CN112206754B - 一种亲和层析介质及其制备方法和应用 - Google Patents

一种亲和层析介质及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种亲和层析介质及其制备方法和应用，包括超大孔基质、聚合物刷和多肽配基；其中，多肽配基与大孔基质通过聚合物刷相连。利用本发明提供的亲和层析抗体具有结构稳定、耐盐、耐酸碱、配基不易脱落再生容易等优势，其中，在利用本发明提供的亲和层析介质提纯后的抗体纯度可达94％以上。

Description

一种亲和层析介质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白分离纯化技术领域，涉及一种亲和层析介质及其制备方法和应用。
背景技术
单克隆抗体因其特异性和高纯度已被广泛用于临床医学和生物技术等领域，并迅速推动着单克隆抗体下游纯化工艺的发展。目前，单抗药物工业下游纯化主要采用以Protein A及其衍生蛋白为主的亲和层析配基。重组这些蛋白配基对抗体拥有优良的特异性和选择性，被广泛应用于抗体的分离纯化，但是还存在价格昂贵、易脱落、不耐酸碱等缺陷，成为抗体生产工艺中的主要材料成本。此外，这些亲和介质多以琼脂糖为基质，琼脂糖由于其孔径在30nm左右，其还存在传质慢、凝胶压缩性差、不能高流速操作的瓶颈。如MabSelect Xtra和MabSelect SuRe等，随线性流速的增加(50～700cm/h)，动态载量会迅速下降40-50％左右。因此，发展低成本同时兼具高流速操作性能的抗体纯化介质是目前单抗药物下游工业亟待突破的重点工程技术。
多肽配基兼具蛋白的亲和性和生化稳定性，是近年来被认为是降低抗体纯化成本的有效途径之一。多肽配基由化学反应合成，价格低廉，分子量小，可以有效避免配基从介质上脱落造成的生物毒性，并且化学稳定性好，耐碱和耐酸远优于蛋白配基。另外基于聚合物骨架设计的超大孔介质，具有百纳米级的贯穿孔以及良好的刚性骨架，可以克服缓慢的传质速度，同时保持高效的结合能力。因此将多肽偶联于超大孔介质上有望将发展成为低成本并可快速分离生物大分子的新型层析介质。
目前多肽偶联于超大孔介质的主要瓶颈在于载量过低。尽管多肽配基固定于琼脂糖介质上已展现出较高的载量，但是在固定于超大孔介质上时，会因超大孔材料比表面积低而带来载量的明显下降。
CN104645949A公开了一种以四肽为功能配基的亲和层析介质及其制备方法，包括层析基质、空间臂和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，空间臂为己二胺，配基为酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸组成的四肽，制备方法包括：二甲基亚砜溶液中加入抽干基质和烯丙基溴进行活化；活化基质与N-溴代丁二酰亚胺反应；将溴代醇化的基质与己二胺反应，得到氨基活化基质；依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N'-二甲基甲酰胺洗涤，加入含有四肽、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、N,N'-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，偶联四肽配基；将偶联四肽的介质置于乙酸钠和乙酸酐的混合液中，得到以四肽作为功能配基的亲和层析介质。该专利基于抗体Fc片段的蛋白A结合位点而设计，抗体的结合选择性大幅度提高，可以用于抗体的分离，但是配体的负载量仍然较低。CN108191956A公开了一种组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用，其中组合型仿生层析介质以亲水性多孔微球为层析基质，采用烯丙基溴活化，N-溴代丁二酰亚胺溴代醇化，然后偶联组合型配基；组合型配基的序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5-氨基苯并咪唑。该专利在保留多肽配基对抗体的选择性高的特点上洗脱条件温和，但是仍然存在配基载量较低的情况。
因此，目前需要开发一种具有较高抗体载量的亲和层析介质来满足应用要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亲和层析介质及其制备方法和应用。本发明提供的亲和层析介质中包括的配基结构稳定并且配基载量较高，亲和层析介质通透性高，可实现大分子的快速传质，进而提高抗体的提纯速率。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种亲和层析介质，包括超大孔基质、聚合物刷和多肽配基；
其中，多肽配基与大孔基质通过聚合物刷相连。
本发明通过聚合物刷来固定多肽配基，在超大孔基质上连接长链结构的聚合物刷，在利用聚合物刷支链来固定多肽配基，可大幅度的提高配基的固载量，进而可以提高配基吸附抗体的量，并且超大孔基质的通透性高，对配体的传质速率快，因此可提高对抗体的提纯速率。
在本发明中，所述超大孔指的是孔道的孔径在100-500nm。具有100nm以上的孔道，可以保证在连接聚合物刷后仍然具有良好的通透性。
优选地，所述多肽配基的含量为10-30μmol/mL干基质，例如12μmol/mL干基质、15μmol/mL干基质、20μmol/mL干基质、22μmol/mL干基质、25μmol/mL干基质、28μmol/mL干基质等。“μmol/mL干基质”为含量单位，指的是相对于每毫升的干基质而言具有的微摩数。
优选地，所述多肽配基吸附含Fc片段的抗体。
本发明并不限定多肽配基的种类，现有技术中只要能吸附含Fc片段的抗体的多肽配基均可以满足用于本发明，示例性的，FYWHCLDE，HWRGWV，KHRFNKD等。
优选地，所述聚合物刷上偶联氨基葡萄糖。
优选地，所述聚合物刷的聚合单体带有环氧基。
优选地，所述聚合物刷为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。
优选地，所述超大孔基质的平均孔径为100-500nm，例如150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm等。
