SU942427A1 - Способ очистки протеолитических ферментов - Google Patents

Abstract

liCnOCOB ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно ввод т во взаимодействие с раствором к нденсируюсцего агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийс  тем, что, с целью повышени  эффективности процесса за счет увеличени  выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевлени  и упрощени  процесса, в качестве носител  используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве носител  используют аминосилохром. 3.Способ по п. 1, отлича ющ и и с   тем, что в качестве кон{денсирующего агента используют (зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат . 4.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в качестве лиганда используют п-(со-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полйпептид. 5.Способ по п. 4, отличающийс  тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийс  тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качестS ве лиганда используют антибиотик Л полипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0. 7.Способ по пп. 1-5, отличающийс  тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли| пептид, а процесс ведут при рН 6,0|8 ,5. 8.Способ по пп. 1-4, о т л ичающийс   тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют п- (со-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5. 9.Способ по п. 8, отличающийс  тем, что процесс осуществл ют при рН 7-8. 10.Способ по пп. 1-4 и 7-9, отличающийс  тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию - в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита .

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, в част ности к области получени  высокоочи щенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, в производстве моющих средств, а также дл  исследовательских целей. Наиболее перспективным дл  избирательной очистки ферментов  вл етс  метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно св занным с нерастворимым носителем, что позвол ет раздел ть ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники, Наиболее широко выделение ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецйфических сорбентов, представл ющих собой нерастворимые носители - производвые агарозы, активированные бромцианом и ковалентно св занные с лигандами - веществами специфическими дл  данного класса ферментов. Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции ферментных растворов на нерастворимом носителе, представл ющем собой производное агарозы сефарозу Зв, который ковалентно св зан с лигандом посредством конденсирующего агента (бромциана) с последующей десорбцией сорбированных ферментов, причем в качестве лиганда используют антибиотик-полипептидбацитрацин ,  вл ющийс  неконкурентны.. ингибитором р да протеиназ. Очистку провод т при рН 1,8-8,0, Десорбцию осуществл ют солевыми буферами или буферами с добавлением органических растворителей JLJ , Выход ферментов по активности достигает 86%, степень очистки 295 раз в зависимости от чистоты исходного препарата. Данный способ обладает р дом ненестатков . Примен ема  сефароза 4в  вл етс  (Импортным дорогосто щим продуктом, Кроме того, недостаточна  механическа  прочность производных агарозы и способность их разрушатьс  под воздействием некоторых ферментов, сопут ствующих очищаемым протеиназам, огра ничивает возможности применени  сефарозы . Недостатком данного способа  вл етс  также применение высокотоксичного бромциана. Указанный способ не обеспечивает достаточной эффективности процесса очистки, гак как сорбенты., полученны на основе сефарозы, содержат от 0,8 до 8 мкмоль лиганда на 1 мл влажного сорбента. Така  концентраци  лиганда не позвол ет добитьс  максимальной сорбции фермента на единицу объема колонки. Дл  обеспечени  более эффективного процесса очистки в р де случаев полезно увеличить концентрацию лиганда, что позвол ет увеличить выход ферментов по активности и чистоте. Целью изобретени   вл етс  повышение эффективности процесса за счет увеличени  выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевление и упрощение процесса. Указанна  цель достигаетс  предлагаемым способом очистки протеолитических ферментов, путем сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или.равном 1,8, на нераство- РИМОМ носителе, который предварительно ввод т во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом , И десорбции . сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей , причем в качестве носител  используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента. Кроме того, в качестве носител  используют аминопроизводный кремнеземсодержащий материал. Процесс ведут при рН 1,8-9,5. В качестве носител  предпочтительно используют аминопроизводные макропористого микросферического кремнезема типа Поросил или Силохром (обычно-- аминосилохром) имеющие внутри зерен крупные поры более или менее однородного размера. Они отличаютс  высокой механической и термической стабильностью. Кроме того, важным преимуществом макропористых кремнеземов по сравнению с другими материалами того же назначени , например сефарозой,  вл етс  высока  химическа  чистота, строго контролируемый размер пор, возможность достижени  больших скоростей фильтрации и легкость стерилизации, Оилохромы выпускаютс  в больших количествах отечественной промышленностью и  вл ютс  значительно более дешевым продуктом чем сефароза. Используемый в способе аминосилохром характеризуетс  высоким, содержанием реакционноспособных аминогрупп , что дает возможность повысить содержание лигандов от б до 100 мкмоль на 1 мл влажного сорбента, а также обладает лучшими по сравнению с сефарозой гидродинамическими свойствами , что позвол ет увеличить скорость и производительность процесса очистки. В качестве конденсирующих агентов дл  св зи носител  с лигандом обьлчно используют п-бензохинон, или карбодиимид , или гексаметилендиизоцианат. В качестве лиганда используют обычно п- (U)-амин омет ил) -фенилборную -O- i-Cfflj-dHj-dH -NH +l Hjd-d o Нгй-С1 0 NH,dH,/ В (он). /j)-N.c N-dHz-dH2-dH ОН -o- i-dH -dHz-dHz-NH-dАнтибиотики-полипептиды , используемые в качестве лигандов,  вл ютс  ингибиторами карбоксильных протеиназ . Этим обусловлено специфическое взаимодействие сорбента с протеолитическими ферментами различных классов . Присутствие в молекулах антибиотиков D-аминокислот и характерные дл  циклопептидов особенности пространственной структуры преп тствуют их расщеплению ферментами.

