CN109030677A

CN109030677A - 一种不饱和化合物固相微萃取方法

Info

Publication number: CN109030677A
Application number: CN201810777055.1A
Authority: CN
Inventors: 张其清; 王家斌; 姜楠; 李文邦; 肖剑华
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN109030677B

Abstract

本发明公开了一种不饱和化合物固相微萃取方法。本发明是以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取‑高效液相色谱‑二极管阵列在线联用检测系统（In‑tube SPME‑HPLC‑DAD），建立不饱和化合物的固相微萃取新方法。本发明利用整体柱材料内负载的银纳米粒与不饱和化合物所带有的不饱和碳碳双键之间存在着特殊作用力，实现不饱和化合物在银纳米粒功能化整体柱上的富集；且由于银纳米粒与不饱和化合物顺反异构体之间作用力的强度不同，因而进一步实现不饱和化合物顺反异构体的顺序洗脱,并满足反式脂肪酸高效检测和顺反‑二苯乙烯分离分析的要求。

Description

一种不饱和化合物固相微萃取方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种不饱和化合物固相微萃取方法。

背景技术

不饱和化合物主要包括芳香族不饱和有机化合物和脂肪族不饱和有机化合物，由于其独特的物理化学性质，在食品、制药等行业受到广泛应用。反式脂肪酸（TFA）作为一种常规脂肪族不饱和有机化合物是食品添加剂（如氢化油脂、人造黄油等）的主要成分。氢化油脂、人造黄油等食品添加剂具有可延长食品保质期和增加口感等优点，在现代食品工业中得到广泛应用。然而， TFA对人体健康具有很多不良的影响，如诱发肿瘤、动脉硬化、Ⅱ型糖尿病、肥胖等病症，尤其对生长发育时期的婴幼儿有很大的影响。2013年我国《预包装食品营养标签通则》明确规定，氢化油脂在食品配料或生产过程中使用，其食品标签中营养组分表必须标示TFA含量。近年来，TFA含量检测成为食品安全领域的研究热点。由于TFA与顺式脂肪酸（CFA）具有相似的化学结构，只是在双键位置氢原子的不同，因此此类化合物在定性和定量分析上具有很大的挑战性，开发快速准确的TFA检测方法迫在眉睫。二苯乙烯类化合物作为一种典型的芳香族不饱和有机化合物，是许多天然非黄酮类多酚物质的母体物质，在现代医学研究中发挥着重要的作用。葡萄酒中天然存在的二苯乙烯类化合物（如白藜芦醇）具有抗氧化、消炎、抗癌、心血管保护等多种功能。因此，人们越来越关注二苯乙烯类化合物的研究。与此同时，这类化合物的有效分离分析手段的开发也逐渐受到了研究人员的关注。

管内固相微萃取（In-tube solid phase microextraction, In-tube SPME）是一种新型的样品在线前处理方法，具有简便、快速、高效、有机溶剂消耗量低、易与其他仪器联用等优点，在分析化学领域受到了广泛的关注。In-tube SPME技术的核心是具有特殊选择性的微萃取固定相，利用固定相与分析对象的相互作用实现分析对象的富集与检测。由于银纳米粒与不饱和化合物所带有的碳碳双键之间存在着特殊的作用力，这种作用力随着双键数量的增加而提高，随着碳链的增长而变小，同时顺式不饱和化合物的作用力要强于反式不饱和化合物。由此启发，本课题组利用原位还原法制备了银纳米粒功能化固相微萃取整体柱，并基于该固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取与高效液相色谱-二极管阵列（In-tube SPME-HPLC-DAD）在线联用检测系统，发展一种不饱和化合物固相微萃取新方法，实现芳香族不饱和有机化合物和脂肪族不饱和有机化合物的高效富集和不同顺反异构体的顺序洗脱，并满足反式脂肪酸高效检测和顺反-二苯乙烯分离分析的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不饱和化合物固相微萃取新方法。本发明是以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取与高效液相色谱-二极管阵列（In-tube SPME-HPLC-DAD）在线联用检测系统，建立不饱和化合物固相微萃取新方法。得益于负载的银纳米粒与不饱和化合物所带有的碳碳双键之间存在着特殊作用力，实现不饱和化合物的富集；并利用银纳米粒与不饱和化合物不同异构体之间作用力的不同，实现不饱和化合物不同异构体的顺序洗脱。该固相微萃取方法可实现油酸甲酯（主要是顺-6-十八碳烯酸甲酯、反-6-十八碳烯酸甲酯、顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）、二苯乙烯（顺式-二苯乙烯、反式-二苯乙烯）等食品中常见不饱和有机化合物的高效富集、顺序洗脱，并满足反式脂肪酸高效检测和顺反-二苯乙烯分离分析的要求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种不饱和化合物固相微萃取新方法，其是以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合In-tube SPME-HPLC-DAD在线联用检测系统得以构建。所述的不饱和化合物固相微萃取新方法，包括以下步骤：

