CN110090635B - 一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于GST‑tag融合蛋白纯化技术领域，涉及一种纯化GST‑tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，由表面修饰有溴化氰的层析介质和还原型谷胱甘肽通过对氨基化合物和马来酰亚胺‑琥珀酰亚胺链接物作为连接臂连接而成。本发明还提供一种纯化GST‑tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，通过溴化氰活化后的层析介质经对氨基化合物修饰后，再采用马来酰亚胺‑琥珀酰亚胺链接物进行修饰，最后通过偶联还原型谷胱甘肽形成GSH亲和层析介质。采用上述制备方法制得的GSH亲和层析介质用于纯化GST‑tag融合蛋白。本发明通过氨基化修饰再偶联马来酰亚胺‑琥珀酰亚胺链接物合成了高载量、高回收率、制作便捷的GSH亲和层析介质，能够广泛的运用于GST‑tag标签融合蛋白的分离和纯化工程。

Description

一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于GST-tag融合蛋白纯化技术领域，具体涉及一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法和应用。

背景技术

随着现代生物医药产业的高速发展，蛋白融合标签共表达的策略得到广泛应用，其中谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签系统由于其能促进蛋白的表达和溶解常被用于重组蛋白的表达。相应地，后续纯化中为了获得较高纯度的目的蛋白，减少分离步骤、降低生产成本，通常需要对琼脂糖进行改性。

利用含有谷胱甘肽巯基转移酶标签的重组蛋白能够特异性结合于还原型谷胱甘肽上这一特性，制备谷胱甘肽亲和层析介质。Simons PC等在1977年首次报道了利用还原型谷胱甘肽能够与谷胱甘肽巯基转移酶发生亲和作用，并成功的利用这一特性实现了对目标蛋白的分离和纯化。

GSH琼脂糖凝胶亲和层析介质是一种常用的固定化谷胱甘肽层析介质，主要由基质、间隔臂、配基几部分组成。目前，国内该介质的生产主要依赖进口，价格昂贵，蛋白纯化载量较低，而且使用几次后效率明显下降，不能有效降低蛋白纯化的成本，不利于实验室大规模使用。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质及其制备方法和应用，可以提高GST-tag融合蛋白的纯化效率，降低纯化成本。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的层析介质和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的层析介质依次通过对氨基化合物和马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物作为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接；所述层析介质为琼脂糖微球或磁珠；所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、己二胺、戊二胺、辛二胺、二氨基癸烷、二氨基十二烷中的任意一种；所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物为11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺。马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺的分子量可以为1000、3400、5000或20000。

本发明还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)通过溴化氰对层析介质进行活化，得到表面修饰有溴化氰的层析介质；

2)将表面修饰有溴化氰的层析介质与对氨基化合物进行偶联反应，得到氨基化修饰的层析介质；

3)将氨基化修饰的层析介质与马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物进行偶联反应，得到马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质；

4)将马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽进行偶联反应，得到GSH介质；

5)将GSH介质与封闭剂进行封闭反应，然后洗净，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。

进一步地，所述层析介质为琼脂糖微球或磁珠；所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、己二胺、戊二胺、辛二胺、二氨基癸烷、二氨基十二烷中的任意一种；所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物为11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺；所述封闭剂为巯基乙醇或半胱氨酸盐酸盐。

进一步地，步骤1)的层析介质活化过程中，所述溴化氰与所述层析介质在0.1～4mol/L的碳酸钠溶液中混合，在室温下振荡混匀；且溴化氰、层析介质和0.1～4mol/L的碳酸钠溶液的体积比为0.1～1：0.5～2：0.5～4。

进一步地，步骤2)的偶联反应中，将表面修饰有溴化氰的层析介质与0.1～0.3mol/L的碳酸钠溶液混合，再加入过量的对氨基化合物进行偶联反应，反应温度为4～16℃，反应时间为2～10h。

进一步地，步骤3)的偶联反应中，将氨基化修饰的层析介质与PBS缓冲液混合，再加入过量的马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物的有机溶剂溶液进行偶联反应，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～2h；所述有机溶剂为DMSO、DMA、DMF中的任意一种。