Бацитрацин представл ет собой природный циклододекапептид, содержащий три D-аминокислоты. Бациллихин - отечественный препарат, аналогичный бацитрацину, выпускаетс  в больших количествах промышленностью дл  использовани  в животноводстве. В молекуле другого природного циклододекапептида , грамицидина С, преобладают гидрофобные аминокислоты. В отличие от бацитрацина, в составе которого имеютс  дикарбоновые аминокислоты , а грамицидине С содержитс  больше нейтральных аминокислот, а также диаминокислота - орнйтин. Тонкие различи  в строении молекул лигандов усиливают специфичность сорбентов к различным протеиназам. В р де случаев грамицидин-С-силохром и бацитрацин-силохром  вл ютс  взаимодополн ющими сорбентами: фермент, который не сорбируетс  на одном из них, можно успешно хроматографировать на другом. Эти свойства можно

I

использовать дл  разделени  смеси, содержащей два протеолитических фермента .

Используема  в качестве п- {Cj-аминометил) фенилборна  кислота обладает групповой специфичностью по отношению к классу сериновых протеиназ , образу  лабильные комплексы с функциональными группами активного центра фермента.

При очистке карбоксильных протеиназ обь1чно .используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид , а процесс ведут при. рН 1,8-5,0.

При очистке сериновых протеиназ обычно в одном случае используют носители , содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, и процесс ведут при рН 6,0-8,5, в другом случае используют носители, содержащие в качестве лиганда п-(СО-аминометил) фенилборную кислоту, и процесс ведут при рН 6-9,5, предпочтительно 7-8.

Сорбцию сериновых протеиназ предпочтительно ведут при дополнительном присутствии глицерина, а десорбцию в присутствии раствора многоатомных спиртов, например пентаэритрита.

