CN104289209A - 一种用于蛋白质分离的wcx/hic双功能混合模式聚合物基质色谱固定相及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种用于蛋白质分离的WCX/HIC双功能混合模式聚合物基质色谱固定相及其制备方法,公开了结构式(I)所示的色谱固定相及其制备方法,所述固定相以聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质,将其水解后与环氧氯丙烷在三氟化硼乙醚催化下反应,再用硫脲在乙醇溶液中与微球表面的氯基团反应生成巯基;微球表面生成的巯基在甲苯中以过氧化苯甲酰为引发剂与含双键的羧酸或酸酐发生巯基-烯点击化学反应,从而将羧基引入微球表面,获得弱阳离子交换色谱填料。该固定相可以分别在疏水模式和弱阳离子交换模式下实现对蛋白质的有效地分离,所以用一根装填这种双功能分离介质的色谱柱具有“一柱二用”的功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相,具体地说是一种疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相。
背景技术
生物技术和生命科学的发展,尤其是重组蛋白质药物的生产和蛋白质组学的研究都依赖于蛋白质高效快速的分离技术。液相色谱(LC)是蛋白分离纯化最有效的工具,二维液相色谱(2DLC)已成为蛋白质组学研究的关键技术。而液相色谱的核心——色谱柱及其色谱固定相,历来都是色谱技术发展的动力来源。
目前一根传统的色谱柱均是基于一种分离机理,如静电作用、疏水作用、亲合作用等,只能用单一分离模式对蛋白质进行分离纯化,其特征是“一柱一用”。混合机理色谱(mixed-mode
chromatography, MMC) 是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的色谱模式。在合成MMC色谱填料时,在配基中合理地引入多个作用位点,使固定相和蛋白质之间存在多种相互作用,以提高固定相的选择性和柱效。与传统的单一模式色谱相比,具有许多优点,如分离效果好,选择性高和柱负荷高等,从而成为当今液相色谱研究的热点之一。目前已报道的MMC主要有RPLC/IEC、亲水色谱(HILIC)/ IEC、HIC/IEC、RPLC/HILIC、疏水性电荷诱导色谱(hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)等几种类型。
Kennedy[Kennedy
L A, et al, J Chromatogr A, 1986, 359: 73-84]等合成了一种弱阴离子交换填料,该填料具有一定的疏水相互作用性质。Horvath等[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469:
3-27]]曾合成了一种聚合物基质的混合模式弱阴离子交换分离介质。目前IEC/HIC MMC色谱柱已有商品化,如美国GE Healthcare公司的Capto
MMC and Capto adhere,Pall Life
Sciences 公司设计生产的HEA, PPA and MEP HyperCel耐盐层析介质,然而,这些 MMC 柱均是以一种色谱分离模式为主,而伴随的其他模式只起着强化主分离模式的辅助作用,不能有效地用于蛋白质样品的二维分离,因此不能称之为二维色谱填料。
以硅胶为基质的色谱固定相pH 适用范围为2-8,这就限制了其在较低或较高pH条件下的使用。与硅胶基质相比,高分子聚合物具有良好的化学稳定性,样品负载量大,可在pH1-14内使用。
传统化学方法制备的键合固定相经常以有机溶剂为介质,而且还会包括很多副反应,这会导致生成的固定相表面配基不均匀、键合量低,还会使成本上升以及环境污染。2001年,K.Barry Sharpless研究小组提出了一种高效、高选择性的合成新策略,并将其命名为“Click
chemistry”(点击化学)[Kolb H. C., et al, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl., 2001, 40: 2004-2021]。“点击化学”的核心思想是利用一系列可靠、高效、高选择性的化学反应来实现碳杂原子的链接(C-X-C),以合成含杂原子的有机化合物,其中应用最成功的是一价铜催化的端基炔和有机叠氮化物反应生成三唑的1,3偶极环加成反应。此类反应的特点为:①反应原料易得;②反应操作简单,条件温和;③反应选择性高,副反应少,产率高,有时产率甚至可达100%;④反应后产物易于处理、纯化。基于以上优点,点击化学已经被广泛应用于有机合成、高分子合成、药物合成与筛选、材料合成和生物大分子修饰等领域。
尽管Cu(I)催化的端基炔和有机叠氮化物反应得到了广泛的应用,但由于反应中要使用一价铜为催化剂,使得生成的固定相中难免会有重金属残留。有报道称由于催化剂Cu(I)的存在诱导了病毒或寡核苷酸的降解[Wang Q, et al., J. Am. Chem. Soc.,
2003, 125:3192-3193; Gierlich J, et al., Org. Lett. , 2006, 8:3639-3642],这将在很大程度上限制该反应在生物材料及药物载体等方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型疏水/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,以满足分别在离子交换模式和疏水模式下实现对蛋白质的高效分离的要求,实现“一柱二用”的功能。
本发明的另一目的在于提供上述固定相简便的制备方法,即“巯基-烯点击化学”法。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
固定相采用聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA/EDMA)微球,将其表面的环氧基团水解成邻二醇后与环氧氯丙烷在三氟化硼乙醚催化下反应,再用硫脲在乙醇溶液中与微球表面的氯基团反应生成巯基;微球表面生成的巯基在甲苯中以过氧化苯甲酰为引发剂与含双键的羧酸或酸酐发生点击化学反应,从而将羧基引入微球表面,获得弱阳离子交换色谱填料。由于聚合物基质本身具有较强的疏水性,在经过水解并引入羧酸基团后,其疏水性减弱为中等强度,在高盐浓度时表现出疏水色谱的性质,亦可作用疏水色谱填料使用,制备出WCX/HIC双功能色谱固定相。
结构式(I)所示的疏水/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,
其中为聚甲基丙烯酸环氧丙酯,
R1为或-(CH2)n-, n为1~3的整数;
R2为,或-(CH2)n-,n为1~3的整数。
上述结构式最好为:
。
上述色谱固定相的制备方法,包括以下步骤:
(1)将聚甲基丙烯酸环氧丙酯PGMA/EDMA分散在硫酸溶液中得到环氧基水解成邻二醇的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(2)将步骤(1)制备的水解PGMA/EDMA微球分散于二氧六环中,加入三氟化硼乙醚和环氧氯丙烷,反应得到含有氯基团的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(3)将步骤(2)制备的含氯基团的PGMA/EDMA微球分散于乙醇中,加入硫脲进一步反应得到含巯基的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(4)将步骤(3)制备的含巯基的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于甲苯中,加入相应的有机酸或酸酐和过氧化苯甲酰反应,产物经洗净得到疏水/弱阳离子交换混合模式聚合物基质色谱固定相。
所述相应的酸或酸酐是容易理解的,根据R1和R2取值和具体要求,如相应的有机酸或酸酐可以是马来酸酐或甲基丙烯酸等。
具体来说,以马来酸酐为例,其制备方法包括以下步骤:
(1)取一份重量的聚甲基丙烯酸环氧丙酯PGMA/EDMA微球分散于0.1 mol/L硫酸中,60 °C下搅拌10小时,然后分别用蒸馏水和甲醇洗涤至中性并于50 °C下真空干燥5小时;
(2)将步骤(1)制备的水解PGMA/EDMA微球分散于一份体积的二氧六环中,加入1/60体积的三氟化硼乙醚和1.5倍微球质量的环氧氯丙烷,80°C下搅拌3小时,然后用乙醇及甲醇各洗涤三遍并于50 °C下真空干燥5小时,即得含氯基团的微球;
(3)将步骤(2)制备的含氯基团的微球分散于乙醇中,加入0.3倍微球重量的硫脲,75°C下搅拌3小时,再加入相同体积10%的NaOH溶液,75°C下搅拌2小时,然后依次用蒸馏水、1mmol/L的盐酸、蒸馏水和甲醇洗涤三遍,50 °C下真空干燥5小时,即得含巯基的微球;
(4)将步骤(3)制备的含巯基的微球分散于甲苯中,加入0.2倍微球重量的马来酸酐和少量过氧化苯甲酰,通氮气20分钟后在70°C下搅拌2小时;将产物用丙酮洗涤三遍,在0.1mol/L的NaOH溶液中搅拌10小时,然后依次蒸馏水和甲醇洗涤三遍,50 °C下真空干燥5小时,即得所述的弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相,