进一步地，步骤4)的偶联反应中，将马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与已用PBS缓冲液溶解的还原型谷胱甘肽进行偶联反应，所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与所述还原型谷胱甘肽的体积比为1：1～10，反应温度为20～37℃，反应时间为1～3h。

进一步地，步骤5)中，将GSH介质洗净后，再加入半胱氨酸盐酸盐溶液进行封闭反应；所述GSH介质与所述半胱氨酸盐酸盐的体积比为1：1～10，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～1.5h。

本发明还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的应用，将制得的GSH亲和层析介质与GST-tag融合蛋白的上清溶液混合，然后采用还原型谷胱甘肽浓度为2～100mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液对GSH亲和层析介质进行洗脱。

进一步地，采用pH＝7.4的PBS缓冲液冲洗洗脱后的GSH亲和层析介质，并采用浓度为20％的乙醇溶液4℃避光保存经冲洗后的GSH亲和层析介质。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法通过溴化氰活化层析介质，然后利用对氨基化合物对表面修饰有溴化氰的层析介质进行氨基化修饰，为进一步偶联提供伯氨基，氨基化修饰的层析介质再接枝马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物，生成较长的连接臂，能够保证最后偶联的配基谷胱甘肽能够与重组蛋白中的GST-tag高效结合，提高介质的纯化效果；

(2)本发明提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法与直接在活化微球上连接GSH的方法相比，具有更高的配基密度，更小的空间位阻，提高了重组蛋白的纯化效率；

(3)本发明提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质在保证介质的高载量、回收率的同时，简化了传统GST亲和纯化介质制备过程，降低了使用成本，提高了GST-Tag重组蛋白生产的纯度和纯化效率；能够广泛的运用于各种含GST标签重组蛋白质的纯化生产；

(4)本发明提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质通过与含有GST-tag融合蛋白的菌株破碎上清混合后，利用一定浓度的还原型谷胱甘肽溶液冲洗GSH亲和层析介质，能够洗脱下结合在GSH亲和层析介质表面的GST-tag融合蛋白。

附图说明

图1为本发明实施例提供的重组蛋白Ubc13洗脱峰图；

图2为本发明实施例提供的重组蛋白Ubc13洗脱峰的SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本实施例提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球依次通过乙二胺和11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接。本实施例采用溴化氰对4B琼脂糖微球基质进行活化，相比常见的环氧活化方式，可提供更多可用于偶联的的活性基团，而且溴化氰活化方式操作更便捷，大大缩短了亲和介质制备耗时；采用结构简单的乙二胺对活化的微球进行修饰，可提供偶联选择性更多的伯氨基。本实施提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可以采用下面的制备方法制成。

本实施例还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数10％的溴化氰溶液、2mol/L的碳酸钠溶液和4B琼脂糖微球按照体积比为0.1：1：1进行混合，在室温的条件下漩涡振荡反应5分钟，得到表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球；将反应得到的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球用PBS缓冲液冲洗干净后备用；

4B琼脂糖微球是指琼脂糖含量占总质量的4％，琼脂糖作为一种富含有羟基，具有良好的生物可容性，是分离纯化过程中运用最广泛的基质合成材料，溴化氰在碱性条件下能快速结合到4B琼脂糖微球表面的羟基上；

2)将制得的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球与0.2mol/L的碳酸钠溶液按照体积比为1：1混合后，再加入过量的乙二胺进行偶联反应，在4℃摇床中震荡反应6h后；将反应得到的氨基化修饰的4B琼脂糖微球冲洗至中性备用；

乙二胺通过活泼的溴化氰能够连接在琼脂糖表面，延长间隔臂的长度，同时提供进一步偶联的伯氨基；

3)用PBS缓冲液冲洗制得的氨基化修饰的4B琼脂糖微球，然后将氨基化修饰的4B琼脂糖微球与PBS缓冲液按照体积比为1：0.2混合后，再加入过量的11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯的二甲亚砜(DMSO)溶液，在25℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯修饰的4B琼脂糖微球用20倍微球体积的4℃预冷的PBS缓冲液淋洗，滤干后备用；

