CN116102628A - 活性聚集肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了活性聚集肽及其应用，属于生物工程技术领域。该类活性聚集肽来源于大肠杆菌Escherichia coli CFT073的α‑溶血素HlyA，共包含五个序列，分别为HlyA218、HlyA60、H12、H1和H2。通过将该类活性聚集肽与目的蛋白融合表达，可介导目的蛋白在宿主细胞内形成活性包涵体，且该类短肽诱导蛋白活性聚集率高、具有刺激重组菌快速生长的潜力。该类活性聚集肽可应用于重组蛋白的无柱化纯化和原位固定化，生产成本低，步骤简便。

Description

活性聚集肽及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及活性聚集肽及其应用。

背景技术

随着生物技术产业的快速发展，广泛应用于工业和医学领域的重组蛋白需求量逐年增长。但目前重组蛋白的高效生产依然面临着一系列的瓶颈问题。首先，异源的重组蛋白常因与宿主不兼容而产量偏低，或因蛋白本身对宿主有毒性而不表达。通过序列密码子优化、改进培养及表达条件及使用融合标签等策略可有效提高重组蛋白的表达量，但可溶性重组蛋白仍面临着被宿主蛋白酶降解的风险。另外，重组蛋白的有效分离与纯化是蛋白生产中下游的重要工艺，而传统的柱层析过程常因其繁琐的步骤和较高的设备要求而具有纯化产率较低和经济、生态成本较高的局限性。除此之外，参与生物催化的酶制剂常需要被固定在载体材料上以实现酶的回收利用，在固定化过程中需要对材料和条件进行个案优化，甚至需要考虑固定化是否会导致酶失活的问题。

活性聚集肽作为一类具有多种功能的融合标签，为解决这些瓶颈问题提供了一种新的思路。这类多肽能通过非共价相互作用自发组装成有序的结构，与目的蛋白融合表达时能介导活性包涵体的产生，活性包涵体具有包涵体的物理性质的同时保留了活性。虽然更高的可溶性蛋白产量一直是研究者们追求的目标，但是活性包涵体带来的物理性质改变能够赋予重组蛋白更高的稳定性以及纯化、固定化的简便性。

目前报道的活性聚集肽存在一定的局限性，例如一些人工设计的自组装短肽作为标签进行融合表达时易导致菌株的生长受阻，以及融合后的重组酶活性显著低于可溶性酶等。此外，一些短的人工肽往往具有重复序列，大大提高了分子克隆过程的难度；而具有相对较长序列的标签，则可能加重宿主细胞代谢负担，影响重组蛋白的产量及下游应用。因此，为更好地利用活性聚集肽来优化重组蛋白的生产，亟需寻找一种具有上述优势且对宿主菌株生长和蛋白产量产生无负面影响的活性聚集肽。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前重组蛋白生产过程中异源蛋白表达受限、易受蛋白酶降解、低效纯化，以及耗时费力的固定化等限制重组蛋白工业化生产的局限问题，而提供了一种新型的活性聚集肽，所述活性聚集肽来源于大肠杆菌Escherichia coliCFT073的α-溶血素(HlyA)。

本发明的首要目的在于提供一种活性聚集肽。

本发明的另一目的在于提供上述活性聚集肽的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种活性聚集肽，其氨基酸序列为如下任一序列所示：

HlyA218：GNSLAKNVLSGGKGNDKLYGSEGADLLDGGEGNDLLKGGYGNDIYRYLSGYGHHIIDDDGGKDDKLSLADIDFRDVAFRREGNDLIMYKAEGNVLSIGHKNGITFRNWFEKESGDISNHQIEQIFDKDGRVITPDSLKKALEYQQSNNKASYVYGNDALAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

HlyA60：LAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

H12：QDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLS；

H1：QDNLNPLINEISKIISAA；

H2：ERAAASLLQLS。

其中，活性聚集肽HlyA60的结构预测结果显示，HlyA60包含两个独立的两亲性α螺旋区域。根据所述活性聚集肽HlyA60中的两亲性α螺旋区域截短得到活性聚集肽H12、H1和H2。