Важным преимуществом описываемого способа  вл етс  возможность его применени  дл  очистки препаратов ферментов, содержащих в качестве примесей большое количество целлюлаэ, кислоту или антибиотик-полипептид: бацитрацин, бациллихин, грамицидин С. Конденсаци  носител  с лигандом с помощью конденсирующего агента 5 иллюстрируетс  следующей схемой duflcxpaff J4NH2-(dN-dO-NH) R HjCizO-rfi-OCzHj Анти иотикполипептид 2-K О . H -dHz-d-KH-dHz-/ VBfoH) декстранаэ и ферментов, способных гидролизовать агарозу. Неорганическ носители на основе макропористого кремнезема устойчивы к действию ферментов и бактерий. Описываемый способ позвол ет исключить применение высокотоксичного бромциана, зам нить дорогосто щий импортный продук сефарозу отечественными носител ми, повысить эффективность процесса очистки. Описываемый способ позвол ет очи щать с выходом 75-100% различные протеолитические ферменты с увеличе нием активности в 1,5-100 раз в зависимости от чистоты исходного препарата Способ особенно эффективен при извлечении ферментов непосредственн из культуральной жидкости, содержащ окрашенные примеси. В таких случа х выдел ютс  практически чистые ферменты , причем вследствие высокой из бирательности сорбентов значительны эффект достигаетс  в одностадийном процессе очистки. Кроме того, описываемые биоспеди фические сорбенты могут быть пригленены дл  работы с растворами в широ ком диапазоне рН (1,8-9,5), Это дае возможность использовать их дл  выделени  протеолитических ферментов различных классов, включа  карбокси ные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы. Способ осуществл ют следующим образом, Дл  синтеза носителей, необходимых дл  очистки требуемого фермента используют производные, макропористы кремнеземов, например аминосилохром который обрабатывают смесью конденсирующих агентов и лигандоЕ в соответствующих буферных системах. На пример, дл  очистки карбоксильных протеиназ - смесью, содержащей бензохинон и антибиотики-полипептиды, дл  сериновых протеиназ - смесью, содержащей  нтарный ангидрид, п-(Со-аминометил )фенилборную кислоту и водорастворимый карбодйимид. Сорбцию ферментов провод т в дин мическом или статическом режиме Пр этом происходит избирательное св зываЕ ие протеиназ с нерастворимым носителем . Затем носитель со св занным белком промывают соответствующим бу ферньом раствором. При этом происходит отделен.ие примесей, в том числе и окрашенных. Дл  десорбции используют растворы солей различной концентрации. В тех случа х, когда фермент св зываетс  с сорбентом настолько прочно что его не удаетс  элюировать, примен ют растворы солей, к последним добавл ют .органические растворители способствующие более эффективной десорбции . Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофильно после обессоливани  гельфильтрацией или диализа. В приведенных примерах по очистке р да протеиназ на колонке с биоспецифическими сорбентами количество нанесенного и элюированного белка измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 2ЙО нм. Активность ферментов измерена по скорости гидролиза гемоглобина (пример 1, 2); по .ск орости створаживани  молока (примеры 3 - 6) , по скорости расщеплени  синтетических субстратов: о;-карбоксипропионилфенилаланина (пример 7) и п-нитроанилида карбобенэокси-1 .-аланил-1-аланил-1-лейцина (пример 8). Пример 1. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бацитрацин-силохроме. Дл  синтеза бацитрацин-силохрома используют 1 г аминосилохрома (340 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1 М ЫаНСОз , рН 10,0, 34 мг п-бен зрхинона в 2 мл абсолютного диметилформамида и 220 мг бацитрацина. Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставл ют на ночь при 5°С. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М NaliCO-j с рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами . Полученный темноокрашенный сорбент по данным аминокислотного анализа содержит 46 мкмоль бацитрадина на 1 г сухого сорбента. Дл  очистки пенсина 0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 23 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бацитрацинсилохромоме Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 25%-ным изопропиловым спиртом в 1 М NaCg с рН 5,0, Удельна  активность пепсина свиньи в элюате 34 е.а./мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,5 раза. Пример 2. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бациллихин-силохроме. Промышленный препарат бациллихина содержит нерастворимый наполнитель . Дл  извлечени  бациллихина препарат трижды экстрагируют кип щим метанолом или этанолом. Экстракты упаривают в вакууме до небольшого объема. Осадок бациллихина, выпавший при охлаждении, отфильтровывают и высушивают. Дл  .синтеза бациллихин-силохрома с пользуют 100 г аминосилохрома

