CN103558320B - 硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统。本发明的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统，包括硼酸亲和整体柱固相微萃取单元、高压液相色谱泵、高压六通切换阀、高压六通进样阀、定量环、进样针、废液瓶、色谱柱和荧光检测器等，通过硼酸亲和整体柱固相微萃取单元和高效液相色谱联用，实现对复杂样品中的单胺类神经递质萃取、净化、解吸和分析检测的全过程在线。本发明结合了硼酸亲和材料对顺式二羟基化合物的高选择性、高富集能力，硼酸亲和整体柱的高稳定性、良好通透性和高效液相色谱的高效分离能力，提高了分析的灵敏度、自动化程度并缩短了分析时间，可有效用于生物样品中痕量单胺类神经递质的分析检测。

Description

硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统

技术领域

本发明属于分析化学样品前处理领域，具体涉及一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统、联用方法及其应用，适用于复杂样品中痕量单胺类神经递质的在线预处理、萃取、解吸、分离和检测。

背景技术

单胺类神经递质及其代谢产物在人体的神经、心血管和内分泌等组织系统中起着广泛的调节作用，对情绪、情感、应激行为和睡眠觉醒等生理活动具有重要影响。MNTs含量的变化与人类多种疾病密切相关，是诊断嗜铬细胞瘤、阿尔茨海默氏症、唐氏综合征、抑郁症和帕金森等疾病的重要依据，其含量的准确测定对于疾病诊断与控制、药物开发与研究和神经学基础研究等具有重要意义。

生物样品中单胺类神经递质的含量低，且单胺类神经递质本身荧光响应和质谱响应信号不强，而生物样本基体复杂，内源干扰物质多，因此其分析检测存在极大的困难。选择快速高效的样品前处理方法，是建立高灵敏单胺类神经递质分析方法的关键，也是当前的瓶颈所在。目前单胺类神经递质的样品前处理方法通常以离线的方式进行，具体操作繁琐冗长，人为误差大，影响了分析检测的灵敏度和重现性。在线样品前处理技术不仅可以有效解决离线技术操作耗时的缺点，还可实现大体积进样，极大地提高分析检测的灵敏度，同时自动化操作可减少人为误差，提高分析方法的准确度和精密度。

硼酸亲和材料是利用硼酸基团的特异性反应对顺式二羟基化合物进行分离、富集和纯化的新型材料。由于单胺类神经递质中去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺均含有顺式二羟基结构，因此硼酸亲和材料可以实现对单胺类神经递质的选择性萃取。

整体柱是通过反应试剂原位聚合而得到的棒状整体，具有高容量、良好渗透性和低传质阻力的特点，是在线样品前处理技术中的重要萃取材料之一。硼酸亲和整体柱兼具硼酸亲和材料与整体柱的优点，具有快速、高效和高选择性的特点，可以很好地满足生物样品前处理的要求。目前，尚无以硼酸整体柱为萃取单元，与高效液相色谱联用，在线同时分析四种单胺类神经递质的相关报道。

发明内容

本发明旨在针对生物样品中单胺类神经递质的含量低，且单胺类神经递质本身荧光响应和质谱响应信号不强，而生物样本基体复杂，内源干扰物质多，导致其分析检测存在极大的困难的问题，设计一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统，结合硼酸亲和整体柱的高选择性、高富集能力，以及高效液相色谱的高分离能力，达到去除生物样品中的杂质，选择性富集痕量单胺类神经递质，最终实现快速、准确定量的目的。

本发明的第二个目的是提供一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线分析生物样品中单胺类神经递质的方法。

