CN113624893A

CN113624893A - 一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法

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Publication number: CN113624893A
Application number: CN202111110823.6A
Authority: CN
Inventors: 王家斌; 陶莹
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113624893B

Abstract

本发明公开了一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的在线固相萃取‑高效液相色谱联用检测方法。本发明以银离子功能化共价有机聚合物作为萃取富集介质，结合在线固相萃取‑高效液相色谱联用系统，建立顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的在线联用检测方法。本发明联合利用银离子与单双不饱和脂肪酸甲酯之间的银离子的亲和作用力、以及共价有机聚合物基质与单双不饱和脂肪酸甲酯之间的π‑π堆叠作用，实现顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的选择性萃取富集，减少样品基质的干扰，提高在线联用检测方法的分析效率。本发明方法简单，操作简便，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广，可实现复杂实际样品中微量顺反式单双不饱和脂肪酸的高效富集和灵敏检测。

Description

一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法。

背景技术

顺反式单双不饱和脂肪酸广泛存在于食物中，其中最为人们熟知的就是反式脂肪酸（TFAs）。TFAs是一类含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸。生活中常见的食物，如油炸食品、烘焙食品、乳制品、冰淇淋以及饮料等，都广泛存在着TFAs。摄入过量TFAs会对人体健康构成威胁，引发心脑血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多种疾病，并有可能提高癌症发病率。世界卫生组织建议TFAs每日摄入量应在食物总能量的1%以下，我国卫生主管部门建议每日摄入TFAs总量不应超过2.2 g，因此，进行食物中的TFAs含量检测意义重大。TFAs检测方法多种多样，主要包括气相色谱法（GC）、液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法（CE）等。其中银离子液相色谱法（Ag⁺-HPLC）是常用的检测方法之一，但是其对TFAs检测存在检测响应较低，且样品中基质对TFAs检测干扰严重的问题，因此为了获得更好的检测结果，在检测前对食品样品进行有效的样品前处理至关重要。

现有的用于TFAs检测的样品前处理方法主要有Ag⁺薄层色谱法（Ag⁺-TLC）、Ag⁺固相萃取法（Ag⁺-SPE）等。其中Ag⁺-SPE是TFAs检测样品前处理领域中效果较好的方法。Ag⁺能够与不饱和脂肪酸中碳碳双键相互作用形成可逆的电荷转移复合物，其与不饱和脂肪酸的亲和作用力随着双键数量的增多而增强，随着链长的增长而减弱，并且银离子与顺式脂肪酸的亲和能力强于TFAs。

共价有机聚合物（COPs）材料具有良好的溶剂与热稳定性、可调节的孔结构、良好的可修饰性，在固相萃取领域不断得到新的应用。由于COPs良好的可修饰性，可对COPs材料加以适当的功能化，使其选择性和富集能力进一步得到提升，并拓展其在固相萃取领域中的应用潜力。由此启发，本课题组将Ag⁺固相萃取技术与COPs材料相结合，制备了银离子功能化共价有机聚合物固相萃取柱，并基于该固相萃取柱，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用检测系统，发展一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的进样、萃取、富集与检测为一体的一步化检测方法，实现食品中顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的在线富集与高效检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测新方法。本发明是以银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺）作为萃取富集介质装填固相萃取柱，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，发展一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的进样、萃取、富集与检测为一体的一步化检测方法。得益于银离子功能化共价有机聚合物与顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯之间的亲和作用与π-π堆叠作用，实现分析对象顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的萃取富集；该固相萃取方法可实现反式-9-十八碳烯酸甲酯（9t-C18:1）、顺式-9-十八碳烯酸甲酯（9c-C18:1）、反式亚油酸甲酯（9t,12t-C18:2）、顺式亚油酸甲酯（9c,12c-C18:2）及亚油酸甲酯异构体混合物（9t,12t-C18:2；9c,12t-C18:2；9t,12c-C18:2；9c,12c-C18:2）等食品中常见的顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯类化合物的高效萃取富集，实现顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的高效检测。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种顺反式单双不饱和脂肪酸的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其是以银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）作为萃取富集介质装填固相萃取柱，结合在线固相萃取-高效液相色谱联用系统得以建立。所述的检测方法，包括以下步骤：

（1）以银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为萃取富集介质的固相萃取柱的制备：

1）基质共价有机聚合物（COP_TPBA-BPDA）的制备：将1,3,5-三(4-氨苯基)苯和4,4-联苯二甲醛分散在乙醇溶剂中，在乙酸催化作用下发生席夫碱反应制备共价有机聚合物基质（COP_TPBA-BPDA），将反应得到的COP_TPBA-BPDA过滤，用无水乙醇清洗两次，真空干燥后备用。其中，所述1,3,5-三(4-氨苯基)苯和4,4-联苯二甲醛的摩尔比为2:3；所述的乙酸浓度为3 mol/L，反应溶液总体积为22 mL；所述乙醇溶液与乙酸的体积比为10:1；。

2）磺酸根功能化共价有机聚合物（COP_TPBA-BPDA@SA）的制备：将COP_TPBA-BPDA和4-氨基苯磺酸分散在均三甲苯和二氧六环混合溶剂中，在催化剂作用下通过席夫碱反应得到COP_TPBA-BPDA@SA，将反应得到的COP_TPBA-BPDA@SA过滤，依次使用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、无水乙醇和超纯水进行清洗，真空干燥备用。其中，所述均三甲苯和二氧六环混合溶剂按体积比制得，均三甲苯和二氧六环体积比为3:7；所述催化剂为乙酸溶液，浓度为3 mol/L，反应溶液总体积为22 mL，所述反应溶剂（均三甲苯和二氧六环混合溶剂）与催化剂乙酸的体积比为10:1。

3）银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）的制备：将制备得到的COP_TAPB-BPDA@SA放置于浓度为1wt%乙酸铵水溶液中浸泡2小时；随后离心，并采用二次水清洗；将处理后的COP_TAPB-BPDA@SA置于浓度为1 mol/L的硝酸银溶液中浸泡2小时；随后采用甲醇清洗样品，真空干燥，得到银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）。

4）固相萃取柱的装填：先将长度为33毫米，内径为2.1毫米的不锈钢空柱管洗净烘干，在柱管出口端装上柱筛板，装好两端柱头；将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺粉末制成匀浆液，借助泵的辅助将匀浆液通入空柱管中，以此将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺填入柱内。之后采用正己烷作为流动相，在液相色谱泵上冲洗固相萃取柱，得到COP_TPBA-BPDA@SA固相萃取柱。

（2）在线固相萃取-高效液相色谱联用系统的构建与分析对象检测方法建立：

采用“六通阀+十通阀”的在线联用模式（在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，专利号：ZL201820762345.4），将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺固相萃取柱作为在线固相萃取柱，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统（如附图1所示），所述的联用系统由六通阀V1、十通阀V2、以银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为萃取富集介质的固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、0.5 mL定量环A、0.2 mL定量环B、液相色谱分析柱以及检测器构成。联用系统的运行包括以下操作步骤：

1）平衡：六通阀V1和十通阀V2都处于LOAD位置；载样液通过泵A平衡以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，其流速为0.08 mL/min；流动相通过泵B直接经分析柱以获得色谱分离所需稳定基线，流速为1.0 mL/min；

2）在线富集萃取：通过进样器将样品溶液注满定量环A，当六通阀V1调至INJECT位置，在线固相萃取开始，定量环A中的样品溶液经由载样液带入以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱；进样流速为0.08 mL/min，进样6.5分钟后，六通阀V1调回LOAD位置；载样液继续冲洗固相萃取柱90 秒以消除残留的样品溶液，降低其干扰；

3）在线洗脱：将泵A的输送液由载样液换成洗脱液，洗脱流速为0.1 mL/min，利用洗脱液将固相萃取柱上萃取富集的分析对象洗脱下来，收集于与十通阀V2连接的定量环B内，洗脱时间为2.5分钟；

4）检测：洗脱液收集完成，十通阀V2调节至INJECT位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱进行分离，再利用检测器进行检测，此时用于输送流动相的泵B的流速为1.0 mL/min。

其中，所述的载样液为正己烷；所述的流动相组成为：按体积分数比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.6%/0.3%/0.1%；所述的洗脱液组成为：按体积分数比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.5%/0.4%/0.1%；所述的液相色谱分析柱为ChromSpher5 Lipids色谱柱（250×4.6 mm，Agilent），柱温箱温度为40 ℃，检测波长为203 nm。

本发明的显著优点在于：

(1) 与传统的Ag⁺-SPE吸附剂不同，本发明使用的COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺吸附剂联合利用银离子与单双不饱和脂肪酸甲酯之间的银离子的亲和作用力、以及共价有机聚合物基质与单双不饱和脂肪酸甲酯之间的π-π堆叠作用，实现顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的选择性萃取富集，增强了分析对象与吸附剂之间的选择性吸附作用，减少样品基质的干扰，提高在线联用检测方法的分析效率。

(2) 与传统的Ag⁺-SPE吸附剂对比，COP_TPBA-BPDA@SA基质材料的磺酸根提供了与银离子的强静电相互作用力，增强了COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺吸附剂中银离子的稳定性，提高了富集萃取介质的稳定性和使用寿命，也提高了检测方法的重现性。

附图说明

图1是在线固相萃取-高效液相色谱（on-line Ag⁺-SPE-Ag⁺-HPLC）联用系统的结构示意图。

图2是洗脱液中乙腈含量对顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯萃取效率的影响。

图3是高效液相色谱（HPLC）图。曲线3a是以银离子功能化共价有机聚合物固相萃取柱作为萃取介质，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用分析系统，分析顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯标准混合物；曲线3b是以与曲线a相同系统分析空白奶茶样品；曲线3c是常规银离子液相色谱（Ag⁺-HPLC）分析空白奶茶样品。检测峰归属：(1) 反-9-十八碳烯酸甲酯（9t-C18:1）；(2) 反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯（9t,12t-C18:2）；(3) 顺-9-十八碳烯酸甲酯（9c-C18:1）；(4) 顺-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯（9c,12t-C18:2）；(5) 反-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯（9t,12c-C18:2）；(6) 顺-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯（9c,12c-C18:2）。

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

一、银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为富集萃取介质的固相萃取柱的制备：

1. 基质共价有机聚合物（COP_TPBA-BPDA）的制备：称取0.1 mmol的1,3,5-三(4-氨苯基)苯和0.15 mmol的4,4-联苯二甲醛于烧瓶中，添加20 mL无水乙醇作为反应溶剂，超声10分钟使其均匀分散；然后加入2 mL 3 mol/L乙酸作为催化剂，常温下搅拌，反应15分钟，得到均匀的黄色悬浊液；过滤，无水乙醇清洗两次，在60℃下真空干燥，得到黄色的COP_TPBA-BPDA。

2. 磺酸根功能化共价有机聚合物（COP_TPBA-BPDA@SA）的制备：将在前一步合成的COP_TPBA-BPDA和0.05 mmol对氨基苯磺酸置于烧瓶中，加入6 mL均三甲苯和14 mL二氧六环作为反应溶剂，在常温下搅拌10分钟得到悬浊液；然后加入2 mL 3 mol/L乙酸作为催化剂，在70℃油浴锅中反应4小时得到红棕色悬浊液；过滤，依次使用 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇和超纯水进行清洗，在60℃下真空干燥，得到砖红色的COP_TPBA-BPDA@SA固体。

3. 银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）的制备：将制备得到的COP_TAPB-BPDA@SA粉末放置于10 mL 1wt%乙酸铵水溶液中浸泡2小时，然后在10,000 转/分钟下离心5分钟，采用二次水进行清洗；将处理后的样品置于10 mL 1 mol/L硝酸银溶液中浸泡2小时，随后采用甲醇清洗样品，将所得到粉末置于60 ℃真空烘箱中真空干燥12小时，得到COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺粉末材料。

