CN110387363A - 一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种限制性内切酶SmaI的表达纯化方法，所述方法包括以下步骤：构建含有限制性内切酶SmaI表达片段的重组工程菌，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶SmaI；所述纯化的方式包括Ni离子亲和层析、阴离子交换层析或肝素亲和层析中的至少两种的组合。通过多种纯化方式的组合，得到纯度大于98％的限制性内切酶SmaI。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法。
背景技术
在生物体内有一类能将外来的DNA切断的酶，它能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，这样就可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。
随着限制修饰现象被发现，科学家发现了限制性内切酶，阐明了限制性内切酶在分子基因问题上的作用，之后，越来越多的限制性内切酶被发现、提纯并获得应用。
关于限制性内切酶的研究,多年来着重于它们作为工具酶的实用价值,包括新酶的发现与筛选、高产工程菌株的构建、酶纯化技术与程序的优化改进等。其中SmaI是一种应用较为广泛的限制性内切酶，可识别六个碱基的核酸序列(5’-CCC^GGG-3’)，不仅可作为普通的限制性内切酶应用于分子克隆，在生物领域的其他方向也具有重要的应用价值及研究潜力。但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的SmaI限制酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。
CN101225396A公开了一种生产限制性内切酶的方法，所述方法包括以下步骤：将与所述限制性内切酶相对的甲基化酶基因克隆到pEEB载体的上游；在甲基化酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌；筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。
但由于表达量低、分离纯化程序繁琐、蛋白得率低等问题，目前市售的SmaI限制性内切酶不仅价格高，而且也限制了它的广泛应用及深入研究。同时，以上提及的一系列问题也限制了其他很多应用广泛的限制性内切酶的深入研究。
因此，提供一种表达量高、分离纯化程序简便、蛋白得率高的制备限制性内切酶SmaI的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法，表达纯化方式操作简单，快速，收率高，纯化出的限制性内切酶SmaI纯度高达98％。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种限制性内切酶SmaI的表达纯化方法，所述方法包括以下步骤：构建含有限制性内切酶SmaI表达片段的重组工程菌，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶SmaI；所述纯化的方式包括Ni离子亲和层析、阴离子交换层析或肝素亲和层析中的至少两种的组合。
优选地，所述重组工程菌的构建方法包括将限制性内切酶SmaI基因片段连接表达载体pG-28b，得到限制性内切酶SmaI重组表达载体pG-28b-SmaI，再将重组表达载体转入工程菌中。
具体地，以SmaI酶的基因编码序列作为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并对其进行PCR清洁，得到所述SmaI酶表达片段；上游引物带有NcoI酶切位点，所述下游引物带有XhoI酶切位点，便于酶切PCR扩增产物从而构建重组载体。将重组载体转入到大肠杆菌感受态细胞中，扩增提取质粒，并测序。然后将测序正确的质粒转化到基因工程菌中。
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
优选地，所述工程菌包括大肠杆菌，优选为大肠杆菌ER2566。
具体地，将质粒与基因工程菌于冰上解冻，然后按体积比为1：100将质粒加入到基因工程菌中，于冰上孵育20～30min；将感受态细胞和质粒的混合物置于42℃水浴中热激30秒；将混合物从42℃水浴中取出，立即置于冰上，并加入500μl无抗性的LB培养液。然后置于37℃摇床上培养1小时，使细胞得到恢复；使用合适的无菌技术，吸取200μl到500μl菌液加到含相应抗性的LB琼脂板上，用细菌涂棒将其均匀涂在平板上，在37℃下将平板倒置培养过夜；平板上得到的菌落，按1：1ml的比例挑选单克隆菌落置于含有抗性的LB培养基中，35℃～38℃的条件下培养2～6h，以使重组工程菌扩增，得到活化菌液。
优选地，所述限制性内切酶SmaI基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列具体如下：
ATGAGCAGGGATGACCAACTCTTTACACTTTGGGGAAAGCTTAACGATCGTCAGAAGGATAATTTTCTAAAATGGATGAAAGCTTTTGATGTAGAGAAAACTTACCAAAAAACAAGTGGGGATATTTTCAATGATGATTTTTTCGATATATTTGGTGATAGATTAATTACTCATCATTTCAGTAGCACGCAAGCTTTAACAAAAACTTTATTCGAACATGCTTTTAATGACTCCTTAAATGAATCTGGAGTTATATCCTCTCTTGCGGAAAGTAGAACAAACCCTGGGCATGACATAACAATCGATAGCATAAAGGTTGCTTTAAAAACAGAAGCAGCTAAAAATATTAGCAAATCATATATTCATGTAAGTAAGTGGATGGAGTTAGGCAAGGGGGAGTGGATTCTAGAATTATTATTAGAACGGTTTTTAGAGCATCTAGAGAATTATGAACGTATTTTCACACTCAGATATTTTAAAATATCCGAGTATAAATTTAGCTACCAGCTTGTAGAAATACCCAAGAGTCTTTTGTTGGAAGCAAAAAATGCGAAATTAGAAATAATGTCGGGAAGCAAACAAAGCCCTAAGCCCGGCTATGGATATGTGTTAGATGAAAATGAAAATAAGAAGTTTTCTCTATACTTTGATGGTGGTGCCGAGAGAAAACTTCAAATAAAACATTTAAATTTAGAACATTGCATTGTTCATGGAGTTTGGGATTTTATTCTACCGCCGCCTTAA.
