CN109959742B - 一种在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪及其使用方法,包括自动进样器、两个色谱泵、两个六通阀、在线净化柱、色谱分离柱、紫外检测器、荧光检测器，可以根据使用需要在离线分析和在线前处理分析两种模式之间切换。用作在线前处理分析时，样品可不经前处理，简单提取后直接检测，大大缩短了检测流程，减少了人工操作，降低了分析成本。作离线分析时不需要对系统进行变动，直接切换即可，有效的提高了仪器的使用效率和分析能力。
Description
技术领域
本发明涉及液相色谱仪，特别是涉及能够实现既能完成离线分析，又能完成在线分析的一种在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪及其使用方法。
背景技术
液相色谱是一种常用的分离和检测设备，但是在应用中也发现一些问题，比如液相色谱法检测中前处理过程复杂，费时费力，前处理的材料成本很高。而建立一套在线前处理系统，样品经简单提取后即可进样，操作非常简便，大大节省了人力，可有效解决样品量大、人手不足的问题。更重要的是，由于在线净化柱只对进入系统的少量样品进行净化，净化量大大减小，可极大的节省了实验成本。
虽然在线前处理液相色谱带来了成本上的节约，但是仍面临新的问题——无法进行离线检测，如果样品不适用在线前处理或者样品基质简单只需常规离线分析时，必须将系统流路恢复为初始的状态。面对样品检验量大，样品种类较多的情况，处理起来有较大困难。经常在两种系统状态中切换，操作很繁琐，对仪器的寿命也不利，而且拆装系统专业性很强，没有经过培训的人员无法操作。如果能够针对液相色谱这一缺陷，在一台液相色谱仪上实现既能够完成离线液相色谱分析，又能够完成在线色谱分析，实现多种液相色谱系统的在线切换，就能够使得液相色谱分析操作简便，提高检测效率，节省人力物力，降低使用成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪及其使用方法，基于多阀切换技术，实现既能完成离线分析，又能完成在线分析。可以在一台液相色谱仪上实现既能够完成离线液相色谱分析，又能够完成在线色谱分析，实现多种液相色谱系统的在线切换，使得液相色谱分析操作简便，提高检测效率，节省人力物力，降低使用成本。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪，包括自动进样器、两个色谱泵、两个六通阀、在线净化柱、色谱分离柱、紫外检测器、荧光检测器，用于系统切换的第一六通阀的六个接口依次分别为a、b、c、d、e、f，第二六通阀的六个接口依次分别为g、h、i、j、k、l，自动进样器分别与第一色谱泵和第二六通阀接口g相连，第二六通阀接口k上连有第二色谱泵，第二色谱泵上连有多个储液瓶，第二六通阀接口h和接口j之间连接有定量环，第二六通阀接口i与第一六通阀接口d相连，第二六通阀接口l与第一六通阀接口a相连，第一六通阀接口c上依次连接有色谱分离柱、紫外检测器和荧光检测器，第一六通阀接口b和接口e之间连接有在线净化柱，第一六通阀接口f为废液接口，第一色谱泵上连有多个储液瓶。
上述在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，当用做离线分析时，依次包括以下步骤：
(1)系统平衡过程：第二色谱泵将储液瓶中的流动相带入第二六通阀，经过定量环进入第一六通阀、色谱分离柱、紫外检测器、荧光检测器，对整个系统进行平衡；
(2)进样：第二六通阀进行切换，自动进样器将样品注入系统随第一色谱泵上储液甁中的流动相进入第二六通阀，样品在定量环中暂存；
(3)洗脱分析过程：第二六通阀进行切换，第二色谱泵将第二色谱泵上储液甁中的流动相带入连在第二六通阀上的定量环，样品进入第一六通阀、色谱分离柱进行分离，并通过紫外检测器和荧光检测器进行分析；
步骤二，当用做在线前处理分析时，依次包括以下步骤：
