CN111019922B

CN111019922B - 一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用

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Publication number: CN111019922B
Application number: CN201911408602.XA
Authority: CN
Inventors: 张坤晓; 程槐旭; 胡梦竹; 燕东平; 聂尚海
Original assignee: Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111019922A

Abstract

本发明提供了一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用，所述突变型限制性内切酶BsaI具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。本发明通过对野生型限制性内切酶BsaI及进行多位点氨基酸突变，得到突变型限制性内切酶BsaI，所得酶稳定性好，酶活和纯度满足市场需要，且价格低廉。

Description

一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用。

背景技术

在生物体内有一类能将外来的DNA切断的酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，这样就可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。

由于细菌体内存在“限制-修饰”现象，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制酶对自身DNA片段的切割，达到抵御外来噬菌体侵染的目的。因此在原核表达体系中单一的重组表达限制酶，会使宿主因DNA被切割而死亡。而甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护,保护完成后再表达限制酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA。

随着“限制-修饰”现象被发现，科学家Werner Arben，Daniel Nathans和HamiltonSmith发现了限制性内切酶，阐明了限制性内切酶在分子基因问题上的作用，之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。关于限制性内切酶的研究，多年来着重于它们作为工具酶的实用价值，包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中BsaI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可识别六个碱基的核酸序列(5’GGTCTCN^NNNN^3’)，属于Type IIs型，IIs型限制性内切酶结合不对称的识别元件，并在识别位点以外进行切割。利用其特性衍生而出的无缝克隆技术Golden Gate克隆，即在同一反应体系中，利用IIs型限制性内切酶在识别位点之外切开DNA，产生含粘性末端的片段，再用连接酶将几个片段按顺序连接，拼成不含酶识别位点的DNA，这种技术能以任何顺序无缝组装多个DNA片段(最多八个)到兼容载体上。BsaI不仅在分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。

CN107267545A公开了一种重组BsaI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：(1)表达质粒pCreat SII-BsaI的构建；(2)BsaI蛋白的诱导表达与鉴定；(3)BsaI蛋白的纯化与鉴定。本发明通过重组方式将BsaI限制性内切酶基因克隆到含His标签的pCreat SII共表达载体中，在低温条件下表达量达到45％。通过Ni柱亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析得到高活力的重组BsaI限制性内切酶，比活与商业化酶相似。

但野生型BsaI面临表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的BsaI限制酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。

因此，提供一种表达量高、分离纯化程序简单、蛋白得率高且价格低廉的BsaI限制性内切酶及其制备方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用，本发明通过将野生型BsaI限制性内切酶的氨基酸序列进行点突变，得到突变型BsaI限制性内切酶，在保证酶活和纯度的前提下，降低生产成本。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种突变型限制性内切酶BsaI，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：

(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；

(III)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有限制性内切酶的活性。

所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列具体如下所示：

MHHHHHHSSGGKKAEYGQGHPIFLEYAEQIIQHKEYQGMPDLRYPDGRIQWEAPSNRKSGIFKDTNIKRRKWWEQKAISIGIDPSSNQWISKTAKLIHPTMRKPCKKCGRIMDLRYSYPTKNLIKRIRKLPYVDESFEIDSLEHILKLDKRLVLQYGDKVYDDLPKLLTCKAVKNIPRLGNDLDTWLNWIDSVYIPSEPSMLSPGAMANPPDRLDGFHSLNECCRSHADRGRWEKNLRSYTTDRRAFEYWVDGDWVAADKLMGLIRTNEQIKKETCLNDNHPGPCSADHIGPISLGFVHRPEFQLLCNSCNSAKNNRMTFSDVQHLINAENNGEEVASWYCKHIWDLRKHDVKNNENALRLSKILRDNRHTAMFILSELLKDNHYLFGSTGLGLQYAERSVSFSNIKIENHIITGQISEQPRDTKYTEEQKARRMRIGFEALKSYIEKENRNALLVINDKIIDKINEIKNILQDIPDEYKLLNEKISEQFNSEEVSDELLRDLVTHLPTKESEPANFKLARKYLQEIMEIVGDELSKMWEDERYVRQTFADLD.

本发明中，通过对野生型限制性内切酶BsaI氨基酸序列中第149、388、391位的疏水氨基酸进行点突变为亲水氨基酸，得到突变型限制性内切酶BsaI，增加了其可溶性，从而降低纯化难度，提高了产率，其氨基酸序列可以是SEQ ID NO.1所示，也可以是与SEQ IDNO.1所示序列具有98％以上同源性的多肽，或者与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

第二方面，本发明提供如第一方面所述的突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列，优选为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2的核苷酸序列具体如下所示：

ATGCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCGGTAAAAAAGCCGAATATGGCCAGGGCCATCCGATTTTCCTGGAGTATGCAGAACAAATTATCCAGCACAAAGAGTACCAGGGTATGCCTGACCTGCGCTACCCGGACGGCCGTATTCAGTGGGAAGCCCCGAGTAATCGCAAAAGTGGTATCTTCAAAGACACCAACATCAAACGTCGTAAGTGGTGGGAACAGAAGGCAATCAGCATTGGCATTGACCCTAGCAGCAACCAGTGGATTAGCAAGACCGCCAAGCTGATTCACCCGACCATGCGCAAACCGTGCAAAAAGTGCGGCCGTATCATGGATCTGCGCTACAGCTACCCGACCAAAAACCTGATTAAGCGCATCCGTAAGCTGCCGTACGTGGATGAGAGCTTCGAAATCGACAGCCTGGAGCACATTCTGAAACTGGACAAGCGCCTGGTTTTACAGTATGGCGACAAAGTGTACGACGATCTGCCGAAACTGCTGACCTGCAAAGCAGTTAAGAACATCCCGCGCCTGGGCAATGATCTGGATACCTGGCTGAACTGGATCGATAGTGTGTATATCCCGAGCGAACCGAGCATGCTGAGTCCTGGCGCAATGGCAAACCCGCCGGATCGCCTGGATGGCTTCCATAGTCTGAACGAATGTTGCCGCAGCCATGCAGATCGTGGCCGTTGGGAGAAAAATCTGCGCAGCTTTACCACAGATCGCCGCGCATTCGAGTACTGGGTGGATGGTGATTGGGTGGCCGCAGACAAACTGATGGGTCTGATCCGCACCAACGAGCAGATTAAAAAAGAAACATGTCTGAATGATAACCACCCGGGTCCGTGTAGCGCCGATCACATTGGCCCTATTAGTCTGGGCTTTGTGCACCGCCCGGAGTTTCAGCTGCTGTGCAACAGCTGCAACAGTGCCAAGAACAATCGCATGACATTCAGTGACGTGCAGCACCTGATCAATGCCGAGAATAACGGCGAAGAAGTTGCCAGCTGGTACTGCAAACACATTTGGGACTTACGTAAACATGATGTTAAGAATAACGAAAATGCCCTGCGCCTGAGCAAGATCCTGCGCGATAATCGTCACACCGCAATGTTCATCCTGAGCGAGCTGCTGAAGGACAATCATTACCTGTTTGGGAGCACCGGGCTGGGCCTGCAGTATGCCGAACGCAGCGTGAGCTTTAGCAATATCAAGATTGAAAATCATATCATCACCGGCCAGATTAGCGAGCAGCCGCGCGACACAAAATATACCGAAGAGCAGAAAGCACGTCGCATGCGCATCGGCTTCGAAGCACTGAAGAGTTACATCGAGAAAGAAAACCGCAACGCCCTGCTGGTGATTAACGATAAAATTATTGATAAGATTAATGAAATTAAAAATATCCTGCAGGACATCCCGGACGAATATAAACTGCTGAATGAAAAAATTAGCGAACAGTTCAATAGTGAGGAAGTGAGCGATGAACTGCTGCGCGACCTGGTTACACATTTACCTACAAAAGAGAGCGAGCCGGCCAACTTTAAGCTGGCCCGCAAATACCTGCAGGAAATCATGGAAATCGTGGGCGACGAGCTGAGTAAAATGTGGGAAGATGAACGCTACGTTCGCCAGACCTTCGCCGACCTGGAC.

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括如第二方面所述的核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，该载体包含可编码上述突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列，该载体可进一步由可编码上述突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列与表达载体经重组得到。所述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体，包括pBAD等。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如第三方面所述的表达载体。

本发明提供了一种含有甲基转移酶M.BsaI、突变型限制性内切酶BsaI片段的宿主细胞，a)该宿主细胞可包含2种载体，该2种载体分别包含编码上述甲基转移酶M.BsaI、突变型限制性内切酶BsaI片段的核苷酸序列。

b)具体的，上述载体分别包含能够编码SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

c)该载体可进一步由可编码上述甲基转移酶M.BsaI、突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列与表达载体经重组得到。所述表达载体为含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件的空载体。进一步具体的，宿主细胞包含的载体为：能够编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列插入pACYC184等表达载体经重组得到的载体，和能够编码SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列插入pBAD等表达载体经重组得到的载体。

优选地，所述宿主细胞为原核生物细胞，优选为大肠杆菌，进一步优选为大肠杆菌ER2566。

优选地，所述宿主细胞表达甲基转移酶M.BsaI。

第五方面，本发明提供一种突变型限制性内切酶BsaI的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)构建甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒；

(2)将步骤(1)所得质粒转入非甲基化保护菌株中，得BsaI特异性保护菌株R.BsaI；

(3)构建如第三方面所述的表达载体，转化步骤(2)所得R.BsaI菌株，得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株；

(4)将步骤(3)所得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株诱导培养，纯化回收产物即得突变型限制性内切酶BsaI。

优选地，步骤(1)所述甲基转移酶M.BsaI的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述SEQ ID NO.3的氨基酸序列如下所示：