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述SEQ ID NO.2的核苷酸序列具体如下：
AGGAAACAGTATCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATC.
优选地，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列具体如下：
CGCCTCGAGGCAGATCGTCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG.
优选地，所述诱导的诱导剂包括IPTG。
优选地，所述诱导剂的终浓度为0.3-1mmol/L，例如可以是0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L或1mmol/L，优选为0.5mmol/L。
优选地，所述诱导培养的温度为35-38℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、或38℃，优选为37℃。
优选地，所述诱导培养的转速为180-220rpm，例如可以是180rpm、190rpm、200rpm、210rpm或220rpm，优选为200rpm。
优选地，所述诱导培养的时间为14-16h。
重组工程菌中插入了SmaI酶表达片段，在特定的条件下诱导，能够表达获得SmaI酶。具体地，按照体积比1:50的比例将活化后的菌液加入到含相应抗性的LB培养基中，35℃～38℃的条件下培养2～6h，进行扩大培养；扩大后的菌液中加入终浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L的IPTG，在35℃～38℃的条件下培养14～16h，得到诱导培养后的菌液；在一实施方式中含有抗性的培养基为含有氨苄青霉素的LB培养基；以上复苏、扩增以及诱导培养的过程中，转速均在150rpm～250rpm。
优选地，所述裂解菌体包括以下步骤：诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得重悬液，加入蛋白酶抑制剂，超声破碎，离心取上清得含有目的蛋白的裂解液。
具体地，离心转速为5000rpm～6500rpm，离心时间为5min～10min，弃上清，收集固体物，得到菌体。
优选地，所述裂解缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑。
优选地，所述裂解缓冲液与菌体的体积质量比为(2-10):1mL/g，例如可以是2:1mL/g、3:1mL/g、4:1mL/g、5:1mL/g、6:1mL/g、7:1mL/g、8:1mL/g、9:1mL/g或10:1mL/g，优选为10mL/g。。
诱导表达后，得到的菌体中表达了大量的SmaI酶，通过对菌体裂解，将目的蛋白释放出来，具体地，用裂解缓冲液重悬菌体，得到重悬液，裂解缓冲液中包含终浓度为10mmol/L～20mmol/L的Tris,200mmol/L～300mmol/L的NaCl,5mmol/L～20mmol/L的咪唑，所述裂解缓冲液与所述菌体的体积比为10:1，裂解缓冲液的PH值为7.4±0.1@25℃，向菌体中加入裂解缓冲液，于震荡器上震荡10～20min以使菌体重悬。
优选地，所述蛋白酶抑制剂为AEBSF,即4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。
具体的，蛋白酶抑制剂是由于在破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白酶降解目的蛋白。
在得到的重悬液中加入1倍浓度的AEBSF蛋白酶抑制剂，并用注射器吹打混匀，其中，AEBSF的母液浓度为4000×，即5mg/ml。
优选地，所述蛋白酶抑制剂的终浓度为1.0-1.5μg/ml，优选为1.25μg/ml。
优选地，所述超声的压强为80-90MPa，优选为85MPa。
优选地，所述超声的时间为2-3min，优选为2.5min。
加入蛋白酶抑制剂混匀后，超声破碎菌体，破碎的过程为使菌液不在粘稠、流动性良好为准。破碎后的混合液在高速冷冻离心机中30000～35000g，4℃离心20～30min，收集上清，得到含有目的蛋白(SmaI酶)的裂解液；将所得到的裂解液经0.22μm的滤膜过滤除菌除杂。
优选地，所述纯化的方式为将裂解液依次进行Ni离子亲和层析、阴离子交换层析和肝素亲和层析。
优选地，所述Ni离子亲和层析包括以下步骤：用裂解缓冲液平衡基质，然后经过浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤，收集含有目的蛋白的洗脱液1。
具体地，将收集到的含有目的蛋白的裂解液加入到用裂解液平衡过的含有Ni离子的烧杯中。于磁力搅拌上100rpm～150rpm的转速低速搅拌结合2～3h。含有目的蛋白裂解液与Ni基质的混悬液加入到空的重力柱中，使其自然沉降，收集流穿液Flow。
优选地，所述浓度梯度的咪唑洗脱液中的咪唑终浓度为20-250mmol/L，例如可以是20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、170mmol/L、180mmol/L、190mmol/L、200mmol/L、210mmol/L、220mmol/L、230mmol/L、240mmol/L或250mmol/L。
咪唑洗脱液能够竞争性的与Ni离子结合，从而将目的蛋白洗脱下来。具体地，洗脱液的PH值约为7.4，将含有目的蛋白的裂解液与Ni基质的混悬液加入到空的重力柱后，先用5～10倍柱床体积的裂解液平衡，再用3～6倍柱床体积的浓度梯度的咪唑洗脱液依次洗涤。洗脱液中含有终浓度10mmol/L～20mmol/L的Tris，200mmol/L～300mmol/L的NaCl，和不同浓度的咪唑，在一实施例中，浓度梯度的咪唑洗脱液液中的咪唑浓度依次为20mmol/L、50mmol/L、250mmol/L。先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，收集洗脱液，收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个咪唑浓度梯度中。