先修饰乙二胺再偶联11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯，控制总长度在6个碳原子左右，能有效进行GSH配基的偶联，同时保证亲和层析介质使用时更高的载量，较高的蛋白回收率，较低的洗脱体积；

4)将制得的11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯修饰的4B琼脂糖微球与已用PBS缓冲液(pH7.3)溶解的还原型谷胱甘肽按照体积比为1：1混合至终浓度为0.1mol/L，在25℃摇床中震荡反应1.5h；将反应得到的GSH介质用20倍微球体积的4℃预冷的10mmol/LPBS pH7.3缓冲液淋洗，滤干后备用；

5)将制得的GSH介质与50mmol/L半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCL)溶液按照体积比为1：1混合，在25℃摇床中震荡反应0.5h，以封闭未反应的基团；反应结束后，将产物用蒸馏水抽滤洗涤，真空泵抽干后，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。本实施例提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可浸泡在体积分数为20％的乙醇水溶液中4℃保存备用。

本实施例通过将乙二胺连接到4B琼脂糖微球的表面，提供了应用范围更广泛的氨基化修饰的4B琼脂糖微球，再将11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯偶联到微球上，然后合成末端连接有还原型谷胱甘肽的微球，获得了一种高载量、高回收率、制作便捷、且可在16个小时内合成的纯化GST-tag标签融合蛋白的GSH亲和层析介质，能够广泛的运用于GST-tag标签融合蛋白的分离和纯化工程，解决现有GST亲和层析介质制备步骤繁琐，交联后介质偶联配基数目稀少以及纯化应用时回收率低的问题。

本实施例还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质对GST-tag融合蛋白纯化，具体对重组蛋白Ubc13纯化过程如下：

1)样品预处理与上样

1.1收集：取1L含有重组蛋白Ubc13表达菌株的培养液，4000rpm离心收集菌体，并用10mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液约80mL重悬菌体；

1.2破碎：采用低温超声处理菌悬液约30min，然后在4℃下以12000rpm离心，收集上清液；

1.3平衡：利用10mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液冲洗GSH亲和层析介质，约5-10个柱体积；

1.4上样：调节蠕动泵流速至3mL/min，将离心后的上清液加入GSH亲和层析介质中进行洗脱；

2)重组蛋白Ubc13洗脱

2.1平衡：将亲和层析柱流出液连接蛋白紫外检测仪，实时检测流出样品读数；利用10mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液冲洗GSH亲和层析介质，约5-10个柱体积，至读数稳定；

2.2洗脱：利用含有10mmol/L还原型谷胱甘肽浓度的PBS pH＝7.4缓冲液洗脱亲和层析柱，收集洗脱峰，如图1所示；并取样进行SDS-PAGE检测，其检测结果如图2所示，4个泳道从左往右依次为蛋白marker、菌体破碎上清液、流穿液和10mmol/L的还原型谷胱甘肽的洗脱峰；

2.3平衡：洗脱结束后，利用10mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液冲洗洗脱后的GSH亲和层析介质，约5-10个柱体积；最终以终浓度为20％的乙醇溶液4℃避光保存经冲洗后的GSH亲和层析介质。

本实施例利用利用上述制备方法制得的GSH亲和层析介质，采用GST亲和层析技术，能够与重组蛋白上GST-tag结合；利用一定浓度的还原型谷胱甘肽溶液对结合有重组蛋白的微球进行竞争性洗脱，收集洗脱液后，进行蛋白电泳检测，即可以得到纯度较高的重组蛋白。测试纯化GST标签融合蛋白产量可以达到5mg/ml(柱料)，纯化出的蛋白纯度能达到95％以上。

实施例二

本实施例提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球依次通过尿素和马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺MW：20000(MAL-PEG20000-NHS)为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接。本实施提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可以采用下面的制备方法制成。

本实施例还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数10％的溴化氰溶液、0.1mol/L的碳酸钠溶液和4B琼脂糖微球按照体积比为0.5：2：4进行混合，在25℃下漩涡振荡反应5分钟，得到表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球；将反应得到的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球用PBS缓冲液冲洗干净后备用；

2)将制得的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球与0.1mol/L的碳酸钠溶液按照体积比为1：10混合后，再加入过量的尿素进行偶联反应，在16℃摇床中震荡反应2h后；将反应得到的氨基化修饰的4B琼脂糖微球冲洗至中性备用；

3)用PBS缓冲液冲洗制得的氨基化修饰的4B琼脂糖微球，然后将氨基化修饰的4B琼脂糖微球与PBS缓冲液按照体积比为1：0.2混合后，再加入过量的MAL-PEG20000-NHS的二甲亚砜(DMSO)溶液，在20℃摇床中震荡反应2h；将反应得到的MAL-PEG20000-NHS修饰的4B琼脂糖微球用20倍微球体积的4℃预冷的PBS缓冲液淋洗，滤干后备用；

4)将制得的MAL-PEG20000-NHS修饰的4B琼脂糖微球与已用PBS缓冲液(pH7.3)溶解的还原型谷胱甘肽按照体积比为1：10混合至终浓度为0.1mol/L，在37℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的GSH介质用20倍微球体积的4℃预冷的10mmol/LPBS pH7.3缓冲液淋洗，滤干后备用；

5)将制得的GSH介质与2mmol/L半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCL)溶液按照体积比为1：10混合，在25℃摇床中震荡反应0.5h，以封闭未反应的基团；反应结束后，将产物用蒸馏水抽滤洗涤，真空泵抽干后，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。本实施例提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可浸泡在体积分数为20％的乙醇水溶液中4℃保存备用。

本实施例还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质对GST-tag融合蛋白纯化，其纯化过程与实施例一相同。

实施例三

本实施例提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球依次通过二氨基癸烷和马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺MW：5000(MAL-PEG5000-NHS)为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接。本实施提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可以采用下面的制备方法制成。

本实施例还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数10％的溴化氰溶液、0.1mol/L的碳酸钠溶液和4B琼脂糖微球按照体积比为0.1：0.5：2进行混合，在室温的条件下漩涡振荡反应5分钟，得到表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球；将反应得到的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球用PBS缓冲液冲洗干净后备用；

2)将制得的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球与0.3mol/L的碳酸钠溶液按照体积比为1：2混合后，再加入过量的二氨基癸烷进行偶联反应，在10℃摇床中震荡反应4h后；将反应得到的氨基化修饰的4B琼脂糖微球冲洗至中性备用；

3)用PBS缓冲液冲洗制得的氨基化修饰的4B琼脂糖微球，然后将氨基化修饰的4B琼脂糖微球与PBS缓冲液按照体积比为1：0.5混合后，再加入过量的MAL-PEG5000-NHS的二甲亚砜(DMSO)溶液，在30℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的MAL-PEG5000-NHS修饰的4B琼脂糖微球用20倍微球体积的4℃预冷的PBS缓冲液淋洗，滤干后备用；

4)将制得的MAL-PEG5000-NHS修饰的4B琼脂糖微球与已用PBS缓冲液(pH7.3)溶解的还原型谷胱甘肽按照体积比为1：5混合至终浓度为0.1mol/L，在30℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的GSH介质用20倍微球体积的4℃预冷的10mmol/LPBS pH7.3缓冲液淋洗，滤干后备用；

5)将制得的GSH介质与40mmol/L半胱氨酸盐酸盐(Cys-HCL)溶液按照体积比为1：3混合，在30℃摇床中震荡反应1h，以封闭未反应的基团；反应结束后，将产物用蒸馏水抽滤洗涤，真空泵抽干后，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。本实施例提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可浸泡在体积分数为20％的乙醇水溶液中4℃保存备用。

本实施例还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质对GST-tag融合蛋白纯化，其纯化过程与实施例一相同。

实施例四

本实施例提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球依次通过己二胺和马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺MW：3400(MAL-PEG3400-NHS)为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接。本实施提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可以采用下面的制备方法制成。

本实施例还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数10％的溴化氰溶液、0.1mol/L的碳酸钠溶液和4B琼脂糖微球按照体积比为1：2：4进行混合，在室温的条件下漩涡振荡反应5分钟，得到表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球；将反应得到的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球用PBS缓冲液冲洗干净后备用；

2)将制得的表面修饰有溴化氰的4B琼脂糖微球与0.3mol/L的碳酸钠溶液按照体积比为1：1混合后，再加入过量的己二胺进行偶联反应，在8℃摇床中震荡反应10h后；将反应得到的氨基化修饰的4B琼脂糖微球冲洗至中性备用；

3)用PBS缓冲液冲洗制得的氨基化修饰的4B琼脂糖微球，然后将氨基化修饰的4B琼脂糖微球与PBS缓冲液按照体积比为1：0.2混合后，再加入过量的MAL-PEG3400-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)溶液，在25℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的MAL-PEG3400-NHS修饰的4B琼脂糖微球用20倍微球体积的4℃预冷的PBS缓冲液淋洗，滤干后备用；

4)将制得的MAL-PEG3400-NHS修饰的4B琼脂糖微球与已用PBS缓冲液(pH7.3)溶解的还原型谷胱甘肽按照体积比为1：3混合至终浓度为0.1mol/L，在25℃摇床中震荡反应2h；将反应得到的GSH介质用20倍微球体积的4℃预冷的10mmol/LPBS pH7.3缓冲液淋洗，滤干后备用；

5)将制得的GSH介质与60mmol/L巯基乙醇溶液按照体积比为1：1混合，在25℃摇床中震荡反应1h，以封闭未反应的基团；反应结束后，将产物用蒸馏水抽滤洗涤，真空泵抽干后，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。本实施例提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可浸泡在体积分数为20％的乙醇水溶液中4℃保存备用。

本实施例还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质对GST-tag融合蛋白纯化，其纯化过程与实施例一类似，采用还原型谷胱甘肽浓度为2mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液对GSH亲和层析介质进行洗脱。

实施例五

本实施例提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，是由表面修饰有溴化氰的磁珠和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的磁珠依次通过二氨基十二烷和马来酰亚胺PEG N-羟基琥珀酰亚胺MW：1000(MAL-PEG1000-NHS)为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接。本实施提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可以采用下面的制备方法制成。

本实施例还提供一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量分数10％的溴化氰溶液、2mol/L的碳酸钠溶液和磁珠按照体积比为0.1：1：3进行混合，在室温的条件下漩涡振荡反应5分钟，得到表面修饰有溴化氰的磁珠；将反应得到的表面修饰有溴化氰的磁珠用PBS缓冲液冲洗干净后备用；

2)将制得的表面修饰有溴化氰的磁珠与0.2mol/L的碳酸钠溶液按照体积比为1：1混合后，再加入过量的二氨基十二烷进行偶联反应，在4℃摇床中震荡反应6h后；将反应得到的氨基化修饰的磁珠冲洗至中性备用；

3)用PBS缓冲液冲洗制得的氨基化修饰的磁珠，然后将氨基化修饰的磁珠与PBS缓冲液按照体积比为1：0.2混合后，再加入过量的MAL-PEG1000-NHS的二甲基乙酰胺(DMA)溶液，在25℃摇床中震荡反应1h；将反应得到的MAL-PEG1000-NHS修饰的磁珠用20倍微球体积的4℃预冷的PBS缓冲液淋洗，滤干后备用；

4)将制得的MAL-PEG1000-NHS修饰的磁珠与已用PBS缓冲液(pH7.3)溶解的还原型谷胱甘肽按照体积比为1：1混合至终浓度为0.1mol/L，在25℃摇床中震荡反应1.5h；将反应得到的GSH介质用20倍微球体积的4℃预冷的10mmol/LPBS pH7.3缓冲液淋洗，滤干后备用；

5)将制得的GSH介质与40mmol/L巯基乙醇溶液按照体积比为1：1混合，在37℃摇床中震荡反应0.5h，以封闭未反应的基团；反应结束后，将产物用蒸馏水抽滤洗涤，真空泵抽干后，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。本实施例提供的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质可浸泡在体积分数为20％的乙醇水溶液中4℃保存备用。

本实施例还提供采用上述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质对GST-tag融合蛋白纯化，其纯化过程与实施例一类似，采用还原型谷胱甘肽浓度为100mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液对GSH亲和层析介质进行洗脱。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质，其特征在于：是由表面修饰有溴化氰的层析介质和能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽连接而成，所述表面修饰有溴化氰的层析介质依次通过对氨基化合物和马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物作为连接臂和所述还原型谷胱甘肽进行连接；所述层析介质为琼脂糖微球或磁珠；所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、己二胺、戊二胺、辛二胺、二氨基癸烷、二氨基十二烷中的任意一种；所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物为11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺 PEG N-羟基琥珀酰亚胺。

2.一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)通过溴化氰对层析介质进行活化，得到表面修饰有溴化氰的层析介质；

2)将表面修饰有溴化氰的层析介质与对氨基化合物进行偶联反应，得到氨基化修饰的层析介质；

3)将氨基化修饰的层析介质与马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物进行偶联反应，得到马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质；

4)将马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与能特异性结合GST-tag融合蛋白的还原型谷胱甘肽进行偶联反应，得到GSH介质；

5)将GSH介质与封闭剂进行封闭反应，然后洗净，即得纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质。

3.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：所述层析介质为琼脂糖微球或磁珠；所述对氨基化合物为尿素、乙二胺、丁二胺、己二胺、戊二胺、辛二胺、二氨基癸烷、二氨基十二烷中的任意一种；所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物为11-马来酰亚胺基十一烷酸琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺 PEG N-羟基琥珀酰亚胺；所述封闭剂为巯基乙醇或半胱氨酸盐酸盐。

4.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：步骤1)的层析介质活化过程中，所述溴化氰与所述层析介质在0.1～4mol/L的碳酸钠溶液中混合，在室温下振荡混匀；且溴化氰、层析介质和0.1～4mol/L的碳酸钠溶液的体积比为0.1～1：0.5～2：0.5～4。

5.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：步骤2)的偶联反应中，将表面修饰有溴化氰的层析介质与0.1～0.3mol/L的碳酸钠溶液混合，再加入过量的对氨基化合物进行偶联反应，反应温度为4～16℃，反应时间为2～10h。

6.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：步骤3)的偶联反应中，将氨基化修饰的层析介质与PBS缓冲液混合，再加入过量的马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物的有机溶剂溶液进行偶联反应，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～2h；所述有机溶剂为DMSO、DMA、DMF中的任意一种。

7.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：步骤4)的偶联反应中，将马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与已用PBS缓冲液溶解的还原型谷胱甘肽进行偶联反应，所述马来酰亚胺-琥珀酰亚胺链接物修饰的层析介质与所述还原型谷胱甘肽的体积比为1：1～10，反应温度为20～37℃，反应时间为1～3h。

8.如权利要求2所述的一种纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的制备方法，其特征在于：步骤5)中，将GSH介质洗净后，再加入半胱氨酸盐酸盐溶液进行封闭反应；所述GSH介质与所述半胱氨酸盐酸盐的体积比为1：1～10，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～1.5h。

9.如权利要求2～8任一项所述的制备方法制得的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的应用，其特征在于：将制得的GSH亲和层析介质与GST-tag融合蛋白的上清溶液混合，然后采用还原型谷胱甘肽浓度为2～100mmol/L的PBS pH＝7.4缓冲液对GSH亲和层析介质进行洗脱。

10.如权利要求9所述的纯化GST-tag融合蛋白的GSH亲和层析介质的应用，其特征在于：采用pH＝7.4的PBS缓冲液冲洗洗脱后的GSH亲和层析介质，并采用浓度为20％的乙醇溶液4℃避光保存经冲洗后的GSH亲和层析介质。

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