CN108732271B - 三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法。本发明是以羟基磷灰石功能化整体柱作为在线固相萃取整体柱，结合在线固相萃取‑高效液相色谱联用系统，建立三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测新方法。本发明利用整体柱中羟基磷灰石颗粒与磷酸基团之间的静电相互作用实现对三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线富集与净化。本发明方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广，可实现三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的高效富集和净化，并满足三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的高灵敏检测要求。

Description

三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法。

背景技术

三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)是一切生物体新陈代谢的能量源泉，普遍存在于一切生物细胞体内，为细胞内各种需能过程提供能量，是细胞生存的必须因素。当生命体存活时，其可通过氧化体内各种有机化合物来补充能量，因此其ATP含量相对稳定。当生命体死亡后，由于其体内氧的来源中断，ATP的来源则通过磷酸肌酸以及酶解等方式进行补充；当这些物质也耗尽时，ATP的含量就开始下降。其后ATP的降解顺序为；ATP -ADP(二磷酸腺苷) - AMP(单磷酸腺苷) - IMP(单磷酸肌苷) - HxR(肌苷) - Hx(次黄嘌呤)。通过评价生鲜食品中ATP及其降解过程中的这些代谢产物含量变化，可以从一个侧面实现相关产品新鲜度的评价。

目前，三磷酸腺苷及其代谢产物的常见的的检测方法主要有液相色谱法、电泳法、层析法等，但现有方法大都存在着操作时间长或精度低等问题。在线固相萃取（Onlinesolid phase extraction, Online SPE）是一种新兴的样品前处理方法，具有简便、快速、高效、有机溶剂消耗量低、易与其他仪器联用等优点，在分析化学领域受到了广泛的关注。SPE的萃取原理是基于样品组分与固定相之间的分配平衡，因此开发新型高选择性SPE固定相始终是SPE方法的核心。据文献报道，羟基磷灰石与磷酸基团有着很强的相互作用。由此启发，本发明将羟基磷灰石纳米材料与SPE技术相结合，制备了羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱，并基于该整体柱，结合在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统，发展一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取新方法，实现三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的高效富集，满足三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的高效检测要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测新方法。本发明是以羟基磷灰石功能化整体柱作为固相萃取整体柱，结合在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统，建立三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测新方法。得益于负载的羟基磷灰石纳米颗粒与磷酸基团之间强烈的静电吸附作用，该在线检测方法可实现三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、单磷酸肌苷）的在线富集与净化；可满足对三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的高灵敏检测要求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测新方法，其是以羟基磷灰石功能化整体柱作为在线固相萃取介质，结合在线固相萃取-高效液相色谱（OnlineSPE-HPLC）联用系统得以建立；具体包括以下步骤：

（1）羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱的制备：

所述的羟基磷灰石功能化整体柱是基于脲醛树脂整体柱的制备工艺改进制备的，即将羟基磷灰石纳米颗粒、聚乙二醇、尿素溶液、甲醛溶液在催化剂溶液作用下原位脱水缩聚制备羟基磷灰石功能化整体柱；

按质量百分数之和为100%计，各组分占整体柱制备配方组成总质量的百分比为：羟基磷灰石纳米颗粒1.7~5%、聚乙二醇3.5~13.4%、尿素溶液33~35%、甲醛溶液41~44%、催化剂8.3~9.1%。

所述羟基磷灰石纳米颗粒的粒径为200 nm；

所述聚乙二醇的平均分子量为6000；

所述尿素的水溶液，其浓度为1 g/mL；

所述甲醛的水溶液，其中甲醛的质量浓度为33%~37%；

所述催化剂为磷酸的水溶液，其浓度为1.8 mol/L；

所用的整体柱柱管为管长30 mm，内径2.1 mm的不锈钢管。

（2）在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统的构建：

所述的Online SPE-HPLC联用系统结构如附图1所示，包括十通阀、六通阀、固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、定量环A、定量环B、液相色谱分析柱以及检测器，所述六通阀的阀芯设置有进样口，六通阀的端口2与液相色谱输液泵A的输出端相连，六通阀的端口1和端口4分别与定量环A的两端相连，六通阀的端口3和十通阀的端口1相连，所述十通阀的端口2和端口7分别与固相萃取柱的两端相连，十通阀的端口4与液相色谱输液泵B的输出端相连，十通阀的端口5和端口8分别与定量环B的两端相连，十通阀的端口9与液相色谱分析柱的输入端相连，所述液相色谱分析柱的输出端与检测器相连；