优选地，所述阴离子交换层析包括以下步骤：将经过Ni离子亲和层析收集的含有目的蛋白的洗脱液1用低盐缓冲液稀释，用平衡缓冲液平衡阴离子交换柱，再用NaCl溶液进行线性洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液2。
离子交换通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。
优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT和0.1mmol/L的EDTA。
优选地，所述稀释的倍数为3-4倍。
将得到的粗产物用低盐缓冲液稀释4倍后，再加入到阴离子交换层析柱中，低盐缓冲液的PH值约为7.4，将粗产物加入到阴离子交换层析柱中，粗产物中的目的蛋白将会结合在阴离子交换柱上，宿主蛋白也会结合在阴离子交换柱上。用线性梯度的高盐缓冲液冲洗阴离子交换层析柱，收集含有SmaI酶的洗脱液。具体地，高盐缓冲液的PH值约为7.4，将粗产物加入到阴离子交换层析柱之前，用低盐缓冲液(含0％的B)与高盐缓冲液(100％的B)配置成含有5％B的平衡缓冲液，用3～4倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述阴离子交换柱，再用5～10倍的柱床体积的浓度NaCl溶液(5％～100％的B)进行线性洗脱。B相当于高盐缓冲液中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA，1mol/L的NaCl。％B是指在高盐缓冲液中无机盐含量，典型但不限于NaCl的含量，所述纯化方案中的％B是指在高盐缓冲液中NaCl的含量，是一种混合液，5％B指该混合液中含有50mmol/L的NaCl，100％B指该混合液中含有1mol/L的NaCl。具体地，线性梯度的高盐缓冲液中的NaCl浓度为50mmol/L～1mol/L。收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个NaCl浓度中。
优选地，所述平衡缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L的NaCl。
优选地，所述NaCl溶液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L～1mol/L的NaCl。
优选地，所述洗脱的线性流速为60cm/h-90cm/h，优选为75cm/h。
优选地，所述肝素亲和层析包括以下步骤：将经过阴离子交换层析收集的含有目的蛋白的洗脱液2用低盐缓冲液稀释，用平衡缓冲液平衡肝素亲和层析柱，再用NaCl溶液进行线性洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液3。
亲和层析主要是依靠蛋白质与介质配体间的特异性的可逆结合作用进行分离，配体可直接与目标结合蛋白。具体地，在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下，用含有竞争分子的缓冲液对所有结合的蛋白质进行洗脱，通过破坏所有蛋白间相互作用用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的PH值或者离子强度。
将经过阴离子交换层析的初纯产物用低盐缓冲液稀释1倍后，再加入到肝素亲和层析柱中，低盐缓冲液中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT和0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA。低盐缓冲液的PH值约为7.4，将粗产物加入到肝素亲和层析柱中，初纯产物中的目的蛋白将会结合在肝素亲和层析柱上。用线性梯度的高盐缓冲液冲洗肝素亲和层析柱，收集含有SmaI酶的洗脱液。高盐缓冲液的PH值约为7.4，将初纯产物加入到肝素亲和层析柱之前，用低盐缓冲液(0％的B)与高盐缓冲液(100％的B)配置成含有10％B的平衡缓冲液，用3～4倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述肝素亲和柱，再用5～10倍的柱床体积的浓度NaCl溶液(5％～100％的B)进行线性洗脱。B相当于高盐缓冲液中含有10mmol/L～20mmol/L的Tris，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA，1mol/L NaCl。具体地，线性梯度的高盐缓冲液B中的NaCl浓度为100mmol/L～1mol/L。收集下来的洗脱液，通过跑SDS-PAGE蛋白胶，从而判断洗脱下来的目的蛋白在哪个NaCl浓度中。
优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT和0.1mmol/L的EDTA。
优选地，所述平衡缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和100mmol/L的NaCl。
优选地，所述NaCl溶液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和100mmol/L～1mol/L的NaCl。
优选地，所述洗脱的线性流速为90cm/h-120cm/h，优选为105cm/h。
优选地，所述表达纯化方法还包括后续处理步骤：将纯化回收含有SmaI酶的洗脱液用储存缓冲液置换。
