CN1815224A - 一种毛细管液相色谱柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种毛细管液相色谱柱及其制备方法，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，其特征在于：所述毛细管内的中部设置有由有机聚合物原位聚合形成且经弱酸阳离子改性的整体固定相，所述固定相的下游设置有去掉表面聚酰亚胺涂层的检测窗口。本发明的制备方法包括：(1)对弹性石英毛细管内壁进行常规预处理；(2)用单体混合物、致孔剂混合物和引发剂制作整体固定相基体；(3)用改性剂对固定相基体进行改性，得到弱酸性阳离子交换整体固定相；(4)制作检测窗口，得到本发明弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱。本发明产品价格低廉，制备条件易于控制，重现性好，同时本发明材料结构本身与生物样品具有很好的相容性，特别适用于生物大分子样品的分离分析，在蛋白组学的研究中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种毛细管液相色谱柱及其制备方法，特别是关于一种可以进行弱酸性阳离子交换的毛细管液相色谱柱及其制备方法。
背景技术
毛细管液相色谱(μ-HPLC)是一种高效、快速的分离分析方法，通常使用内径50μm～530μm的毛细管柱，与传统的4.6mm内径的液相色谱柱相比，可以大大节省流动相、固定相和样品的消耗，并且易于质谱等检测器在线联用，由于其独特的优势，近年来在生化分析、环境、医药等领域得到了日益广泛的应用。尤其是20世纪90年代后期，随着蛋白组学的发展，毛细管液相色谱得到越来越多的重视，毛细管液相色谱与质谱联用技术已成为蛋白组学研究的重要工具，高效毛细管液相色谱柱的制备是蛋白质组学分离技术中需要考虑的关键技术之一。目前在生物大分子的分离纯化领域使用的高效液相色谱方法按照分离机理的不同可分为离子交换色谱、反相色谱、疏水作用色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等多种分离模式。其中由于离子交换色谱通常在室温下进行，所使用的流动相缓冲溶液一般与生物分子存在的环境条件比较接近，因此固定相表面经过各种化学修饰的离子交换官能团能为生物大分子的分离提供“软接触”的温和相互作用，非常有利于保持生物大分子的生物活性。目前蛋白组学中占有重要地位的多维液相色谱-质谱联用技术中，第一维液相色谱大多采用毛细管离子交换色谱柱。
目前有关毛细管离子交换色谱柱的报道大多为填充毛细管液相色谱柱，通常是将3μm或5μm的离子交换填料通过匀浆法装入毛细管柱中来制备填充毛细管液相色谱柱。这一方法的装柱技术非常重要，很大程度上决定了柱性能的好坏，但该技术很难掌握，因此大多研究者采用直接购买商品毛细管离子交换色谱柱的方式。而由于毛细管液相色谱柱制备技术含量高，因此造成其价格昂贵，一根商品毛细管液相色谱柱的价格几乎是普通液相色谱柱的2倍甚至更高。同时相对于传统4.6mm内径的液相色谱柱，毛细管液相色谱柱寿命很低，这是因为毛细管柱通常采用弹性石英柱管，机械强度差，易碎，远远不如不锈钢柱管耐用。另外，生物样品组成复杂，而毛细管柱容量又很小，因此很容易被污染。目前蛋白组学的研究费用很高，其中一个重要因素就是需要购买大量价格昂贵的毛细管液相色谱柱。此外，生物大分子在传统的颗粒填充离子交换色谱柱上的分离柱效较低，主要是由于溶质在颗粒填料孔内缓慢的扩散过程，影响体积大且形状不规则的生物分子的传质过程。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够进行弱酸性阳离子交换的毛细管整体液相色谱柱及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种毛细管液相色谱柱，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，其特征在于：所述毛细管内的中部设置有由有机聚合物原位聚合形成且经弱酸阳离子改性的整体固定相，所述固定相的下游设置有去掉表面聚酰亚胺涂层的检测窗口。
所述毛细管的内径为0.05～0.53mm。
一种毛细管液相色谱柱的制备方法，它包括以下步骤：(1)对弹性石英毛细管内壁进行常规预处理；(2)将单体混合物与致孔剂混合物按体积比2∶2～3混合，加入引发剂，超声混合，通入氮气去除反应混合溶液中的空气；将得到的反应混合溶液通入所述毛细管中，并用硅胶封住其两端，在40～80℃水浴中反应18～24h，用甲醇冲洗毛细管柱，得到整体固定相基体；(3)用NaOH调节改性试剂的pH至10.5～11.5，用泵将得到的改性剂在65℃下以20～40μL/min的流速流过所述固定相基体16～36h，得到弱酸性阳离子交换整体固定相；(4)将距离固定相一端10～12cm的毛细管外壁上的聚酰亚胺涂层去掉2～3mm作为检测窗口，得到弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱。
所述改性试剂为亚氨基二乙酸钠溶液。
所述单体混合物为甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯，其质量比为3～7∶1。
所述致孔剂为正丙醇、1，4-丁二醇和水，其质量比为4～5∶3～4∶1。
所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为所述单体化合物质量的0.5～1％。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明采用原位聚合的方法制备有机聚合物整体柱，由于有机聚合物直接键合到毛细管的内壁上，具有机械强度高、不易碎、气泡在整体柱内不易留存等优点。2、本发明中固定相直接作为分离材料，大大地增加了柱容量，有效地提高了分离效率，同时还可以使分辨率基本上不依赖于流速。3、由于在制备整体柱的过程中可以调节不同组分的相互比例，从而制备得到大孔径且孔径均一的整体柱，这样有利于体积大且形状不规则的生物分子的扩散，而且由于孔径的扩大可以在高流速下进行分析，这样有利于生物样品的快速分离和分析。4、本发明对固定相进行弱酸性阳离子改性，通过改性试剂与固定相基体中环氧基团的反应在整体柱中添加了羧酸官能团，制备得到了弱阳离子交换色谱整体柱，并且可以利用不同生物样品等电点之间的差异，实现对待测生物样品的快速分离。5、本发明的改性剂采用亚氨基二乙酸钠，其价格低廉，易获取，在水中溶解度高，可以采用高浓度进行改性，有利于提高改性的程度；在发生改性反应时，原有的固定相基体上的每一个环氧官能团所在的位点经过反应后可以得到两个用于离子交换的羧基官能团，可以提高离子交换整体柱中羧基官能团的含量，有利于提高分离能力；改性所需要的pH值较低，不会破坏原有的固定相基体的稳定性。6、本发明在固定相的制备过程中，所采用的材料价格低廉，且制备条件易控制，重现性好。本发明毛细管整体液相色谱柱材料本身与生物样品具有很好的相容性，特别适用于生物大分子样品的分离分析，在蛋白组学的研究中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明的毛细管液相色谱柱结构示意图
图2是粗卵蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶等三种蛋白样品在本发明离子交换毛细管液相色谱柱上分离谱图
图3是粗卵蛋白、纤维素酶、马心细胞色素C等三种蛋白样品在本发明离子交换毛细管液相色谱柱上分离谱图
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细的描述。
实施例一：
本实施例毛细管液相色谱柱(如图1所示)的制备方法包括以下步骤：
1、毛细管柱的预处理：取内径为0.32mm，长为20cm的弹性石英毛细管1，利用真空泵的负压将0.1M氢氧化钠溶液通过毛细管2小时后，用水冲洗毛细管，直到pH为7，将为毛细管体积50倍的丙酮通过毛细管，用氮气吹干2分钟，取30％的γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充满毛细管柱，两端用硅橡胶密封12小时，用丙酮冲洗，氮气吹干待用。
2、离子交换整体柱的制备分两步进行：
(1)将甲基丙烯酸甘油酯、双甲基丙烯酸乙酯按质量比3∶1混合，形成单体混合物，再将致孔剂正丙醇、1，4-丁二醇和水以质量比为4.5∶3.5∶1混合，形成致孔剂混合物，将单体混合物与致孔剂混合物以体积比为2∶3混合在一起，再加入质量为聚合反应单体质量1％的偶氮二异丁腈作为引发剂，超声混合均匀，在混合物中通入氮气2分钟以除去混合物中的空气，之后将聚合物混合溶液装入毛细管中，混合溶液的装入量根据分离不同物质的需要决定(比如分离蛋白质时需要高流速而且分离蛋白质的能力和柱长没有关系，这样固定相的长度就不需要太长，几厘米就可以，分离离子的时候柱长和分离能力有很大关系，这时候就需要将柱子做的长一些)；然后将毛细管两端用硅橡胶密封，放在60℃水浴中加热20小时后取出，用甲醇冲洗毛细管柱，得到毛细管内壁上键合形成有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的整体固定相基体。
(2)利用亚氨基二乙酸钠对获得的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体固定相进行改性，在固定相上键合羧酸基官能团，从而获得了弱酸性阳离子交换整体固定相2。具体方法是用NaOH调节亚氨基二乙酸钠溶液的pH至11，再用泵将该溶液以20μL/min的流速循环流过直接合成好的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，在65℃下反应24小时，反应完成后，用水冲洗整体柱，得到弱酸性阳离子交换整体固定相。
3、检测窗口的制备：将距离固定相2一端10～12cm的毛细管外壁上的聚酰亚胺涂层去掉2～3mm作为利用紫外检测器进行柱上检测的检测窗口3，进而得到本发明弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱。
利用上述色谱柱对蛋白质样品进行测试，其过程如下：取粗卵蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的水溶液200nl，流动相组成为：A＝10mM Na2HPO4-HCl(PH＝7)，B＝A+1M NaCl(PH＝7)，0～1min，0％B；1～3min，5％B；3～5min，10％B；流速为0.5mL/min，在280nm波长下，利用制备好的弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱对样品进行分离，其结果如图2所示。从图2中可以看出，采用本发明色谱柱可以在6分钟内实现对三种蛋白质样品的完全分离。
实施例二：
本实施例毛细管液相色谱柱(如图1所示)的制备方法包括以下步骤：
1、毛细管柱的预处理：同实施例一。
2、离子交换整体柱的制备分两步进行：
(1)将甲基丙烯酸甘油酯、双甲基丙烯酸乙酯按质量比4∶1混合形成单体混合物，再将致孔剂正丙醇、1，4-丁二醇和水以质量比为4∶3∶1混合，形成致孔剂混合物，将单体混合物与致孔剂混合物以体积比为3∶4混合在一起，再加入质量为聚合反应单体质量0.8％的偶氮二异丁腈作为引发剂，超声混合均匀，在混合物中通入氮气2分钟以除去混合物中的空气，之后将聚合物混合溶液装入毛细管中，混合溶液的装入量根据分离不同物质的需要决定，然后将毛细管两端用硅橡胶密封，放在50℃水浴中加热20小时后取出，用甲醇冲洗毛细管柱，得到毛细管内壁上键合形成有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的整体固定相基体。
(2)利用亚氨基二乙酸钠对获得的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体固定相进行改性，在固定相上键合羧酸基官能团，从而获得了弱酸性阳离子交换整体固定相2。具体方法是用NaOH调节亚氨基二乙酸钠溶液的pH至11，再用泵将该溶液以40μL/min的流速循环流过直接合成好的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，在65℃下反应30小时。反应完成后，用水冲洗整体柱，得到弱酸性阳离子交换整体固定相2。
3、检测窗口的制备：同实施例一，得到本发明弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱。。
利用通过以上步骤得到本发明弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱，对蛋白质样品进行测试，其过程如下：取粗卵蛋白、纤维素酶、马心细胞色素C的水溶液200nl，流动相组成为：A＝10mM Na2HPO4-HCl(PH＝7)，B＝A+1M CH3COONa(PH＝7)，0～1min，0％B；1～3min，4％B；3～5min，8％B；流速为0.5mL/min，在280nm波长下，按照常规方法利用制备好的弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱对样品进行分离，其结果如图3所示。从图3中可以看出，采用本发明色谱柱可以在7分钟内实现对三种蛋白质样品的完全分离。
上述各实施例中，聚合形成的整体柱的孔径大小受到聚合时反应温度的影响，温度高时反应速度快，形成的聚合物比较致密，孔径较小；温度低时反应速度慢，形成的聚合物比较疏松，孔径较大；在蛋白分离时，孔径大有利于分离的进行，因此采用的温度一般不宜过高，本发明选择水浴温度在40～80℃之间。另外本发明在试验中采用的改性反应温度为65℃，温度有些变化不应排除在本发明的保护范围之外。
上述各实施例中，单体混合物、致孔剂混合物、引发剂和改性剂使用的成分及配比都是可以变化的，凡根据本发明原理进行的等效变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (9)
1、一种毛细管液相色谱柱，它包括一无需粘接的整根弹性石英毛细管，其特征在于：所述毛细管内的中部设置有由有机聚合物原位聚合形成且经弱酸阳离子改性的整体固定相，所述固定相的下游设置有去掉表面聚酰亚胺涂层的检测窗口。
2、如权利要求1所述的一种毛细管液相色谱柱，其特征在于：所述毛细管的内径为0.05～0.53mm。
3、一种毛细管液相色谱柱的制备方法，它包括以下步骤：
(1)对弹性石英毛细管内壁进行常规预处理；
(2)将单体混合物与致孔剂混合物按体积比2∶2～3混合，加入引发剂，超声混合，通入氮气去除反应混合溶液中的空气；将得到的反应混合溶液通入所述毛细管中，并用硅胶封住其两端，在40～80℃水浴中反应18～24h，用甲醇冲洗毛细管柱，得到整体固定相基体；
(3)用NaOH调节改性试剂的pH至10.5～11.5，用泵将得到的改性剂在65℃下以20～40μL/min的流速流过所述固定相基体16～36h，得到弱酸性阳离子交换整体固定相；
(4)将距离固定相一端10～12cm的毛细管外壁上的聚酰亚胺涂层去掉2～3mm作为检测窗口，得到弱酸性阳离子交换毛细管液相色谱柱。
4、如权利要求3所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述改性试剂为亚氨基二乙酸钠溶液。
5、如权利要求3所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述单体混合物为甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯，其质量比为3～7∶1。
6、如权利要求4所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述单体混合物为甲基丙烯酸丁酯和双甲基丙烯酸乙酯，其质量比为3～7∶1。
7、如权利要求3或4或5或6所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述致孔剂为正丙醇、1，4-丁二醇和水，其质量比为4～5∶3～4∶1。
8、如权利要求3或4或5或6所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为所述单体化合物质量的0.5～1％。
9、如权利要求7所述的一种毛细管液相色谱柱的制备方法，其特征在于：所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量为所述单体化合物质量的0.5～1％。
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