JPS59169490A - 酸性プロテア−ゼの採取法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酸性プロテアーゼ含有液から酸性プロテアー
ゼを効率良く採取する方法に関する。

従来酸性プロテアーゼの採取法としては、イオン交換樹
脂、イ万ン交換セルロース等を用いる吸着法が知られて
いるが、これらの方法によれば酸性プロ、テアーセ含有
液に、例えば酸性プロテアーゼと物理的性質の類似する
アミノペプチダーゼ等の酵素が混在する場合、これらの
夾雑酵素を分離、除去する操作が著しく繁雑となるばか
りでなく目的とする酵素の収率も劣下する等の欠点があ
った。

そこで本発明者等は、鋭意検削した結果、水に不溶でか
つ親水性の重合体と共有結合したペプスタチン（以下固
定化ペプスタチンと略称する）に酸性プロテアーゼを特
異的に吸着させ、次いでこれを水素結合もしくは疎水結
合を弱める機能を有する蛋白変性試薬で溶出させること
により、酸性プロテアーゼが効率良く得られることを知
り、本発明を完成した。

即ち、本発明は、酸性プロテアーゼ含有液に、水に不溶
でかつ親水性の重合体と共有結合したペプスタチンを接
触させ、酸性プロテアーゼを吸着苫せた後、水素結合も
しくは疎水結合を弱める機能を有する蛋白変性試薬で溶
出することを特徴とする酸性プロテアーゼの採取法でア
ル。

以下、本発明の詳細な説明する。

不発明で用いられる酸性プロテアーゼ含有液としては、
酸性プロテアーゼを含む液であれば如何なるものでも良
く、例えば通常の醤油醸造法によす製造した醤油、アス
ペルギルス・ソーヤ／−／／λ（ＦＥＲＭ−Ｐ扁ｊ０Ｉ
Ｉ−）、アスペルギルス・ソーヤ／　　／　９　Ｑ　（
ＦＥＲＭ−Ｐ　Ａ夕０夕）、アスペルギルス・オリセー
≠乙Ｑ（ＦＥＲＭ−Ｐ扁／／１１９　）等の酸性プロテ
アーゼ生産菌を常法により培養して得られる培養液もし
くはこれを水、有機溶剤等で常法により抽出して得た培
養抽出液等が好適な例として挙げられる。

又、上述の酸性プロテアーゼは、主としてｐＨ３付近に
至適ｐＨを持つプロテアーゼであるが、通称酸性プロテ
アーゼと言われるものであれば何れも有効である。

次に本発明に用いられる固定化ベグスタチンは、例えば
以下の手段により製造される。

先ず担体として水酸基、アミン基、カルボキシル基及び
これらの官能基が活性化されたものよりなる群から選ば
れた７種以上の基を分子中に有する水に不溶性でかつ親
水性の重合体を、例えばセルロースｒ例えばセラックス
（バイオラド社製）〕、セファロース［ｆＥｔＪｆセフ
ァロースｔｌ−Ｂ（ファルマンア社製）、セファロース
乙Ｂ（ファルマシア社製）〕等の水酸基全分子中に有す
る重合体、又アミノ基を有する重合体としてアミノエチ
ルセハロース〔例えばセレソクスＡ　Ｆ　Ｌ　（バイオ
ゲル社製）〕、ナイロン、ハイドパウダー等、及びカル
ボキシル基を有する重合体としてカルボキシルメチルデ
キストラン〔例えばＣＭ−セファデックス（ファルマシ
ア社製）〕等の中から適宜に選定する。

次いでこれらの担体と酸性プロテアーゼ阻害剤として知
られているペプスタチンとを、公知方法、例えば千畑編
「固定化酵素」／／〜≠０頁（講談社、昭和！θ年３月
２θ日発行）、山崎編「アフイニテイ・クロマトグラフ
ィー」７９〜３２頁（講談社、昭和５０年）月／日発行
）に記載の方法を用いて製造する。

なお上述の重合体とペプスタチンを共有結合させる際、
スペイサ−を用いるのが好ましく、この具体例としては
該重合体とペプスタチンとの距離が炭素原子６個分以内
、好ましくは２個分以内となるようなスペイザーで、例
えばジアミノメタン、ジアミノエタン等である。

この様にして得た固定化ベグスタチンは、通常はゲル状
で使用する。例えば固定化ペプスタチンを酸性プロテア
ーゼ含有液と共に容器内で混合攪拌して接触させるが、
この場合好ましくは約７０分以上保持する。酸性プロテ
アーゼ含有液と接触させた固定化ペプスタチンは、酸性
プロテアーゼ含有液より濾過又は遠心分離法を用いて分
離する。

接触処理する方法としてはこの他、固定化ペプスタチン
を充填したカラムに該含有液を通液する方法を採用して
も良く、この場合にはＳＶ−、Ｚθ以下、好まし、くは
ｓ　Ｖ−ｊ〜／θ程度であり、又処理温度は０〜３０℃
、好ましくは５〜１０℃である。

この様にして酸性プロテアーゼを吸着した固定化ペプス
タチンから酸性プロテアーゼを採取するには、水素結合
もしくは疎水結合を弱める機能を有する蛋白変性試薬を
用い、２０”Ｃ以下好ましくは５℃以下で洗浄し回収す
る。