收集含有SmaI酶的洗脱液的操作之后，还包括：用储存缓冲液对含有SmaI酶的洗脱液进行缓冲液置换，储存缓冲液中含有终浓度10mmol/L～20mmol/L的Tris，200mmol/L～300mmol/L的NaCl，1mmol/L～5mmol/L的DTT，0.1mmol/L～0.5mmol/L的EDTA，50％的Glyceron和终浓度为500μg/ml的BSA。
优选地，所述储存缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、300mmol/L的NaCl、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA、50％的甘油和500μg/ml的BSA。
进一步的，将含有SmaI酶的洗脱液置换成储存缓冲液后，存放于-20℃条件下保存待用。
本发明中表达纯化限制性内切酶SmaI的流程见图1，需要说明的是，实际应用中，表达纯化的SmaI酶，不局限于图1中步骤S10～S90的顺序。本领域的技术人员可以根据需要进行调整。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述表达纯化方法制备得到的限制性内切酶SmaI。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的限制性内切酶SmaI的表达纯化方法操作简单，快速，成本低，收率高，表达纯化获得的限制性内切酶纯度高，满足市场上对限制性内切酶的纯度要求；
(2)本发明通过结合Ni离子亲和层析、阴离子交换层析和肝素亲和层析的纯化方式，得到纯度大于98％的限制性内切酶SmaI。
(3)本发明的限制性内切酶SmaI的纯化方法第一步采用Ni离子进行捕获，利用Ni的亲和性质进行结合大量的目的蛋白并分离杂蛋白，便于后续纯化，该方式可应用于大部分带有His标签的限制性内切酶目的蛋白的捕获。
(4)本发明的限制性内切酶SmaI采用阴离子交换层析的方式进行纯化，利用不同的基质性质分离蛋白，同时宿主蛋白也会结合在阴离子交换层析柱上，而宿主蛋白被洗脱下来却需要更高的离子强度，所以可将目的蛋白与宿主蛋白分离开来，该方式可应用于大部分的偏酸性及中性蛋白的纯化，同时还可以分离宿主DNA。
(5)本发明在此纯化基础上可进行工业化放大，有利于限制性内切酶SmaI的大批量生产。
附图说明
图1为限制性内切酶SmaI的表达纯化方法的流程图；
图2为实施例1中SmaI酶经Ni柱纯化后的SDS-PAGE电泳结果，其中第1泳道为流穿样品，第2泳道为低浓度咪唑溶液收集的洗涤液，第3泳道为中浓度咪唑溶液收集的洗涤液，第4泳道为目的蛋白的洗脱液，第5泳道(M)为蛋白Marker，蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD；
图3A为实施例1中SmaI酶经Q柱纯化后的SDS-PAGE电泳结果，其中第1泳道为流穿样品，第2泳道到第6泳道分别为：在一定时间内，从含有50mmol/LNaCl的混合液线性梯度洗脱到含有1mol/L的NaCl的混合液所收集的洗脱液，其中目的蛋白所在的泳道3～泳道4的混合液中的NaCl浓度约为200mmol/L，第7泳道为蛋白Marker，蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD；图3B为蛋白纯化系统AKTA-explore得到峰图结果；
图4A为实施例1中SmaI酶经Heparin柱纯化后的SDS-PAGE电泳结果，其中第1泳道为流穿样品，第2泳道到第8泳道分别为：在一定时间内，从含有100mmol/L NaCl的混合液线性梯度洗脱到含有1mol/L的NaCl的混合液所收集的洗脱液，其中目的蛋白所在的泳道3-泳道5的混合液中的NaCl浓度约为400mmol/L，第9泳道为蛋白Marker。蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD；图4B为蛋白纯化系统AKTA-explore所得到的峰图结果；
图5为实施例1中制备的SmaI酶的酶活检测以及非特异性DNase污染的琼脂糖凝胶电泳图；
图6A为实施例1中制备的SmaI酶的双酶切的琼脂糖凝胶电泳图；图6B为NEB对照酶的双酶切的琼脂糖凝胶电泳图；
图7为实施例1中制备的SmaI酶样品中大肠杆菌核酸残留检测的荧光定量图；
图8为实施例1中限制性内切酶SmaI的重组载体图谱。
具体实施方式
为使本发明的上述目的，特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实验材料
1)菌株与质粒
B-PER购自赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisherScientific)；
pBAD、pACYC184、pUC19购自淼灵生物质粒平台；
ER2566购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)
酶活检测底物λDNA购自赛默飞世尔科技有限公(ThermoFisherScientific)；
2)仪器与试剂
低温超高压连续流细胞破碎仪：购自永联生物科技股份有限公司；
高速冷冻离心机：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司(BeckmanCoulter)
蛋白分子量标准：PAGE-MASTERProteinStandardPlus购自金斯瑞生物科技有限公司；
PAGE Gel 10×8 12％12wells-预制胶-GenScript购自金斯瑞生物科技有限公司；
PAGE-MASTER Protein Standard Plus-蛋白胶marker-GenScript购自金斯瑞生物科技有限公司；
T4 DNA连接酶-购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)；
限制性内切酶SmaI对标品购自New England Biolabs(NEB)；
4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐-AEBSF-购自上海生物工程技术服务有限公司；
限制性内切酶FlashCutTM SmaI，FlashCutTM HindIII，FlashCutTM NcoI，FlashCutTM XhoI购自莫纳生物科技有限公司；
乙酰化BSA购自莫纳生物科技有限公司；
10×FlashOneTM Buffer购自莫纳生物科技有限公司。
实施例1
(1)构建含有SmaI酶表达片段的重组工程菌
以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列作为扩增模板，加入上游引物(SEQ IDNO.2)和下游引物(SEQ ID NO.3)后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将得到的PCR扩增产物用NcoI酶和XhoI酶双酶切处理，得到SmaI酶的表达片段。然后将SmaI酶表达片段克隆到经NcoI酶和XhoI酶双酶切的pG-28b载体上，得到重组载体pG-28b-SmaI，如图8所示。将重组载体pG-28b-SmaI转入到DH5α感受态细胞后提取质粒测序，测序正确后将上述质粒转化到ER2566中，即获得含有SmaI酶表达片段的重组工程菌。使用合适的无菌技术，吸取200到500μl菌液加到含相应抗性的LB琼脂板上，用细菌涂棒将其均匀涂在平板上。在37℃下将平板倒置培养过夜。
(2)菌种活化及表达
从平板上挑选25个单克隆菌落接种到25ml含有氨苄青霉素与氯霉素抗性的LB培养基中，37℃，200rpm的条件下培养4.5h，将活化好的菌液按照体积比1:50的比例接种到含相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm的条件下培养5h，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，在37℃，200rpm的条件下培养14～16h，离心收集菌体，并称取菌重。
(3)纯化限制性内切酶SmaI
将冻存的菌体(以10g为例)置于室温解冻，用100ml裂解缓冲液(10mmol/L的Tris,300mmol/L的NaCl,5mmol/L的咪唑，PH 7.4)重悬菌体，于震荡器上震荡10～20min以使菌体重悬。加入终浓度为1.25ug/ml的AEBSF蛋白酶抑制剂，并用注射器吹打混匀。通过超声破碎(85MPa，2.5min)裂解菌体，然后于高速冷冻离心机中35000g，4℃离心30min，收集上清，得到100ml含有目的蛋白的裂解液。将所得到的裂解液经0.22μm的滤膜过滤除菌除杂。
a)Ni离子亲和层析
将收集到的含有目的蛋白的裂解液加入到用裂解液平衡过的含有Ni离子的烧杯中。于磁力搅拌上100rpm～150rpm的转速低速搅拌结合2～3h，收集流穿液Flow。用5倍柱床体积的裂解液平衡基质，收集未结合的杂蛋白，再用5倍柱床体积的低浓度咪唑洗脱液(10mmol/L的Tris,300mmol/L的NaCl,20mmol/L的咪唑，PH 7.4)洗涤，再用稍高浓度的咪唑洗脱液(10mmol/L的Tris,300mmol/L的NaCl,50mmol/L的咪唑，PH 7.4)洗涤，最后用洗脱目的蛋白的咪唑溶液(10mmol/L Tris 300mmol/L的NaCl，250mmol/L的咪唑，PH 7.4)洗脱Ni柱，使目的蛋白流出，收集含有目的蛋白的洗脱液。此步可除去大量的杂蛋白，上柱过程中温度维持在4℃左右。
b)阴离子交换层析
将步骤a)收集到的目的蛋白用低盐缓冲液(10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，PH 7.4)稀释4倍后，再加入到阴离子交换层析柱中，用低盐缓冲液(0％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，PH 7.4)与高盐缓冲液(100％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，1mol/L NaCl，PH 7.4)配置成含有5％B(10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，50mmol/L NaCl，PH 7.4)的平衡缓冲液，用3倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述阴离子交换柱，再用10倍的柱床体积的浓度NaCl溶液(5％～100％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，50mmol/L～1mol/L NaCl，PH 7.4)进行线性洗脱。收集含有目的蛋白的洗脱液。在进行Q柱纯化过程中，上样及洗脱的线性流速都为75cm/h，此步可除去大量的宿主DNA，上柱过程中温度维持在4℃。
c)肝素亲和层析
将步骤b)收集到的目的蛋白用低盐缓冲液(10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，PH 7.4)稀释1倍后，再加入到肝素亲和层析柱中，用低盐缓冲液(0％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，PH 7.4)与高盐缓冲液(100％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，1mol/L NaCl，PH 7.4)配置成含有10％B(10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，100mmol/L NaCl，PH 7.4)的平衡缓冲液，用3倍柱床体积的平衡缓冲液平衡所述肝素亲和层析柱，再用10倍的柱床体积的浓度NaCl溶液(10％～100％的B，10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，100mmol/L～1mol/L NaCl，PH 7.4)进行线性洗脱。收集含有目的蛋白的洗脱液。在进行Heparin柱纯化过程中，上样及洗脱的线性流速都为105cm/h，此步的回收率为95％左右，上柱过程中温度维持在4℃。
收集的含有SmaI酶的洗脱液用储存缓冲液(10mmol/L的Tris，300mmol/L的NaCl,1mmol/L的DTT，0.1mmol/L的EDTA，50％的Glyceron)进行缓冲液置换。取两个透析夹以及孔径为10KD大小的透析袋于50℃～60℃的超纯水中进行清洗，透析袋的截取长度＝含目的蛋白的洗脱液的体积ml/3+3cm。用透析夹小心的将透析袋的一端加紧，然后加入含目的蛋白的洗脱液，再把另一端加紧，就可放入储存缓冲液中，透析过夜。透析过程应在4℃进行。收集透析后的样品，并补加终浓度为500μg/ml的乙酰化BSA，混匀，保存于-20℃。
实施例2
实施例2的SmaI酶的纯化方法与实施例1表达纯化的方法大致相同。采用实施例1中的构建保存的含有SmaI酶表达片段的重组工程菌进行活化以及表达，离心收集表达后的菌体，然后对菌体裂解，收集裂解液。
与实施例1不同的是，离子交换层析与肝素亲和层析的顺序不同，先过肝素亲和层析，后过离子交换层析柱，这样的话，稀释倍数将会有所改变，增加了稀释样品的难度，且一定程度上增加了上样体积，纯化时间将会大大增加。
纯化限制性内切酶SmaI的过程中各阶段的样品的SDS-PAGE分析
(1)SmaI酶经Ni柱纯化后的SDS-PAGE分析
分别取实施例1中Ni柱纯化中的流穿样品，低浓度咪唑溶液收集的洗涤液、中浓度咪唑溶液收集的洗涤液、目的蛋白的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示。泳道的上样样品从左到右依次为：第1泳道：流穿样品，第2泳道：低浓度咪唑溶液收集的洗涤液，第3泳道：中浓度咪唑溶液收集的洗涤液，第4泳道：目的蛋白的洗脱液，第5泳道(M)：蛋白Marker。蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD。
从图2中可以看出，未结合的杂蛋白大多被流穿了出来，最后收集到的目的蛋白的洗脱液中条带明显(第四泳道)，但仍有一些杂蛋白存在。故还需后续纯化。
(2)SmaI酶经阴离子交换层析柱纯化后的SDS-PAGE电泳分析以及蛋白纯化仪AKTA-explore所呈现出的峰图分析
分别取实施例1中Q柱纯化中的流穿样品，线性梯度浓度的NaCl溶液收集的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，以及线性梯度浓度的NaCl洗脱的峰值，结果如图3A-B所示。图3A中，泳道的上样样品从左到右依次为：第1泳道：流穿样品，第2泳道到第6泳道分别为：线性梯度浓度的NaCl溶液收集的洗脱液，第7泳道：蛋白Marker。蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD。
从图3A中可以看出，收集到的目的蛋白的洗脱液中条带明显(第3、4泳道)，杂蛋白明显降低，但仍有一些杂蛋白存在，通过图3B的峰图的电导可以判断出，洗脱目的蛋白的所需的NaCl浓度约为200mmol/L，横坐标是洗脱体积，纵坐标是UV280值的大小，由图3B峰型上看出是否为单一峰型，目的蛋白与杂蛋白是否分离开来。
(3)SmaI酶经肝素亲和交换层析柱纯化后的SDS-PAGE电泳分析以及蛋白纯化仪AKTA-explore所呈现出的峰图分析
分别取实施例1中Heparin柱纯化中的流穿样品，线性梯度浓度的NaCl溶液收集的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，以及线性梯度浓度的NaCl洗脱的峰值结果，如图4A-B所示。图4A中，泳道的上样样品从左到右依次为：第1泳道：流穿样品，第2泳道到第8泳道分别为：线性梯度浓度的NaCl溶液收集的洗脱液，第9泳道：蛋白Marker。第2-8泳道具体盐浓度需根据所收集的每管样品的电导来判断，且盐浓度是呈线性递增，故每个泳道的NaCl浓度并不是固定的，而是一个范围。蛋白Marker的分子量从上到下依次为120KD、80KD、60KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD、10KD。
从图4A中可以看出，收集到的目的蛋白的洗脱液中条带纯净(第3、4、5泳道)，说明洗脱液中的目的蛋白(SmaI酶)纯度高。从峰图(图4B)的电导上可以判断出，洗脱目的蛋白的所需的NaCl浓度约为400mmol/L。
限制性内切酶的活性标定以及非特异性DNase酶污染检测
将实施例1中通过透析收集到的样品，用NanoDrop 280测定蛋白浓度，结果为3.67mg/ml。同时采用NEB的SmaI的说明书方法测定酶活，1单位定义为:在25℃下，在50μl的总反应体积中在1小时内消化1μgλDNA(HindIII消化物)所需的酶量。分别对酶切15min、1h和16h的结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5所示，最终酶活定为1280U/μl，具体的，共30个泳道，图中从左至右第1-9泳道为酶切15min的电泳结果且稀释倍数依次为1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560和1/5120，第10、21泳道均为蛋白Marker，第11-19泳道为酶切1h的电泳结果且稀释倍数依次为1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560和1/5120，第20泳道为底物，第21-29泳道为16h过夜酶切的电泳结果且稀释倍数依次为1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560和1/5120。如图5所示，分别进行了15min，1h，16h的过夜消化，均无非特异性条带出现，且128X均无非特异性DNase污染，结合蛋白胶图以及通过Gel-PBO Analyzer凝胶定量分析系统软件进行泳道分析，可以看出纯化的SmaI酶的纯度>98％。
由图5可知，纯化获得的限制性内切酶SmaI具有良好的酶切活力，比活力约为348773.84U/mg。
蓝白斑筛选检测
将实施例1中通过透析收集到的样品，采用NEB的SmaI的说明书方法检测蓝白斑，具体流程为将pUC19载体的样品用10倍过量的SmaI线性化，重新连接和重组转化到表达LacZβ片段基因的大肠杆菌菌株中，统计白色菌落的比例<1％。结果如表1所示。
表1B-W统计
| 酶量 | 白斑数 | 总斑数<sup>*</sup> | 白斑比例 | 背景蓝斑 |
| 16U | 144 | 27756 | 0.5％ | 3888 |
由表1可知，宿主菌在合格范围以内。
酶切-连接-再酶切分析(D-L-RD体系)
将实施例1中通过透析收集到的样品，采用NEB的SmaI的说明书方法检测D-L-RD，具体流程为用SmaI过量消化λDNA 10倍后，可以在16℃下在16小时内将约50％的DNA片段与T4 DNA连接酶连接。结果如图6A-B和表2所示，其中图6A使用本发明实施例1所得限制性内切酶SmaI，从左至右泳道依次为，第1泳道：底物，第2泳道到第4泳道分别为：酶切条带、连接条带、再酶切条带，第5泳道为Marker。图6B使用NEB公司生产的SmaI，从左至右泳道依次为，第1泳道到第3泳道分别为：酶切条带、连接条带、再酶切条带，第4泳道：底物，第5泳道为Marker。
表2
| D | L | RD | |
| 实施例1的SmaI | 74.9％ | 56.00％ | 73.0％ |
| NEB的SmaI | 82.7％ | 45％ | 72％ |
由表2可知，实施例1的SmaI与NEB的SmaI的酶切以及再酶切的比例都大于70％，说明这两个酶都可用于酶切实验，但是实施例1的SmaI的连接比例>NEB的SmaI的连接比例，说明实施例1的SmaI在进行双酶切实验中的连接效率更好一些。
Ecoli.宿主残留DNA检测
将实施例1中通过透析收集到的样品，采用实时荧光定量核酸扩增检测系统来检测，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
结果计算与判定：
SmaI 1Rxn Ecoli宿主DNA Ct值计算方式为：原液平均值+log2(酶活)。
若最终计算1Rxn Ct值≥30，则待测样品宿主检测合格，1Rxn Ct值≤30，则待测样品宿主检测不合格。结果如图7所示。
综上所述，通过对含有SmaI酶的表达片段的重组工程菌进行诱导培养，并收集所述诱导培养后的菌体；将所述菌体裂解，得到含有目的蛋白的裂解液；利用Ni离子亲和柱纯化所述上清液，得到所述SmaI酶的粗产物；根据其本身所带有的电荷，再通过离子交换柱纯化上述粗产物，就能得到纯度较高的SmaI酶的初纯产物；将上述初纯产物再利用配基与目标蛋白的特异性，通过肝素亲和柱进一步提纯，就能得到纯度>95％的SmaI限制酶，这种表达纯化的方法操作简便、快速、成本低，适用于大批量的生产。表达纯化获得的SmaI酶纯度高，在基因工程中能够识别并切割特异的双链DNA序列以及切割目的基因和载体，且不容易出现非特异性DNase酶的污染。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 莫纳（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法
<130> 20190827
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgagcaggg atgaccaact ctttacactt tggggaaagc ttaacgatcg tcagaaggat 60
aattttctaa aatggatgaa agcttttgat gtagagaaaa cttaccaaaa aacaagtggg 120
gatattttca atgatgattt tttcgatata tttggtgata gattaattac tcatcatttc 180
agtagcacgc aagctttaac aaaaacttta ttcgaacatg cttttaatga ctccttaaat 240
gaatctggag ttatatcctc tcttgcggaa agtagaacaa accctgggca tgacataaca 300
atcgatagca taaaggttgc tttaaaaaca gaagcagcta aaaatattag caaatcatat 360
attcatgtaa gtaagtggat ggagttaggc aagggggagt ggattctaga attattatta 420
gaacggtttt tagagcatct agagaattat gaacgtattt tcacactcag atattttaaa 480
atatccgagt ataaatttag ctaccagctt gtagaaatac ccaagagtct tttgttggaa 540
gcaaaaaatg cgaaattaga aataatgtcg ggaagcaaac aaagccctaa gcccggctat 600
ggatatgtgt tagatgaaaa tgaaaataag aagttttctc tatactttga tggtggtgcc 660
gagagaaaac ttcaaataaa acatttaaat ttagaacatt gcattgttca tggagtttgg 720
gattttattc taccgccgcc ttaa 744
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aggaaacagt atccatgggc agcagccatc atcatcatca tc 42
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgcctcgagg cagatcgtca gtcagtggtg gtggtggtgg tg 42
Claims (10)
1.一种限制性内切酶SmaI的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
构建含有限制性内切酶SmaI表达片段的重组工程菌，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶SmaI；
所述纯化的方式包括Ni离子亲和层析、阴离子交换层析或肝素亲和层析中的至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组工程菌的构建方法包括将限制性内切酶SmaI基因片段连接表达载体pG-28b，得到限制性内切酶SmaI重组表达载体pG-28b-SmaI，再将重组表达载体转入工程菌中；
优选地，所述工程菌包括大肠杆菌，优选为大肠杆菌ER2566；
优选地，所述限制性内切酶SmaI基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导的诱导剂包括IPTG；
优选地，所述诱导剂的终浓度为0.3-1mmol/L，优选为0.5mmol/L；
优选地，所述诱导培养的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，所述诱导培养的转速为180-220rpm，优选为200rpm；
优选地，所述诱导培养的时间为14-16h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体包括以下步骤：诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得重悬液，加入蛋白酶抑制剂，超声破碎，离心取上清得含有目的蛋白的裂解液；
优选地，所述裂解缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑；
优选地，所述裂解缓冲液与菌体的体积质量比为(2-10):1mL/g，优选为10mL/g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为AEBSF；
优选地，所述蛋白酶抑制剂的终浓度为1.0-1.5μg/ml，优选为1.25μg/ml；
优选地，所述超声的压强为80-90MPa，优选为85MPa；
优选地，所述超声的时间为2-3min，优选为2.5min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化的方式为将裂解液依次进行Ni离子亲和层析、阴离子交换层析和肝素亲和层析；
优选地，所述Ni离子亲和层析包括以下步骤：用裂解缓冲液平衡基质，然后经过浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤，收集含有目的蛋白的洗脱液1；
优选地，所述浓度梯度的咪唑洗脱液中的咪唑终浓度为20-250mmol/L。
7.根据权利要求6所述的表达纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析包括以下步骤：将经过Ni离子亲和层析收集的含有目的蛋白的洗脱液1用低盐缓冲液稀释，用平衡缓冲液平衡阴离子交换柱，再用NaCl溶液进行线性洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液2；
优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT和0.1mmol/L的EDTA；
优选地，所述稀释的倍数为3-4倍；
优选地，所述平衡缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L的NaCl；
优选地，所述NaCl溶液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L～1mol/L的NaCl；
优选地，所述洗脱的线性流速为60cm/h-90cm/h，优选为75cm/h。
8.根据权利要求7所述的表达纯化方法，其特征在于，所述肝素亲和层析包括以下步骤：将经过阴离子交换层析收集的含有目的蛋白的洗脱液2用低盐缓冲液稀释，用平衡缓冲液平衡肝素亲和层析柱，再用NaCl溶液进行线性洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液3；
优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT和0.1mmol/L的EDTA；
优选地，所述平衡缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和100mmol/L的NaCl；
优选地，所述NaCl溶液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和100mmol/L～1mol/L的NaCl；
优选地，所述洗脱的线性流速为90cm/h-120cm/h，优选为105cm/h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述表达纯化方法还包括后续处理步骤：将纯化回收含有SmaI酶的洗脱液用储存缓冲液置换；
优选地，所述储存缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、300mmol/L的NaCl、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA、50％的甘油和500μg/ml的BSA。
10.一种如权利要求1-9任一项所述表达纯化方法制备得到的限制性内切酶SmaI。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191029 |
|
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