MSNAKSFSLNEKTEANALIDFIIEKSNQSKDLGYWLQKSKGQFYTHNFIGEKLVTEIVENIKFNDDSEVIKIIDPFCGDGRLICILLDKFNAINKFRNTLLEIEFWDIDPEAVEVAYTNIKEKANALEFNVQLKGRVCDTFLFAQDYFGSYDICITNPPWVIIKPDKKEKERLSKEEEIEYIEILKNFDDFLSRYYPTSLPTKKYGGWGTNLARCGTEVALRLISKVGICGIVSPASLLGDQVSDNLRVWMFNNYEVYSISYFVAEAKLFGKVDQAVITLTLSPKCDDSSGDIIPHLFYYDRELFEKRYYMDEYDWRIIKSLNYVIPIQFGLEIIKMNRLFKSLPTLGDLENEKEGIWLGRELDETGIKEKLANKGQYRFIKGKMVGRYNLIEESNQYIDVRKIDKIPKSVEFYRLVWRDVSRTTQKRRLISTIIPPKYITGNSLNVAYFKDNNLKKLKALLAIMNSFVFEAQVRANLSTNHISLGIIRRAHIPKLEGRVVDELSQLVDNYVNEESELLLEVKVAKAYGLSFEDFSSILSLFDKIGKDEKEKILQVAKKYLKGGIKNDSLIIKHVPPGGNWKDIPEWVPSKRLEQIRKSYAEGKGSRSTYYGRLLPDMPSYTINTYFNRPGNGCHIHYEQDRTLSQREAARLQSFPDDFIFYGSKTAINNQIGNAVPPLLAYQIAKAFPFKGQFVDLFSGAGGLSLGFLWAGWKPIIANDIDKWALTTYMNNIHNEVVLGDIRDEKVSETIIQKCLIAKKSNPDRPLFVLGGPPCQGFSTAGKKRSIVDERNWLFESYVSILKEVKPDGFIFENVTGLLSMEKGAFFEMVKSELSKTVSNLFVYKLNSVDYGVPQRRNRVVIIGDSTGTKNSEPPIPITSLKGEKTLFDALSSAISVKEALSDLPLLSPNEDGSWKNYVCEPQNIYQSFMRKKITAQQYIEMLSSLAII.

优选地，步骤(1)所述重组表达质粒的构建方法包括甲基转移酶M.BsaI基因的获取，将M.BsaI基因片段无缝克隆至表达载体中，得到甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒pACYC184-M.BsaI。

优选地，所述表达载体为pACYC184。

优选地，所述M.BsaI基因的获取方式包括PCR扩增、基因合成或者DNA文库构建中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，甲基转移酶M.BsaI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法，从菌株Bacillus stearothermopHilus的基因组中使用甲基转移酶M.BsaI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.BsaI的基因。

优选地，所述M.BsaI基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

所述M.BsaI基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示：

正向引物(SEQ ID NO.4)：

5’-GAAGGAGATATACCATATGAGCAACGCGAAAAG-3’；

反向引物(SEQ ID NO.5)：

5’-CGCATTAAAGCTTCCTCGAGGAGACCTTAAATAATCG-3’.

本发明中，通过在M.BsaI基因特异性引物中引入BsaI酶切位点(下划线部分所示序列)，方便后续筛选甲基化保护菌株，限制性内切酶BsaI完全无法切割的克隆即为被M.BsaI甲基转移酶完全保护的宿主菌。

优选地，步骤(2)所述甲基化保护菌株的筛选方法包括以下步骤：将质粒pACYC184-M.BsaI转化入大肠杆菌ER2566中，培养后提取pACYC184-M.BsaI质粒并用限制性内切酶BsaI消化，筛选甲基化保护菌株使得pACYC184-M.BsaI质粒在菌体内受到甲基转移酶M.BsaI的完全保护。

优选地，步骤(3)所述表达载体的构建包括以下步骤：将突变型限制性内切酶BsaI基因片段进行组氨酸标记后与表达载体相连。

本发明中，突变型限制性内切酶BsaI基因片段可以由基因合成的方式获得，也可以通过对包含野生型限制性内切酶BsaI基因片段的载体进行逐个点突变获得。

优选地，所述表达载体包括pBAD。

优选地，步骤(4)所述诱导培养的条件为将步骤(3)所述突变型BsaI重组菌株接种到LB培养基中，37℃，180-250rpm，培养至OD 0.7-0.9，然后加入诱导剂，20-30℃，180-250rpm，培养15-20h。

所述培养转速为180-250rpm，例如可以是180rpm、190rpm、200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm或250rpm，优选为200rpm。

所述培养至OD0.7-0.9，例如可以是0.7、0.75、0.8、0.85或0.9，优选为0.8。

所述培养15-20h例如可以是15h、16h、17h、18h、19h或20h，优选为16h。

优选地，所述诱导剂包括阿拉伯糖。

优选地，所述诱导剂的终浓度为0.1-0.5％，优选为0.2％。

第六方面，本发明提供一种突变型限制性内切酶BsaI的纯化方法，包括如下步骤：

(1’)收集突变型BsaI重组菌株诱导培养后的菌体，3-6℃，60-90MPa裂解，得裂解液；

(2’)将步骤(1’)所得裂解液离心，20000g-40000g，20-40min，收集上清液，得到粗产物；

(3’)将步骤(2’)所得粗产品依次经过Ni亲和层析柱、离子交换层析柱、肝素亲和层析柱纯化，得到突变型限制性内切酶BsaI。

亲和层析主要是依靠蛋白质与介质配体间的特异性的可逆结合作用进行分离，配体可直接与目标结合蛋白。具体地，在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下，用含有竞争分子的缓冲液对所有结合的蛋白质进行洗脱，通过破坏所有蛋白间相互作用用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的pH值或者离子强度。本发明组合使用两种亲和层析纯化手段，提高产品纯度和得率。

优选地，步骤(1’)所述裂解包括以下步骤：用裂解缓冲液重悬所述菌体，得到重悬液，所述裂解缓冲液与菌体比例为10∶1，对所述重悬液进行低温超高压破碎，收集上清，得到所述裂解液；其中所述裂解缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl、终浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L的EDTA、0.5mmol/L～1.5mmol/L的DTT、5％Glycerol和终浓度为150mmol/L～250mmol/L的NaCl。

优选地，步骤(3’)所述Ni亲和层析柱的操作包括：将所述粗产品加入到所述Ni亲和层析柱中，用浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤所述Ni亲和层析柱，收集含有突变型BsaI的洗脱液。

优选地，所述洗脱液包括终浓度5mmol/L～20mmol/L的Tris、10mmol/L～150mmol/L的NaCl和5-200mmol/L的咪唑。

优选地，步骤(3’)所述离子交换层析柱的操作包括：将经过Ni亲和层析柱的突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液用低盐缓冲液稀释，再加入到阴离子交换层析柱中，用浓度梯度的NaCl溶液洗涤所述阴离子交换层析柱，收集含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液。

优选地，所述阴离子交换层析柱包括Q阴离子交换层析柱。

优选地，所述Q阴离子交换层析柱的粒径为20-90μm。

优选地，步骤(3’)所述肝素亲和层析柱操作包括：将经过阴离子亲和柱的突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液用低盐缓冲液稀释，再加入到肝素亲和层析析柱中，用线性梯度的高盐缓冲液冲洗肝素亲和层析柱，收集含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液。

优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT和0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。

优选地，所述高盐缓冲液包括终浓度10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT、0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA和100mmol/L～1mol/L的NaCl。

优选地，步骤(3’)所述肝素亲和层析柱纯化后还包括后处理步骤：用储存缓冲液对含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液进行缓冲液置换。

优选地，所述储存缓冲液包括终浓度10mmol/L～20mmol/L的Tris，200mmol/L～300mmol/L的NaCl、1mmol/L～5mmol/L的DTT、0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA、50％的甘油和300μg/ml的BSA。

优选地，步骤(3’)后还包括突变型限制性内切酶BsaI的活力检测步骤，具体包括：对经纯化后得到的突变型限制酶BsaI进行梯度稀释后，在20μl反应体系中，与底物pPIC9k在37℃温育15min，之后进行琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况，其中突变型限制性内切酶BsaI的酶活定义为：37℃下，在20μl反应体系中，1μl能够在15min内完全消化1μgpPIC9k。

本专利采用现代基因工程技术，先将野生型M.BsaI表达片段重组到表达菌株中，再将野生型BsaI多位点的氨基酸突变，并经重组后转化进上述含有重组M.BsaI表达片段质粒的菌株中，经过酶活筛选，得到含突变型BsaI表达片段的重组工程菌。对含有突变型BsaI表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。将菌体裂解，通过高速离心收集上清液，从而得到粗产物。通过Ni亲和层析、阴离子交换层析、肝素亲和层析，得到纯度达到95％以上的突变型BsaI。通过以上纯化方式获得的BsaI纯度高，满足Golden Gate克隆对于限制性内切酶BsaI的纯度要求，具有广阔的市场应用前景。

第七方面，本发明提供一种酶制剂，包括如第一方面所述的突变型限制性内切酶BsaI。

优选地，所述酶制剂还包括酶缓冲液。

第八方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变型限制性内切酶BsaI、如第二方面所述的突变型限制性内切酶BsaI的核苷酸序列、如第三方面所述的表达载体、如第四方面述的宿主细胞或如第七所述的酶制剂在制备分子检测试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对野生型限制性内切酶BsaI及进行多位点氨基酸突变，得到突变型限制性内切酶BsaI，所得酶稳定性好，酶活和纯度满足市场需要，且价格低廉；

(2)本发明通过对突变型限制性内切酶BsaI粗产品依次进行Ni亲和层析柱、离子交换层析柱以及肝素亲和层析柱纯化，得到纯度达95％以上的突变型限制性内切酶BsaI，满足Golden Gate克隆对于限制性内切酶BsaI的纯度要求，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为pACYC184-M.BsaI的载体图谱；

图2为pBAD-R.BsaI的载体图谱；

图3为突变前后BsaI第一步纯化后的SDS-PAGE电泳对比图，其中泳道1为第一步纯化200mM咪唑洗脱下来的突变型限制性内切酶BsaI，泳道2为第一步纯化200mM咪唑洗脱下来的野生型限制性内切酶BsaI；

图4为突变型限制性内切酶BsaI最终纯化后样品的SDS-PAGE电泳图；

图5为突变型BsaI的活力检测电泳图，底物为pPIC9k。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1甲基转移酶M.BsaI的重组表达菌株的建立

1)甲基转移酶M.BsaI基因的获取

菌株Bacillus stearothermopHilus平板培养菌落以去离子水重悬后，95℃温育10min，作为PCR模板；PCR扩增的引物序列基于甲基转移酶M.BsaI基因的上游引物5’-端序列及下游引物3’-端反向互补序列进行设计合成，M.BsaI基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示。

所述M.BsaI基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示：

正向引物(SEQ ID NO.4)：

5’-GAAGGAGATATACCATATGAGCAACGCGAAAAG-3’；

反向引物(SEQ ID NO.5)：

5’-CGCATTAAAGCTTCCTCGAGGAGACCTTAAATAATCG-3’.

其中下划线部分为限制性内切酶BsaI的酶切位点，这一对引物用于特异性扩增M.BsaI基因，同时引入BsaI的酶切位点，方便后续筛选实验；PCR扩增反应使用MonHI-FIDNA Polymerase，按照标准PCR反应流程进行，获得了与理论值大小一致的M.BsaI基因片段SEQ ID No.3；上述PCR扩增产物通过无缝克隆的方式与pACYC184载体形成重组表达质粒；

2)构建甲基转移酶M.BsaI的重组表达菌株

制备M.BsaI的pACYC184表达载体按照以下流程进行：

pACYC184质粒以FlashCut^TM NdeI及FlashCut^TM XhoI限制酶双酶切后，再以MonClone^TM Fast AP(Fast)进行去磷酸化处理，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收线性化的pACYC184载体片段，溶于TE Buffer中；

使用MonHI-FI DNA Polymerase对M.BsaI基因进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认获得特异性扩增片段后，用MonClone Hi-Fusion Cloning Mix与线性化的pACYC184载体片段无缝克隆连接，于50℃下反应15min后使用化学转化法转化进入T1感受态细胞中；在氯霉素筛选条件下进行细胞培养，获得了M.BsaI的重组表达质粒pACYC184-M.BsaI；质粒pACYC184-M.BsaI序列的正确性经过测序确认，pACYC184-M.BsaI的质粒图谱见图1。

实施例2甲基化保护菌株的筛选

M.BsaI保护菌株的筛选按照以下流程进行：将测序正确的质粒pACYC184-M.BsaI通过化学转化法转化进入大肠杆菌菌株ER2566(赛默飞世尔科技有限公司)，在氯霉素筛选条件下进行细胞培养；挑选单克隆，在含有氯霉素抗生素的琼脂平板上划线，并进行相应编号后于37℃，200rpm培养16h，收取菌液将质粒重新提出；在10μl反应体系中，取0.2μl限制性内切酶BsaI，在FlashOne缓冲条件下，与100ng重组质粒pACYC184-M.BsaI在37℃温育1h，然后使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测底物被BsaI消化的情况；确认该重组质粒在宿主菌体内受到M.BsaI甲基转移酶的完全保护，默认宿主菌基因组DNA同样可受到pACYC184-M.BsaI所表达的M.BsaI甲基转移酶保护；经再次验证保护性后将平板上相应编号的菌株使用Inoue处理，制备成感受态细胞[pACYC184-M.BsaI,ER2566]备用。

实施例3构建突变型限制性内切酶BsaI的重组表达菌株

1)突变型限制性内切酶BsaI基因的合成及组氨酸标记

以野生型限制性内切酶BsaI基因为模板，人工合成突变型组氨酸标记的pBAD-R.BsaI质粒，质粒的载体图谱见图2；

2)突变型限制性内切酶BsaI的重组表达

将步骤1)所述的重组表达质粒pBAD-R.BsaI转化[pACYC184-M.BsaI，ER2566]感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得突变型限制酶BsaI的重组表达菌株；在LB培养基中接种限制酶BsaI的重组表达菌株后，在37℃摇床以150～250rpm培养至OD 0.6～0.8，加入诱导剂阿拉伯糖，终浓度0.1％～0.3％，并在37℃摇床以150～250rpm培养14～16h。

实施例4突变型限制性内切酶BsaI的纯化

对实施例3所得诱导培养后的菌液，通过离心进行固液分离，收集固体物，得到菌体。具体地，离心转速为5000rpm～6500rpm，离心时间为5min～10min，弃上清，收集固体物，得到菌体。