4. 固相萃取柱的装填：先将长度为33毫米，内径为2.1毫米的不锈钢空柱管洗净烘干，在柱管出口端装上柱筛板，装好两端柱头；将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺粉末制成匀浆液，借助泵的辅助将匀浆液通入空柱管中，以此将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺填入柱内。之后采用正己烷作为流动相，在液相色谱泵上冲洗固相萃取柱，得到COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺固相萃取柱。

二、在线固相萃取-高效液相色谱联用系统的构建与分析对象检测方法建立：

采用“六通阀+十通阀”的在线联用模式（在线固相萃取-高效液相色谱联用系统，专利号：ZL201820762345.4），将COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺固相萃取柱作为在线固相萃取柱，构建在线固相萃取-高效液相色谱联用系统（如图1所示），所述的联用系统由六通阀V1、十通阀V2、以银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为萃取富集介质的固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、0.5 mL定量环A、0.2 mL定量环B、液相色谱分析柱以及检测器构成。联用系统的运行包括以下操作步骤：

（1）平衡：六通阀V1和十通阀V2都处于LOAD位置；载样液通过泵A平衡以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱，其流速为0.08 mL/min；流动相通过泵B直接经分析柱以获得色谱分离所需稳定基线，流速为1.0 mL/min；

（2）在线富集萃取：通过进样器将样品溶液注满定量环A，当六通阀V1调至INJECT位置，在线固相萃取开始，定量环A中的样品溶液经由载样液带入以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱；进样流速为0.08 mL/min，进样6.5分钟后，六通阀V1调回LOAD位置；载样液继续冲洗固相萃取柱90 秒以消除残留的样品溶液，降低其干扰；

（3）在线洗脱：将泵A的输送液由载样液换成洗脱液，洗脱流速为0.1 mL/min，利用洗脱液将固相萃取柱上萃取富集的分析对象洗脱下来，收集于与十通阀V2连接的定量环B内，洗脱时间为2.5分钟；

（4）检测：洗脱液收集完成，十通阀V2调节至INJECT位置，将洗脱下来的分析对象输送至液相色谱分析柱进行分离，再利用检测器进行检测，此时用于输送流动相的泵B的流速为1.0 mL/min。

应用实施例1

以上述具体实施方式所制备的银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为萃取介质装填固相萃取柱,构建在线固相萃取-高效液相色谱（on-line Ag⁺-SPE-Ag⁺-HPLC）联用分析系统（如图1所示），考察了洗脱剂中乙腈（ACN）含量对分析物顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯标准混合物（9t-C18:1；9c-C18:1；9t,12t-C18:2；9c,12c-C18:2）萃取效率的影响。联用系统运行条件为：载样液为正己烷；分离流动相组成为：按体积分数比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.6%/0.3%/0.1%；联用系统使用的液相色谱分析柱为ChromSpher5Lipids色谱柱（250×4.6 mm，Agilent），柱温箱温度为40 ℃，检测波长为203 nm。

由于ACN所带有的孤对电子可以进入银离子的空轨道，并破坏银离子与带有碳碳双键的不饱和化合物之间形成的可逆电荷转移复合物，可实现吸附剂COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺上萃取的不饱和脂肪酸甲酯的洗脱。从图2中可知，当ACN含量从0.1%（v:v）增加至0.4%（v:v）时，峰面积显著增加。这是由于洗脱剂中ACN含量的增加，促使洗脱剂的洗脱能力增强，使得分析物更易从COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺上被洗脱下来，萃取效率也随之提高。但是，当ACN含量从0.4%（v:v）进一步增加至0.6%（v:v）时，分析对象的萃取效率反而下降。这可能是因为随着ACN含量的增加，分析对象顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯与COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺基质材料本身的π-π堆叠作用增强，削弱了洗脱剂的洗脱能力，从而导致了萃取效率的下降。由此也说明，带有碳碳双键的不饱和化合物在COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺固相萃取柱上的富集行为是碳碳双键和银离子的亲和作用，以及不饱和化合物与共价有机聚合物基质之间的π-π堆叠作用的复合作用。

