CN102680557A - 一种用于固相萃取-毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法，具体为采用商品化的具有特征粒径尺寸和孔隙度的二氧化硅微球置于毛细管内，微球粒径要略大于毛细管的内径，基于二氧化硅微球与毛细管内壁的基石效应这种纯物理作用使得单个微球可以固定于毛细管孔道内充当柱塞，将固相萃取的填充材料固定于毛细管的一端。该制备方法简便、快速、高重现，可以精确的控制柱长的长度，解决了传统的烧结法和原位聚合法制备柱塞的操作过程繁琐、可控性差，难以在毛细管柱的末端获得特定长度的填充床等问题，在痕量样品以及复杂基体样品的分离分析方面有较好的应用前景。

Description

一种用于固相萃取-毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种毛细管微柱的制备方法，尤其涉及一种用于固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法。 

【背景技术】

固相萃取（SPE）是一种基于色谱分离的重要的样品前处理方法。在样品处理过程中，液体样品在一定的外力作用下通过装有固体吸附剂的固相萃取装置，由于固体吸附剂具有不同的官能团，特定的化合物会被吸附并保留在SPE柱上，从而实现对目标化合物的分离纯化、浓缩、溶剂转换等功能。目前，固相萃取技术已经在环境保护分析、食品分析、司法鉴定、药物分析、生命科学等领域得到了广泛的应用。毛细管电泳（CE）是一种快速、高效、低消耗的液相分离技术，尤其适合于生物样品中带电分子的分离。然而，毛细管电泳较小的进样体积（1－100nL）和较短的光程（25－100μm）导致其灵敏度相对较低，限制了其在生化分析中的应用范围。将固相萃取技术与毛细管电泳结合可以充分发挥两种技术的优势：固相萃取前处理后可以脱除样品基体并对样品进行富集，降低基体效应并提高毛细管电泳分析的灵敏度，降低其检出限；经前处理后的复杂样品可以得到毛细管电泳快速、高效的分离分析。 

固相萃取与毛细管电泳联用主要有离线和在线联用两种模式。离线联用操作繁琐、耗时且重现性较差，而在线联用由于其易实现自动化操作，较低的死体积和较少的溶剂消耗等优点被广泛采用。固相萃取与毛细管电泳在线联用所使用的固相萃取柱主要有带有涂层的开管毛细管萃取柱、填充床固相萃取柱以及聚合整体柱床的固相萃取柱等。其中，填充床固相萃取柱因为其可选择的填充材料种类多、方法强健以及相对较大的柱容量而最为常见。填充床固相萃取－毛细管电泳在线联用所使用的毛细管微柱类似于毛细管电色谱柱，所不同的是这种微柱只在柱子的一端填充一定长度的填充材料用于复杂样品的前处理，剩余部分为毛细管电泳的分离通道用于对复杂的混合物进行分离分析。填充床固相萃取－毛细管电泳在线联用所使用的毛细管微柱制备的关键技术在于如何在毛细管微柱的一端固定一定长度的固相萃取填料，现有的文献中主要有两种解决方案。其一是基于传统的烧结法制备入口柱塞和出口柱塞将萃取填料固定在毛细管内，烧结法是使用裸硅胶颗粒或硅基质的填料在高温下烧结制备成多孔的柱塞，这种柱塞的制备方法需要在高温下操作容易造成填充材料表面官能团性质的改变，不适用于聚合物基质的填充填料，与此同时高温操作使毛细管表面涂层灰化脱落，毛细管柱的强健性降低。除此之外，烧结法制备的柱塞重现性差、成功率低，诸多的缺陷限制 了其大规模用于制备固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱。其二是使用原位聚合法在毛细管内原位聚合多孔的整体材料将填料固定在毛细管内，这种方法需要通过较为复杂的化学反应来实现，操作繁琐且重现性差，这种方法比较适合于制备出口柱塞而难以用于制备入口柱塞，这些缺陷也同样限制了其在制备固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱中的应用。如何快速、有效的在毛细管柱末端固定特定长度的填充床一直是制备固相萃取－毛细管电泳微柱的一个技术瓶颈。 

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是：提供一种简便、快速、高重现地制备填充床固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法。 

为实现上述目的，本发明提供的制备方法为，采取的技术方案是采用商品化的具有特征粒径尺寸和孔隙度的二氧化硅微球置于毛细管内，微球粒径要略大于毛细管的内径，基于二氧化硅微球与毛细管内壁的基石效应这种纯物理作用使得单个微球可以固定于毛细管孔道内充当柱塞，将固相萃取的填充材料固定于毛细管的一端。 

制备步骤具体为： 

匀浆的制备：将所要填充的固相萃取填料加入适当的溶剂中制备成匀浆，振荡使溶液初步混合均匀，然后在超声波振荡器中振荡，使填料能均匀分布于溶剂中；本发明适用的固相萃取填料为无机基质和有机聚合物基质的色谱填料。制备匀浆所采用的试剂通常为密度和黏度较大的有机溶剂。如二氧六环、环己烷、四氯化碳等； 