优选地，所述超大孔基质表面带有羟基、环氧基或醛基中的任意一种或至少两种的组合。
当带有环氧基和/或醛基时，可以还原反应为羟基，羟基与甲基丙烯酸缩水甘油酯带有的环氧基发生反应，然后甲基丙烯酸缩水甘油酯带有的双键进行聚合，可将聚合物刷连接到基质上。
优选地，所述超大孔基质选自甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物微球、甲基丙烯酸缩水甘油酯与甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物微球或甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的共聚物微球中的任意一种或至少两种的组合。
相比于传统的多糖基质的亲和层析介质，本发明的超大孔基质具有百纳米级的贯通孔，可以对大尺寸生物分子有很好的传质特性，偶联配基后，可以实现快速、高效和高通量的亲和层析过程。
所述亲和层析介质的操作流速范围广，为0-3000cm/h，耐受压力为0-20MPa；在流速10-1000cm/h流速范围内，结合目标物动态载量变化小于20％。
第二方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的亲和层析介质的制备方法，所述制备方法如下：
将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上，得到所述亲和层析介质。
优选地，所述带有聚合物刷的超大孔基质的制备方法如下：
(1)将聚合物刷的聚合单体接枝于超大孔介质表面并进行聚合，然后将氨基葡萄糖偶联于聚合物刷上；
(2)将氨基葡萄糖上带有的羟基氧化为醛基，得到所述带有聚合物刷的超大孔基质。
优选地，步骤(1)所述超大孔基质表面带有环氧基，先将环氧基还原为羟基，再进行接枝反应；
优选地，所述还原反应的温度为30-80℃，例如40℃、50℃、60℃、70℃等，时间为0.5-12h，例如1h、3h、5h、7h、8h、9h、10h、11h等，进一步优选温度为35-60℃，时间为1-10h。
优选地，所述还原反应在酸性溶液中进行。
优选地，所述酸性溶液的用量为所述超大孔基质质量的10-20倍，例如11倍、13倍、15倍、17倍、19倍等。
优选地，所述酸性溶液包括盐酸、硫酸或醋酸溶液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述酸性溶液的浓度为0.1-0.9M，例如0.2M、0.4M、0.6M、0.8M等。
优选地，所述接枝反应的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯。
优选地，所述接枝反应和聚合反应均在硝酸铈铵溶液中进行。
优选地，所述硝酸铈铵溶液的pH为1.0-3.0，例如1.5、2.0、2.5等。
优选地，所述硝酸铈铵溶液的浓度为0.5-3.6wt％，例如1.0wt％、1.5wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％等。
优选地，所述接枝反应的温度为30-80℃，例如40℃、50℃、60℃、70℃等，时间为1-3h，例如1.5h、2h、2.5h等。
优选地，步骤(1)所述氨基葡萄糖以溶液的形式进行偶联反应。
优选地，氨基葡萄糖水溶液的浓度为0.5-5.0wt％，例如1.0wt％、2wt％、3wt％、4wt％等，进一步优选1.0-4.0wt％。
优选地，所述氨基葡萄糖水溶液的pH为4-12，例如5、6、7、8、9、10、11等，进一步优选7-10。
优选地，所述偶联反应的温度为20-70℃，例如30℃、50℃、60℃等，时间为5-20h，例如10h、15h等，进一步优选为33-60℃，时间为7-18h。
优选地，步骤(2)所述氧化的氧化剂为高锰酸钾、高碘酸、高碘酸钾或次氯酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述的氧化在氧化剂水溶液中进行。
优选地，所述氧化剂水溶液的pH值为0.5-5，例如1、2、3、4等，进一步优选1-3。
优选地，所述氧化剂水溶液的浓度为0.5-5wt％，例如1.0wt％、2wt％、3wt％、4wt％等，进一步优选1-4wt％。
优选地，所述氧化的温度为25-80℃，例如30℃、50℃、70℃等，时间为1-8h，例如2h、3h、5h、7h等，进一步优选33-60℃，2-7h。
优选地，所述将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上的方法为：将带有聚合物刷的超大孔基质与浓度为0.5-10mg/mL(例如1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL等)的多肽配基的缓冲溶液混合，在15-40℃(例如20℃、30℃等)下反应5-25h(例如10h、15h、20h等)，得到所述亲和层析介质。
优选地，所述多肽配基的缓冲溶液的浓度为0.5-6mg/mL，例如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL等。
优选地，所述多肽配基的缓冲溶液的pH为5.0-11.0，例如6、8、10等，进一步优选为6.0-9.0。
优选地，所述多肽配基的缓冲溶液中还包括1wt％的硼氢化钠。
优选地，所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠体系、Tris-HCl体系或乙酸-乙酸钠体系中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了根据第一方面所述的亲和层析介质在提纯具有Fc片段的抗体中的应用。
优选地，所述具有Fc片段的抗体包括IgG抗体及其衍生抗体或片段。
第四方面，本发明提供了根据第一方面所述的亲和层析介质在血液透析中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过聚合物刷来固定多肽配基，在超大孔基质上连接长链结构的聚合物刷，在利用聚合物刷支链来固定多肽配基，可大幅度的提高配基的固载量，进而可以提高配基吸附抗体的量，并且超大孔基质的通透性高，对配体的传质速率快，因此可提高对抗体的纯化速率。
(2)利用本发明提供的亲和层析抗体具有结构稳定、耐盐、耐酸碱、配基不易脱落再生容易等优势，其中，在利用本发明提供的亲和层析介质提纯后的抗体纯度可达94％以上。
附图说明
图1是实施例1提供的亲和层析介质提纯抗体的层析谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种亲和层析介质，制备方法如下：
(1)超大孔基质的制备
参照CN105037626A制备超大孔微球，平均孔径为102.4nm。
(2)超大孔基质带有的环氧基还原为羟基
准确称取超大孔微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入浓度为2M的H2SO4水溶液，在40℃下120rpm振荡摇床中孵育2h后，抽滤，用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。
(3)在基质表面制备聚合物刷
将上述还原为羟基的超大孔微球放入pH为9.0、浓度为3.0％的硝酸铈铵溶液中，在65℃下反应0.5h，加入2mL甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，反应2h。
(4)聚合物刷偶联氨基葡萄糖
将上述微球放入pH为10.0、浓度为4％的氨基葡萄糖水溶液中，在50℃下反应12h，反应完毕后用去离子水洗涤至中性。
(5)氨基葡萄糖上带有的羟基氧化为醛基
将上述微球放入pH为1.0的2％高碘酸钠水溶液中，65℃下反应2h，反应结束后用去离子水洗涤至中性。
(6)固定多肽基质
将上述微球放入pH为7.0、浓度为5mg/mL的多肽(FYWHCLDE)的磷酸盐缓冲液中，加入1％的硼氢化钠，在室温下反应12h，反应完毕后用去离子水洗涤至中性，得到亲和层析介质。
性能测试
对实施例提供的亲和层析介质进行性能测试，方法如下：
(1)对抗体的分离纯化
a：实施例1提供的亲和层析介质经平衡缓冲液pH＝7.0的20mM磷酸钠盐充分平衡，然后用上样环进样500μL稀释后的人血清，用平衡缓冲液充分淋洗至基线，pH＝7.0的0.5M氯化钠缓冲液洗脱，分别收集穿透峰和洗脱峰，结果如图1所示，从图1可以看出，亲和层析介质能够很好的分离IgG抗体。
在图1中，从左往右，第一个峰为抗体穿透峰，第二个峰为抗体洗脱峰，第三个峰为再生洗脱峰。
b：分离IgG抗体的纯度检测，具体如下：将步骤(a)洗脱后的抗体由SDS-PAGE检测，使用10％的分离胶，4.5％的浓缩胶，上样浓度0.5mg/mL左右，20μL样品加5μL非还原性的上样缓冲液，在100℃中煮样6min，煮样完成后进行上样，上样体积是15μL，上样完成后，进行电泳，浓缩胶一般在电压在90mV条件下跑10min，然后将电压调节到180mV进行电泳，电泳完成后，用考马斯亮蓝染料染色30min，然后用脱色液(水:乙醇:乙酸＝7:2:1)进行脱色过夜，脱色完成后用凝胶成像仪进行条带的灰度检测，根据目标条带的灰度占同一泳道中所有条带灰度之和的比例，即可确定抗体的纯度为95.1％。
(2)亲和层析介质的稳定性
亲和层析介质进行分离纯化后，先用1个柱体积的纯水清洗层析柱，然后用5个柱体积的1M NaOH缓冲液淋洗柱子，再用2个柱体积的20mmol/L PB缓冲溶液，最后用5个柱体积的平衡液平衡，重复提纯抗体和介质清洗过程5次，5次层析操作的层析谱重复性良好，表明配基载量无明显变化。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的亲和层析介质及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (38)

1.一种亲和层析介质，其特征在于，包括超大孔基质、聚合物刷和多肽配基；所述超大孔基质的平均孔径为100-500nm；
其中，多肽配基与大孔基质通过聚合物刷相连；所述聚合物刷上偶联氨基葡萄糖；所述聚合物刷为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；所述多肽配基的含量为10-30μmol/mL干基质；
所述亲和层析介质采用如下方法进行制备，所述方法包括：将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上，得到所述亲和层析介质；所述带有聚合物刷的超大孔基质的制备方法如下：
(1)将聚合物刷的聚合单体接枝于超大孔介质表面并进行聚合，然后将氨基葡萄糖偶联于聚合物刷上；所述接枝反应的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；
(2)将氨基葡萄糖上带有的羟基氧化为醛基，得到所述带有聚合物刷的超大孔基质；
所述将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上的方法为：将带有聚合物刷的超大孔基质与浓度为0.5-10mg/mL的多肽配基的缓冲溶液混合，在15-40℃下反应5-25h，得到所述亲和层析介质；所述多肽配基的缓冲溶液中还包括1wt％的硼氢化钠。
2.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述多肽配基吸附含Fc片段的抗体。
3.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述超大孔基质表面带有羟基、环氧基或醛基中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述超大孔基质选自甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚物微球、甲基丙烯酸缩水甘油酯与甲基丙烯酸羟乙酯的共聚物微球或甲基丙烯酸缩水甘油酯与苯乙烯的共聚物微球中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上，得到所述亲和层析介质；
所述带有聚合物刷的超大孔基质的制备方法如下：
(1)将聚合物刷的聚合单体接枝于超大孔介质表面并进行聚合，然后将氨基葡萄糖偶联于聚合物刷上；所述接枝反应的单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；
