CN102513073A - 一种毛细管固相萃取微柱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种毛细管固相萃取微柱的制备方法，涉及一种微型固相萃取柱。提供一种操作简便，可精确控制柱床长度(小于等于1cm)的毛细管固相萃取微柱的制备方法。将所要填充的颗粒填料加入丙酮中制备成匀浆；将单个二氧化硅多孔微球压入毛细管末端，制备出口柱塞；使用注射器抽取所制得的匀浆，将注射器安装在手动泵上，然后将毛细管柱入口端与注射器相连，使用手动泵驱动匀浆进入毛细管柱完成柱床填充；将填充完的毛细管柱的入口端压入二氧化硅多孔微球作为入口柱塞，即完成毛细管固相萃取微柱的制备。

Description

一种毛细管固相萃取微柱的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微型固相萃取柱，尤其涉及一种毛细管固相萃取微柱的制备方法。
背景技术
固相萃取是一种广泛采用的样品预处理技术，它可以实现样品浓缩、清洗、脱盐等功能，且操作简便，可自动化，是现代分析实验室中必备的技术。该技术的核心是固相萃取柱，即填充有一段色谱填料的柱管。在操作时，粗样品由一端注入，在完成固相萃取过程后，处理好的样品由另一端洗脱出来。目前的固相萃取柱尺寸往往较大，即使最小的柱径也在几个毫米，其处理的样品量通常在毫升级。对于样品量很少的生物或医学样品(微升级)而言，该类常规的固相萃取柱显然无法满足微量分析的要求。
毛细管柱是微柱的一种，多采用内径为50～300μm的弹性石英毛细管填充制备，其微小的柱体积和极低的体积流速能显著降低填料和溶剂消耗，在微量样品的分离分析中具有独特的优势。毛细管填充柱制备的一项关键技术在于其柱塞的制作：柱塞是固定于毛细管内的多孔结构，它可以将填料颗粒固定于柱管内形成色谱柱床。传统的柱塞制备方法有烧结法、原位聚合法以及锥尾法等。烧结法是使用裸硅胶颗粒或硅基质的填料在高温下烧结制备成柱塞。原位聚合法是在柱管内原位聚合多孔整体材料形成柱塞。锥尾法多采用激光微型拉制器将毛细管末端拉制成呈收缩状的锥尾，从而将填料颗粒限制在柱管内，该法主要应用于液相色谱-质谱联用接口装置上。传统的柱塞制备方法普遍存在操作步骤繁琐、柱塞长度难以控制和重现性差等缺点。最重要的是，传统制塞方法难以控制柱塞的长度，如烧结法制得的柱塞长度往往达到几个毫米。因而，基于这些方法无法制备1cm柱长甚至更短的毛细管柱。同时，柱塞的质量还会影响毛细管柱的分析效能，特别是对短柱床的毛细管柱的影响尤为显著。传统制备柱塞方法重现性差也是其难以制备高效的超短柱床的毛细管柱的一个重要原因。
中国专利CN201427050公开一种流动注射在线固相萃取微柱主要由左石英棉、吸附填料、左锥形柱、右锥形柱、右小孔、右石英棉、左小孔组成，左小孔处填有左石英棉，右小孔处填有右石英棉，右锥形柱和左锥形柱以插入式相连，右锥形柱和左锥形柱内填有吸附填料。
发明内容
本发明的目的在于针对传统的制柱工艺难以制备短柱床的毛细管微柱等问题，提供一种操作简便，可精确控制柱床长度(小于等于1cm)的毛细管固相萃取微柱的制备方法。
本发明包括以下步骤：
1)将所要填充的颗粒填料加入丙酮中制备成匀浆；
2)将单个二氧化硅多孔微球压入毛细管末端，制备出口柱塞；
3)使用注射器抽取步骤1)所制得的匀浆，将注射器安装在手动泵上，然后将毛细管柱入口端与注射器相连，使用手动泵驱动匀浆进入毛细管柱完成柱床填充；
4)将填充完的毛细管柱的入口端压入与步骤2)相同的二氧化硅多孔微球作为入口柱塞，即完成毛细管固相萃取微柱的制备。
在步骤1)中，所述将所要填充的颗粒填料加入丙酮中制备成匀浆的具体方法可将所要填充的颗粒填料加入丙酮中，振荡使溶液混合均匀，然后在超声波振荡器中振荡，使填料均匀分布于丙酮中，制成匀浆。
本发明所采取的技术方案是将预先制备的具有贯穿孔的二氧化硅微球置于毛细管中，基于微球与毛细管内壁之间的基石效应使得单个二氧化硅微球可以固定在毛细管内作为柱塞，这种柱塞制备方法操作简便，重现性好，且柱塞的长度仅为单个多孔微球的直径(110μm)。基于这种制塞技术，通过匀浆填充法进行填充，可以获得超短的填充床，柱床长度低至毫米级。
本发明基于单颗粒多孔微球柱塞法可方便地制得填充长度低至毫米级的超短柱床的毛细管微柱，并用于微量样品的固相萃取。其在面向微量样品的纯化、富集等方面有良好的应用前景。
本发明所制备的毛细管固相萃取微柱是一种具有超短柱床的毛细管固相萃取微柱，适用于处理微升级的样品。
附图说明
图1为未经毛细管固相萃取微柱纯化的溶菌酶的酶解产物的电泳分离谱图。由图1可见，由于基体的存在吸收背景较高且样品的分离效果很差。
图2为经毛细管固相萃取微柱纯化的溶菌酶的酶解产物的电泳分离谱图。由图2可见，基体得到有效的脱除，样品得到良好的分离。
图3为未经毛细管固相萃取微柱富集的微量心得安药物样品的电泳分离谱图。由图3可见，由于药物的浓度较低导致检测的信号响应值较小。
图4为经毛细管固相萃取微柱富集后的心得安药物的电泳分离谱图。由图4可见，吸光度值得到较大提升，富集倍数约为10倍。
在图1～4中，横坐标为时间t(min)，纵坐标为强度Abs(mAU)。
具体实施方式
实施例1
超短柱床固相萃取毛细管微柱的制备
1、匀浆制备
称取适量粒径为3μm的C18反相硅胶键合固定相，将所取的填料加入到丙酮中制备成的匀浆，手摇振荡是溶液初步混匀，然后在超声波振荡仪中振荡10min，使填料均匀的分布于丙酮中。
2、制备出口柱塞
截取一段适宜长度的内径100μm，外径365μm的弹性石英毛细管，将毛细管一端置于盛有直径110μm多孔硅胶小球的离心管中，将单颗多孔硅胶小球压入毛细管一端作为出口柱塞，然后切除多余长度的毛细管，保留1cm的柱长。
3、固定相填充
使用体积为1ml的注射器抽取一定体积的匀浆，将注射器安装在手动泵上，然后将毛细管柱入口端与注射器相连，使用手动泵驱动匀浆进入毛细管柱完成柱床填充。
4、制备入口柱塞
将填充完的毛细管并与注射器分离，将其入口端置于盛有直径110μm多孔硅胶小球的离心管中，将单颗多孔硅球压入毛细管作为入口柱塞。
5、将所制备的毛细管固相萃取微柱用于微量蛋白质酶解产物的纯化，并对其纯化结果进行评价。
首先使用适量的1％的ACN/H2O溶液冲洗毛细管柱，将1mg/ml的溶菌酶的酶解产物50μl加到毛细管柱上，然后再使用1％的ACN/H2O溶液冲洗脱去基体，弃掉废液。最后用60％的ACN/H2O溶液50μl将样品洗脱并收集，使用毛细管电泳对纯化前后的样品进行评价。
测试条件：电泳分离所使用毛细管总长32cm，有效长度22cm，背景电解质为25mM磷酸盐缓冲液(pH＝3.0)，分离电压10kV，检测波长为214nm。
图1给出未经毛细管固相萃取微柱纯化的溶菌酶的酶解产物的电泳分离谱图，由于基体的存在吸收背景较高且样品的分离效果很差。图2给出经毛细管固相萃取微柱纯化的溶菌酶的酶解产物的电泳分离谱图，基体得到有效的脱除，样品得到良好的分离。
实施例2
超短柱床固相萃取毛细管微柱的制备
超短毛细管微柱的制备所用填料、柱塞制备方法以及填充方法同实施例一，不同的是填充长度缩短为0.5cm，将所制备的毛细管微柱对微量的药物Propranolol(心得安)样品进行富集，并对富集结果进行评价。
首先使用适量的1％的ACN/H2O溶液冲洗毛细管柱，将含有微量心得安药物的样品溶液500μl加到毛细管柱上，然后再使用1％的ACN/H2O溶液冲洗脱去基体，弃掉废液。最后用60％的ACN/H2O溶液50μl将样品洗脱并收集，使用毛细管电泳对富集前后的样品进行评价。
测试条件：电泳分离所使用毛细管总长32cm，有效长度22cm，背景电解质为25mM磷酸盐缓冲液(pH＝3.0)，分离电压10kV，检测波长为214nm。
图3给出未经毛细管固相萃取微柱富集的微量心得安药物样品的电泳分离谱图，由于药物的浓度较低导致检测的信号响应值较小。图4给出经毛细管固相萃取微柱富集后的心得安药物的电泳分离谱图，吸光度值得到较大提升，富集倍数约为10倍。

Claims (2)

1.一种毛细管固相萃取微柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将所要填充的颗粒填料加入丙酮中制备成匀浆；
2)将单个二氧化硅多孔微球压入毛细管末端，制备出口柱塞；
3)使用注射器抽取步骤1)所制得的匀浆，将注射器安装在手动泵上，然后将毛细管柱入口端与注射器相连，使用手动泵驱动匀浆进入毛细管柱完成柱床填充；
4)将填充完的毛细管柱的入口端压入与步骤2)相同的二氧化硅多孔微球作为入口柱塞，即完成毛细管固相萃取微柱的制备。
2.如权利要求1所述的一种毛细管固相萃取微柱的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述将所要填充的颗粒填料加入丙酮中制备成匀浆的具体方法是将所要填充的颗粒填料加入丙酮中，振荡使溶液混合均匀，然后在超声波振荡器中振荡，使填料均匀分布于丙酮中，制成匀浆。
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