上記した蛋白変性試薬としては、尿素、塩酸グアニジン
等が好適に用いられ、例えば尿素を用いる場合、その濃
度はＯｊ−≠Ｍ程度が好ましい。

なお本発明に於いて、水素結合もしくは疎水結合を弱め
る機能を有する蛋白変性試薬を用いることにより、酸性
プロテアーゼとベグスタチンの結合が強く、極め°て溶
出困難とされて酋た酸性プロテアーゼの溶出も、著しく
容易にした。

そして本発明により採取される酸性プロテアーゼは、医
薬用として、又飼料添加剤等として有用である。

以下、実施例にょシ本発明を具体的に説明する。

実施例１ セファロース６Ｐ（ファルマシア社製）ｇ０１πｅに２
Ｍ炭酸ソーダ１＝Ｏｒｎｌ及び臭化シアン１０？を含む
アセトニトリル溶液ｊ　ｒｒｔｌを加え、３分間攪拌し
た後、冷重曹、２１で洗浄し、活性化されたセファロー
スに／アミノエタン３７を添加し、／Ｎ−水酸化ナトリ
ウムでｐＨ９！ｒに調整後１．２３℃でλθ０時間反応
せ水洗した後、ジオキサンで洗浄し活性セファロース６
Ｂを得た。

一方ペプスタチン（蛋白質研究会奨励金製）／θＱ　ｙ
ｎｇ　、ジシクロへキシルカルボジイミド乙θ〃ｉｇ及
び／Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド３θ〃１７をジメチ
ルフォルムアミド／２ｔｎｌ！に溶解し、≠θ℃で７２
時間反応させ、ガラスフィルターで濾過し活性ペプスタ
チンを得り。

両者’ｔＨ／　ＯｍｌＥのジオキサン中で攪拌しカップ
リングさせた後、これをジメチルフォルムアミト−ジオ
キサン混合溶液ＣＩ＝２（Ｖ／Ｖ）’Ｊで洗浄後、更に
水で洗浄しセファロース乙Ｂに固定化したペプスタチン
を得た。

この固定化ペプスタチン乙Ｑｍｌ　ｆカラムに詰め、次
いで濃口生醤油夕θｔを３’Ｃで５Ｖ＝＝乙の速さで流
下させ、酸性プロテアーゼを特異的に吸着させた（吸着
てれた全酸性プロテアーゼ活性は９０．０００ＰＵであ
った）。

次いで上述の酸性プロテアーゼを吸着した固定化ペプス
タチンを、０７Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４４５）で洗浄した
後、これを２Ｍ尿素を含む０．７Ｍ酢酸ソーダー塩酸緩
衝液（ｐＨ３，０）で流下させ（流下速度、ｓｖ＝、２
）酸性プロテアーゼ標品Ｃ３０ＰＵ／、／ｌ’）乙θ０
０ｒｎｌを得た。

実施例２ 鈑／２乙θにりに水９．３ｔを加え、これを２Ｋｇ／ｃ
２１−Ｇで２０分間蒸煮し、次いでこれにアスペルギル
ス・ンーヤ／　−／　／　２　（ＦＥＢＭ　Ｐ−扁夕０
≠）を接種して３θ℃で６０時間培養して麹を得、該地
中の酵素を水で常法によシ抽出し皺麹の抽出液３θｔを
得た。

次に実施例１で用いた固定化ペプスタチンｇＱｍ／？　
ｆカラムに充填し、次いで上記した皺麹の抽出液３０１
を塩酸でｐ　Ｈ４４ｔに調整したものを、１℃で、Ｓ■
＝夕の速さで流下させ、酸性プロテアーゼを特異的に吸
着させた（吸着された全酸性グロテアーセｌ占性は／２
０，０θθＰＵであった）。

そして上述の酸性プロテアーゼを吸着した固定化ペプス
タチンを、（：）、　／　ｉＪ酢酸緩腫ｉ液（ｐＨ≠ｊ
で洗浄した後ζこれを２Ｍ尿素を含む０．７Ｍ酢酸ノー
グー塩酸緩衝液（ｐＢ３．０）で流下させ（流下速度、
　　ｓ　ｖ−，２）　、酸性プロテアーゼ標品（３３Ｐ
　Ｕ　／　ｒｒｔｌ４　）　／　００θｔｒｉｅ　ｆ　
得た。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸性プロテアーゼ含有液に、水に不溶てかつ親水
   性の重合体と共有結合したペプスタチンを接触さぜ、酸
   性プロテアーゼを吸着させた後、水素結合もしくは疎水
   結合を弱める機能を有する蛋白変性試薬で溶出すること
   を特徴とする酸性プロテアーゼの採取法。
2. （２）酸性プロテアーゼ含有液が醤油である特許請求の
   範囲第（１）項記載の酸性プロテアーゼの採取法。
3. （３）重合体が水酸基、アミノ基、カルボ斤７ル基から
   なる群より選ばれた７種以上の基を含むものである特許
   請求の範囲第（１）項記載の酸性プロテアーゼの採取法
   。
4. （４）蛋白変性試薬が尿素である特許請求の範囲第（１
   ）項記載の酸性プロテアーゼの採取法。