CN105498715A - 基于6b琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用 - Google Patents

基于6b琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，通过环氧氯丙烷活化琼脂糖微球与葡聚糖聚合，在不降低琼脂糖微球表面羟基数目的情况下，增加了琼脂糖微球的表面积，同时葡聚糖分子有效的降低了琼脂糖微球的电荷效应，再次将活化的琼脂糖微球连接L-天门冬氨酸并通过溴乙酸处理，生成具有较长延长臂，保证镍金属能够与重组蛋白高效结合，提高介质的纯化效果。该发明解决了现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题。

Description

基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法及其应用。
背景技术
现代生物医药产业的高速发展，要求生物材料的性能逐步提高。以琼脂糖制备的亲和层析介质广泛运用于蛋白质的分离工程中，介质性能直接决定了分离纯化的效率。
琼脂糖作为一种富含有羟基，具有良好的生物可溶性，是分离纯化过程中，运用最广泛的基质合成材料。但是，由于普通的琼脂糖微球硬度较低，在高压的条件下容易产生形变，减低微球间空隙的大小，直接导致纯化介质的流速降低；而一味的提高流速会直接导致琼脂糖微球的破裂，影响纯化效果。基于此种局限性，通常会对琼脂糖微球进行交联和改性。现有报道中，常见的交联剂为含有环氧、Cl和Br等活性较高官能团的有机物。较早的报道如PorathJC(1975,journalofchromatography10349-62)等利用碱性条件下，环氧氯丙烷与琼脂糖微球进行反应，制备拥有一定机械强度的微球。PernemalmP等在专利EP0203049A1中报道，通过一种分步交联的方法，实现琼脂糖微球的高度交联，即利用含有多个环氧官能团的有机物如1,4-丁二醇缩水甘油醚、三环氧丙基异氰尿酸酯等，利用这些有机物较长的分子链，先对琼脂糖的空间结构进行稳定，而后利用环氧氯丙烷对琼脂糖微球的结构进行加强，获得拥有较高强度的微球。
与此同时，为了获得较高纯度的目标蛋白，减少分离步骤、降低生产成本，需要利用特殊手段对琼脂糖进行改性。镍金属亲和层析就是利用含有六个组氨酸标签的重组蛋白，能够特异性结合于金属镍上。正是利用这一特性，我们能够制备出含有镍的亲和纯化介质。PorathJ等在1975年首次报道了利用金属离子能够与蛋白之间发生亲和作用，并成功的利用这一特性实现了对目标蛋白的分离和纯化。
然而，由于天然琼脂糖中含有大量的含硫的物质，且难以处理干净。使得纯化过程中纯化介质带有电荷效应，对样品中的杂蛋白产生吸附作用，影响洗脱效果。因此，需要克服琼脂糖微球的电荷效应这种理化性质，提高蛋白质纯化效果。
发明内容
本发明的目的是克服现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题。
为此，本发明提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球。
2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球。
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
上述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。
本发明中，优选的一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球。
2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.8:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球。
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.4:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在25～30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
另外，本发明还提供了采用该方法制得的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质在纯化蛋白中的应用，具体过程为：
将上述制得的镍金属层析介质与含有重组蛋白的菌株破碎后的上清液混合进行亲合吸附，然后利用不同咪唑浓度的PBS溶液对镍金属层析介质进行洗脱，收集每个浓度的洗脱液。
进一步地，所述PBS溶液的咪唑浓度为25mM和150mM。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的这种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法通过环氧氯丙烷活化琼脂糖微球与葡聚糖聚合，在不降低琼脂糖微球表面羟基数目的情况下，增加了琼脂糖微球的表面积，使得微球具有更高的硬度，同时葡聚糖分子有效的降低了琼脂糖微球的电荷效应，提高了纯化介质的流速。
(2)本发明提供的这种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法将活化的琼脂糖微球连接L-天门冬氨酸并通过溴乙酸处理，生成具有较长延长臂，能够保证镍金属能够与重组蛋白高效结合，提高介质的纯化效果。
(3)采用本发明制备方法制备的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质可用于重组蛋白的洗脱，洗脱效果好。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明中重组蛋白EGFP洗脱峰图。
图2是本发明中重组蛋白EGFP洗脱峰的SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
实施例1：
为了解决现有琼脂糖微球中交联步骤繁琐，交联后介质偶联配基密度较低以及琼脂糖理化性质影响纯化效果的问题，本实施例提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球；其中，2M的氢氧化钠表示氢氧化钠浓度为2mol/L；6B琼脂糖微球是指琼脂糖含量占总质量的6%。
2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.8:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；其中，所采用葡聚糖分子量为40000。
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.4:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
其中，上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
对本实施例制得的镍金属层析介质在不同压强下进行流速测试，其结果如表1所示。
表1：
压强(KPa) 10 20 30 40 50 60 70
流速(mL/min) 20 50 100 200 400 800 1200
实施例2：
本实施例提供了一种一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1:0.9:1进行混合，在反应温度为25℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球；其中，2M的氢氧化钠表示氢氧化钠浓度为2mol/L；6B琼脂糖微球是指琼脂糖含量占总质量的6%。
2)将1M的氢氧化钠、0.1g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应5小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；其中，所采用葡聚糖分子量为40000。
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1:0.8:1进行混合，在反应温度为25℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M，在50℃下反应5小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M，在25℃下反应5小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
其中，上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
对本实施例制得的镍金属层析介质在不同压强下进行流速测试，其结果如表2所示。
表2：
压强(KPa) 10 20 30 40 50 60 70
流速(mL/min) 5 10 25 35 60 70 85
实施例3：
本实施例提供了一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.5:0.5:1进行混合，在反应温度为70℃的条件下，反应6小时制得活化的琼脂糖微球；其中，2M的氢氧化钠表示氢氧化钠浓度为2mol/L；6B琼脂糖微球是指琼脂糖含量占总质量的6%。
2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.9:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；其中，所采用葡聚糖分子量为40000。
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.5:0.4:1进行混合，在反应温度为70℃的条件下，反应6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质。
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性。
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性。
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
其中，上述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
对本实施例制得的镍金属层析介质在不同压强下进行流速测试，其结果如表3所示。
表3：
压强(KPa) 10 20 30 40 50 60 70
流速(mL/min) 25 60 120 260 500 820 1400
实施例4：
本实施例采用实施例1制得的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质对重组蛋白EGFP（增强型绿色荧光蛋白）进行纯化，其过程为将上述制得的镍金属层析介质与含有重组蛋白的菌株破碎后的上清液混合进行亲合吸附，然后利用含有25mM和150mM咪唑浓度的PBS（磷酸盐缓冲液），pH=7.4缓冲液对镍金属层析介质进行洗脱，收集每个浓度洗脱液的洗脱峰，重组蛋白EGFP洗脱峰图如图1所示，其中第一个吸收峰由25mM咪唑浓度的PBS洗脱，第二个吸收峰由150mM咪唑浓度的PBS洗脱。
浓度为10%的SDS-PAGE胶，EGFP上样蛋白浓度在10μg,电泳20分钟后，通过考马斯亮蓝染色后得到的SDS-PAGE胶图如图2所示。
其中，含有重组蛋白的菌株的收集是取1L含有重组蛋白EGFP表达菌株的培养液，4000rpm离心收集菌体，并用10mM的PBS，pH=7.4约80mL重悬菌体，其中，10mM的PBS表示PBS的浓度为10mmol/L。
破碎过程为将上述收集的含有重组蛋白的菌株低温超声处理，菌悬液约30min，然后在4℃以12000rpm离心收集上清液。
同时，可对实施例1制得的镍金属层析介质进行预处理，利用10mM的PBSpH=7.4冲洗镍金属层析介质，约5～10个柱体积。
综上所述，本发明提供的这种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法与直接修饰微球的方法相比，具有更高的配基密度，更低的非特异性结合，提高了重组蛋白的纯化效率，降低了微球对杂蛋白的非特异性结合，该方法制备的镍金属层析介质能够广泛的运用于蛋白质及抗体纯化等领域。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.5～0.9:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时制得活化的琼脂糖微球；
2)将1M的氢氧化钠、0.1～0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.3～0.9:1:1混合，在反应温度为25～37℃的条件下，反应5～10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.1～0.5:0.4～0.8:1进行混合，在反应温度为25～70℃的条件下，反应3～6小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1或1:2混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.1M～0.3M，在50～60℃下反应5～10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1或1.5:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.3M～0.6M，在25～30℃下反应5～12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应2～3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
2.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤1)～3)和步骤5)～6)中的反应均在摇床上震荡反应。
3.如权利要求1所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的葡聚糖分子量为4000。
4.如权利要求1或2或3所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和6B琼脂糖微球按体积比0.2:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时制得活化的琼脂糖微球；
2)将1M的氢氧化钠、0.3g/mL的葡聚糖水溶液和步骤1)制得的活化的琼脂糖微球按体积比0.8:1:1混合，在反应温度为25℃的条件下，反应10小时，得到葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球；
3)将环氧氯丙烷、2M的氢氧化钠和步骤2)制得的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球按体积比0.4:0.8:1进行混合，在反应温度为40℃的条件下，反应3小时，制得活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
4)步骤3)反应结束后，立即用1mM的盐酸进行中和，然后用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质；
5)将步骤4)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与1M的碳酸钠溶液以体积比1:1混合后，加入L-天门冬氨酸至终浓度为0.3M，在60℃下反应10小时后，用蒸馏水冲洗活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质至中性；
6)将步骤5)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与0.1M的碳酸钠溶液按体积比2:1混合，加入溴乙酸至终浓度为0.6M，在25～30℃下反应12小时后，用蒸馏水冲洗介质至中性；
7)将步骤6)处理后的活化的葡聚糖修饰的6B琼脂糖微球介质与100mM的硫酸镍溶液等体积混合室温反应3小时后，用蒸馏水冲洗介质至介质颜色不再变化，流出液中无镍离子为止，得到镍金属层析介质。
5.一种如权利要求1～4任一项制得的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的应用，其特征在于：将制得的镍金属层析介质与含有重组蛋白的菌株破碎后的上清液混合进行亲合吸附，然后利用不同咪唑浓度的PBS溶液对镍金属层析介质进行洗脱，收集每个浓度的洗脱液。
6.如权利要求5所述的基于6B琼脂糖微球的镍金属层析介质的应用，其特征在于：所述PBS溶液的咪唑浓度为25mM和150mM。
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