。
上述步骤(1)中所用的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球PGMA/EDMA,其粒径为3~40µm,孔径为150~1000Å,交联剂为甲基丙烯酸乙二醇酯,交联度为40~50%。
本发明的积极效果是:
(1)采用高效快速的巯基-烯点击化学方法首次合成了用于蛋白分离的疏水/弱阳离子交换双功能混合模式聚合物基质色谱固定相,该固定相稳定、pH适用范围宽、合成成本低、使用寿命长、分离效果好;
(2)实验表明该疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分离;
(3)用一根装填这种双功能分离介质的色谱柱可代替两根常用的弱阳离子交换和疏水色谱柱对蛋白质进行分离纯化,用一根色谱柱就可实现IEC-HIC或HIC-IEC二维色谱分离,具有“一柱二用”的功能。
为了克服传统化学方法制备色谱固定相的缺点,本发明以聚合物微球为基质,利用“巯基-烯点击化学”的方法合成了一种新型的WCX/HIC双功能色谱固定相。由于IEC和HIC的分离机理是正交的,采用一根双功能色谱柱就可完成HIC-IEC或IEC-HIC二维色谱分离,即具有“一柱二用”的功能,这将大大降低生物大分子分离纯化所需要的分离介质的数量,从而大大降低生物大分子,特别是重组蛋白药物的生产成本,对生物大分子的分离纯化具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相的IR光谱图;
图2为本发明制备的疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在离子交换模式下对五种蛋白质的分离色谱图;
图3为本发明制备的疏水/弱阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在疏水模式下对六种蛋白质的分离色谱图。
具体实施方式
下面结合实施实例和附图,对本发明做进一步说明。应当理解,实施实例仅限于说明本发明而不是对本发明的限定。
实施例
1
1) 取6.0g聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA/EDMA)微球分散于60 mL的0.1 mol/L H2SO4中,60℃下搅拌10小时,然后依次用蒸馏水及甲醇洗净,50 °C下真空干燥5小时,即可得到表面环氧基水解成邻二醇的微球;
2) 取6.0 g水解PGMA/EDMA微球置于100 mL烧瓶中,加入40 mL二氧六环、0.5 mL三氟化硼乙醚和10 mL环氧氯丙烷,80℃下搅拌3小时。产物依次用乙醇及甲醇洗净,50 °C下真空干燥5小时,即可得到含氯基团的微球;
3) 取5.0 g含氯基团的PGMA/EDMA微球置于100 mL烧瓶中,将1.5 g硫脲溶于50 mL乙醇并加入烧瓶中,75 °C下搅拌3小时,再加入50 mL 10% NaOH溶液,75 °C下搅拌2小时,产物依次用蒸馏水、1 mmol/L盐酸、蒸馏水及甲醇洗净,即可得到表面含巯基的微球;
4) 取5.0 g含巯基的PGMA/EDMA微球置于100 mL烧瓶中,将1 g马来酸酐溶于30 mL甲苯并加入烧瓶中,通氮气15分钟,70℃下搅拌2小时,50℃真空干燥5小时,即可得到权利要求1所述的疏水/弱阳离子交换混合模式聚合物基质色谱固定相。所得含巯基的PGMA/EDMA微球和WCX/HIC双功能固定相用傅里叶变换红外光谱仪进行测试,测试结果如图1所示,曲线1为表面含巯基的PGMA/EDMA微球的IR图,在2565cm-1处的吸收峰说明微球表面生成了巯基;曲线2为所合成的WCX/HIC双功能固定相的IR。由于配基中含羧基,在1722 cm-1处出现了羰基的强吸收峰。元素分析显示该固定相中S元素含量为1.52%。用滴定法测得该固定相上的羧基含量为0.925 mmol/g。综合以上信息,说明由巯基与马来酸酐通过点击化学反应将羧基引入到PGMA/EDMA微球表面,从而制成了弱阳离子交换固定相。
实施例
2
使用实施例1所制备的色谱填料装柱,然后在弱阳离子交换模式下对六种标准蛋白进行分离。分离条件:
流动相:A液: 20
mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),B 液: 20 mmol/L KH2PO4
+ 1.0 mol/L NaCl (pH 7.0); 洗脱条件:0→100%B,30 min。流速为1.0 mL/min,对myoglobin、RNase B、RNase A、cytochrome c、α-