(120 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1М МаПСО-з, рН 10, 864 мг п-бензохинона в ЬО мл абсолютного диметил .формамида и 12,8 г бациллихина. Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставл ют на ночь при . Затем сорбент тщательно промывают О,1М NaHCO-, рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами . Полученный темноокрашенный с ербент по данным аминокислотного анализа содержит 16 мкмоль бациллихина на 1 г сухого сорбента. Дл  очистки пепсина 0,1М ацетатный буферной раствор м рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 22 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихинсилохромом . Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 2Ь%-ным изопропиловым спиртом в 1М NaCg, рН 5,0. Удельна  активность пепсина свиньи в элюате 34 е.а./мг. Выход по активности составл ет 100%, очистка в 1,5 раза

Пример 3. Очистка протеиназы из Trichoderma Eignorum на бацитрацин-силохроме .

Синтез бацитрацин-силохрома осуществл ют по примеру 1. О,1М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий 4 Г-белка (неочищенную смесь протеиназ и целлюлаз) с удельной активностью 13,0 е.а./о.е,, пропускают через хроматографическую колонку (6x1,5 см), заполненную бацитрацин-силохромом . Затем сорбент промывают исходным буфером и элюируют последовательно 1М NaC в том же буфере и 25%-ным изопропанолом в 1М NaCB, рН 5,0. Собирают солевую (1) и изопропанольную (11) фракции элюата, содержащие активный белок. Удельна  активность фракции 1 216 е.а./о.е. Очистка в 16,6 раза. Удельна  активность фракции 11 58 ,6 е.а./о.е. Очистка в 4,4 раза. Выход активного белка 97%.

Пример 4. Очистка ультрафильтрата культуральной жидкости базидального гриба Russula dec dorans Fr-0456 на бацитрацин-силохро-ме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществл ют по примеру 1. Ультрафильтрат культуральной жидкости с удельной активностью 13 е.а./о.е. по створаживанию молока пропускают через хроматографическую колонку (6x1,5 см), заполненную, бацитрацинсилохромом и уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем сорбент промывают исходным буфером и последовательно элюируют 1М NaCI, рН 4,5 в том же буфере (фракци  1) и 25%-ным изопропанолом в 1М NaCI рН 5,0 (фракци  11). Удельна  активность фракции 1 - 664 е.а./о.е..

очистка в Ы раз, фракции 11 260 е.а./о.е., очистка в 20 раз: Выход, активного белка 100%.

Пример 5. Очистка ультрафильтрата культуральной жи,дкости базидального гриба Russula decdorans Fr-04b6 на бациллихин-силокроме.

Синтез бациллихин-силохромг. осуществл ют по примеру 2. Ультрафильтрат культуральной жидкости, с удельной активностью 3,3 е,а./о„е. пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихин-силохромом , уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем промывают сорбент тем же буфером . Активный фермент элюируют 20% изопропанолом в 1М NaCI, рН . дельна  активность фермента в элюате 120 е.а./о.е., очистка в 36 раз. Выход по активности 90%.

Пример 6 , Вьщелен 1е двух протеиназ из высушенного экстракта культуральной жидкости баз1адального гриба Russula decdorans Fr-0456 с помощью бациллкхин-силохрома и грамицидин-С-силохрома .

Экстракт, содержащий фермент с удельной активностью 180 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (25x1,5 см) с бациллихинсилохромом , уравиовеи.1екную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Собирают прошедший через сорбент раствор,который содержит протекназу 1. Удельна  активность раствора 2,6 е.а./о.е. Колонку промывают исходным буфером. Протеиназу 11, сорбированную на коонке элюируют изопропанолом в 1М NaCI, рН 4,5. Удельна  активность фермента в элюате 380 е.а./о.е. Выход по активности 88%, очистка в 2,4 раза.

Раствор, содержаадий протеиназу 1, не сорбировавшуюс  на 6ациллихин силохроме, пропускают через хроматографическую колонку (18x1 см) с грамицидин-С-силохромом.

Дл  получени  сорбента используют 50 г аминосилохь ома (50 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1М ЫаИСОэ, рН 10, 162 мг п бензохинона в 30 мл абсоютного диметилформамида и 2,1 г грамицидина С, .Услови  синтеза те , что в примерах 1,2

Колонку с сорбированной протеиназой 1 промывают 0, 1М ацетатньп- буфером , рН 4,5, активный д)ермент элюируют 20%-ным изопропанолом в 1 М Wace, рН 4,5. Удельна  активность фермента в элюате 370 е.,ае/о.е,, очистка в 3,7 раза, выход по активности 60%.

Пример 7. Очистка 05-химотрипсина на фенилборонат-силохроме. Д/ш синтеза сорбента использова65 -ПИ аминосилохром (415 мкмоль аминогрупп на 1 г),  нтарный ангидрид и хлоргидрат п- (СО-аминометил) фенилборной кислоты.

3 г аминосилохрома обрс1батывают в течение 20 мин при 20°С раствором 1 г  нтарного ангидрида в 9 мл диметилформамида. Избыток ангидрида удал ют промывкой 50 мл диметилфор мамида и водой. К 3 г полученного сукцинилсилохрома прибавл ют 333 мг хлоргидрата п- (w-аминометил)фенилборной кислоты в 15 мл. воды. Затем при рН 5 добавл ют 3 г водорастворимого карбодиимида, Смесь выдерживают 1 ч при при осторожном периодическом перемешивании о Сорбент отфильтровывают и промывают большим количеством воды, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный фенилборонат-силохром содержит 215 мкмолей лиганда на 1 г сухого сорбента (или 100 мкмолей на 1 мл влажного сорбента). На колонку с 2 мл фенилборонат-силохрома нанос т раствор 10 мг 06 -химотрипсина в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5о Удельна  активность раствор 0,025 е,а,/мг. Затем сорбент промывают 50 мл исходного буфера 1М NaC в том же буфере, 0,5 М глицерином в том же буфере, фосфатным буфером, рН 9, и элюируют белок 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере рН9. Получают 5,9 мг белка с удельной активностью 0,053 е.а„/мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,7 раза.

П- р и М е р 8. Очистка субтилизина А-50 на фенилборонат-силохроме .

На. колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома , полученного по методу, приведенному в примере 7, и уравновешенного 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, нанос т 40 мл культуральной жидкости Вас, Subtilis А-50 с рН 7, с удельной активностью 0,08 е,а./мг по гидролизу Z-Ala-Ala-Leu-pNA, Колонку последовательно промывают 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, 1М NaCI в том же буфере, 0,5М глицерином в том же буфере, 0,05М фосфатным буфером, рН 9, Активный бело элюируют О,5М пентаэритритом в 0,05М фосфатном буфере, рН 9. Посл обессоливани  и лиофилизации получают 2,26 мг белка с удельной активностью 1,08 е.а./мг, выход 80%, очистка в 13,7 раз.

Пример 9, Синтез фенилборо нат-силохрома с применением в качестве конденсирующего агента гекса (метилендиизоцианата,

К 1 г аминосилохрома (340 мкмоль NH -rpynn) прилийают избыток гексаметилендиизоцианата и оставл ют при комнатной температуре на 15 мин, затем промывают аминосилохромдиметилфор .мамидом и водой. Получают сорбентi содержащий 300 мкмоль изоцианатных групп на 1 г носител . К 1 г такого сорбента приливают раствор 200 мг п- (aJ-аминометил) фенилборной кислоты 5 в 5 мл диметилформамида, оставл ют на 20 мин при комнатной температуре, затем избыток реактивов отмывают диметилформамидом и водой. Получают фенилборонат-силохром с содержанием

0 лиганда 150 мкмоль/г.

Пример- 10. Очистка пепсина на. грамицидин-С-силохроме.

К раствору 25 мг препарата свиного пепсина (производства Московского

5 м сокомбината) в 10 мл 0,05М универсального буфера, рН 1,8, добавл ют 200 мг грамицидин-С-силохрома, перемешивают 20 мин, раствор декантируют, промывают сорбент п ть раз по 5 мл

Q универсального буфера, рН 1,8, и элюируют пепсин дважды по 5 мл 1М хлористого натри  в 0,05М универсальном буфере, рН 1,8, содержащем 25% изопропанола . Выход по активности 30%,

5 очистка в 10 раз.

Пример 11. Очистка-субтилизина BPN на бацитрацин-силохроме.

К раствору 25 мг субтилизина BPN (Серва) в 10 мл универсального буфера, рН 6,0, прибавл ют 200 мг

бацитра1/ин-силохрома, перемешивают 20 мин, промывают сорбент п ть раз по 5 мл 0,05М универсального буфера, рЫ 6,0, и элюируют субтилизин дважды по 5 мл 1М хлористого натри  в

5 0,05М универсальном буфере, рН 6,0, содержащем 25% изопропанола. С выходом 45% получают субтилиаин BPN, обладающий активностью по Z-AIa-AIa-Leu-pNA , 1,5 е.а./мг,. очистка в

0 1,5 раза.

Пример 12. Очистка субтилизина 72 на бацитрацин-силохроме.

На колонку с 10 мл бацитрацин-сиг лохрома, уравновешенную 50 М трис-буфером , рН 8,5, нанос т раствор 2 г промышленного препарата субтилизина 72 (Протосубтилин ГЗх) с удельной активностью 0,166 е.а./мг. Колонку промывают 50 мМ трис-буфером, рН 8,5, затем 1М хлористым натрием в том же буфере. Активный фермент элюируют 1М хлористым натрием в 50 мМ трисбуфере , рН 8,5, содержащем 20% изопропанола . В результате получают 5 56 мг препарата с удельной активностью 7,7 е.а./мг. Выход по активности 130%, очистка в 40 раз.

Пример 13, Очистка щелочной 0 сериновой протеазы Вас. Lichenifor- mis на фенилборонат-силохроме.

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома (200 мкмоль лиганда на 1 г (сорбента), уравновешенную 0,5М гли .5 церином в 0,05М фосфатном буфере.

11 94242712

рН 6,0, нанос т раствор 10 мг про-Протеазу элюируют 0,5М пентаэритримышленного препарата сериновой про-том в 0,05М фосфатном буфере, рН 9.5.

теазы Вас. licheniformis в 5 мл тогоВыход по активности 150%, очистка

же буфера. Колонку промывают тем жев Ь,6 раз, полученный препарат имеет

буфером, 1М хлористым натрием вудельную активность, определ емум. по

0,05М фосфатном буфере, рН 6,0, и5 гидролизу Z-AIa-AIa-Le i-pNA,

0,05М фосфатным буфером, рН 9,5.18 е.а./мг.

Claims (10)

1^СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при pH, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса за счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при pH 1,8-9,5 в зависимости от pH-оптимума фермента .

2. Способ поп. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром.

3. Способ поп. 1, отличающий с я тем, что в качестве кон-, {денсирующего агента используют п-Ъен(зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат .

4. Способ поп. 1, отличающийся тем, что в качестве лиганда используют п-(со-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полйпептид.

5. Способ поп. 4, отличающийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С.

6. Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качест-< ве лиганда используют' антибиотикполипептид, а процесс ведут при pH 1,8-5,0.

7. Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли пептид, а процесс ведут при pH 6,0- ,8,5.

8. Способ по пп. 1-4, о т л ичающийс я тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют п- (Q-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ве- \ дут при pH 6,0-9,5.

9. Способ поп. 8, отличающийся тем, что процесс осуществляют при pH 7-8.

10. Способ по пп. 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию - в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита.