)图，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-pET28a-clMag-GFP细胞破碎液的上清、沉淀；5：铁珠纯化后clMagR-GFP蛋白。
图4是无linker模式下融合clMagR标签的脂肪酶、糖苷酶、普鲁兰酶的蛋白电泳图；其中，(a)图，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-p28aMagR-lipase细胞破碎液的上清、沉淀；5：铁珠纯化后clMagR-lipase蛋白；(b)图，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-p28aMagR-α-AF细胞破碎液的上清、沉淀；5：铁珠纯化后clMagR-α-AF蛋白；(c)图，M：蛋白分子量标准；1、2：BL21-pET28a细胞破碎液的上清、沉淀；3、4：BL21-p28aMagR-pullulanase细胞破碎液的上清、沉淀；5：铁珠纯化后clMagR-pullulanase蛋白。
图5是游离脂肪酶与固定化脂肪酶的酶学性质对比；其中，(a)游离脂肪酶和固定化脂肪酶在不同温度下的相对活性曲线；(b)游离脂肪酶和固定化脂肪酶的热稳定性；(c)游离脂肪酶和固定化脂肪酶在各种pH条件下的相对活性曲线；(d)游离脂肪酶和固定化脂肪酶的pH稳定性；
图6是固定化脂肪酶的可重复利用性；
图7是去掉clMagR标签的脂肪酶的蛋白电泳图；其中，M：蛋白分子量标准；1：BL21-pET28a细胞破碎液的上清；2:BL21-p28aMagR-lipase细胞破碎液的上清；3：铁珠纯化后clMagR-lipase蛋白；4：凝血酶在4℃下将纯化的clMagR-lipase蛋白消化10h得到的脂肪酶条带；5：凝血酶在20℃下将纯化的clMagR-lipase蛋白消化3.5h得到的脂肪酶条带；6：凝血酶在37℃下将纯化的clMagR-lipase蛋白消化1.5h得到的脂肪酶条带。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明所用的原料或试剂，如无特殊说明，均市售可得。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。
应当理解，根据本发明所提供的方法，该方法适用于任何磁感应蛋白，但是由于存在无法穷举的原因，本文仅以两种磁感应蛋白作为举例说明，其中一种是来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因，另一种是来自果蝇的磁感应蛋白基因，其中来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，来自果蝇的磁感应蛋白基因具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列。但是，应当理解，来自果蝇的磁感应蛋白作为纯化标签的应用与来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白的应用在方法上是基本一致的，区别仅在于具体核苷酸序列的不同。因此，以下具体实施方式仅以来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因为例，来自果蝇的磁感应蛋白基因的应用则不再赘述。
实施例中用到的试剂、缓冲液和培养基如下：
主要试剂配置：
卡那霉素：无菌双蒸水配置50mg/mL的kanr溶液，使用孔径0.22μm无菌滤膜除菌，-20℃保存。
50×TAE：冰醋酸57mL，Tris 242g，0.5mol/L EDTA(pH8.0)40mL，ddH2O定容至1000mL。
蛋白电泳缓冲液：Tris-Base：3g，SDS(十二烷基磺酸钠)：1g，甘氨酸(Glycine)：14.4g，加双蒸水定容至1000mL，调节pH为8.3。
5×Loading Buffer：pH6.8的1M Tris-Hcl:0.6mL，10％SDS：2mL，2-巯基乙醇：0.5mL，50％甘油：5mL，1％溴酚蓝：1mL，双蒸水：0.9mL。
SDS-PAGE染色液：冰乙酸：100mL，无水乙醇：450mL，考马斯亮蓝R-250：1g，双蒸水：450mL。
SDS-PAGE脱色液：无水乙醇：100mL，冰乙酸：200mL，双蒸水：700mL。
LB培养基(1L)配方：氯化钠：10g，蛋白胨：10g，酵母粉：5g，原始pH；其固体培养基：在LB液体培养基中加入15-20％的琼脂粉；121℃，湿热灭菌20分钟。
质粒提取试剂盒购自Invitrogen(USA)，胶回收试剂盒购自OMEGA公司。
实施例1 pET28a-clMagR重组表达质粒的构建
1)合成如SEQ ID NO.1所示的clMagR基因的核苷酸序列，该序列由金斯瑞生物科技有限公司合成；
2)分别合成以下引物：
引物clMagRF：5’CGCGGATCCATGGCATCTAGCGCATCATC3’，其中，下划线部分为BamH I识别位点；
引物clMagRR：5’ACGGAGCTCGATGTTAAAGCTTTCTCCAC3’，其中，下划线部分为Sac I识别位点。
3)在上述引物的引导下，以步骤1)中的序列为模板进行PCR扩增。
4)将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤3)得到的带有BamH I和SacI酶切位点的基因，分别用BamH I和SacI进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌DH5a，用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，命名为pET28a-clMagR。
实施例2磁蛋白的异源高效可溶性表达和磁蛋白的磁性验证
1)将实施列1中的获得的表达质粒pET28a-clMagR采用热激法转入到大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落，在含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB培养基中37℃培养8小时，然后按1％的比例转接到新鲜的40ml LB培养基中继续繁殖。当OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度20μM。在20℃下诱导13小时后，收集细胞并用纯水洗涤。将收集的细胞重悬于TBS缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，pH7.5)中，并超声破碎15分钟。将细胞裂解液离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳。
2)将步骤1)收集的上清取0.5ml，加入0.1ml的Fe3O4-SiO2纳米粒子(10mg ml-1)，室温孵育10mim，通过离心收集所得沉淀，并用TBS缓冲液洗涤三次以除去非吸附杂蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测吸附的蛋白质。实验结果如图2所示，clMagR基因在大肠杆菌中实现了异源高效可溶性表达，并且该表达的磁蛋白经验证具有一定的磁性。
实施例3linker的设计模式
1)分别设计并合成刚性linker和柔性linker，以及引物linker1F，linker2F，linker1R/linker2R，GFP 1F/GFP1R，GFP2F/GFP2R，GFP3F/GFP3R；
其中，刚性linker的基因序列如SEQ ID NO.5所示，柔性linker的基因序列如SEQID NO.6所示；
linker1F：5’ATCGAGCTCAAAGCGAAACTGAAAGAGGA3’，其中，下划线部分为Sac I识别位点；
linker2F：5’ATCGAGCTCGGCGGAGGTGGCTCTGGCGG3’，其中，下划线部分为Sac I识别位点；
linker1R/linker2R：5’TTCTCCTTTACTCATATGGCTGCCGCGCGG
CACCA3’
GFP1F/GFP2F：5’CCATATGAGTAAAGGAGAAGAACT3’
GFP3F：5’ATCGAGCTCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGTAAAGGAGAAGAAC3’，其中，下划线部分为Sac I识别位点；
GFP1R/GFP2R/GFP3R：5’AGTGCGGCCGCTTATTTGTATAGTTCATCCA3’，其中，下划线部分为Not I识别位点。
2)对于质粒构建，使用引物GFP 1F/GFP1R，GFP2F/GFP2R扩增包括完整ORF的GFP的DNA片段Ⅰ/Ⅱ。接着，合成含有凝血酶序列+柔性linker/凝血酶序列+刚性linker的DNA片段Ⅲ/Ⅳ，用引物linker1F/linker1R和linker2F/linker2R扩增得到DNA片段Ⅴ/Ⅵ。接着，使用PCR纯化过的片段Ⅰ/Ⅴ和片段Ⅱ/Ⅵ作为模板，用引物linker1F/GFP1R和linker2F/GFP2R扩增得到DNA片段Ⅶ/Ⅷ。接着，通过Sac I和Not I消化载体pET28a-clMagR，然后与同经过Sac I/Not I双酶切的片段Ⅶ/Ⅷ整合，产生载体pET28a-clMagR-柔性linker-GFP和pET28a-clMagR-刚性linker-GFP。相似的，基因GFP用引物GFP3F/GFP3R扩增，其在GFP的5'端引入凝血酶消化序列。在通过Sac I/Not I消化后，将GFP基因克隆到质粒pET28a-clMagR中以获得载体pET28a-clMagR-GFP。
3)将重组表达质粒pET28a-clMagR-柔性linker-GFP、pET28a-clMagR-刚性linker-GFP和p28aMagR-GFP通过热激法分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导GFP表达，其诱导条件是：20℃，IPTG 0.05mmol/L，13小时通过离心收集细胞，用TBS缓冲液洗涤两次，然后通过超声破碎。如上所述，通过Fe3O4-SiO2纳米颗粒纯化融合蛋白，进行SDS-PAGE电泳。结果如图3所示，验证了磁蛋白作为纯化标签的可行性。并且将200μL的clMagR-GFP，clMagR-柔性linker-GFP，clMagR-刚性linker-GFP溶液转移到96孔微量培养板中，然后置于BioTekTM CytationTM 3Cell Imaging Multi-ModeReader(美国佛蒙特州)中，在485nm激发和520nm发射条件下，测得三者的荧光强度，结果见表一。
表一clMagR-rigid linker-GFP,clMagR-flexible linker-GFP and clMagR-GFP的荧光强度
Figure GDA0002566783800000091
根据上表一结果可知，当在clMagR和GFP之间连入刚性linker时，荧光强度最强，其次是不加linker的情况，再次是连入柔性linker的情况。因此，在该实施例中，在磁感应蛋白与外源蛋白之间连入刚性linker时，外源蛋白的表达量最高。但是，考虑到不加linker的荧光强度仅比连入刚性linker的荧光强度稍低，而不加linker模式构建表达目的蛋白重组质粒步骤简单，而且选择不同目的蛋白，它们的构象也不同，连入刚性linker是否会影响相应目的蛋白的构象也并不确定，而不加linker模式就表明了磁蛋白不影响GFP构象，因此，也可选择不加linker。对于其他外源蛋白，还可优选连入柔性linker。
实施例4通用质粒p28aMagR的构建：
1)合成带有clMagR纯化标签、凝血酶切位点的核苷酸序列，如SEQ IDNO.13所示；
2)合成下列引物：
引物MagRF：5’CGCGGATCCATGGCATCTAGCGCATCATC3’，其中下划线部分为BamH I识别位点；
引物MagRR：5’ACGGAGCTCATGGCTGCCGCGCGGCACCA3’，其中，下划线部分为Sac I识别位点。
3)在上述引物的引导下，以步骤1)中合成的序列为模板进行PCR扩增。
4)将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤3)得到的带有BamH I和SacI酶切位点的基因片段，分别用BamH I和Sac I进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌DH5a，用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，试剂盒提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆质粒，命名为p28aMagR。
实施例5 p28aMagR-lipase,p28aMagR-α-AF和p28aMagR-pullulanase的构建
为了确认该纯化方法的普遍性，选择具有不同分子量大小的脂肪酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-AF)和普鲁兰酶作为靶蛋白。合成具有Sal I和Xho I酶切位点的引物lipaseF/lipaseR、AFF/AFR、pulluF/pulluR，以分别扩增脂肪酶，α-AF和普鲁兰酶基因的完整ORF，纯化的PCR产物通过Sal I和NotI双酶切后并整合到p28aMagR中，产生p28aMagR-lipase，p28aMagR-α-AF和p28aMagR-pullulanase重组表达质粒。其中：
lipaseF：5’TCCGTCGACTCCTCAGGGCATAACCCTGT3’，其中，下划线部分为Sal I识别位点；
lipaseR：5’GTGCTCGAGTTAATTTGTATTTTGTCCGC3’，其中，下划线部分为Xho I识别位点；
AFF：5’TCCGTCGACATGAAAAACTTCAAGATGCT3’，其中，下划线部分为Sal I识别位点；
AFR：5’GTGCTCGAGTCAGTTCAGTGTGATCTCAA3’，其中，下划线部分为Xho I识别位点；
pulluF：5’TCCGTCGACGATTCTACTTCGACTAAAGT3’，其中，下划线部分为Sal I识别位点；
pulluR：5’GTGCTCGAGTTATTGTTTGAGAATAAGCG3’，其中，下划线部分为Xho I识别位点。
将重组载体p28aMagR-lipase，p28aMagR-α-AF和p28aMagR-pullulanase分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。选择通过PCR和测序确认的转化体。脂肪酶，α-AF和支链淀粉酶的诱导条件为：20℃，IPTG 0.1mmol/L，16小时；20℃，IPTG 0.2mmol/L，20h；20℃，IPTG0.1mmol/L，18小时。通过离心收集细胞，用TBS缓冲液洗涤两次，然后通过超声破碎。如上所述，通过Fe3O4-SiO2纳米颗粒纯化融合蛋白，进行SDS-PAGE电泳。结果如图4所示，验证了磁蛋白作为纯化标签的通用性。
实施例6脂肪酶的一步纯化与固定化
1)在BL21-p28aMagR-lipase破碎后的上清中投入Fe3O4-SiO2纳米粒子(购买于苏州海狸生物医学工程有限公司)，方法见实施例2中的步骤2)，通过磁蛋白与纳米铁珠的物理吸附作用，一步实现脂肪酶的纯化与固定化。通过分别对游离脂肪酶和固定化脂肪酶在不同温度下和不同pH下的稳定性进行比较，结果如图5所示，固定化脂肪酶的热稳定性和pH稳定性均相比游离脂肪酶得到提高。此外，发明人还对固定化脂肪酶的可重复利用性进行了研究，结果如图6所示，固定化脂肪酶在重复利用高达15次后，其相对活性仍然保持80％，在重复利用20次后，其相对活性也仍然高达75％。由此可知，通过纳米铁珠对磁蛋白的物理吸附作用，实现了脂肪酶的一步纯化和固定化，使脂肪酶的稳定性和重复利用性均得到提高。为了得到纯的脂肪酶溶液，在步骤1)所得溶液中加入少量的凝血酶，分别在4℃、20℃、37℃、酶切10h、3.5h、1.5h，实现磁蛋白标签与脂肪酶的分离，结果如图7所示，磁蛋白标签与脂肪酶成功分离，获得了更加接近天然序列的脂肪酶。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种酶固定化方法及其应用
<160> 21
<210> 1
<211> 399
<212> DNA
<213> 家鸽
<400> 1
atggcatcta gcgcatcatc tgttgttaga gcaacagtta gagcagttag caaaagaaaa 60
attcaagcaa caagagcagc acttacactt accccatcag ctgttcagaa gataaaagag 120
cttcttaaag ataaacctga gcatgtaggc gtgaaagtag gtgttcgcac aagaggatgc 180
aatggacttt cttacacatt agaatataca aaatcaaaag gagactctga tgaagaagta 240
gttcaagatg gggttagagt gtttattgag aagaaggcac agctgacgct tttaggcact 300
gaaatggact atgtagaaga caaactgtcc agtgaatttg tcttcaataa tccaaacatc 360
aaaggaacat gtggctgtgg agaaagcttt aacatctga 399
<210> 2
<211> 393
<212> DNA
<213> 果蝇
<400> 2
atggcgacac gtgtggtggc aacggcgaca gtgcgggcgg tgaaaggccg gaagttaatc 60
ccgacgcggg ccgctctgac tctgacaccc gcggcggtgc tacgcatcaa gacgcttctg 120
caggacaagc cggacatggt tggcctaaag gtgggcgtac ggcagcgagg atgcaatggt 180
ctgtcctaca cgctggacta tgccagccaa aaagacaagt tggatgagga ggtggtccag 240
gatggcgtca aggtcttcat cgacaagaaa gcgcagttgt cgctgctggg taccgagatg 300
gactttgtgg aatcgaagct gtccagcgag ttcgtgttta acaatccgaa cattaagggc 360
acatgcggct gcggcgaatc gttcagcatg taa 393
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>clMagRF
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 3
cgcggatcca tggcatctag cgcatcatc 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>clMagRR
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 4
acggagctcg atgttaaagc tttctccac 29
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>刚性linker
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 5
aaagcgaaac tgaaagagga ggaagagcgt aagcagcgcg aagaagaaga cgtattaaac 60gtctggaaga actggcgaaa cgtaaagaag aggaacgcaa a 101
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>柔性linker
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 6
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>linker1F
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 7
atcgagctca aagcgaaact gaaagagga 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>linker2F
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 8
atcgagctcg gcggaggtgg ctctggcgg 29
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> linker1R/linker2R
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 9
ttctccttta ctcatatggc tgccgcgcgg cacca 35
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> GFP1F/GFP2F
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 10
ccatatgagt aaaggagaag aact 24
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> GFP3F
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 11
atcgagctcc tggtgccgcg cggcagccat atgagtaaag gagaagaac 49
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> GFP1R/GFP2R/GFP3R
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 12
agtgcggccg cttatttgta tagttcatcc a 31
<210> 13
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> p28aMagR
<223>
<400> 13
atggcatcta gcgcatcatc tgttgttaga gcaacagtta gagcagttag caaaagaaaa 60
attcaagcaa caagagcagc acttacactt accccatcag ctgttcagaa gataaaagag 120
cttcttaaag ataaacctga gcatgtaggc gtgaaagtag gtgttcgcac aagaggatgc 180
aatggacttt cttacacatt agaatataca aaatcaaaag gagactctga tgaagaagta 240
gttcaagatg gggttagagt gtttattgag aagaaggcac agctgacgct tttaggcact 300
gaaatggact atgtagaaga caaactgtcc agtgaatttg tcttcaataa tccaaacatc 360
aaaggaacat gtggctgtgg agaaagcttt aacatcggcc tggtgccgcg cggcagccat 420
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>MagRF
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 14
cgcggatcca tggcatctag cgcatcatc 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> MagRR
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 15
acggagctca tggctgccgc gcggcacca 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> lipaseF
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 16
tccgtcgact cctcagggca taaccctgt 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> lipaseR
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 17
gtgctcgagt taatttgtat tttgtccgc 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> AFF
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 18
tccgtcgaca tgaaaaactt caagatgct 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> AFR
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 19
gtgctcgagt cagttcagtg tgatctcaa 29
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> pulluF
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 20
tccgtcgacg attctacttc gactaaagt 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> pulluR
<223>金斯瑞生物科技有限公司
<400> 21
gtgctcgagt tattgtttga gaataagcg 29

Claims (4)

1.一种酶固定化方法，其特征在于，利用磁感应蛋白与酶的直接融合，然后通过纳米铁珠对融合蛋白的吸附，从而实现酶的一步纯化与固定化，所述酶固定化方法包括以下步骤：
1）向载体质粒pET-28a(+)中插入磁感应蛋白基因，构建一通用载体；
2）将酶基因可操作地插入所述步骤1）中的通用载体中，构建含有酶基因的重组表达质粒，实现磁感应蛋白与酶的直接融合，再将该重组表达质粒导入宿主细胞，获得重组菌株；以及
培养所述重组菌株，诱导所述酶基因表达，收集细胞并用纯水洗涤，将收集的细胞重悬于TBS缓冲液中，并超声破碎，将细胞裂解液离心，向收集的上清中加入纳米铁珠，室温孵育，通过离心收集所得沉淀，并用TBS缓冲液洗涤以除去非吸附杂蛋白，从而获得一种固定化酶；
其中，所述酶是一种脂肪酶，所述磁感应蛋白基因是一种来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因，所述来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的酶固定化方法，其特征在于，固定化脂肪酶在重复利用15次后，其相对活性仍然高达80%。
3.根据权利要求2所述的酶固定化方法，其特征在于，固定化脂肪酶在重复利用20次后，其相对活性仍然高达75%。
4.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的酶固定化方法在制备工业酶制剂中的应用。
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