上述活性聚集肽在高效介导形成重组蛋白活性包涵体中的应用。

一种重组蛋白活性包涵体的制备方法，包括如下步骤：

(1)将重组表达构建体导入宿主细胞中，获得重组细胞；所述重组表达构建体包括编码融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列；所述融合蛋白包括目的蛋白、构建在目的蛋白羧基端的上述活性聚集肽以及目的蛋白与活性聚集肽之间的连接肽；

(2)培养步骤(1)所得重组细胞，表达所述融合蛋白，获得包含融合蛋白的活性包涵体。所述目的蛋白、活性聚集肽及连接肽形成的融合蛋白在宿主细胞表达后形成大量活性包涵体。

优选的，步骤(1)中所述的重组表达构建体采用的载体可以是在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还可以是能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得适于本发明的载体。在本发明的实施例中的表达构建体衍生自Novagen公司的pRSFDuet-1。

优选的，步骤(1)中所述的重组表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列可操纵地连接，以进行转录及在宿主细胞中生产所述融合蛋白。表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列等。

优选的，步骤(1)中所述目的蛋白可以是任何长度的多肽或蛋白。进一步优选的，所述目的蛋白的长度为182～320个氨基酸。在本发明的实施例中，通过本发明生产的目的蛋白包括但不限于来源于枯草芽孢杆菌168的脂肪酶A(LipA)和来源于短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶(AXE)。

优选的，步骤(1)中所述连接肽是指由2～15个氨基酸组成的多肽，可以使连接的多肽或蛋白各自充分展开，互不影响，各自折叠成相应的天然构象，包括常见的连接融合蛋白表达所用的连接肽。本发明的实施例中选用的连接肽为HRV 3C site。

优选的，步骤(1)中所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞。示例性的原核生物细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细菌细胞，优选是大肠杆菌细胞。在本发明的具体实施方案中，所使用的宿主细胞为Escherichia coliBL21(DE3)菌株细胞。

优选的，步骤(1)中所述导入可以通过许多已熟知的技术之一实现，所述技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。

优选的，步骤(2)的具体操作为：将步骤(1)所得重组细胞进行培养，收获的细胞经裂解后去除上清，收集不可溶部分，获得包含融合蛋白的活性包涵体。

所述裂解的处理方法，包括但不限于超声破碎法、溶菌酶破壁法、高压破碎法等，及其上述方法的组合，优选为超声破碎法。

一种重组蛋白活性包涵体，通过上述制备方法得到。

一种重组蛋白包涵体的纯化方法，包括如下步骤：利用两步洗涤法对上述重组蛋白活性包涵体进行纯化，即可获得纯化后的融合蛋白；所述两步洗涤法包括如下步骤：

第一步：使用含TritonX-100的磷酸钠缓冲液重悬活性包涵体，置冰上孵育20±2min；

第二步：离心去除上清后使用磷酸钠缓冲液洗涤活性包涵体。

优选的，所述TritonX-100在体系中的体积浓度为0.8±0.1％。

优选的，所述磷酸钠缓冲液的浓度为50±5mM，pH为7.0±0.2。

优选的，所述离心的条件为转速12000±1000rpm、温度4±2℃、时间5±2min。

优选的，所述洗涤的次数为2次。

一种重组蛋白，由目的蛋白、构建在目的蛋白羧基端的上述活性聚集肽以及目的蛋白与活性聚集肽之间的连接肽组成。

优选的，所述目的蛋白为酶蛋白，所述重组蛋白为重组酶蛋白。

所述的重组蛋白在蛋白质工程领域中的应用。

上述重组酶蛋白作为原位固定化酶在生物催化反应中的应用。

优选的，所述重组酶蛋白可重复回收利用至少30次。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种来源于大肠杆菌Escherichia coli CFT073的活性聚集肽，所述活性聚集肽能够高效诱导目的蛋白形成活性包涵体。