(1)进样和系统平衡过程：自动进样器将样品注入系统随第一色谱泵中的流动相进入第二六通阀，样品被带入第一六通阀中在线净化柱中富集，杂质和基质随流动相排入废液；第二色谱泵将流动相带入第一六通阀、色谱分离柱、紫外检测器和荧光检测器，对整个系统进行平衡；
(2)洗脱分析过程：第二六通阀进行切换，第二色谱泵将流动相进入连在第一六通阀上的在线净化柱，在线净化柱中样品进入色谱分离柱进行分离，并通过紫外检测器和荧光检测器进行分析。
所述步骤二的(2)洗脱分析过程后还包括在线活化再生过程：第一色谱泵将第一色谱泵上储液瓶中的流动相带入在线净化柱，对在线净化柱进行活化再生，随后第一色谱泵将第一色谱泵储液甁中的流动相比列切换为进样初始比例，对在线净化柱进行平衡，用于下一个样品的净化分析。
本发明的有益效果：可以在一台液相色谱仪上实现离线液相色谱分析和在线前处理液相色谱分析的在线切换，解决传统液相色谱仪只能做离线液相色谱分析或者在线前处理液相色谱分析的缺点，可以根据待分析样品的性质在线切换分析系统，大大提高了仪器的便利性和使用效率，降低了仪器的使用成本。同时，在线净化分析系统节省了样品前处理的时间和繁复的操作过程，在线净化柱的活化再生处理，循环利用，相对对传统净化柱一次性的使用特性也要更加的环保，也大大降低了分析成本。
附图说明
图1为本发明在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的离线检测系统平衡和洗脱过程的结构示意图。
图2为本发明在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的离线检测进样分析过程的结构示意图。
图3为本发明在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的在线前处理检测进样和系统平衡及在线活化再生过程的结构示意图。
图4为本发明在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的在线前处理检测洗脱过程的结构示意图。
图5为本发明实施例的谷物分析赭曲霉毒素A的色谱图。
图6为本发明实施例的赭曲霉毒素A的校准曲线图。
图7为本发明实施例的爽肤水中分析苯并(a)芘在线前处理检测的荧光检测器色谱图。
图8为本发明实施例的爽肤水中分析苯并(a)芘在线前处理检测的紫外检测器色谱图。
图9为本发明实施例的苯并(a)芘的校准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明：
如图1-4所示，本发明的在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪，包括自动进样器、两个色谱泵、两个六通阀、在线净化柱、色谱分离柱、紫外检测器、荧光检测器，用于系统切换的第一六通阀3的六个接口依次分别为a、b、c、d、e、f，第二六通阀8的六个接口依次分别为g、h、i、j、k、l，自动进样器2分别与第一色谱泵1和第二六通阀8接口g相连，第二六通阀8接口k上连有第二色谱泵10，第二色谱泵10上分别连接有第一储液瓶15、第二储液瓶16、第三储液瓶17、第四储液瓶18，第二六通阀8接口h和接口j之间连接有定量环9，第二六通阀8接口i与第一六通阀3接口d相连，第二六通阀8接口l与第一六通阀3接口a相连，第一六通阀3接口c上依次连接有色谱分离柱5、紫外检测器6和荧光检测器7，第一六通阀3接口b和接口e之间连接有在线净化柱4，第一六通阀3接口f为废液接口，第一色谱泵1上分别连接有第五储液瓶11、第六储液瓶12、第七储液瓶13和第八储液瓶14。
上述在线分析前处理和离线分析一体液相色谱仪的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，当用做离线分析时，依次包括以下步骤：