1）原位还原法制备银纳米粒功能化整体柱：

所述的原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱是由尿素溶液、甲醛溶液在硝酸银的柠檬酸水溶液催化下原位脱水缩聚制得；在整体柱的制备过程中，溶液中银离子在甲醛作用下原位还原为银纳米颗粒并分布于整体柱内，甲醛同时起到了缩聚单体和还原剂的双重作用。

其中，按质量百分数之和为100%计，各组分所占质量百分数为：尿素溶液40~55%、甲醛溶液36~50%、硝酸银的柠檬酸水溶液8~10%。

其中，尿素溶液的浓度为1 g/mL；

甲醛溶液的质量浓度为33%~37%；

硝酸银的柠檬酸水溶液中硝酸银的浓度为0.4 mmol/L，柠檬酸的浓度为0.5 mol/L。

在整体柱的制备过程中，甲醛既作为缩聚单体参与脲醛树脂的一步原位脱水缩聚反应，又作为还原剂用于将溶液中的银离子原位还原为银纳米颗粒并使其分布在整体柱内。具有路易斯酸性质的硝酸银溶液不仅能够催化脲醛树脂的一步原位脱水缩聚反应，起到催化剂的作用，同时溶液中的银离子由于甲醛的原位还原而生成银纳米颗粒并分布在整体柱内。柠檬酸不但能够酸催化脲醛树脂的一步原位脱水缩聚反应，起到催化剂的作用，还可以用于稳定原位还原生成的银纳米粒，防止银纳米粒聚集，起到稳定剂的作用。

2）In-tube SPME-HPLC-DAD在线联用检测系统的构建：

所述的In-tube SPME-HPLC-DAD在线联用检测系统由微萃取和分析两部分组成，结构如图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（V1）、一台液相色谱输液泵（泵A）、原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱、0.5 mL 不锈钢定量环。分析部分包括：一个六通阀（V2）、一台液相色谱输液泵（泵B）、氨基色谱分析柱、二极管阵列检测器（DAD）。

3）不饱和化合物的固相微萃取：

首先，六通阀V1和V2置于LOAD位置。装载液通过泵A平衡原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱，流速为0.1 mL/min。流动相通过泵B直接经氨基色谱分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min。同时，利用进样器将分析样品注满定量环。

当六通阀V1调至INJECT位置，开始固相微萃取，装载液将定量环中的样品带入固相微萃取整体柱，一定时间后，六通阀V1调回LOAD位置，装载液继续冲洗固相微萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液所引起的干扰。

然后，泵B流速设置为0.1 mL/min，六通阀V2调节至INJECT位置，利用流动相将固相微萃取整体柱上富集的分析对象顺序洗脱。经过给定时间洗脱完成时，六通阀V2调节至LOAD位置，泵B流速设置为1.0 mL/min进行分析检测。

所述的装载液组成为正己烷/异丙醇=95%/5% (v/v)；所述的流动相为100%正己烷；柱温箱温度为30 ℃，油酸甲酯的检测波长为203 nm，二苯乙烯的检测波长为290 nm。