(2)相较于其他活性聚集肽，本发明所述的活性聚集肽，除具有诱导蛋白活性聚集率高的优点外，还具有刺激重组菌快速生长并积累生物量的潜力。

(3)活性聚集肽介导的两步洗涤法，作为一种快速、经济、无柱化的蛋白纯化方法，可简化重组蛋白纯化过程，大幅度降低纯化成本。同时，活性聚集肽介导的原位固定化能够达到与应用广泛的载体结合固定化相当的效果。因此本发明所述的活性聚集肽具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的实验结果图；其中，A为HlyA218与HlyA60的结构示意图，B为不同表达菌株中各细胞组分的荧光值测定结果，C为不同表达菌株中活性包涵体的分布。

图2为实施例2的实验结果图；其中，A为重组酶LipA-HlyA60与LipA-His的SDS-PAGE分析结果(M为Protein Marker，S为细胞破碎后的上清液，P为细胞破碎后的沉淀)，B为重组酶LipA-HlyA60与LipA-His在胞内两组分的酶活测定结果及发酵末期菌体密度(终OD₆₀₀)。

图3为实施例3的实验结果图；其中，A为重组酶AXE-HlyA60与AXE-His的SDS-PAGE分析结果(M为Protein Marker，S为细胞破碎后的上清液，P为细胞破碎后的沉淀)，B为重组酶AXE-HlyA60与AXE-His在胞内两组分的酶活测定结果及发酵末期菌体密度(终OD₆₀₀)。

图4为AXE-HlyA60的重复利用情况统计图(第一次反应的酶活定义为100％)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以在此基础上做出若干变动和改进，例如改变表达载体的种类、表达载体构建的方法、宿主细胞的种类等。这些都属于本发明的保护范围。

如无特殊说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明，所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。

实施例1：活性聚集肽HlyA218、HlyA60、H12、H1、H2介导红色荧光蛋白(mCherry)形成活性包涵体

1.重组表达菌株的构建

以E.coli CFT073基因组DNA为模板，使用引物hlyA218-F/hlyA218-R扩增hlyA218基因；以pET30a-mCherry质粒(市售产品)为模板，用引物mCherry-F/mCherry-R进行扩增mCherry基因；以质粒pRSFDuet-1为模板，引物pRSF-F/pRSF-R扩增pRSFDuet-1载体片段。所有片段经纯化后用于后续同源重组连接。引物序列如表1所示，使用PrimeSTAR Max酶进行PCR，体系及程序如表2所示。扩增完成后经1％琼脂糖凝胶电泳验证，得到hlyA218基因片段，mCherry基因片段和pRSFDuet-1质粒片段。所有片段经纯化后用于后续同源重组连接。

表1.引物序列

注：下划线处的碱基序列为酶切位点

表2.PCR体系及程序

利用

MultiS重组克隆试剂盒将得到的hlyA218基因片段，mCherry基因片段和pRSFDuet-1载体片段进行重组反应，重组反应的体系及条件见表3。将重组产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证正确的转化子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h后提取质粒进行测序。测序正确后即获得pRSF-mCherry-HlyA218质粒。

表3.重组反应的体系及条件

以上述构建好的pRSF-mCherry-HlyA218质粒为模板，引物hlyA60-F/hlyA218-R扩增hlyA60基因片段，用引物H1-F/H2-R扩增H12基因片段，引物H1-F/H1-R扩增H1基因片段,引物H2-F/H2-R扩增H2基因片段，引物序列如表1所示。用SalI和XhoI对pRSF-mCherry-HlyA218进行双酶切以获得缺少hlyA218片段的质粒片段，双酶切反应体系和程序如表4所示。所有片段经纯化后用于后续连接。

表4.双酶切反应体系和程序

以pRSF-mCherry-HlyA60质粒的构建过程为例，将PCR获得的hlyA60基因片段用SalI和XhoI进行酶切，与用相同酶切获得的pRSF-mCherry-HlyA218质粒片段使用T4ligase按照表5的体系与条件连接。mCherry与其他活性聚集肽融合表达的质粒以类似方法进行构建。