本发明的第三个目的是提供一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统在检测生物样品中单胺类神经递质方面的应用。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，其特征在于，包括固相微萃取单元、第一高压液相泵、第二高压液相泵、高压六通进样阀、高压六通切换阀、定量环、进样针、废液瓶、色谱柱和荧光检测器，所述固相微萃取单元是硼酸亲和整体柱，所述硼酸亲和整体柱的一端与高压六通进样阀连接，另一端与高压六通切换阀连接；第一高压液相泵的输出端与高压六通进样阀连接，定量环的两端连接于高压六通进样阀上；所述废液瓶与高压六通切换阀连接，第二高压液相泵的输出端与高压六通切换阀连接，色谱柱的一端与高压六通切换阀连接，另一端连接于荧光检测器；所述的高压六通进样阀和所述高压六通切换阀都包括两个状态，分别是载样档和进样档，当所述高压六通进样阀位于进样档状态时，所述第一高压液相泵、定量环与所述硼酸亲和整体柱相连通；当所述高压六通进样阀位于载样档状态时，所述定量环与所述硼酸亲和整体柱相隔离，所述第一高压液相泵与所述硼酸亲和整体柱相连通；当所述高压六通切换阀位于进样档状态时，所述硼酸亲和整体柱与所述的色谱柱相连通；当所述高压六通切换阀位于载样档状态时，所述硼酸亲和整体柱与所述的色谱柱相隔离，所述第二高压液相泵与所述色谱柱相连通。

进一步地，所述硼酸亲和整体柱由以下步骤的制备方法得到：第一，将不锈钢毛细柱浸泡于盐酸溶液中1小时后，用超纯水清洗，干燥备用；第二，将正丙醇和1,4-丁二醇混合作为溶剂和致孔剂，然后加入4-乙烯基苯硼酸、甲叉双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈，超声脱气，通氮气除氧，最后将混合溶液注入经第一步处理后的不锈钢毛细管柱，用硅橡胶堵住毛细管柱两端后进行热引发聚合反应；第三，将第二步合成的硼酸亲和整体柱连接到一个高压液相泵上，用甲醇冲洗整体柱，除去致孔剂和未反应溶剂。

进一步地，所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，其特征在于：还包括装有携带液的携带液试剂瓶和装有液相色谱流动相的流动相试剂瓶，所述携带液试剂瓶与第一高压液相泵的输入端连接，所述流动相试剂瓶与第二高压液相泵的输入端连接。

进一步地，所述流动相试剂瓶有两个，分别用于容纳液相色谱流动相溶质和液相色谱流动相溶剂。

所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统的联用方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，使所述高压六通进样阀位于载样档状态，且所述高压六通切换阀位于载样档状态，且用进样针将样品溶液打入定量环中，开启第一高压液相泵和第二高压液相泵，所述第一高压液相泵驱动携带液平衡硼酸亲和整体柱，第二高压液相泵驱动液相色谱流动相平衡色谱柱；

第二步，使所述高压六通进样阀位于进样档状态，且所述高压六通切换阀仍位于载样档状态，携带液将定量环中的样品溶液输送至硼酸亲和整体柱进行固相微萃取；

第三步，使所述高压六通进样阀位于载样档状态，且所述高压六通切换阀仍位于载样档状态，携带液将硼酸亲和整体柱中多余的样品溶液除去送入废液瓶，净化整体柱，同时用进样针向定量环中注入洗脱溶剂；

第四步，暂停所述第二高压液相泵，且使所述高压六通进样阀位于进样档状态，所述高压六通切换阀切换为进样档状态，携带液将洗脱溶剂从定量环输送至硼酸亲和整体柱，将目标分析物从整体柱中解吸下来进入色谱柱柱头；

第五步，使所述高压六通切换阀切换为载样档状态，并开启所述第二高压液相泵，运行梯度洗脱程序，进行梯度分析检测。

所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统可应用于检测生物样品中单胺类神经递质。

借由上述技术方案，本发明硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统、联用方法，及其在分析生物样品中单胺类神经递质方面的应用，优势在于：

（1）硼酸亲和整体柱可对单胺类神经递质进行选择性萃取，有效除去其他内源性物质的对检测的干扰；

（2）在线操作，可实现大体积进样，将全部解吸液注入色谱中，极大地提高了检测灵敏；

（3）集萃取、净化、解吸和分离于一体，减少了手工操作，简化了样品前处理过程，提高了分析的准确度和精密度；

（4）系统简单，易于实现，只需在高效液相色谱仪器的基础上添加高压六通阀（高压六通进样阀和高压六通切换阀），定量环和固相微萃取单元。

附图说明

图1为本发明提供的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统装置图，其中：1：第一高压液相泵；2：携带液试剂瓶；3：定量环；4：高压六通进样阀；5：硼酸亲和整体柱；6：高压六通切换阀；7：废液瓶；8：进样针；9：第二高压液相泵；10：流动相试剂瓶；11：色谱柱；12：荧光检测器。