诱导表达后，得到的菌体中表达了大量的突变型BsaI，通过对菌体裂解，将目的蛋白释放出来。具体地，将菌体裂解，得到裂解液的操作包括以下步骤：

用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，裂解缓冲液中包含终浓度为5mmol/L～20mmol/L Tris,150mmol/L～250mmol/L NaCl,5mmol/L～20mmol/L咪唑，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为10∶1。

具体地，裂解缓冲液的pH值为7.4±0.1@25℃，向菌体中加入裂解缓冲液，于震荡器上震荡10～20min以使菌体重悬。

对所述得到的重悬液进行超声破碎，固液分离收集上清，得到该裂解液。

具体地，超声破碎菌体，破碎的过程为使菌液不在粘稠、流动性良好为准。破碎后的混合液在30000～35000g，4℃离心20～30min，收集上清，得到含有目的蛋白(突变型BsaI)的裂解液。将所得到的裂解液经0.22μm滤膜过滤。

(1)Ni亲和层析柱纯化

利用Ni亲和层析柱纯化所述得到的裂解液，得到突变型BsaI的粗产物，具体包括如下步骤：将收集到的含有目的蛋白的裂解液加入到用裂解液平衡过的含有Ni亲和层析填料的烧杯中。于磁力搅拌上100rpm～150rpm的转速低速搅拌结合2～3h；将所述含有目的蛋白裂解液与Ni基质的混悬液加入到空的重力柱中，使其自然沉降，收集流穿液；用浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤Ni亲和层析柱，收集含有突变型BsaI的洗脱液。

具体地，洗脱液的pH值约为7.4，将含有目的蛋白的裂解液与Ni亲和填料的混悬液加入到空的重力柱后，先用5～10倍柱床体积的裂解液平衡，再用3～6倍柱床体积的浓度梯度的咪唑洗脱液依次洗涤。

洗脱液中含有终浓度5mmol/L～20mmol/L的Tris，10mmol/L～100mmol/L的NaCl,和不同浓度的咪唑，具体地，浓度梯度的咪唑洗脱液液中的咪唑浓度依次为5mmol/L、20mmol/L、100mmol/L、200mmol/L。

先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni亲和层析柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni亲和层析柱，收集洗脱液。

具体地，收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个咪唑浓度梯度中。

(2)阴离子交换层析柱纯化

利用离子交换层析柱纯化所述得到的目的蛋白洗脱液，得到初纯的突变型BsaI。

具体地，利用离子交换层析柱纯化上述粗产物的操作包括以下步骤：

将所述得到的粗产物用低盐缓冲液稀释4倍后，再加入到阴离子交换层析柱中，低盐缓冲液中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。

具体地，低盐缓冲液的pH值约为7.4，将粗产物加入到阴离子交换层析柱中，粗产物中的目的蛋白将会结合在阴离子交换层析柱上，宿主蛋白也会结合在阴离子交换层析柱上。

用线性梯度的高盐缓冲液冲洗阴离子交换层析柱，收集含有突变型BsaI的洗脱液。

离子交换通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。

具体地，高盐缓冲液的pH值约为7.4，将粗产物加入到阴离子交换层析柱之前，用低盐缓冲液Buffer A与高盐缓冲液Buffer B配制成含有5％Buffer B的平衡缓冲液，用3～4倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述阴离子交换层析柱，再用5～10倍的柱床体积的含有5％～100％Buffer B的洗脱缓冲液进行线性洗脱。

高盐缓冲液Buffer B中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA，1mol/L NaCl。低盐缓冲液Buffer A中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。具体地，线性梯度的高盐缓冲液中的NaCl浓度为5mmol/L～1mol/L。

具体地，收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个NaCl浓度中。

(3)肝素亲和层析柱纯化

利用肝素亲和层析柱纯化所述得到的目的蛋白洗脱液，可得到突变型BsaI。

具体地，利用肝素亲和层析柱纯化上述初纯产物的操作包括以下步骤：

将所述得到的初纯产物用低盐缓冲液稀释1倍后，再加入到肝素亲和层析柱中，低盐缓冲液中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。

具体地，低盐缓冲液的pH值约为7.4，将粗产物加入到肝素亲和层析柱中，初纯产物中的目的蛋白将会结合在肝素亲和层析柱上。

用线性梯度的高盐缓冲液冲洗肝素亲和层析柱，收集含有突变型BsaI的洗脱液。

具体地，高盐缓冲液的PH值约为7.4，将初纯产物加入到肝素亲和层析柱之前，用低盐缓冲液Buffer A与高盐缓冲液Buffer B配制成含有10％B的平衡缓冲液，用3～4倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述肝素亲和柱，再用5～10倍的柱床体积的含有5％～100％Buffer B的洗脱缓冲液进行线性洗脱。

高盐缓冲液Buffer B中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA，1mol/L NaCl。低盐缓冲液Buffer A中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。具体地，线性梯度的高盐缓冲液中的NaCl浓度为100mmol/L～1mol/L。