表5.连接反应体系与条件

将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证正确的转化子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h后提取质粒进行测序。测序正确后即获得pRSF-mCherry-HlyA60质粒、pRSF-mCherry-H12质粒、pRSF-mCherry-H1质粒、pRSF-mCherry-H2质粒。

以上述构建好的pRSF-mCherry-HlyA218为模板，使用引物mCherry-F和mCherry-Xho1-R进行扩增，得到带有linker的mCherry片段。同时使用NcoI和XhoI对构建好的pRSF-mCherry-HlyA218为进行双酶切，得到载体片段。所有片段经纯化后用于后续同源重组连接。

利用

II重组克隆试剂盒将带有linker的mCherry片段，与双酶切获得的pRSF-mCherry-HlyA218载体片段进行重组反应，重组的体系及条件见表3。

将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证正确的转化子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h后提取质粒进行测序。测序正确后即获得pRSF-mCherry-His质粒。

将pRSF-mCherry-HlyA218质粒、pRSF-mCherry-HlyA60质粒、pRSF-mCherry-H12质粒、pRSF-mCherry-H1质粒、pRSF-mCherry-H2质粒和pRSF-mCherry-His质粒分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得mCA218菌株、mCA60菌株、mCH12菌株、mCH1菌株、mCH2菌株和mC菌株。

2.重组蛋白的诱导表达

(1)将mCA218菌株、mCA60菌株、mCH12菌株、mCH1菌株、mCH2菌株和mC菌株分别接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm恒温摇床中培养12h左右，作为种子液。

(2)将种子液以1：50的体积比例接种于20mL含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，随后置于37℃，220rpm恒温摇床中培养。

(3)培养期间取样测定菌液OD₆₀₀值。诱导条件为：当菌液OD₆₀₀值在0.5-0.8之间，添加终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG。再将其置于30℃，180rpm的摇床中培养22h，用于诱导目的蛋白mCherry-HlyA218、mCherry-HlyA60、mCherry-H12、mCherry-H1、mCherry-H2与mCherry-His的表达。

(4)诱导表达相应时间后，用紫外分光光度计测量并记录菌液的终OD₆₀₀值。于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。

(6)将离心收集到的菌体沉淀，根据终OD₆₀₀值用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬并稀释至10OD₆₀₀/mL。稀释液取1mL进行超声破碎。破碎条件为：25％功率，10min，3s/3s(工作时间/停止时间)。

(7)将超声破碎后的菌液于4℃，12000rpm离心5min。随后将沉淀和上清液分离至不同的2mL离心管中，沉淀需再吸取与上清液体积相同的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬。将沉淀重悬液与上清液保存于4℃冰箱里，用于荧光值测定。

3.荧光测定

(1)将超声破碎得到的沉淀与上清样品各取200μL加至96孔板中，每个样品设置三个平行。同时以50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为空白对照。

(2)酶标仪设置激发波长为580nm，发射波长为610nm，设置测定前振荡5s，测定各个样品的荧光值。

4.激光扫描共聚焦显微镜分析

(1)重组菌株培养完成后，在4℃条件下以2000g离心5min收集菌体；

(2)用50mM磷酸钠缓冲液重悬洗涤菌体，4℃条件下以2000g离心5min去除上清；

(3)4％多聚甲醛重悬菌体，在4℃下孵育20min以固定细胞。

(4)4℃条件下以2000g离心5min去除上清，用50mM磷酸钠缓冲液漂洗两次；

(5)用一定体积的50mM磷酸钠缓冲液重悬菌体，滴加5μL菌液至载玻片上，盖上盖玻片；

(6)样品用共聚焦显微镜观察并拍摄图像，激发波长为561nm。

荧光值测定结果如图1中的B所示，存在于细胞内不可溶组分的mCherry-HlyA218、mCherry-HlyA60、mCherry-H12、mCherry-H1和mCherry-H2融合蛋白均被检测到荧光，说明该类活性聚集肽能够介导mCherry形成活性包涵体。将活性包涵体形成率定义为不可溶组分的活性(或荧光)占粗细胞提取物总活性(或荧光)的比例。其中mCherry-HlyA218活性包涵体形成率最高，为79.9％。mCherry-HlyA60活性包涵体形成率为74.7％，HlyA60相较于HlyA218序列更短，并且序列的截短带来的聚集率下降可以忽略不计。根据HlyA60中α-螺旋结构进一步截短得到的H12截短融合蛋白mCherry-H12活性包涵体形成率为45.1％，若仅比较不可溶组分的荧光值，mCherry-H12相较于mCherry-HlyA60仍保持了较高的不可溶组分的荧光值水平。mCherry-H1和mCherry-H2活性包涵体形成率分别为14.1％和21.0％，相较于mCherry-H12活性包涵体形成率有明显下降，说明两个α螺旋共存时活性聚集效果更佳。

激光共聚焦显微镜结果与荧光值测定结果相符。如图1中的C所示，作为对照的mC菌株表达的mCherry-His被观察到均匀分布于胞内，这是可溶性蛋白在胞内的分布特征。而mCA218菌株表达的mCherry-HlyA218蛋白和mCA60菌株表达的mCherry-HlyA60蛋白主要集中于大肠杆菌胞内的两个末端，这种集中在胞内极性区域的分布是包涵体的典型情况(Rinas U.,Garcia-Fruitos E.,Corchero J.L.,et al.Bacterial Inclusion Bodies:Discovering Their Better Half[J].Trends in Biochemical Sciences,2017,42(9):726-737.)。mCH12菌株的细胞可以明显观察到同时存在可溶蛋白均匀分布的特点和包涵体聚集分布的特点，而mCH1菌株则类似mC菌株以均匀分布为主。对比mCH1菌株，mCH2菌株极性区域的聚集现象更明显。

实施例2：活性聚集肽HlyA60介导脂肪酶A(LipA)形成活性包涵体

1.重组表达菌株的构建

以质粒pMAL1(Wu F,Ma J,Cha Y,et al.Using inexpensive substrate toachieve high-level lipase A secretion by Bacillus subtilis through signalpeptide and promoter screening[J].Process Biochemistry,2020,99:202-210.为模板)，引物LipA-F/LipA60-R扩增LipA基因，引物序列如表6所示，PCR体系及程序如表2所示。用SacI和NcoI对pRSF-mCherry-His和pRSF-mCherry-HlyA60分别进行酶切以获得缺少mCherry基因的质粒片段。扩增、酶切完成后经1％琼脂糖凝胶电泳验证，得到LipA基因片段和两个质粒片段，经纯化后用于后续同源重组连接。

表6.引物序列

注：下划线处的碱基序列为酶切位点。

利用

II重组克隆试剂盒将PCR获得的LipA片段，与酶切获得的pRSF-mCherry-HlyA60和pRSF-mCherry-His质粒片段分别进行重组反应，重组反应的体系及条件见表3。将重组产物转化至E.coliDH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证正确的转化子接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h后提取质粒进行测序。测序正确后即获得pRSF-LipA-HlyA60质粒和pRSF-LipA-His质粒。

将pRSF-LipA-HlyA60质粒和pRSF-LipA-His质粒分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，获得LipAA60菌株和LipA菌株。

2.重组蛋白的诱导表达

LipAA60菌株和LipA菌株的诱导条件为：当菌液OD₆₀₀值在0.4-0.6之间，添加终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG。再将其置于30℃，180rpm的摇床中培养6h，用于诱导目的蛋白LipA-HlyA60与LipA-His的表达。其余步骤参考实施例1第2部分的重组蛋白的诱导表达。

3.SDS-PAGE分析

吸取10μL蛋白上样缓冲液于干净的1.5mL离心管中，并添加40μL样品混匀，煮沸10min并短暂离心。制得的样品使用5％浓缩胶和12％分离胶进行电泳，电泳结束后进行染色和脱色操作。

4.脂肪酶(LipA)活性测定

以对硝基苯酚乙酸酯(pNPP)为底物测定脂肪酶活性，生成的对硝基苯酚(pNP)在405nm波长具有最大吸光值，通过测定反应液在405nm处的吸光值来计算脂肪酶的活性。

(1)反应体系：30mg pNPP加入10mL异丙醇中配制底物溶液，将207mg的脱氧胆酸钠和100mg的阿拉伯树胶溶解于90mL 50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)配制反应缓冲液，将底物溶液与反应缓冲液以1:9比例混合，取175μL加入至在96孔微板中，再加入5μL适当稀释的酶液。空白对照体系为180μL上述混合液。每个样品设置三个重复。

(2)反应条件：配置好的体系立即置于37℃下孵育5min，反应结束后立即测定样品在405nm处的吸光值。

(3)酶活计算：将测定得到的样品吸光值减去空白对照吸光值后，根据标准曲线计算酶活，酶活定义为每分钟催化产生1μmol的pNP所需要的酶量。

SDS-PAGE分析结果如图2中的A所示，LipA-HlyA60大部分以不可溶形式表达，而作为对照的LipA-His主要存在于胞内可溶组分。说明HlyA60作为活性聚集标签，能够有效地介导目的蛋白的聚集。酶活测定结果和发酵末期菌体密度(终OD₆₀₀)如图2中的B所示，重组酶LipA-HlyA60与对照酶LipA-His相比，胞内两组分的总酶活降低了24.0％，表明HlyA60与目的蛋白的融合表达不会导致酶活水平的明显降低。LipA-HlyA60活性包涵体形成率为66.7％，HlyA60对目的蛋白具有较好的活性聚集效果。除此之外，LipAA60菌株表现出较高的发酵末期菌体密度，是对照菌株LipA的1.7倍，说明HlyA60具有刺激重组菌快速生长的潜力。

实施例3：活性聚集肽HlyA60介导乙酰木聚糖酯酶(AXE)形成活性包涵体

1.菌株构建

以质粒pET-AXE-His(徐天旺.自组装短肽诱导酶活性聚集体的分离纯化及其稳定性研究[D].华南理工大学.2018.)为模板，引物AXE-F/AXE-R扩增AXE基因，引物序列如表1所示，以构建pRSF-AXE-HlyA60质粒。构建过程参考实施例2中pRSF-LipA-HlyA60质粒的构建。

以构建好的pRSF-AXE-HlyA60质粒为模板，引物AXE-F/His-R扩增带有linker的AXE基因片段，引物序列如表7所示，以构建pRSF-AXE-His质粒。构建过程参考实施例2中pRSF-LipA-His质粒的构建。

表7.引物序列

注：下划线处的碱基序列为酶切位点。

4.重组蛋白的诱导表达

AXEA60菌株和AXE菌株的诱导条件为：当菌液OD₆₀₀值在0.5-0.7之间，添加终浓度为0.2mM的诱导剂IPTG。再将其置于22℃，180rpm的摇床中培养22h，用于诱导目的蛋白AXE-HlyA60与AXE-His的表达。其余步骤参考实施例1第2部分的重组蛋白的诱导表达。

3.SDS-PAGE分析

方法参考实施例2的第3部分的SDS-PAGE分析。

4.乙酰木聚糖酯酶(AXE)活性测定

以对硝基苯酚乙酸酯(pNPA)为底物测定乙酰木聚糖酯酶活性，生成的对硝基苯酚(pNP)在405nm波长具有最大吸光值，通过测定反应液在405nm处的吸光值来计算乙酰木聚糖酯酶的活性。

(1)反应体系：用无水乙醇配制50mM的pNPA底物溶液。在96孔微板中加入240μL50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，5μL底物溶液以及5μL适当稀释的酶液。空白对照体系为245μL 50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和5μL底物溶液。每个样品设置三个重复。

(2)反应条件：配置好的体系立即置于37℃下孵育5min，反应结束后立即测定样品在405nm处吸光值。

(3)酶活计算：将测定得到的样品吸光值减去空白对照吸光值后，根据标准曲线计算酶活，酶活定义为每分钟催化产生1μmol的pNP所需要的酶量。

SDS-PAGE分析结果如图3中的A所示，AXE-HlyA60大部分以不可溶形式表达，而作为对照的AXE-His主要存在于胞内可溶组分。酶活测定结果和发酵末期菌体密度(终OD₆₀₀)如图3中的B所示，AXE-HlyA60活性包涵体形成率为97.6％。AXE-HlyA60则保持了与AXE-His相当的酶活水平，且AXEA60菌株的终OD₆₀₀是对照菌株AXE的1.9倍。

实施例4：酶活性包涵体AXE-HlyA60及可溶性酶AXE-His的纯化效果对比

1.重组酶的大量表达

酶活性包涵体AXE-HlyA60及可溶性酶AXE-His的表达菌株复苏后，使用100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基进行培养，其余操作步骤参考实施例3中的第2部分重组蛋白的诱导表达。

诱导表达后收集的菌体经超声波细胞粉碎机进行大量破碎，破碎条件为：30％功率，30min，3s/5s(工作时间/停止时间)。超声破碎后的菌液于4℃，12000rpm离心5min。对于AXEA60菌株，破碎后沉淀用与上清液体积相同的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬，用于后续活性包涵体的纯化。对于AXE菌株，将上清液收集至50mL离心管中，经0.22μm滤膜过滤，4℃保存用于后续亲和层析与脱盐。

2.蛋白纯化

AXEA60菌株表达得到的AXE-HlyA60活性包涵体通过两步洗涤法进行纯化。首先，将超声破碎后得到的沉淀用含0.8％TritonX-100的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)重悬，置冰上20min，期间适当颠倒或摇晃离心管，孵育结束后12000rpm，4℃离心5min弃去上清。得到的沉淀用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤两次，弃去上清后即可得到纯化后的活性包涵体。

AXE菌株表达得到的AXE-His可溶蛋白通过常规镍柱亲和层析进行纯化，其中柱子为HiTrap^TM chelating HP，洗脱条件为使用40％的Buffer B洗脱杂蛋白。由于亲和层析得到的收集液中盐离子浓度较高，可能会影响后续的蛋白浓度测定以及酶活检测，所以后续需要使用HiPrep^TM 26/10desalting柱进行脱盐处理。

各步骤的蛋白量、总酶活和回收率如表8所示。AXE-His通过上述的纯化与脱盐，由于步骤繁琐，在过程中有较多的目的蛋白损失，最终的回收率只有50.8％。相较于可溶蛋白繁琐的纯化步骤，HlyA60介导形成活性包涵体后的纯化仅需两步洗涤就能获得纯度较高的蛋白，AXE-HlyA60的回收率可达98.8％，显著高于传统的亲和层析及脱盐方法。且由于AXEA60菌株具有生长优势，纯化后最终收获的目的蛋白量是AXE-His的4.2倍，其总酶活相对于AXE-His能够保持相当水平。HlyA60介导的两步洗涤纯化法所需器材少，成本低，同时能够回收到大量的活性蛋白。

表8.蛋白量、总酶活和回收率

注：上表以100mL发酵液来计算蛋白量及酶活

实施例5：活性包涵体AXE-HlyA60的原位固定化

(1)在2mL离心管中加入960μL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，20μL 50mM的pNPA溶液以及20μL适当稀释的经两步洗涤法获得的AXE-HlyA60重悬酶液。

(2)在37℃反应5min，反应结束后立即12000rpm，4℃离心3min，分离上清至另一离心管，取250μL在405nm处测定吸光值。第一次反应测得的酶活作为初始酶活。

(3)用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)将离心管中的沉淀洗涤一次，12000rpm，4℃离心3min，弃上清。

(4)向含有洗涤后的沉淀重新加入980μL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)和20μL 50mM的pNPA溶液，并进行步骤(2)的操作，测定每个反应批次的酶活，以每个批次的酶活与初始酶活的比值计算残余酶活。

利用AXE-HlyA60在37℃下将pNPA转化为pNP的反应来测试HlyA60介导的原位固定化方法的重复利用性，结果如图4所示，经过30个批次的连续反应，AXE-HlyA60仍保持了大于85％的初始活性，展示了其在循环的生物催化中具有较好的稳定性。来源于无花果曲霉的重组乙酰木聚糖酯酶(RAXE)利用优化后的条件在壳聚糖包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子上进行固定化后，以pNPA为底物在水相中循环反应10次后，保持了95％左右的剩余酶活(Saravanakumar T.,Palvannan T.,Kim D.-H.,et al.Optimized immobilization ofperacetic acid producing recombinant acetyl xylan esterase on chitosancoated-Fe₃O₄ magnetic nanoparticles[J].Process Biochemistry,2014,49(11):1920-1928.)。相应地，AXE-HlyA60在第10个反应批次也保持了95.8％的活性。两种固定化方法的对比结果表明，HlyA60介导的原位固定化能够达到与应用广泛的载体结合固定化相当的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种活性聚集肽，其特征在于：其氨基酸序列为如下任一序列所示：

HlyA218：GNSLAKNVLSGGKGNDKLYGSEGADLLDGGEGNDLLKGGYGNDIYRYLSGYGHHIIDDDGGKDDKLSLADIDFRDVAFRREGNDLIMYKAEGNVLSIGHKNGITFRNWFEKESGDISNHQIEQIFDKDGRVITPDSLKKALEYQQSNNKASYVYGNDALAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

HlyA60：LAYGSQDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLSGNASDFSYGRNSITLTASA；

H12：QDNLNPLINEISKIISAAGNFDVKEERAAASLLQLS；

H1：QDNLNPLINEISKIISAA；

H2：ERAAASLLQLS。

2.权利要求1中所述的活性聚集肽在高效介导形成重组蛋白活性包涵体中的应用。

3.一种重组蛋白活性包涵体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将重组表达构建体导入宿主细胞中，获得重组细胞；所述重组表达构建体包括编码融合蛋白的多核苷酸序列与表达控制序列；所述融合蛋白包括目的蛋白、构建在目的蛋白羧基端的权利要求1中所述的活性聚集肽以及目的蛋白与活性聚集肽之间的连接肽；

(2)培养步骤(1)所得重组细胞，表达所述融合蛋白，获得包含融合蛋白的活性包涵体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表达控制序列为启动子、增强子、核糖体作用位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定mRNA的序列中的任意一种或多种组合；

步骤(2)的具体操作为：将步骤(1)所得重组细胞进行培养，收获的细胞经裂解后去除上清，收集不可溶部分，获得包含融合蛋白的活性包涵体。

5.一种重组蛋白活性包涵体，其特征在于：通过权利要求3或4的制备方法得到。

6.一种重组蛋白包涵体的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：利用两步洗涤法对权利要求5中所述的重组蛋白活性包涵体进行纯化，获得纯化后的融合蛋白；所述两步洗涤法包括如下步骤：

第一步：使用含TritonX-100的磷酸钠缓冲液重悬活性包涵体，置冰上孵育20±2min；

第二步：离心去除上清后使用磷酸钠缓冲液洗涤活性包涵体；

所述TritonX-100在体系中的体积浓度为0.8±0.1％；

所述磷酸钠缓冲液的浓度为50±5mM，pH为7.0±0.2；

所述离心的条件为转速12000±1000rpm、温度4±2℃、时间5±2min。

7.一种重组蛋白，其特征在于：由目的蛋白、构建在目的蛋白羧基端的权利要求1中所述的活性聚集肽以及目的蛋白与活性聚集肽之间的连接肽组成。

8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于：所述目的蛋白为酶蛋白，所述重组蛋白为重组酶蛋白。

9.权利要求8中所述的重组酶蛋白作为原位固定化酶在生物催化反应中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述重组酶蛋白重复回收利用至少30次。

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