应用实施例2

以上述具体实施方式所制备的银离子功能化共价有机聚合物（COP_{TPBA-BPDA@SA@Ag} ⁺）为萃取介质装填固相萃取柱,构建在线固相萃取-高效液相色谱（on-line Ag⁺-SPE-Ag⁺-HPLC）联用分析系统，联用系统最优分离检测条件为：载样液为正己烷；分离流动相组成为：按体积分数比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.6%/0.3%/0.1%；使用的洗脱液组成为：按体积分数比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.5%/0.4%/0.1%；联用系统使用的液相色谱分析柱为ChromSpher5 Lipids色谱柱（250×4.6 mm，Agilent），柱温箱温度为40 ℃，检测波长为203nm。在最优分离检测条件下，考察顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯标准混合物（9t-C18:1；9c-C18:1；9t,12t-C18:2；9c,12t-C18:2；9t,12c-C18:2；9c,12c-C18:2）的富集与分离行为。同时，采用相同固相萃取-高效液相色谱（on-line Ag⁺-SPE-Ag⁺-HPLC）联用分析系统及分离检测条件分析空白奶茶样品，并采用和常规银离子液相色谱（Ag⁺-HPLC）对空白奶茶样品进行分析。

如附图3所示，在使用常规Ag⁺-HPLC进行分析时，分析对象的检测峰受样品基质干扰难以识别（曲线3c）。而使用on-line Ag⁺-SPE-Ag⁺-HPLC在线联用系统进行分析时（曲线3a），奶茶样品中的基质干扰明显减弱，分析对象的信号峰可以清晰识别，由此也充分说明了COP_{TAPB-BPDA@SA@Ag} ⁺具有优越的亲和富集能力，还具有令人满意的净化能力。通过on-lineAg⁺-SPE-Ag⁺-HPLC系统对于空白奶茶实际样品的分析（曲线3b），可以发现实际奶茶样品中天然存在顺式单双不饱和脂肪酸以及少量反式单不饱和脂肪酸，不存在主要来源于人为加工产生的反式双不饱和脂肪酸。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法是以银离子功能化共价有机聚合物作为萃取富集介质，结合在线固相萃取-高效液相色谱联用检测系统，实现顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯的进样、萃取、富集与检测为一体的一步化检测方法。

2.根据权利要求1所述的一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述的萃取富集介质是以磺酸根功能化共价有机聚合物为基质填料，以铵盐为中间离子交换剂实现银离子对磺酸根功能化共价有机聚合物的功能化，制得的银离子功能化共价有机聚合物；所述的磺酸根功能化共价有机聚合物是以1,3,5-三(4-氨苯基)苯和4,4-联苯二甲醛为反应原料，制备基质共价有机聚合物，并利用4-氨基苯磺酸为衍生化试剂制得。

3.根据权利要求1所述的一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述的顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯具体为反式-9-十八碳烯酸甲酯顺式-9-十八碳烯酸甲酯、反式亚油酸甲酯、顺式亚油酸甲酯、亚油酸甲酯异构体中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述的在线固相萃取-高效液相色谱联用检测系统由六通阀V1、十通阀V2、以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱、液相色谱输液泵A、液相色谱输液泵B、0.5 mL定量环A、0.2 mL定量环B、液相色谱分析柱以及检测器构成。

5.根据权利要求4所述的一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法包括以下步骤：

2）在线富集萃取：通过进样器将样品溶液注满定量环A，当六通阀V1调至INJECT位置，在线固相萃取开始，定量环A中的样品溶液经由载样液带入以银离子功能化共价有机聚合物为萃取富集介质的固相萃取柱；进样流速为0.08 mL/min，进样6.5分钟后，六通阀V1调回LOAD位置；载样液继续冲洗固相萃取柱90秒以消除残留的样品溶液，降低其干扰；

6.根据权利要求5所述一种顺反式单双不饱和脂肪酸甲酯在线固相萃取-高效液相色谱联用检测方法，其特征在于：所述的载样液为正己烷；所述的流动相组成为：按体积百分比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.6%/0.3%/0.1%；所述的洗脱液组成为：按体积百分比计，正己烷/乙腈/二氯甲烷=99.5%/0.4%/0.1%；所述的液相色谱分析柱为250×4.6 mm的ChromSpher5 Lipids色谱柱。