图2为硼酸亲和整体柱对四种单胺类神经递质富集量的比较。

图3为含有四种单胺类神经递质的混合标准溶液和尿样的液相色谱图。其中：1：去甲肾上腺素；2：肾上腺素；3：多巴胺；4:5-羟色胺；a：2mg/L混合标准溶液（上述四种单胺类神经递质的浓度均为2mg/L）直接进样所得色谱图；b：尿液样品直接进样所得色谱图；c：尿液样品经硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统所得色谱图；d：加标浓度为10μg/L的尿液样品经硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统所得色谱图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明以达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例和附图，对本发明硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线分析生物样品中单胺类神经递质的特征及其具体实施方式，详细说明如下。

如图1所示，为本发明提供的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统装置图。将高压六通进样阀4和高压六通切换阀6按实线的连通状态记为载样档（Load），按虚线的连通状态记为进样档（Inject）。

在第一高压液相泵1的驱动下，位于携带液试剂瓶2内的携带液经高压六通进样阀4上的定量环3，将环中溶液（样品溶液、洗脱溶剂或净化溶液）输送到硼酸亲和整体柱5中，进行萃取、洗脱或净化的操作。在第二高压液相泵9的驱动下，位于流动相试剂瓶10内的液相色谱流动相经高压六通切换阀6，进入色谱柱11和检测器12进行分析检测。

应用实例：采用硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统在线分析尿样中的单胺类神经递质

主要仪器与试剂：LC-20A高效液相色谱仪，RF-10AXL荧光检测器，WatersT3色谱柱(150mm×4.60mmI.D.,5μm)；四种单胺类神经递质（去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺）标准溶液；初始流动相为5%乙腈，进样后保持1min，然后在14min内提高至30%，最后30%保持5min。流速1.0mL/min。

硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统如图1所示，操作步骤及相应阀的位置如表1所示，每步具体操作如下：1）6mL待测液通过进样针8注入高压六通进样阀4的定量环3，开启第一高压液相泵1和第二高压液相泵9，携带液（超纯水）平衡硼酸亲和整体柱，5%乙腈平衡色谱柱11；2）在第一高压液相泵1的驱动下，携带液以1.0mL/min的流速将样品从定量环3中推入硼酸亲和整体柱5进行萃取，萃取后溶液经高压六通切换阀6进入废液瓶7中；3）第一高压液相泵1将携带液泵入硼酸亲和整体柱5净化，同时洗脱溶剂（0.5%甲酸水溶液）通过进样针8注入高压六通进样阀4的定量环3；4）暂停第二高压液相泵9，在第一高压液相泵1的驱动下，携带液以1.0mL/min的流速将洗脱溶剂从定量环3中推入硼酸亲和整体柱5进行解吸，洗脱溶剂全部进入色谱柱11的柱头；5）开启第二高压液相泵9，运行液相色谱梯度洗脱程序，进行梯度分离检测。

表1硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统的分析步骤及相应阀的状态

本应用实例中的四种单胺类神经递质分别为去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺5-羟色胺，去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺三种物质结构中均含有顺式二羟基，而5-羟色胺则不含顺式二羟基基团。图2为硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统对四种单胺类神经递质富集量的比较（萃取10μg/L混合标准溶液3mL），可以看出硼酸亲和整体柱对5-羟色胺的萃取量明显小于其他三种物质，表明了所合成的硼酸亲和整体柱对含有顺式二羟基的物质有较高的选择性。

图3为含有四种单胺类神经递质的混合标准溶液和尿样的液相色谱图。可以看出尿样直接进样（b）只能检测到1个分析物，而尿样经硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统在线分析后（c），4个目标分析物均可检测到；通过（b）与（c）相比较，可看出本方法能明显提高分析灵敏度，（c）与（d）相比较，说明了本方法有较好的回收率。在线联用分析方法分析四种单胺类神经递质，检出限不高于3.0μg/L，在3.0μg/L-50μg/L之间线性良好，日内RSD小于5.2%，日间RSD小于8.95%,回收率介于81.0%-105.5%之间，说明硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱联用系统灵敏、稳定和可靠。