chymotrypsinogen A、lysozyme这六种蛋白质实现了良好的分离(如图2所示1、2、3、4、5、6分别为myoglobin、RNase B、RNase A、cytochrome c、α- chymotrypsinogen A、lysozyme)。
实施例
3
使用实施例1所制备的色谱填料装柱,然后在疏水模式下对六种标准蛋白进行分离。分离条件:
流动相: A液: 20
mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 2.5 mol/L (NH4)2SO4
(pH 7.0),B 液: 20
mmol/L KH2PO4 (pH 7.0);洗脱条件:30分钟线性梯度0→100%B,100%延长10分钟。流速为1.0 mL/min,对cytchrome
c、myoglobin、RNase
A、α- lactalbumin、α- chymotrypsinogen A、insulin等六种蛋白质实现了良好的分离(如图3所示1、2、3、4、5、6分别为cytchrome c、myoglobin、RNase A、α- lactalbumin、α- chymotrypsinogen A、insulin)。
Claims (5)
1.结构式(I)所示的疏水/弱阳离子交换混合模式色谱固定相,
其中为聚甲基丙烯酸环氧丙酯,
R1为或-(CH2)n-, n为1~3的整数;
R2为,或-(CH2)n-,n为1~3的整数。
2.根据权利要求1所述的色谱固定相,其特征在于结构式(I)为:
。
3.权利要求1所述色谱固定相的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将聚甲基丙烯酸环氧丙酯PGMA/EDMA分散在硫酸溶液中得到环氧基水解成邻二醇的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(2)将步骤(1)制备的水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于二氧六环中,加入三氟化硼乙醚和环氧氯丙烷,反应得到含有氯基团的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(3)将步骤(2)制备的含氯基团的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于乙醇中,加入硫脲进一步反应得到含巯基的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球;
(4)将步骤(3)制备的含巯基的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球分散于甲苯中,加入相应的有机酸或酸酐和过氧化苯甲酰反应,产物经洗净得到疏水/弱阳离子交换混合模式聚合物基质色谱固定相。
4.权利要求2所述色谱固定相的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取一份重量的聚甲基丙烯酸环氧丙酯PGMA/EDMA微球分散于0.1 mol/L硫酸中,60 °C下搅拌10小时,然后分别用蒸馏水和甲醇洗涤至中性并于50 °C下真空干燥5小时;
(2)将步骤(1)制备的水解PGMA/EDMA微球分散于一份体积的二氧六环中,加入1/60体积的三氟化硼乙醚和1.5倍微球质量的环氧氯丙烷,80°C下搅拌3小时,然后用乙醇及甲醇各洗涤三遍并于50 °C下真空干燥5小时,即得含氯基团的微球;
(3)将步骤(2)制备的含氯基团的微球分散于乙醇中,加入0.3倍微球重量的硫脲,75°C下搅拌3小时,再加入相同体积10%的NaOH溶液,75°C下搅拌2小时,然后依次用蒸馏水、1mmol/L的盐酸、蒸馏水和甲醇洗涤三遍,50 °C下真空干燥5小时,即得含巯基的微球;
(4)将步骤(3)制备的含巯基的微球分散于甲苯中,加入0.2倍微球重量的马来酸酐和少量过氧化苯甲酰,通氮气20分钟后在70°C下搅拌2小时;将产物用丙酮洗涤三遍,在0.1mol/L的NaOH溶液中搅拌10小时,然后依次蒸馏水和甲醇洗涤三遍,50 °C下真空干燥5小时,即得所述的弱阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相,
。
5.根据权利要求3或4所述色谱固定相制备方法,其特征在于:步骤(1)中所用的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球PGMA/EDMA,其粒径为3~40µm,孔径为150~1000Å,交联剂为甲基丙烯酸乙二醇酯,交联度为40~50%。
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