所述六通阀的端口5和端口6以及十通阀的端口6分别外接流出的废液管；

所述十通阀的端口3和端口10通过管路直接连接；

（3）三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取与高灵敏检测：

a平衡：六通阀102与十通阀101都处于Load位置，装载液通过液相色谱输液泵A104平衡羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，流速为0.1 mL/min；流动相通过液相色谱输液泵B105直接经液相色谱分析柱108以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5 mL用于装载样品的定量环A106；

b在线富集：将六通阀102调至Inject位置，在线固相萃取开始，定量环A106中的样品经由装载液带入羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，经过5分钟时间，再将六通阀102调回Load位置，装载液继续冲洗羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液，并降低其干扰；

c在线洗脱：六通阀102和十通阀101都处于Load位置；然后，将液相色谱输液泵A104的输送液由装载液换成洗脱液，利用洗脱液将固相萃取整体柱上富集的分析对象洗脱；洗脱流速设为0.1 mL/min，在0.2 mL PEEK管定量环A106内收集第4至第6分钟的洗脱液；

d检测：洗脱液收集完成时，十通阀101调节至Inject位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱108进行分离，再利用二极管阵列检测器109进行检测。

本发明的显著优点在于：

1）实际生物样品中通常存在着大量的对分析对象检测造成干扰的杂质，本发明利用羟基磷灰石功能化整体柱中的羟基磷灰石纳米颗粒与磷酸基团的静电相互作用实现对三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的选择性富集，实现检测样品的净化和分析对象的富集，同时也满足了高灵敏检测的要求。

2）本发明方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广。

附图说明

图1是在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统的结构示意图。

图中：

101-十通阀；102-六通阀；103-固相萃取柱；104-液相色谱输液泵A；105-液相色谱输液泵B；106-定量环A；107-定量环B；108-液相色谱分析柱；109-检测器；110-进样口；111-废液管。

图2为三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物（ATP、ADP、AMP以及IMP）加标的空白鱼肉样品的色谱对比图；其中a曲线为使用在线固相萃取-高效液相色谱(Online SPE-HPLC)联用系统在线富集检测；b曲线为使用普通HPLC系统检测，其中标号1、2、3、4为分析对象，具体为：1. 三磷酸腺苷(ATP)；2. 单磷酸肌苷(IMP)；3. 二磷酸腺苷(ADP)；4. 单磷酸腺苷(AMP)。

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

步骤一、羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱的制备：

1)将内径为2.1 mm，长度为30 mm的不锈钢空柱管接上液相色谱泵，用色谱纯甲醇在0.5 mL/min的流速下冲洗10 min，去除不锈钢管内的杂质，然后将空柱管拆解，并置于60℃烘箱中烘干，待用；

2)管内快速缩聚：将40 mg 粒径为200 nm纳米的羟基磷灰石颗粒，120 mg聚乙二醇6000，550 mg 1 g/mL尿素溶液，450 mg甲醛溶液和100 mg 1.8 mol/L磷酸溶液均匀混合，快速振荡1~2分钟，然后将混合物快速注满经清洗干燥的不锈钢管中，两端封闭并浸于70 ℃水浴中恒温加热120分钟；

3)整体柱的冲洗：待反应完成后，以水为流动相，在液相色谱泵上冲洗不锈钢管整体色谱柱1 小时，冲去床层内残留的溶剂和反应残留试剂，即得到羟基磷灰石功能化整体柱。

步骤二、在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统的构建：

包括十通阀、六通阀、固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、定量环A、定量环B、液相色谱分析柱以及检测器，所述六通阀的阀芯设置有进样口，六通阀的端口2与液相色谱输液泵A的输出端相连，六通阀的端口1和端口4分别与定量环A的两端相连，六通阀的端口3和十通阀的端口1相连，所述十通阀的端口2和端口7分别与固相萃取柱的两端相连，十通阀的端口4与液相色谱输液泵B的输出端相连，十通阀的端口5和端口8分别与定量环B的两端相连，十通阀的端口9与液相色谱分析柱的输入端相连，所述液相色谱分析柱的输出端与检测器相连。

进一步的，所述六通阀的端口5和端口6以及十通阀的端口6分别外接流出的废液管。

进一步的，所述十通阀的端口3和端口10通过管路直接连接。

进一步的，所述液相色谱分析柱为InertSustain AQ-C18色谱柱。

进一步的，所述检测器为二极管阵列检测器。

步骤三、三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取与高灵敏检测

（1）平衡：六通阀102与十通阀101都处于Load位置，装载液通过液相色谱输液泵A104平衡羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，流速为0.1 mL/min；流动相通过液相色谱输液泵B105直接经液相色谱分析柱108以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5 mL用于装载样品的定量环A106；

（2）在线富集：将六通阀102调至Inject位置，在线固相萃取开始，定量环A106中的样品经由装载液带入羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，经过5分钟时间，再将六通阀102调回Load位置，装载液继续冲洗羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液，并降低其干扰；