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，其特征在于，包括固相微萃取单元、第一高压液相泵、第二高压液相泵、高压六通进样阀、高压六通切换阀、定量环、进样针、废液瓶、色谱柱和荧光检测器，所述固相微萃取单元是硼酸亲和整体柱，

所述硼酸亲和整体柱由以下步骤的制备方法得到：第一，将不锈钢毛细柱浸泡于盐酸溶液中1小时后，用超纯水清洗，干燥备用；第二，将正丙醇和1,4-丁二醇混合作为溶剂和致孔剂，然后加入4-乙烯基苯硼酸、甲叉双丙烯酰胺和偶氮二异丁腈，超声脱气，通氮气除氧，最后将混合溶液注入经第一步处理后的不锈钢毛细管柱，用硅橡胶堵住毛细管柱两端后进行热引发聚合反应；第三，将第二步合成的硼酸亲和整体柱连接到一个高压液相泵上，用甲醇冲洗整体柱，除去致孔剂和未反应溶剂，

所述硼酸亲和整体柱的一端与高压六通进样阀连接，另一端与高压六通切换阀连接；第一高压液相泵的输出端与高压六通进样阀连接，定量环的两端连接于高压六通进样阀上；所述废液瓶与高压六通切换阀连接，第二高压液相泵的输出端与高压六通切换阀连接，色谱柱的一端与高压六通切换阀连接，另一端连接于荧光检测器；所述的高压六通进样阀和所述高压六通切换阀都包括两个状态，分别是载样档和进样档，当所述高压六通进样阀位于进样档状态时，所述第一高压液相泵、定量环、所硼酸亲和整体柱相连通；当所述高压六通进样阀位于载样档状态时，所述定量环与所述硼酸亲和整体柱相隔离，所述第一高压液相泵与所述硼酸亲和整体柱相连通；当所述高压六通切换阀位于进样档状态时，所述硼酸亲和整体柱与所述的色谱柱相连通；当所述高压六通切换阀位于载样档状态时，所述硼酸亲和整体柱与所述的色谱柱相隔离，所述第二高压液相泵与所述色谱柱相连通。

2.根据权利要求1所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，其特征在于：还包括装有携带液的携带液试剂瓶和装有液相色谱流动相的流动相试剂瓶，所述携带液试剂瓶与第一高压液相泵的输入端连接，所述流动相试剂瓶与第二高压液相泵的输入端连接。

3.根据权利要求2所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，其特征在于，所述流动相试剂瓶有两个，分别用于容纳液相色谱流动相溶质和液相色谱流动相溶剂。

4.根据权利要求1所述的硼酸亲和整体柱固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统的联用方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，使所述高压六通进样阀位于载样档状态，且所述高压六通切换阀位于载样档状态，且用进样针将样品溶液打入定量环中，开启第一高压液相泵和第二高压液相泵，所述第一高压液相泵驱动携带液平衡硼酸亲和整体柱，第二高压液相泵驱动液相色谱流动相平衡色谱柱；

第二步，使所述高压六通进样阀位于进样档状态，且所述高压六通切换阀仍位于载样档状态，携带液将定量环中的样品溶液输送至硼酸亲和整体柱进行固相微萃取；

第三步，使所述高压六通进样阀位于载样档状态，且所述高压六通切换阀仍位于载样档状态，携带液将硼酸亲和整体柱中多余的样品溶液除去送入废液瓶，净化整体柱，同时用进样针向定量环中注入洗脱溶剂；

第四步，暂停所述第二高压液相泵，且使所述高压六通进样阀位于进样档状态，所述高压六通切换阀切换为进样档状态，携带液将洗脱溶剂从定量环输送至硼酸亲和整体柱，将目标分析物从整体柱中解吸下来进入色谱柱柱头；

第五步，使所述高压六通切换阀切换为载样档状态，并开启所述第二高压液相泵，运行梯度洗脱程序，进行梯度分析检测。