(1)系统平衡过程：第二色谱泵10将第四储液瓶18中的流动相带入第二六通阀8，经过定量9环进入第一六通阀3、色谱分离柱5、紫外检测器6、荧光检测器7，对整个系统进行平衡，如图1所示；
(2)进样：第二六通阀8进行切换，自动进样器2将样品注入系统随第一色谱泵1中的第八储液甁18中的流动相进入第二六通阀8，样品在定量环9中暂存，如图2所示；
(3)洗脱分析过程：第二六通阀8进行切换，第二色谱泵10将第四储液甁18中的流动相带入连在第二六通阀上的定量环9，样品进入第一六通阀3、色谱分离柱5进行分离，并通过紫外检测器6和荧光检测器7进行分析，如图1所示；
步骤二，当用做在线前处理分析时，依次包括以下步骤：
(1)进样和系统平衡过程：自动进样器2将样品注入系统随第一色谱泵1中的流动相进入第二六通阀8，样品被带入第一六通阀3中在线净化柱4中富集，杂质和基质随流动相排入废液；第二色谱泵10将流动相带入第一六通阀3、色谱分离柱5、紫外检测器6和荧光检测器7，对整个系统进行平衡，如图3所示；
(2)洗脱分析过程：第二六通阀8进行切换，第二色谱泵10将流动相进入连在第一六通阀上的在线净化柱4，在线净化柱中样品进入色谱分离柱5进行分离，并通过紫外检测器6和荧光检测器7进行分析，如图4所示。
优选，所述步骤二的(2)洗脱分析过程后还包括在线活化再生过程：第一色谱泵1将第五储液甁11和第六储液瓶12中的流动相带入在线净化柱4，对在线净化柱进行活化再生，随后第一色谱泵1将第五储液甁11和第六储液瓶12中的流动相比列切换为进样初始比例，对在线净化柱进行平衡，用于下一个样品的净化分析，如图3所示。
具体地说，自动进样器2连有第一色谱泵1和第二六通阀8，第二六通阀上定量环9，并与第一六通阀3和第二色谱泵10相连，第一色谱泵5与第五储液瓶11、第六储液瓶12、第七储液瓶13和第八储液瓶14相连，第二色谱泵与第一储液瓶15、第二储液瓶16、第三储液瓶17和第四储液瓶18相连，第一六通3上连有色谱分离柱5，色谱分离柱5依次与紫外检测器6、荧光检测器7连接，构成离线液相色谱分析系统；
自动进样器2连有第一色谱泵1和第二六通阀8，第二六通阀上定量环9，并与第一六通阀3和第二色谱泵10相连，第一色谱泵5与第五储液瓶11、第六储液瓶12、第七储液瓶13和第八储液瓶14相连，第二色谱泵与第一储液瓶15、第二储液瓶16、第三储液瓶17和第四储液瓶18相连，第一六通3上连有在线净化柱4，与上述第一六通阀3上连的色谱分离柱5，色谱分离柱5依次与紫外检测器6、荧光检测器7连接，构成在线净化前处理液相色谱分析系统。
第一储液瓶15用于装乙腈，第二储液瓶16用于装水，第四储液瓶18用于装水/乙腈/乙酸溶液水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V),第三储液瓶17备用。
第五储液瓶11用于装乙腈，第二储液瓶12用于装水，第四储液瓶14装水/乙腈/乙酸溶液水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V)，第三储液瓶13备用。
具体实施如下：
本液相色谱系统做离线分析谷物中赭曲霉毒素A时，其步骤如下：
(1)系统平衡过程：称取20g试样于25mL容量瓶中加入提取液(氯化钠-碳酸氢钠溶液)定容至刻度，混匀，以玻璃纤维滤纸过滤纸滤液澄清。，加入100mL提取液，高速均质3min，定量滤纸过滤，移取10mL滤液加入40mL磷酸盐缓冲溶液稀释至50mL，玻璃纤维滤纸过滤。移取10mL滤液至免疫亲和柱，分别注入10mL冲洗液(氯化钠-碳酸氢钠溶液)10mL真菌毒素清洗缓冲液和10mL水淋洗，1mL甲醇洗脱，HPLC测定。第二色谱泵10以1mL/min的速度将第四储液瓶18中的水/乙腈/乙酸溶液水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V)带入第二六通阀8，经过定量环9进入第一六通阀3、色谱分离柱5(型号：Utimate XB-C18，4.6*150mm，5μm)、紫外检测器6、荧光检测器7，对整个系统进行平衡；