(2)将氨基葡萄糖上带有的羟基氧化为醛基，得到所述带有聚合物刷的超大孔基质；
所述将多肽配基固定于带有聚合物刷的超大孔基质的聚合物刷上的方法为：将带有聚合物刷的超大孔基质与浓度为0.5-10mg/mL的多肽配基的缓冲溶液混合，在15-40℃下反应5-25h，得到所述亲和层析介质；所述多肽配基的缓冲溶液中还包括1wt％的硼氢化钠。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述超大孔基质表面带有环氧基，先将环氧基还原为羟基，再进行接枝反应。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述还原反应的温度为30-80℃，时间为0.5-12h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述还原反应的温度为35-60℃，时间为1-10h。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述还原反应在酸性溶液中进行。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液的用量为所述超大孔基质质量的10-20倍。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液包括盐酸、硫酸或醋酸溶液中的任意一种或至少两种的组合。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述酸性溶液的浓度为0.1-0.9M。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述接枝反应和聚合反应均在硝酸铈铵溶液中进行。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述硝酸铈铵溶液的pH为1.0-3.0。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述硝酸铈铵溶液的浓度为0.5-3.6wt％。
16.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述接枝反应的温度为30-80℃，时间为1-3h。
17.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基葡萄糖以溶液的形式进行偶联反应。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，氨基葡萄糖水溶液的浓度为0.5-5.0wt％。
19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，氨基葡萄糖水溶液的浓度为1.0-4.0wt％。
20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述氨基葡萄糖水溶液的pH为4-12。
21.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述氨基葡萄糖水溶液的pH为7-10。
22.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为20-70℃，时间为5-20h。
23.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为33-60℃，时间为7-18h。
24.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述氧化的氧化剂为高锰酸钾、高碘酸、高碘酸钾或次氯酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
25.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的氧化在氧化剂水溶液中进行。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂水溶液的pH值为0.5-5。
27.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂水溶液的pH值为1-3。
28.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂水溶液的浓度为0.5-5wt％。
29.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂水溶液的浓度为1-4wt％。
30.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氧化的温度为25-80℃，时间为1-8h。
31.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氧化的温度为33-60℃，2-7h。
32.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多肽配基的缓冲溶液的浓度为0.5-6mg/mL。
33.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多肽配基的缓冲溶液的pH为5.0-11.0。
34.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多肽配基的缓冲溶液的pH为6.0-9.0。
35.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠体系、Tris-HCl体系或乙酸-乙酸钠体系中的任意一种或至少两种的组合。
36.根据权利要求1-4中的任一项所述的亲和层析介质在提纯具有Fc片段的抗体中的应用。
37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述具有Fc片段的抗体包括IgG抗体及其衍生抗体或片段。
38.根据权利要求1-4中的任一项所述的亲和层析介质在血液透析中的应用。
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