（3）在线洗脱：六通阀102和十通阀101都处于Load位置；然后，将液相色谱输液泵A104的输送液由装载液换成洗脱液，利用洗脱液将固相萃取整体柱上富集的分析对象洗脱；洗脱流速设为0.1 mL/min，在0.2 mL PEEK管定量环A106内收集第4至第6分钟的洗脱液；

（4）检测：洗脱液收集完成时，十通阀101调节至Inject位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱108进行分离，再利用二极管阵列检测器109进行检测。

应用实施例1

按上述具体实施方式以纳米羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱作为固相萃取介质，结合在线固相萃取-高效液相色谱（Online SPE-HPLC）联用系统，建立鱼肉样品中微量三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测新方法。

具体分离条件：装载液组成：乙腈/水=70%/30% (v/v)；样品溶剂：乙腈/水=70%/30% (v/v)；进样流速：0.1 mL/min；进样体积：500 μL；洗脱液为5 mmol/L pH=5.7磷酸盐缓冲溶液；洗脱流速：0.1 mL/min；洗脱体积：200 μL（收集第4至第6分钟的洗脱液）；分离流动相：甲醇/15mmol/L pH=5.7磷酸盐缓冲溶液=10%/90% (v/v)；分离流速：1.0 mL/min；柱温箱温度：40℃；检测波长：254 nm。图2中a曲线的检测峰1、2、3、4分别是ATP、IMP、ADP以及AMP。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法，其特征在于：所述的检测方法是以羟基磷灰石功能化整体柱作为在线固相萃取整体柱，结合在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，建立三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法；所述三磷酸腺苷的磷酸化代谢产物为二磷酸腺苷、单磷酸腺苷和单磷酸肌苷；

所述的羟基磷灰石功能化整体柱是以将羟基磷灰石纳米颗粒、尿素水溶液、甲醛水溶液、聚乙二醇、催化剂混合，通过一步原位脱水缩聚制得；按质量百分数之和为100%计，各组分占整体柱制备配方组成总质量的百分比为：羟基磷灰石纳米颗粒1.7~5%、聚乙二醇3.5~13.4%、尿素溶液33~35%、甲醛溶液41~44%、催化剂8.3~9.1%；所述尿素水溶液，其浓度为1g/mL；所述甲醛水溶液，其中甲醛的质量浓度为33%~37 %；所述催化剂为磷酸水溶液，其浓度为1.8 mol/L；所述聚乙二醇的平均分子量为6000；所述羟基磷灰石纳米颗粒粒径为200nm；

所述在线固相萃取-高效液相色谱联用系统为：包括十通阀、六通阀、固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、定量环A、定量环B、液相色谱分析柱以及检测器，所述六通阀的端口2与液相色谱输液泵A的输出端相连，六通阀的端口1和端口4分别与定量环A的两端相连，六通阀的端口3和十通阀的端口1相连，所述十通阀的端口2和端口7分别与固相萃取柱的两端相连，十通阀的端口4与液相色谱输液泵B的输出端相连，十通阀的端口5和端口8分别与定量环B的两端相连，十通阀的端口9与液相色谱分析柱的输入端相连，所述液相色谱分析柱的输出端与检测器相连；

所述六通阀的端口5和端口6以及十通阀的端口6分别外接流出的废液管；

所述十通阀的端口3和端口10通过管路直接连接；

所述三磷酸腺苷及其磷酸化代谢产物的在线固相萃取检测方法包括以下步骤：

（1）平衡：六通阀102与十通阀101都处于Load位置，装载液通过液相色谱输液泵A104平衡羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，流速为0.1 mL/min；流动相通过液相色谱输液泵B105直接经液相色谱分析柱108以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5 mL用于装载样品的定量环A106；

（2）在线富集：将六通阀102调至Inject位置，在线固相萃取开始，定量环A106中的样品经由装载液带入羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱103，经过5分钟时间，再将六通阀102调回Load位置，装载液继续冲洗羟基磷灰石功能化固相萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液，并降低其干扰；

（3）在线洗脱：六通阀102和十通阀101都处于Load位置；然后，将液相色谱输液泵A104的输送液由装载液换成洗脱液，利用洗脱液将固相萃取整体柱上富集的分析对象洗脱；洗脱流速设为0.1 mL/min，在0.2 mL PEEK管定量环A106内收集第4至第6分钟的洗脱液；

（4）检测：洗脱液收集完成时，十通阀101调节至Inject位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱108进行分离，再利用二极管阵列检测器109进行检测；

步骤（4）中具体分离条件为：所述液相色谱分析柱为C18色谱柱；所述的装载液组成为：按体积分数比计，乙腈和水的比例为7/3；所述的流动相为：按体积分数比计，甲醇和15mmol/L pH值为5.7磷酸盐缓冲溶液的比例为1/9；所述的洗脱液为5 mmol/L pH值为5.7磷酸盐缓冲溶液。

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