(2)进样：第二六通阀8进行切换，自动进样器2将10μL样品注入系统随第一色谱泵1中的第八储液甁14中的水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V)进入第二六通阀8，共注入90μL(0.18mL/min的速度注入0.5min)，样品在定量环9中暂存；
(3)洗脱分析过程：第二六通阀8进行切换，第二色谱泵10将第四储液甁18中的水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V)带入连在第二六通阀8上的定量环9，样品进入第一六通阀3、色谱分离柱5(型号：Utimate XB-C18，4.6*150mm，5μm)进行分离，并通过紫外检测器6和荧光检测器7(激发波长333nm，发射波长460nm)进行分析。赭曲霉毒素A紫外响应较弱，此应用实例仅使用荧光检测器，紫外检测器为其他分析时备用。
(4)标准曲线的绘制：用水+乙腈+乙酸溶液(49.5+49.5+1，V/V/V)配制1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的校准曲线溶液，以质量浓度(X)与峰面积(Y)进行线性回归。得到校准曲线的线性方程为
Y＝108.9273X+98.1914，线性相关系数R2＝1.0。赭曲霉毒素A色谱图见图5，赭曲霉毒素A标准曲线见图6。
本液相色谱系统做在线前处理分析爽肤水中苯并(a)芘时，其步骤如下：
(1)进样和系统平衡过程：称取0.5g试样于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，超声提取30min，5000r/min离心5min，取上层清液过0.45um滤膜后，用于分析。自动进样器2将20μL样品注入系统并随第一色谱泵1中的第五储液甁11中乙腈和第六储液瓶12中的水(乙腈+水＝5+95)以1.0mL/min的速度进入第二六通阀8并转入第一六通阀3，样品中的苯并(a)芘在在线净化柱4(型号：Acclaim PolarAdvantage II 3μm，4.6*50mm)中富集，杂质和基质随异丙醇排入废液；第二色谱泵10以1.2mL/min的速度将第一储液甁11和第二储液甁12中的流动相(乙腈+水＝88+12)带入六通阀3、色谱分离柱5(型号：Utimate XB-C18，4.6*150mm，5μm)、紫外检测器6和荧光检测器7，对整个系统进行平衡。
(2)洗脱分析过程：第一六通阀3进行切换，第二色谱泵4以1.2mL/min的速度将第一储液甁15中的乙腈和第二储液甁16中的水(乙腈+水＝88+12)带入六通阀3上的在线净化柱4(型号：Acclaim PolarAdvantage II 3μm，4.6*50mm)，将在线净化柱4中的苯并(a)芘洗脱进入色谱分离柱5(型号：
Utimate XB-C18，4.6*150mm，5μm)进行分离，并通过紫外检测器6(波长254nm)和荧光检测器6(激发波长370nm，发射波长406nm)进行分析。
(3)在线净化柱洗涤及活化过程：第一六通阀3进行切换，第一色谱泵1将第五储液甁11中的乙腈和第六储液甁12中的水以1.0mL/min的速度(梯度比例见下表)经六通阀3带入在线净化柱7(型号：Acclaim PolarAdvantage II 3μm，4.6*50mm)，随后切换为第五储液甁11中的乙腈对在线净化柱进行洗涤，再切换为第五储液甁11中的乙腈和第六储液甁12中的水对在线净化柱进行活化再生，用于下一个样品的净化分析。同时第二色谱泵10以1.2mL/min的速度将第一储液甁15中的乙腈和第二储液甁16中的水(乙腈+水＝88+12)带入第一六通阀3、色谱分离柱5(型号：Utimate XB-C18，4.6*150mm，5μm)、紫外检测器6和荧光检测器7，对色谱分离柱5进行平衡。
(4)第一色谱泵1储液瓶8、9、10时间梯度程序见下表：
| 时间min | 储液瓶11(％) | 储液瓶12(％) |
| 0 | 5 | 95 |
| 0.3 | 5 | 95 |
| 1.8 | 5 | 95 |
| 8 | 5 | 95 |
| 8.5 | 100 | 0 |
| 22 | 100 | 0 |
| 23 | 5 | 95 |
(5)标准曲线的绘制：用乙腈配制0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.80ng/mL、4.0ng/mL、16.0ng/mL的校准曲线溶液，以质量浓度(X)与峰面积(Y)进行线性回归。得到校准曲线的线性方程为Y＝29928.1330X-5.1980，线性相关系数R2＝0.9999。苯并(a)芘色谱图见图7、8，苯并(a)芘标准曲线见图9，此应用实例中紫外检测器响应较低，仅用于出现阳性结果时对样品进行辅助定性，因此未做苯并(a)芘标准曲线。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (1)
1.一种用一体式液相色谱仪进行在线分析前处理和离线分析的方法，其中所述一体式液相色谱仪包括：自动进样器、两个色谱泵、两个六通阀、在线净化柱、色谱分离柱、紫外检测器、荧光检测器，其中，用于系统切换的第一六通阀(3)的六个接口依次分别为a、b、c、d、e、f，第二六通阀(8)的六个接口依次分别为g、h、i、j、k、l，自动进样器(2)分别与第一色谱泵(1)和第二六通阀(8)接口g相连，第二六通阀(8)接口k上连有第二色谱泵(10)，第二色谱泵(10)上连有多个储液瓶，第二六通阀(8)接口h和接口j之间连接有定量环(9)，第二六通阀(8)接口i与第一六通阀(3)接口d相连，第二六通阀(8)接口l与第一六通阀(3)接口a相连，第一六通阀(3)接口c上依次连接有色谱分离柱(5)、紫外检测器(6)和荧光检测器(7)，第一六通阀(3)接口b和接口e之间连接有在线净化柱(4)，第一六通阀(3)接口f为废液接口，第一色谱泵(1)上连有多个储液瓶；
其中所述方法包括以下步骤：
步骤一，当用做离线分析时，依次包括以下步骤：
(1)系统平衡过程：第二色谱泵(10)将储液瓶中的流动相带入第二六通阀(8)，经过定量环(9)进入第一六通阀(3)、色谱分离柱(5)、紫外检测器(6)、荧光检测器(7)，对整个系统进行平衡；
(2)进样：第二六通阀(8)进行切换，自动进样器(2)将样品注入系统随第一色谱泵(1)上储液瓶中的流动相进入第二六通阀(8)，样品在定量环(9)中暂存；
(3)洗脱分析过程：第二六通阀(8)进行切换，第二色谱泵(10)将第二色谱泵上储液瓶中的流动相带入连在第二六通阀上的定量环(9)，样品进入第一六通阀(3)、色谱分离柱(5)进行分离，并通过紫外检测器(6)和荧光检测器(7)进行分析；
步骤二，当用做在线前处理分析时，依次包括以下步骤：
(1)进样和系统平衡过程：自动进样器(2)将样品注入系统随第一色谱泵(1)中的流动相进入第二六通阀(8)，样品被带入第一六通阀(3)中在线净化柱(4)中富集，杂质和基质随流动相排入废液；第二色谱泵(10)将流动相带入第一六通阀(3)、色谱分离柱(5)、紫外检测器(6)和荧光检测器(7)，对整个系统进行平衡；
(2)洗脱分析过程：第二六通阀(8)进行切换，第二色谱泵(10)将流动相进入连在第一六通阀上的在线净化柱(4)，在线净化柱中样品进入色谱分离柱(5)进行分离，并通过紫外检测器(6)和荧光检测器(7)进行分析；
其中所述步骤二的(2)洗脱分析过程后还包括在线活化再生过程：第一色谱泵(1)将第一色谱泵上储液瓶中的流动相带入在线净化柱(4)，对在线净化柱进行活化再生，随后第一色谱泵(1)将第一色谱泵储液瓶中的流动相比列切换为进样初始比例，对在线净化柱进行平衡，用于下一个样品的净化分析。
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