CN116621955A - 一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签及其纯化方法，该标签是由2～3个His组成的序列组成，用该标签时不影响蛋白的表达以及活性，能够直接使用镍柱纯化，并且纯化的蛋白纯度高，还具有成本低、操作简单等优点，对链霉亲和素的纯化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，还涉及链霉亲和素的纯化方法。
背景技术
大肠杆菌易于处理、培养成本低、倍增时间短和表达水平高，其可溶表达的活性与天然表达性质相似，因此是表达链霉亲和素最常用的宿主，但是可溶表达产量低，回收率低，而大量表达时往往以包涵体的形式存在。
目前主要是通过亚氨基生物素琼脂糖亲和纯化方式获得蛋白，该方法成本高、操作繁琐且并不适用于某些突变体的纯化。常规硫酸铵沉淀法能获得大部分的链霉亲和素。但是纯度低。因此寻找一种普适性的、简便的纯化方式不仅可以降低生产成本，也可以提高链霉亲和素的纯度，对生产有一定的实际意义。
His tag的分子量小，不影响目的蛋白构象，并且镍柱使用简便，成本低廉，耐用性好，是目前纯化蛋白的首选标签，最常用的是6～8His tag。但是6～8His tag不适用对四聚体蛋白的纯化。因此，亟需优化His tag以获得适合于链霉亲和素的标签。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签；本发明的目的之二在于提供亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用；本发明的目的之三在于提供一种链霉亲和素的纯化方法，该方法选择2～3个His作为纯化标签，具有普适性的、方法简便。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，所述纯化标签是由2～3个His组成。
2、所述亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用。
3、一种纯化链霉亲和素的方法，构建表达N端融合2～3个His的链霉亲和素的重组表达载体，重组表达后使用镍柱纯化。
本发明优选的，所述重组表达载体为人工合成或将编码N端融合2～3个His的链霉亲和素的核苷酸序列连入表达载体中，获得重组表达载体。
本发明优选的，所述重组表达是将重组表达载体转入表达宿主后诱导表达。
本发明优选的，所述诱导表达是将活化的重组表达宿主扩大培养后加入0.5μMIPTG诱导培养2h。
本发明优选的，所述镍柱纯化的方法是将诱导培养后的培养物收集菌体，超声破碎，收集包涵体，然后用变性剂溶解包涵体后，离心去除沉淀，上清用加入复性液复性，然后加入平衡的Ni-TED Beads柱中，接着用含5mM咪唑的1×PBS缓冲液冲洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的50mM Tris-HCl洗脱目的蛋白，收集洗脱液得到纯化后的链霉亲和素。
本发明优选的，所述变性液为8M Urea；所述复性液为1×PBS+10％甘油。
本发明优选的，所述复性液加入体积相当于变性液体积的10～30倍。
本发明优选的，所述Ni-TED Beads柱的平衡方法是先用水冲洗Ni-TED Beads，然后用1×PBS缓冲液平衡。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，该标签由由2～3个His组成的序列，具有不影响蛋白的表达，纯化后目的蛋白的纯度高，仍然能够高特异性的富集生物素化标记的蛋白(野生型)或Twinstrep标签目的蛋白(突变型)，用于链霉亲和素纯化的具有成本低，操作简单等优点。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为2His和6His CSav(WT)小量表达对比图；
图2为2His和无标签CSav(WT)小量表达对比图；
图3为2His和3His-CSav(WT)小量表达对比图；
图4为硫酸铵沉淀法纯化(T：包涵体总蛋白，RT：复性后常温下跑胶检测，Boiled：复性后金属浴95℃加热5min后跑胶检测；10fold、20fold、30fold：变性蛋白分别在变性液10倍、20倍、30倍的体积中复性后，70％硫酸铵沉淀，离心后用PBS重悬沉淀后的上清蛋白)；
图5为2His-CSav(WT)和6His-CSav(WT)洗脱率对比图(A：2His-CSav(WT)的洗脱效率；B：3His-CSav(WT)的洗脱效率；C：6His-CSav(WT)的洗脱效率)；
图6为2His-CSav交联固定图(图A为2His-CSav(MT)，图B为2His-CSav(WT)，M：蛋白Marker；Load：交联前2His-CSav蛋白；Ft：与NHS-Activated-Sepharose交联后的穿出；Beads：交联上2His-CSav蛋白的Beads)；
图7为2His-CSav(Mut)富集能力测试图(M：蛋白Marker；Load：Twinstrep-eGFP裂解液；Ft：穿出液；E1，E2：洗脱液)；
图8为2His-CSav(WT)与生物素结合能力测试图(M：蛋白Marker；Load：Biotin-BSA裂解液；Ft：穿出液；Elution：beads上所结合蛋白)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、融合蛋白构建方法
由公司合成PIISA-2His-CSav(WT)，PIISA-6His-CSav(WT)、PIISA-2His-CSav(Mut)，PIISA-2His-CSav(WT)，具体序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。PIISA-2His-CSav(WT)为表达含2个His标签的链霉亲和素的重组载体，SEQ ID NO.1中第202位至第594位为编码带2个His标签的链霉亲和素核苷酸序列；PIISA-6His-CSav(WT)为表达含6个His标签的链霉亲和素的重组载体，SEQ ID NO.2中第202位至第606位为编码带6个His标签的链霉亲和素核苷酸序列；PIISA-2His-CSav(Mut)为表达含2个His的链霉亲和素突变蛋白的重组载体，SEQ ID NO.3中第202位至第594位为编码带2个His标签的链霉亲和素突变蛋白的核苷酸序列；PIISA-2His-CSav(WT)为表达含3个His的链霉亲和素蛋白的重组载体，SEQ ID NO.4中第202位至第597位为编码带2个His标签的链霉亲和素突变蛋白的核苷酸序列。
实施例2、小量表达
1)取1μL抽提的含上述设计的质粒加入至100μL的BL21 codon plus(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，再在冰上静置2min，涂布于含100μg/mL的氨苄抗性的平板上，37℃恒温过夜培养。
2)挑取10个单菌落至含有200μL LB培养基的EP管中培养，37℃，220rpm培养至待菌液浑浊后，取100μL留样，另吸取100μL再转接至含有900μL新鲜的LB培养基中培养，检测菌液OD600约为0.8时，留一个样作为诱前，其余的样加入0.5mM IPTG，37℃培养2h后，离心弃去培养基，用40μL PBS重悬菌体，加入10μL的5×SDS混匀后95℃加热15min，用SDS-PAGE胶检测蛋白表达情况，结果如图1～3所示。结果在小量表达中发现2His-CSav(WT)与无标签CSav(WT)对比，不影响蛋白的表达；3His-CSav(WT)与2His-CSav(WT)对比表达量无明显差异，但是6His-CSav(WT)的表达量较2His-CSav(WT)明显减少。
实施例3、硫酸铵沉淀法纯化
1)选择无标签CSav(WT)表达较高的菌种，将之前所留的样转接至100mL LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12～14h，将菌液转接至1L含100μg/mL的氨苄抗性LB培养基的培养瓶中，在37℃恒温大摇床上培养至OD600至0.8～1.2时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，在37℃诱导3～5h。
2)培养结束后于大容量低温离心机内4℃、3500rpm离心20min收集所有大肠杆菌，倒净所有上清，重悬于40mL 1×PBS(pH8.0)中；
3)在重悬菌液中加入适量溶菌酶，4℃反应15min；
4)以40％的功率，超声3s，停止7s，超声20min超声破碎溶菌酶处理后的菌液；
5)超声完成后，将裂解液转移至离心管，4℃，12000g，离心30min，去除上清，收集沉淀；
6)用包涵体洗涤缓冲液对包涵体进行充分的研磨洗涤，洗涤后12000g，离心30min弃废液，重复两次，收集白色的洗净的沉淀；
7)用40～50mL的变性剂在4℃过夜溶解包涵体至澄清，4℃，12000g，离心30min，去除沉淀，收集上清用于复性；
8)取500μL变性液(8M Urea)缓慢地分别滴加至5mL，10mL，15mL的复性液(1×冰冷的PBS)中，同时用磁力搅拌器缓慢搅拌促进复性，得到复性液；
9)70％硫酸铵沉淀，根据硫酸铵沉淀表向复性好的复性液中加入相应质量的硫酸铵固体，在冰上静置析出沉淀，4℃，12000g，离心30min收集沉淀，用500μL的1×PBS重悬沉淀，再4℃，12000g，离心30min去除不溶沉淀，得到重悬后上清。
如图4所示，CSav(WT)的纯度较低。
实施例4、镍柱纯化
1)用3～5倍柱体积的去离子水冲洗Ni-TED Beads，然后用1×PBS缓冲液平衡Ni-TED Beads；
2)平衡好柱子后加入上述条件制备的复性液，收集穿出后再重复上样一次；
3)用含5mM咪唑的1×PBS缓冲液冲洗杂蛋白，一般冲洗200mL体积；
4)用含250mM咪唑的50mM Tris-HCl洗脱目的蛋白，Elution1和Elution2各收集10mL。
如图5所示，复性后的上清仍存在的少量单体，但是几乎都以不挂柱的形式而流穿，最后的纯度相比于直接使用硫酸铵沉淀有很大的提高。同时发现在相似浓度Load挂相同体积的镍柱并使用相同浓度的咪唑洗脱条件下，2His-CSav(WT)和3His-CSav(WT)的Elution浓度高于6His-CSav(WT)，即2His-CSav(WT)和2His-CSav(WT)的洗脱效率(图5，A和B)优于6His-CSav(WT)(图5，C)。
实施例5、2His-CSav交联固定
1)将纯化后的2His-CSav蛋白在2L的200mM NaHCO3、500mM NaCl缓冲液中透析，每隔2h更换透析液一次，总计更换透析液两次；
2)测定链霉亲和素在280nm波长的紫外吸收值，根据每毫克蛋白的吸收值计算透析的蛋白浓度和蛋白总质量；
3)按每毫升NHS Beads交联固定12mg 2His-CSav取相应体积的NHS Beads；
4)Beads反应完成后，用5倍Beads体积的冰冷的1mM HCl溶液活化NHS Beads，穿柱后吸干溶液；
5)加入蛋白，用四维旋转混合仪在4℃过夜旋转交联；
6)交联结束后收集穿出，用100mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液冲洗Beads，再用5倍Beads体积的100mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液在4℃封闭10h以上，封闭Beads上未反应的NHS基团；
7)封闭结束后，流出封闭液，用5倍Beads体积的50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1mM EDTA缓冲液冲洗Beads一次，将交联完成好的Beads保存于1倍Beads体积的50mMTris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.03％NaN3缓冲液中，于4℃保存。
如图6所示，结果显示2His-CSav MT蛋白(图A)和2His-CSav WT蛋白(图B)能很好的固定在琼脂糖凝胶上。
实施例6、2His-CSav(Mut)对TwinStrep-eGFP的富集
按照实施例2～5的方法制备并纯化得到含2个His标签的链霉亲和素突变体(简称2His-CSav(Mut))，然后用于富集TwinStrep-eGFP：
1)取20μL 2His-CSav(Mut)beads置于微量pull down柱中，用200μL 20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM PMSF平衡beads，4℃、3000rpm离心，弃废液；
2)取适量TwinStrep-eGFP裂解液(实验室保存)加入至2His-CSav(MT)beads中，置于4℃在四维旋转混匀装置上轻柔孵育1h；
3)孵育完成后，4℃、3000rpm离心，弃废液；
4)加入500μL 20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％ Triton-X100缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复3次；
5)再加入500μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复两次；
6)用60μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、50mM Biotin缓冲液洗脱beads上的蛋白重复3次洗脱目的蛋白，4℃、3000rpm离心，重复两次；
7)留取pull down过程中各时期的蛋白样进行SDS-PAGE胶或westren bolt检测；
如图7所示，2His-CSav(Mut)很好的富集Twinstrep目的蛋白的能力且有高特异性。
实施例7、2His-CSav(WT)对生物素结合能力测试
1)取20μL 2His-CSav(WT)beads置于微量pull down柱中，用200μL 20mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM PMSF平衡beads，4℃、3000rpm离心，弃废液；
2)取适量Biotin-BSA裂解液(实验室保存)加入至2His-CSav(WT)beads中，置于4℃在四维旋转混匀装置上轻柔孵育1h；
3)孵育完成后，4℃、3000rpm离心，弃废液；
4)加入500μL 20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％ Triton-X100缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复3次；
5)再加入500μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA缓冲液清洗杂蛋白，4℃、3000rpm离心，弃废液，重复两次；
6)向beads中加入60μL 20mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl缓冲液，95℃加热5min，进行SDS-PAGE胶检测。
如图8所示，2His-CSav(WT)很好的富集biotin化的目的蛋白的能力且有高特异性。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种用于纯化链霉亲和素的亲和标签，其特征在于：所述纯化标签是由2～3个His组成。
2.权利要求1所述亲和标签在纯化链霉亲和素中的应用。
3.一种链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：构建表达N端融合2～3个His的链霉亲和素的重组表达载体，重组表达后使用镍柱纯化。
4.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述重组表达载体为人工合成或将编码N端融合2～3个His的链霉亲和素核苷酸序列连入表达载体中，获得重组表达载体。
5.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述重组表达是将重组表达载体转入表达宿主后诱导表达。
6.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述诱导表达是将活化的重组表达宿主扩大培养后加入0.5μM IPTG诱导培养2h。
7.根据权利要求3所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述镍柱纯化的方法是将诱导培养后的培养物收集菌体，超声破碎，收集包涵体，然后用变性剂溶解包涵体后，离心去除沉淀，上清用加入复性液复性，然后加入平衡的Ni-TED Beads柱中，接着用含5mM咪唑的1×PBS缓冲液冲洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的50mM Tris-HCl洗脱目的蛋白，收集洗脱液得到纯化后的链霉亲和素。
8.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述变性液为8M Urea；所述复性液为1×PBS+10％甘油。
9.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述复性液加入体积相当于变性液体积的10～30倍。
10.根据权利要求7所述链霉亲和素的纯化方法，其特征在于：所述Ni-TED Beads柱的平衡方法是先用水冲洗Ni-TED Beads，然后用1×PBS缓冲液平衡。
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