出口柱塞的制备：截取所需长度的毛细管1，将商品化的单个二氧化硅多孔微球压入毛细管一端，然后使用细外径的毛细管2将微球推至适当的位置作为出口柱塞；其中单个二氧化硅多空微球的外径略大于毛细管1的内径，细外径的毛细管2的外径小于毛细管1的内径。毛细管1适用于25－100μm内径的弹性石英毛细管。在具体的实施例中，毛细管1的内径为100μm，多孔硅胶小球的直径110μm，毛细管2的外径为90μm。其中毛细管1为弹性石英毛细管，毛细管2为石英毛细管。 

柱床填充：通过一定的外力（压力、重力、离心力等）驱使匀浆通过毛细管柱，溶剂被多孔的二氧化硅微球滤过而填充材料会被微球所充当的柱塞固定在毛细管内以获得一定长度的填充床；填充床长度可低至1mm，上至几十个厘米。本发明所适用的填充模式为高压填充、离心填充和重力填充。 

入口柱塞的制备：将填充完的毛细管柱的入口端压入一个同样的二氧化硅多孔微球作为入口柱塞，通过两个柱塞可以将固相萃取填充材料限制在毛细管的一端完成固相萃取-毛细 管电泳在线联用微柱的制备。本发明采用单个二氧化硅多孔微球作为柱塞。 

制备匀浆中所采用的试剂为密度和黏度较大的有机溶剂，如二氧六环、环己烷、四氯化碳；柱床填充中匀浆通过高压、离心和重力通过毛细管柱；填充床的长度1mm至几十个厘米。 

图1即是在线固相萃取－毛细管电泳微柱结构原理图。 

本发明的制备方法解决了传统的烧结法和原位聚合法制备柱塞的操作过程繁琐、可控性差，难以在毛细管柱的末端获得特定长度的填充床等问题。 

本发明的制备方法操作简便，所制备的填充床重现性好并且可以精确地控制填充床的长度。 

本发明的制备方法基于单颗粒多孔微球柱塞法可简便、快速、高重现地制备填充床固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱并且可以精确的控制柱长的长度。 

本发明的实施例提供了固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱用于微量蛋白质酶解产物的分离分析，将未经固相萃取样品前处理和经过固相萃取样品前处理的牛血清白蛋白酶解产物的电泳分离谱图进行对比，可以看出未经过富集处理的样品的响应值较低，且有很大一部分的组分被背景所掩盖，而通过固相萃取前处理的样品的响应值较高，一些含量较低的组分也有较高的响应值，复杂的混合样品也得到电泳的有效的分离。 

本发明的另外一个实施例提供了固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱用于微量的药物心得安样品的分离分析，将未经固相萃取样品前处理和经过固相萃取样品前处理的药物心得安样品的电泳分离谱图进行对比，可以看出未经毛细管固相萃取微柱富集的微量心得安药物样品的电泳分离谱图，由于药物的浓度较低导致检测的信号响应值较小。而经毛细管固相萃取微柱富集后的心得安药物的电泳分离谱图，吸光度值得到较大提升，富集倍数约为10倍。 

本发明的固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管柱在痕量样品以及复杂基体样品的分离分析方面有较好的应用前景。 

【附图说明】

图1为在线固相萃取－毛细管电泳微柱结构原理图。 

图2为未经固相萃取样品前处理(CE)和经过固相萃取样品前处理(SPE-CE)的牛血清白蛋白酶解产物的电泳分离谱图。 

图3为未经毛细管固相萃取微柱富集的微量心得安药物样品的电泳分离谱图。 

图4为经毛细管固相萃取微柱富集后的心得安药物的电泳分离谱图。 

【具体实施方式】

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 

实施例1：填充床固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备 

1、匀浆制备： 

称取质量为10mg，粒径为3μm的C18反相硅胶键合固定相(Waters公司)，将所取的填料加入到1mL丙酮中制备成匀浆，手摇振荡使溶液初步混匀，然后在超声波振荡仪中振荡10min，使填料均匀的分布于丙酮中。 

2、制备出口柱塞 

截取内径100μm，外径365μm的弹性石英毛细管30cm（河北永年锐沣色谱器件有限公司，YN-100365），,将毛细管一端置于盛有直径110μm的多孔二氧化硅微球（英国X-tec公司）的离心管中，将单颗多孔二氧化硅微球压入毛细管一端，然后使用外径为90μm的石英毛细管（河北永年锐沣色谱器件有限公司）将多孔微球推至毛细管内距末端2mm处，预留的2mm柱管用于填充长度为2mm的填充床。 

3、柱床的填充 

使用体积为1ml的注射器抽取一定体积的匀浆，将注射器安装在手动泵上，然后将毛细管柱入口端与注射器相连，使用手动泵驱动匀浆进入毛细管柱完成柱床填充。 

4、制备入口柱塞 

将填充完的毛细管并与注射器分离，将其入口端置于盛有直径110μm多孔硅胶小球的离心管中，将单颗多孔硅球压入毛细管作为入口柱塞。通过入口柱塞和出口柱塞将长度为2mm的填充床固定在毛细管的末端。 

实施例2：固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱用于微量蛋白质酶解产物的分离分析 

实施例1制备的毛细管柱装在毛细管电泳仪上(Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪)，使用水、甲醇、水分别冲洗柱子1min，然后使用缓冲液（乙酸铵50mM，pH 3.5）平衡3min。使用10psi压力驱使痕量的牛血清白蛋白的酶解液（牛血清白蛋白和胰蛋白酶均购买于Sigma-Aldrich公司，以牛血清白蛋白与胰蛋白酶质量比为50∶1的比例进行酶解）通过萃取柱， 进样时间为1min，进样体积约为60μL。然后使用缓冲溶液冲洗柱床2min，脱去基体。使用体积比为60：40的甲醇－乙酸铵缓冲液对样品进行洗脱，洗脱压力为2psi，洗脱时间为10s。经洗脱的样品最后在10kV的电压下进行毛细管电泳的分离，电泳分离毛细管有效长度为22cm，检测波长为214nm。 

图2为未经固相萃取样品前处理和经过固相萃取样品前处理的牛血清白蛋白酶解产物的电泳分离谱图，通过对比可以看出未经过富集处理的样品的响应值较低，且有很大一部分的组分被背景所掩盖，而通过固相萃取前处理的样品的响应值较高，一些含量较低的组分也有较高的响应值，复杂的混合样品也得到电泳的有效的分离。 

实施例3：固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱用于对微量的药物心得安样品（Propranolol）进行富集 

实施例1制备的毛细管柱装在毛细管电泳仪上(Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪)，使用水、甲醇、水分别冲洗柱子1min，然后使用缓冲液（乙酸铵50mM，pH 3.5）平衡3min。使用10psi压力驱使质量浓度约为1ng/ml的心得安样品（汕头金石制药总厂，B1420202380）通过萃取柱，进样时间为0.5min，进样体积约为30μL。然后使用缓冲溶液冲洗柱床2min，脱去基体。使用体积比为60∶40的甲醇－乙酸铵缓冲液对样品进行洗脱，洗脱压力为2psi，洗脱时间为10s。经洗脱的样品最后在10kV的电压下进行毛细管电泳的分离，电泳分离毛细管有效长度为22cm，检测波长为214nm。 

图3为未经毛细管固相萃取微柱富集的微量心得安药物样品的电泳分离谱图，由于药物的浓度较低导致检测的信号响应值较小。图4为经毛细管固相萃取微柱富集后的心得安药物的电泳分离谱图，吸光度值得到较大提升，富集倍数约为10倍。 

Claims (6)

1.一种用于固相萃取－毛细管电泳在线联用的毛细管微柱的制备方法，所述制备方法步骤如下：

匀浆的制备：将所要填充的固相萃取填料加入适当的溶剂中制备成匀浆，振荡使溶液初步混合均匀，然后在超声波振荡器中振荡，使填料能均匀分布于溶剂中；

出口柱塞的制备：截取所需长度的毛细管1，将单个二氧化硅多孔微球压入毛细管一端，然后使用细外径的毛细管2将微球推至毛细管1内适当的位置作为出口柱塞；

柱床填充：通过一定的外力驱使匀浆通过毛细管1，溶剂被多孔的二氧化硅微球滤过而填料会被微球所充当的柱塞固定在毛细管1内以获得一定长度的填充床；

入口柱塞的制备：将填充完的毛细管柱的入口端压入一个同样的二氧化硅多孔微球作为入口柱塞，通过两个柱塞可以将固相萃取填充材料限制在毛细管1的一端。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：出口柱塞的制备中，充当柱塞的二氧化硅多孔微球的直径略大于所填充毛细管1的内径。

3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于：出口柱塞的制备中，细外径的毛细管2的外径小于毛细管1的内径。

4.权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：出口柱塞的制备中，毛细管1为弹性石英毛细管，毛细管2为石英毛细管。

5.权利要求4所述的制备方法，其特征在于：毛细管1为25-100μm内径的弹性石英毛细管。

6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：本发明的固相萃取填料为无机基质和有机聚合物基质的色谱填料；制备匀浆所采用的试剂为密度和黏度较大的有机溶剂，如二氧六环、环己烷、四氯化碳；柱床填充中匀浆通过高压、离心和重力通过毛细管柱；填充床的长度为1mm至几十个厘米。

Images