本发明的显著优点在于：

1）本发明以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取固定相，利用银纳米粒与不饱和化合物碳碳双键之间的相互作用实现不饱和化合物的富集，而对饱和化合物没有富集能力，降低了食品样品中存在的大量饱和化合物对不饱和化合物检测的干扰，提高了分离度和检测灵敏度。

2）由于顺反式不饱和化合物极为相似的化学结构，其他常规SPME材料与两者的作用力往往都是相同的，因此通常只能实现富集，而难以实现顺序洗脱。与其他常规SPME材料不同，银纳米粒功能化整体柱得益于负载的银纳米粒与不饱和化合物不同异构体之间作用力的不同，可实现不饱和化合物不同异构体的顺序洗脱，提高顺反式不饱和化合物的分离度，满足反式脂肪酸高效检测和顺反-二苯乙烯分离分析的要求。

3）本发明利用In-tube SPME-HPLC-DAD在线联用系统进行分离检测，该联用技术对复杂样品集预处理及富集分析于一体，具有高萃取率、高灵敏度、高效率、有机溶剂用量少、方法重现性好、并且易于自动化等特点。

4）本发明方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广。

附图说明

图1是管内固相微萃取与高效液相色谱-二极管阵列（In-tube SPME-HPLC-DAD）在线联用检测系统的结构示意图。

图2是以不同整体柱作为固相微萃取整体柱，建立In-tube SPME-HPLC-DAD在线联用检测系统对两种油酸甲酯顺反异构体（顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的色谱分离图；

图中A是以500 mg浓度为1 g/mL的尿素溶液、400 mg质量浓度为33%~37%的甲醛溶液和100 mg 0.2 mol/L盐酸溶液均匀混合制备脲醛树脂整体柱作为固相微萃取整体柱，B是以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱。

图3是以不同整体柱作为固相微萃取整体柱，建立In-tube SPME-HPLC-DAD 在线联用检测系统对二苯乙烯两种顺反异构体混合物（顺式-二苯乙烯、反式-二苯乙烯）的色谱分离图；

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

步骤一、原位还原法制备银纳米粒功能化固相微萃取整体柱：

（1）空管的清洗：将内径为750 µm的PTFE管接上液相泵，用色谱纯甲醇在0.5 mL/min的流速下冲洗10 min，去除PTFE管内壁残留的有机物杂质等，然后通氮气，并置于60℃烘箱中烘干10 min，待用；

（2）管内快速缩聚：将500 mg浓度为1 g/mL的尿素溶液、400 mg质量浓度为33%~37%的甲醛溶液、100 mg硝酸银的柠檬酸水溶液（其中硝酸银的浓度为0.4 mmol/L，柠檬酸的浓度为0.5 mol/L）均匀混合，快速振荡1~2 min，再将混合物快速注满洗净干燥的空管中，两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热10 min；

（3）整体柱的冲洗：待反应完成后，以乙腈为流动相，在液相色谱泵上冲洗PTFE管整体柱约1小时，以去除柱床内残留的溶剂，即得到相应原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱。

步骤二、In-tube SPME-HPLC-DAD 在线联用检测系统的构建：

所述的In-tube SPME-HPLC-DAD 在线联用检测系统由微萃取和分析两部分组成，结构如图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（V1）、一台液相色谱输液泵（泵A）、原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱、0.5 mL 不锈钢定量环。分析部分包括：一个六通阀（V2）、一台液相色谱输液泵（泵B）、氨基色谱分析柱、二极管阵列检测器（DAD）。

步骤三、不饱和化合物固相微萃取：

1.首先，六通阀V1和V2置于LOAD位置。装载液通过泵A平衡原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱，流速为0.1 mL/min。流动相通过泵B直接经氨基色谱分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min。同时，利用进样器将分析样品注满定量环。

2.当六通阀V1调至INJECT位置时，开始固相微萃取，装载液将定量环中的样品带入固相微萃取整体柱，经过5 分钟，六通阀V1调回LOAD位置，装载液继续冲洗固相微萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液所引起的干扰。

3.然后，泵B流速设置为0.1 mL/min，六通阀V2调节至INJECT位置，利用流动相将固相微萃取整体柱上富集的分析对象顺序洗脱。经过给定时间洗脱完成时，六通阀V2调节至LOAD位置，泵B流速设置为1.0 mL/min进行分析检测。

应用实施例1

以500 mg浓度为1 g/mL的尿素溶液、400 mg质量浓度为33%~37%的甲醛溶液和100 mg0.2 mol/L盐酸溶液均匀混合制备脲醛树脂整体柱（A）和按上述具体实施方式所述原位还原法制备银纳米粒功能化固相微萃取整体柱（B），并以这两种整体柱作为固相微萃取整体柱，结合In-tube SPME-HPLC-DAD 在线联用检测系统，考察两种油酸甲酯顺反异构体（顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的固相微萃取行为（图2）。

具体运行条件：装载液组成：正己烷/异丙醇=95%/5% (v/v)；样品溶剂：100%正己烷；进样流速：0.1 mL/min；进样体积：500 μL；洗脱液组成：100%正己烷；洗脱流速：0.1 mL/min；洗脱体积：150 μL；分离流动相：100%正己烷；分离流速：1.0 mL/min；柱温箱温度：30℃；检测波长：203 nm。图2中B曲线，检测峰1是反-9-十八碳烯酸甲酯，检测峰2是顺-9-十八碳烯酸甲酯。

如图2所示，使用脲醛树脂整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线A）时，检测峰强度较低，且两种油酸甲酯顺反异构体无法得到分离；而使用原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线B）时，检测峰强度得到增强，且两种油酸甲酯顺反异构体得到分离。以上结果表明基于脲醛树脂整体柱的固相微萃取方法，无法实现两种油酸甲酯顺反异构体的富集和顺序洗脱；而在相同实验条件下，基于原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱的固相微萃取方法，不仅实现了两种油酸甲酯顺反异构体的富集，并且由于顺-9-十八碳烯酸甲酯与银纳米粒的作用力强于反-9-十八碳烯酸甲酯，两种油酸甲酯顺反异构体按照作用力强度也实现顺序洗脱，并得以有效分离分析，印证了原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱具有实现不饱和化合物顺反异构体顺序洗脱的能力。

应用实施例2

以500 mg浓度为1 g/mL的尿素溶液、400 mg质量浓度为33%~37%的甲醛溶液和100 mg0.2 mol/L盐酸溶液均匀混合制备脲醛树脂整体柱（A）和按上述具体实施方式所述原位还原法制备银纳米粒功能化固相微萃取整体柱（B），并以这两种整体柱作为固相微萃取整体柱，结合In-tube SPME-HPLC-DAD 在线联用检测系统，考察二苯乙烯两种顺反异构体混合物（顺式-二苯乙烯、反式-二苯乙烯）的固相微萃取行为（图3）。

具体运行条件：装载液组成：正己烷/异丙醇=95%/5% (v/v)；样品溶剂：100%正己烷；进样流速：0.1 mL/min；进样体积：500 μL；洗脱液组成：100%正己烷；洗脱流速：0.1 mL/min；洗脱体积：300 μL；分离流动相：100%正己烷；分离流速：1.0 mL/min；柱温箱温度：30℃；检测波长：290 nm。图3中B曲线，检测峰1是顺式-二苯乙烯，检测峰2是反式-二苯乙烯。

如图3所示，使用脲醛树脂整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线A）时，检测峰强度较低，且二苯乙烯两种顺反异构体无法得到分离；而使用原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线B）时，检测峰强度得到增强，且二苯乙烯两种顺反异构体得到分离。以上结果表明基于脲醛树脂整体柱的固相微萃取方法，无法实现二苯乙烯两种顺反异构体的富集和顺序洗脱；而在相同实验条件下，基于原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱的固相微萃取方法，不仅实现了二苯乙烯两种顺反异构体的富集，同时由于反式-二苯乙烯具有更高的共平面性，使其与银纳米粒的作用力强于顺式-二苯乙烯，二苯乙烯顺反式异构体按照作用力强度实现顺序洗脱，并得以有效分离分析，印证了原位还原法制备的银纳米粒功能化固相微萃取整体柱具有实现不饱和化合物顺反异构体顺序洗脱的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述的固相微萃取方法是以原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，并将其与高效液相色谱-二极管阵列检测系统在线联用，建立不饱和化合物固相微萃取检测方法。

2.根据权利要求1所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述的原位还原法制备的银纳米粒功能化整体柱是由尿素溶液、甲醛溶液在硝酸银的柠檬酸水溶液催化作用下原位脱水缩聚制得；溶液中银离子在甲醛作用下原位还原为银纳米颗粒并分布于整体柱内，甲醛同时起到了缩聚单体和还原剂的双重作用；所述整体柱，按质量百分数之和为100%计，各原料所占质量百分数为：尿素溶液40~55%、甲醛溶液36~50%、硝酸银的柠檬酸水溶液8~10%，其中，尿素溶液的浓度为1 g/mL，甲醛溶液的质量浓度为33%~37%，硝酸银的柠檬酸水溶液中硝酸银的浓度为0.4 mmol/L，柠檬酸的浓度为0.5 mol/L。

3.根据权利要求2所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述整体柱的制备方法，包括以下步骤：

1）空管的清洗：用色谱纯甲醇冲洗空管，然后通氮气，并置于60℃烘箱中烘干，待用；

2）管内快速缩聚：将尿素溶液、甲醛溶液、硝酸银的柠檬酸水溶液按比例混合均匀，快速振荡1~2分钟，再将混合物快速注满洗净干燥的空管中，两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热10分钟；

3）整体柱的冲洗：待反应完成后，以乙腈为流动相冲洗制备的整体柱，去除柱床内残留的溶剂及未反应的原料与催化剂，即得到所述银纳米粒功能化整体柱。

4.根据权利要求1所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述的管内固相微萃取与高效液相色谱-二极管阵列在线联用检测系统由微萃取和分析两部分组成；微萃取部分包括：一个六通阀-V1、一台液相色谱输液泵-泵A、银纳米粒功能化固相微萃取整体柱、0.5 mL 不锈钢定量环；分析部分包括：一个六通阀-V2、一台液相色谱输液泵-泵B、氨基色谱分析柱、二极管阵列检测器。

5.根据权利要求4所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述的固相微萃取具体操作包括如下步骤：

（1）首先，六通阀V1和V2置于LOAD位置；装载液通过泵A平衡银纳米粒功能化固相微萃取整体柱，流速为0.1 mL/min；流动相通过泵B直接经氨基色谱分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，利用进样器将分析样品注满定量环；

（2）当六通阀V1调至INJECT位置时，开始固相微萃取，装载液将定量环中的样品带入银纳米粒功能化固相微萃取整体柱，一定时间后，六通阀V1调回LOAD位置，装载液继续冲洗银纳米粒功能化固相微萃取整体柱90 s以消除残留的样品溶液所引起的干扰；

（3）然后，泵B流速设置为0.1 mL/min，六通阀V2调节至INJECT位置，利用流动相将银纳米粒功能化固相微萃取整体柱上富集的分析对象顺序洗脱；经过给定时间洗脱完成时，六通阀V2调节至LOAD位置，泵B流速设置为1.0 mL/min进行分析检测。

6.根据权利要求5所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述的装载液组成为：正己烷/异丙醇=95%/5%（v/v）；所述的流动相为100%正己烷。

7.根据权利要求1-6任一所述的一种不饱和化合物固相微萃取方法，其特征在于：所述不饱和化合物包括芳香族不饱和有机化合物和脂肪族不饱和有机化合物；所述芳香族不饱和有机化合物具体为顺式-二苯乙烯、反式-二苯乙烯；所述脂肪族不饱和有机化合物具体为顺-6-十八碳烯酸甲酯、反-6-十八碳烯酸甲酯、顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯。