CN103877956A

CN103877956A - 一种用于分离纯化gst标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103877956A
Application number: CN201410136632.0A
Authority: CN
Inventors: 任宇红; 魏东芝; 倪克奉; 杨剑冰
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明提供了一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料及其制备方法和应用。所述磁性亲和纳米材料包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面固定有还原型谷胱甘肽。本发明所提供的磁性亲和纳米材料具有较大的比表面积，提高了该纳米材料和蛋白分子之间的结合速率和结合量，具有的超顺磁特性同时简化了分离过程的操作强度，并且该磁性亲和纳米材料的制备方法简单、价廉，用于分离纯化GST融合蛋白的过程简便、快速、有效，在生物技术领域具有广泛的应用前景和实用价值。

Description

一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，更具体地涉及一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术

在生物技术研究领域，蛋白质的分离纯化是一个非常重要的环节，尤其在蛋白质组学的研究中，复杂的组成以及极低的蛋白含量更增加了蛋白分离纯化的难度。融合标签技术的发展为蛋白质的分离纯化提供了一条更加简便的途径。融合标签技术主要通过重组DNA技术在目标蛋白编码基因的3’或5’端融合特定标签的编码基因并在合适的表达宿主中表达重组蛋白。利用固定化特异配体和重组蛋白的融合标签之间的亲和作用，能够快速有效实现目标蛋白的分离纯化。其中，谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合标签是目前应用广泛的融合标签之一，该标签能与还原型谷胱甘肽（GSH）发生酶-底物的特异性结合，因此将GSH固定在特定的载体上能实现GST融合蛋白的分离纯化。

通常而言，采用GST融合标签的纯化系统多采用柱层析法，但是这种方法存在操作过程繁琐，耗时长等缺点。近年来发展的磁性亲和纳米材料技术得到密切关注，该技术大大简化了纯化的流程，通过磁性分离的方法有效缩短了纯化时间，此外该技术还能从极低浓度的样品中对目标蛋白进行富集分离。虽然目前国内外已经报道了多种用于纯化GST融合蛋白的磁性亲和纳米材料，例如，Pan等人在2011年在Chemical Science发表了一篇文章“Glutathione(GSH)-decorated magnetic nanoparticles for bindingglutathione-S-transferase(GST)fusion protein and manipulating live cells”，其中记载了先通过两步化学反应将GSH和多巴胺连接，然后用于修饰磁性四氧化三铁纳米材料制备得到磁性亲和材料用于GST标签蛋白的分离。但是这种材料的合成和修饰过程复杂，成本高。因此，开发一种特异性高、合成过程简单，成本低的GST融合标签磁性亲和纳米材料一直是本领域当前的研究热点。

近几年来研究者通过对海洋贻贝类生物粘附蛋白结构组成剖析研究发现多巴胺能在弱碱性条件发生自聚，并在几乎任何材料的表面形成涂层，更为重要的是该涂层能进一步与其他生物大分子发生粘连。深入的研究发现这种粘连优先通过聚多巴胺中的邻苯二酚官能团和生物大分子的巯基之间反应产生。利用该特性，聚多巴胺涂层修饰的材料可以用于生物大分子例如酶、细胞、DNA、抗体的固定化，但是，到目前为止，还没有出现将聚多巴胺用于GST融合蛋白分离纯化的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料及其制备方法和应用，从而解决现有技术中的用于GST标签融合蛋白纯化的磁性亲和纳米材料合成与修饰过程复杂，成本价格较高的缺陷，以及现有技术中缺少一种简单即可实现对GST标签融合蛋白的分离纯化方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料，包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面固定有还原型谷胱甘肽。

所述还原型谷胱甘肽通过所述聚多巴胺涂层表面富含的邻苯二酚基团固定。

还提供一种如上所述的磁性亲和纳米材料的制备方法，包括以下步骤：1）提供多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入四氧化三铁纳米颗粒，搅拌，磁性分离获得聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒；2）提供还原型谷胱甘肽溶液，将步骤1）中制备的所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒分散到所述还原型谷胱甘肽溶液中，搅拌，磁性分离获得所述磁性亲和纳米材料。

步骤1）中所述多巴胺溶液浓度为0.1-5mg/mL，加入的所述四氧化三铁纳米颗粒浓度为0.5-5mg/mL（优选为1mg/mL），搅拌时间为0.5-5h，步骤2）中所述还原型谷胱甘肽溶液浓度为1-10mg/mL，加入的所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒的浓度为0.5-5mg/mL（优选为1mg/mL），搅拌时间为6-12h。

优选地，所述还原型谷胱甘肽与所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒的比例为2︰1。

其中，所述四氧化三铁纳米颗粒采用以下方法制备：将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O按照摩尔比2:1的比例在氮气保护下溶解于超纯水中，用NaOH调节溶液pH至9.0左右，40℃搅拌2小时后采用磁性分离获得所述四氧化三铁纳米颗粒。

该方法的主要原理是通过多巴胺在弱碱性条件下在四氧化三铁纳米颗粒表面包裹形成聚多巴胺涂层，通过聚多巴胺富含的邻苯二酚基团将还原型谷胱甘肽固定在材料表面，利用GSH和GST标签之间的特异性结合实现GST融合蛋白的分离纯化。

还提供一种如上所述的磁性亲和纳米材料在GST标签融合蛋白的分离纯化中的应用。

该应用包括以下步骤：1）提供根据权利要求1所述的磁性亲和纳米材料，加入细胞裂解液，振荡孵育，磁分离回收所述磁性亲和纳米材料；2）提供洗涤缓冲液，向步骤1）中回收的所述磁性亲和纳米材料中加入所述洗涤缓冲液，通过磁分离反复清洗回收所述磁性亲和纳米材料；3）提供洗脱缓冲液，向步骤2）中清洗后的所述磁性亲和纳米材料中加入所述洗脱缓冲液，振荡孵育，通过磁分离获得洗脱液，所述洗脱液中含有经过分离纯化的GST标签融合蛋白。

优选地，所述细胞裂解液为重组大肠杆菌裂解液，表达GST标签融合的绿色荧光蛋白或GST标签融合的脂肪酶。

优选地，步骤1）中的所述细胞裂解液的总蛋白浓度为0.5-2mg/mL，加入的所述磁性亲和纳米材料浓度为1-10mg/mL，孵育的时间为0.5-1h。

优选地，步骤2）中的所述洗涤缓冲液成分为50mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲液、Triton X-100（0.5%w/v）、500mM NaCl，步骤3）中的所述洗脱缓冲液成分为50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液、Triton X-100（0.5%w/v）、500mM NaCl、50mM还原型谷胱甘肽。

本发明利用多巴胺在弱碱性条件下自聚的特性将其修饰在四氧化三铁纳米颗粒的表面，利用聚多巴胺膜富含的邻苯二酚官能团与还原型谷胱甘肽（GSH）的巯基反应制备得到表面修饰有GSH的磁性亲和纳米材料，所提供的磁性亲和纳米材料具有较大的比表面积，提高了材料和蛋白分子之间的结合速率和结合量，四氧化三铁纳米颗粒的超顺磁特性简化了分离过程的操作强度，利用材料表面固定的GSH实现对GST融合蛋白的选择性结合，通过高浓度GSH溶液与GST之间的竞争作用实现了材料结合GST融合蛋白的洗脱。本发明所提出的磁性亲和纳米材料制备方法简单、廉价，该材料用于分离纯化GST融合蛋白的过程简便、快速、有效，因此该技术在生物技术领域具有广泛的应用前景和实用价值。

附图说明

图1是采用本发明的技术方案分离纯化GST融合绿色荧光蛋白的电泳图结果，其中，1：蛋白质分子量标准；2：细胞裂解液；3：穿出液；4：洗涤液；5：洗脱液；

图2是采用本发明的技术方案分离纯化GST融合脂肪酶的电泳图结果，其中，1：蛋白质分子量标准；2：细胞裂解液；3：穿出液；4：洗涤液；5：洗脱液。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1磁性亲和纳米材料的制备

（1）称取2.7g FeCl₃·6H₂O和0.99g FeCl₂·4H₂O在氮气保护下溶解在250ml超纯水中，通过加入5M NaOH调节pH至9左右，40℃搅拌2小时，通过磁铁分离得到四氧化三铁纳米颗粒。然后将其溶解于超纯水中配置成1mg/ml的磁性四氧化三铁纳米颗粒溶液。

（2）取50mg四氧化三铁纳米颗粒分散在50mL Tris-HCl缓冲液中（10mM，pH8.5），超声分散15分钟，加入50mg多巴胺盐酸。室温搅拌1小时后，通过磁铁分离得到聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒。

（3）将上述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒分散在50mL的超纯水中，加入100mg还原型谷胱甘肽，室温搅拌反应6小时后，通过磁铁分离得到GSH修饰的磁性亲和纳米材料。

通过XPS、FT-IR、DLS、TEM等分析方法对最终合成的材料进行鉴定表征，结果表明合成的四氧化三铁纳米颗粒大小在15nm左右。通过聚多巴胺的修饰后得到了平均粒径在580nm左右的纳米复合颗粒，XPS和FT-IR的结果确认了GSH对材料的修饰。

实施例2GST融合的绿色荧光蛋白（GST-GFP）的分离纯化

本实施例所选用的产GST-GFP重组大肠杆菌为本实验室以原始的绿色荧光蛋白基因为模板通过基因工程手段融合GST标签构建而成（关于未添加GST标签的原始的绿色荧光蛋白基因，可参见Kaisa Hakkila,MikaelMaksimow,Matti Karp,Marko Virta,Reporter Genes lucFF,luxCDABE,gfp,anddsred Have Different Characteristics in Whole-Cell Bacterial Sensors,AnalyticalBiochemistry,Volume301,Issue2,Pages235–242）。其中，含有该绿色荧光蛋白基因的质粒通过现有的商业途径即可购买得到，通过PCR将该绿色荧光蛋白基因进行扩增，所用的正向引物为：5’-GGACTAGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’;反向引物为：5’-CGGGATCCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-3’。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，利用胶回收试剂盒回收目标大小的片段。通过SpeI和BamHI对片段进行双酶切，连接到同样经过双酶切的pET42a质粒上。利用pET42a质粒所携带的GST标签融合到绿色荧光蛋白的N端。将构建好的质粒转化到E.coli DH5α，经过测序正确后，抽取质粒转化表达宿主E.coli BL21中进行表达。将重组大肠杆菌接种到发酵培养中，37℃培养至OD600到0.6-0.8之间，加入IPTG至浓度为0.1mM，25℃诱导培养16小时后离心收集菌体，将其重悬在生理盐水中，通过超声破碎离心后得到细胞裂解液，裂解液中的总蛋白浓度通过Bradford法进行测定。取100μL细胞裂解液（总蛋白浓度2mg/mL）加入400μL磁性亲和纳米材料（10mg/mL），振荡孵育30分钟后，通过磁铁对材料进行分离，除去上清。加入500μL洗涤缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.4，0.5%Triton X-100，500mMNaCl）对材料进行清洗除去非特异性结合，通过磁分离除去上清，反复清洗三次。最终加入500μL洗脱缓冲液（50mMTris-HCl,pH8.0,0.5%Triton X-100,500mMNaCl,50mMGSH），室温振荡孵育30分钟，通过磁分离得到洗脱液。

通过SDS-PAGE对上述纯化过程中的穿出液、洗涤液、洗脱液进行了检测，结果如图1所示。将细胞裂解液（泳道2）和磁性亲和纳米材料混合之后，大部分目的蛋白由于GST的特异性作用结合到了材料的表面，而其他的蛋白则留在穿出液（泳道3）中。此外，利用绿色荧光蛋白的荧光特性，通过荧光显微镜测定加入材料前后溶液的荧光吸收值变化计算出细胞裂解液中超过80%的目的蛋白结合到了材料上。三次的洗涤过程除去了一些非特异性结合的蛋白（泳道4），而目的蛋白脱落的量较少，通过荧光定量总共少于8%。最后通过高浓度的GSH洗脱液进行洗脱后得到了单一条带的目的蛋白（泳道5）。

实施例3GST融合的脂肪酶（GST-Lip）的分离纯化

本实施例所选用的产GST-Lip重组大肠杆菌为本实验室以脂肪酶基因为模板通过基因工程手段融合GST标签构建而成（关于未添加GST标签的原始的脂肪酶基因，可参见Bei Gao,Erzheng Su,Jinping Lin,Dongzhi Wei.Development of recombinant Escherichia coli whole-cell biocatalyst expressing anovel alkaline lipase-coding gene from Proteus sp.for biodiesel production.Journal of Biotechnology.2009,139(2):169-175）。其中，带有脂肪酶LipK107基因的质粒通过现有的商业途径即可购买得到，以此作为模板，通过PCR对脂肪酶LipK107基因进行扩增，所用的正向引物为：5’-GGACTAGTATGTCAACGAAATATCCTATC-3’；反向引物为：5’-GGAATTCTTAAAGTTGCTTACTCGCTAAG-3’。通过胶回收对目的基因片段进行回收，利用SpeI和EcoRI限制性内切酶对片段进行双酶切，连接到同样经过双酶切的pET42a质粒中。利用pET42a中所带的GST标签融合到蛋白的N端。将构建成功的质粒转化到E.coli BL21中进行表达。按照实施例2中所述的方法用磁性亲和纳米材料对GST-Lip进行分离纯化，结果如图2所示，在穿出液（泳道3）中几乎观察不到目的蛋白的条带，说明对GST-Lip具有很高的结合能力。虽然洗涤的过程中存在部分目的蛋白的脱落（泳道4），然而通过洗脱能得到大量高纯度的目的蛋白（泳道5）。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种用于分离纯化GST标签融合蛋白的磁性亲和纳米材料，其特征在于，包括：四氧化三铁纳米颗粒和包裹于所述四氧化三铁纳米颗粒外部的聚多巴胺涂层，所述聚多巴胺涂层表面固定有还原型谷胱甘肽。

2.根据权利要求1所述的磁性亲和纳米材料，其特征在于，所述还原型谷胱甘肽通过所述聚多巴胺涂层表面富含的邻苯二酚基团固定。

3.一种根据权利要求1所述的磁性亲和纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供多巴胺溶液，向所述多巴胺溶液中加入四氧化三铁纳米颗粒，搅拌，磁性分离获得聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒；

2）提供还原型谷胱甘肽溶液，将步骤1）中制备的所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒分散到所述还原型谷胱甘肽溶液中，搅拌，磁性分离获得所述磁性亲和纳米材料。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述多巴胺溶液浓度为0.1-5mg/mL，加入的所述四氧化三铁纳米颗粒浓度为0.5-5mg/mL，搅拌时间为0.5-5h，步骤2）中所述还原型谷胱甘肽溶液浓度为1-10mg/mL，加入的所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒浓度为0.5-5mg/mL，搅拌时间为6-12h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述还原型谷胱甘肽与所述聚多巴胺修饰的四氧化三铁纳米颗粒的比例为2︰1。

6.一种根据权利要求1所述的磁性亲和纳米材料在GST标签融合蛋白的分离纯化中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供根据权利要求1所述的磁性亲和纳米材料，加入细胞裂解液，振荡孵育，磁分离回收所述磁性亲和纳米材料；

2）提供洗涤缓冲液，向步骤1）中回收的所述磁性亲和纳米材料中加入所述洗涤缓冲液，通过磁分离反复清洗回收所述磁性亲和纳米材料；

3）提供洗脱缓冲液，向步骤2）中清洗后的所述磁性亲和纳米材料中加入所述洗脱缓冲液，振荡孵育，通过磁分离获得洗脱液，所述洗脱液中含有经过分离纯化的GST标签融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞裂解液为重组大肠杆菌裂解液，表达GST标签融合的绿色荧光蛋白或GST标签融合的脂肪酶。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1）中的所述细胞裂解液的总蛋白浓度为0.5-2mg/mL，加入的所述磁性亲和纳米材料浓度为1-10mg/mL，孵育的时间为0.5-1h。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2）中的所述洗涤缓冲液成分为50mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲液、Triton X-100（0.5%w/v）、500mM NaCl，步骤3）中的所述洗脱缓冲液成分为50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液、Triton X-100（0.5%w/v）、500mM NaCl、50mM还原型谷胱甘肽。