具体地，收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个NaCl浓度中。具体地，如图3突变前后BsaI第一步纯化后的SDS-PAGE电泳对比图示例。其中泳道1为第一步纯化200mM咪唑洗脱下来的突变型限制性内切酶BsaI，泳道2为第一步纯化200mM咪唑洗脱下来的野生型限制性内切酶BsaI；由图3可知，在相同菌重条件下进行相同步骤及洗脱体积，突变型BsaI蛋白的得率显著高于野生型BsaI蛋白，通过本发明对BsaI氨基酸序列的突变优化，配合特定的纯化手段，提高了限制性内切酶BsaI的纯化收率以及效率。图4为突变型限制性内切酶BsaI最终纯化后样品的SDS-PAGE电泳图。

具体地，收集含有突变型BsaI的洗脱液的操作之后，还包括：用储存缓冲液对含有突变型BsaI的洗脱液进行缓冲液置换，储存缓冲液中含有终浓度10mmol/L～20mmol/LTris，200mmol/L～300mmol/L NaCl,1mmol/L～5mmol/L DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/LEDTA，50％Glycerol和终浓度为300μg/ml的BSA。

进一步地，将含有突变型BsaI的洗脱液置换成储存缓冲液后，存放于-20℃条件下保存待用。

需要说明的是，实际应用中，表达纯化的突变型BsaI，不局限于上述步骤。本领域的技术人员可以根据需要进行调整。

实施例5突变型限制性内切酶BsaI活力检测

突变型限制性内切酶BsaI的活力检测方法如下：对经纯化后得到的突变型限制性内切酶BsaI进行梯度稀释后，在1×FlashOne^TM Buffer缓冲条件下、20μl反应体系中，与底物pPIC9k质粒在37℃温育15min，然后以1％琼脂糖凝胶电泳检测底物的酶切情况；突变型限制性内切酶BsaI的酶活定义为：37℃下，在20μl反应体系中，1μl能够在15min内完全消化1μg pPIC9K质粒。如图5，对纯化后的BsaI反应15min，1h，16h的酶活测定，泳道1为起始酶液稀释梯度1/2.5，泳道2～9为酶液稀释梯度1/5，1/10，1/20，1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，箭头所指泳道为纯化后酶液稀释320倍后取1μl，与1μg pPIC9K质粒共同在20μl反应体系中37℃温育15min后，和不加酶底物相比，加入酶的底物被完全消化，因此测定未稀释酶液酶活为320U。

综上所述，本发明通过对含有突变型限制性内切酶BsaI表达片段的重组工程菌进行诱导培养，经过筛选后得到最佳菌株，并收集诱导培养后的菌体。然后菌体裂解，得到含有目的蛋白的裂解液。利用Ni亲和层析柱对所述裂解液进行初步纯化。得到含有目的蛋白的洗脱液，洗脱液中杂蛋白大量减少，体积较少，减小后续纯化的上样时间。然后依次进行阴离子交换层析和肝素亲和层析，对含有目的蛋白的洗脱液进行精细纯化，最终得到高纯度的限制性内切酶BsaI。这种制备方式体系完善，操作高效，成本低，收率高，表达纯化获得的限制性内切酶纯度高，满足市场上对限制性内切酶BsaI的纯度要求。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 莫纳（武汉）生物科技有限公司

<120> 一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用

<130> OISZ18013

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> Amino acid

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(553)

<400> 1

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Lys Glu Thr Cys Leu Asn Asp Asn His Pro Gly Pro Cys Ser Ala Asp

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His Ile Gly Pro Ile Ser Leu Gly Phe Val His Arg Pro Glu Phe Gln

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Leu Leu Cys Asn Ser Cys Asn Ser Ala Lys Asn Asn Arg Met Thr Phe

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Ser Asp Val Gln His Leu Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gly Glu Glu Val

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Tyr Leu Phe Gly Ser Thr Gly Leu Gly Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Ser

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Leu Leu Asn Glu Lys Ile Ser Glu Gln Phe Asn Ser Glu Glu Val Ser

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Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Val Thr His Leu Pro Thr Lys Glu Ser

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515 520 525

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<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> Nucleotide

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1659)

<400> 2

atgcatcatc atcatcatca cagcagcggc ggtaaaaaag ccgaatatgg ccagggccat 60

ccgattttcc tggagtatgc agaacaaatt atccagcaca aagagtacca gggtatgcct 120

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attattgata agattaatga aattaaaaat atcctgcagg acatcccgga cgaatataaa 1440

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cgcaaatacc tgcaggaaat catggaaatc gtgggcgacg agctgagtaa aatgtgggaa 1620

gatgaacgct acgttcgcca gaccttcgcc gacctggac 1659

<210> 3

<211> 949

<212> PRT

<213> Amino acid

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(949)

<400> 3

Met Ser Asn Ala Lys Ser Phe Ser Leu Asn Glu Lys Thr Glu Ala Asn

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Val Ile Ile Lys Pro Asp Lys Lys Glu Lys Glu Arg Leu Ser Lys Glu

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945

<210> 4

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<212> DNA

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<220>

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<222> (1)..(37)

<400> 5

cgcattaaag cttcctcgag gagaccttaa ataatcg 37

Claims

1.一种突变型限制性内切酶BsaI，其特征在于，如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述的突变型限制性内切酶BsaI的基因，其特征在于，如SEQID NO: 2所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的表达载体；

所述宿主细胞为原核生物细胞；

所述宿主细胞表达甲基转移酶M.BsaI。

5.一种突变型限制性内切酶BsaI的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）构建甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒；

（2）将步骤（1）所得质粒转入非甲基化保护菌株中，得BsaI特异性保护菌株R.BsaI；

（3）构建如权利要求3所述的表达载体，转化步骤（2）所得R.BsaI菌株，得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株；

（4）将步骤（3）所得突变型限制性内切酶BsaI重组菌株诱导培养，纯化回收产物即得突变型限制性内切酶BsaI。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述甲基转移酶M.BsaI的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤（1）所述重组表达质粒的构建方法包括甲基转移酶M.BsaI基因的获取，将M.BsaI基因片段无缝克隆至表达载体中，得到甲基转移酶M.BsaI的重组表达质粒pACYC184-M.BsaI；

所述M.BsaI基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示；

步骤（2）所述甲基化保护菌株的筛选方法包括以下步骤：将质粒pACYC184-M.BsaI转化入大肠杆菌ER2566中，培养后提取pACYC184-M.BsaI质粒并用限制性内切酶BsaI消化，筛选甲基化保护菌株使得pACYC184-M.BsaI质粒在菌体内受到甲基转移酶M.BsaI的完全保护；

步骤（3）所述表达载体的构建包括以下步骤：将突变型限制性内切酶BsaI基因片段进行组氨酸标记后与表达载体相连；

步骤（4）所述诱导培养的条件为将步骤（3）所述突变型BsaI重组菌株接种到LB培养基中，37℃，180-250rpm，培养至OD 0.7-0.9，然后加入诱导剂，20-30℃，180-250rpm，培养15-20h；

所述诱导剂为阿拉伯糖；

所述诱导剂的终浓度为0.1-0.5%。

7.一种如权利要求1所述的突变型限制性内切酶BsaI的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1’）收集突变型BsaI重组菌株诱导培养后的菌体，3-6℃，60-90MPa高压裂解，得裂解液；

（2’）将步骤（1’）所得裂解液2-8℃，离心20000g~40000g， 20-40min，收集上清液，得到粗产物；

（3’）将步骤（2’）所得粗产品依次经过Ni亲和层析柱、离子交换层析柱、肝素亲和层析柱纯化，得到突变型限制性内切酶BsaI。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，步骤（3’）所述Ni亲和层析柱的操作包括：将所述粗产品加入到所述Ni亲和层析柱中，用浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤所述Ni亲和层析柱，收集含有突变型BsaI的洗脱液；

所述洗脱液包括终浓度5mmol/L~20mmol/L的Tris、10mmol/L ~150mmol/L的NaCl和5-200mmol/L的咪唑；

步骤（3’）所述离子交换层析柱的操作包括：将经过Ni亲和层析柱的突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液用低盐缓冲液稀释，再加入到阴离子交换层析柱中，用浓度梯度的NaCl溶液洗涤所述阴离子交换层析柱，收集含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液；

所述阴离子交换层析柱包括Q阴离子交换层析柱；

所述Q阴离子交换层析柱的粒径为20-90µm；

步骤（3’）所述肝素亲和层析柱操作包括：将经过阴离子交换层析柱的突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液用低盐缓冲液稀释，再加入到肝素亲和层析柱中，用线性梯度的高盐缓冲液冲洗肝素亲和层析柱，收集含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液；

所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L~20mmol/L的Tris，1mmol/L~5mmol/L的DTT和0.1mmol/L~0.5mmol/L的EDTA；

所述高盐缓冲液包括终浓度10mmol/L~20mmol/L的Tris，1mmol/L~5mmol/L的DTT、0.1mmol/L~0.5mmol/L的EDTA和100mmol/L~1mol/L的NaCl；

步骤（3’）所述肝素亲和层析柱纯化后还包括后处理步骤：用储存缓冲液对含有突变型限制性内切酶BsaI的洗脱液进行缓冲液置换；

所述储存缓冲液包括终浓度10mmol/L~20mmol/L的Tris，200mmol/L~300mmol/L的NaCl、1mmol/L~5mmol/L的DTT、0.1mmol/L~0.5mmol/L的EDTA、50%的甘油和300µg/ml的BSA。

9.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的突变型限制性内切酶BsaI；

所述酶制剂还包括酶缓冲液。

10.一种如权利要求1所述的突变型限制性内切酶BsaI、如权利要求3所述的表达载体、如权利要求4所述的宿主细胞或如权利要求9所述的酶制剂在制备分子检测试剂盒中的应用。