SU777041A1 - Биоспецифический сорбент дл аффинной хроматографии трипсина - Google Patents

Description

3

мость (цена сефарозы 125 руб/кг); загр знение им окружающей среды, так как в качестве активатора иснользуют сильно  довитое и отравл ющее вещество - цианобромид; недостаточно высока  степень очистки трипсина.

Предлагаетс  новый биоспецифический сорбент общей формулы

ОН

1 0вомуноид

P-0-Si-{ H2)3

где Р - остаток силохрома, дл  аффинной хроматографии трипсина.

В предлагаемом сорбенте матрицей служит силохром, в качестве промежуточных соединений (активаторов) используют аминопропилтриэтоксисилан и п-бензохинон, а в качестве лиганда - овомукоид.

Такой сорбент получают следующим образом .

Силохром обрабатывают -у-аминопропилтриэтоксисиланом по известной методике:

р|-о- 11-(снг)з-кнг-Ь г I I л

Ситхром оЗраЗотанньш

jf- аминопрзпилтризтожс/си/ атм

Я I

(енг)з - NH

- о- L - (еН2)з-МН

АI

OBoi tjKoud

рЯ-0- i- (ен2)

Силохром обогащают аминогруппами обработкой уачинопронилтриэтоксисиланом, затем активируют /г-бенохиноном. К полученному активированному носителю присоедин ют овомукоид, растворенный в боратном буфере при рН 8,0 в течение 1 ч при комнатной температуре.

Овомукоид присоедин етс  в положении 5 хинонового цикла с помощью е-аминогруппы лизина или концевых аминогрупп белков, что обеспечивает прочную и стабильную св зь, не нарушает ингибиторную способность овомукоида. Полученный сорбент содержит 45-50 мг овомукоида на 1 г сухого сорбента.

Силохром благодар  своему неорганическому происхождению обладает жесткой, неизмен емой микроструктурой, которой обусловливаютс  механическа  прочность, долговечность, хорощие гидродинамические свойства и возможность повторной регенерации сорбентов на основе силохрома. Сорбенты на основе силохрома также устойчивы против воздействи  микроорганизмов.

Благодар  стабильной св зи д-бензохинона с овомукоидом и также микроструктуре нерастворимой матрицы силохрома достигаетс  высокое содержание овомукоида в сорбенте: 45-50 мг на 1 г сухого носител , что, в свою очередь, повышает эффективность очистки трипсина. Достигаетс  чистота прапаратов трипсина 64-67 ед. БАЭЭ/мкмол/мин/мгбелка.

Овомукоид-силохром три раза дешевле овомукоид-сефарозы (цена силохрома 40 руб./кг).

Использование в качестве активатора /х-бензохинона позвол ет исключить применение цианобромида - сильного  да и отравл ющего вещества. Преимуществом предлагаемого сорбента  вл етс  также возможность его регенерации прокаливанием при 500-900°С с повторной активацией согласно изобретению.

Срок использовани  такого сорбента 2,5-3,0 мес ца.

Claims (3)

1. Приме.р 1. Используют силохром (СХ-2), выпускаемый Горьковским опыт-. ным заводом ВНИИ нефт ных продуктов ВТУ-341671 (Д 920 А, S 71 , Vnop 1,63 фракции 0,1 -1,0 мм). В колбу наливают 350 мл 1,5%-ного раствора у-аминопропилтриэтоксисилана, при перемешивании внос т 100 г силохрома (СХ-2) и выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем жидкость декантируют и осадок высушивают в термостате при 130°С в течение 4-5 ч. К 0,5 г силохрома, обработанного -аминопропилтриэтоксисиланом (содержаш,им 200 мк-экв. аминогрупп на 1 г носител ), прибавл ют 30 мл 70%-кого раствора изопропилового спирта, который включает 0,105 г /г-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X20 мл изопропилового спирта и высушивают . Получают 0,5 г носител , содержащего 200 мк-экв. хиноновых групп на 1 г носител . Далее активированный носитель пропитывают 1,7 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН8 (содержащем 25 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15-20 мм рт. ст.) при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натри  и еще раз дополнительно боратным буфером дл  удалени  несв занного белка. Полученный сорбент содержит 45 мг овомукоида на 1 г сухого носител . Пример
2. 2. К 1,0 г силохрома, обработанного -уэминопропилтриэтоксисиланом (содержащим 250 мк-экв. аминогрупп на 1 г носител ), прибавл ют 60 мл 70%-ного раствора изопропилового спирта, содержащего 0,21 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X40 мл изопропилового спирта и высушивают . Получают 1,0 г носител , содержащего 250 мк-экв. хиноновых групп на 1 г носител . Далее активированный носитель пропитывают 3,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере с рН 8,0 (содержащем 50 мг овомукоида) и выдерживают в течение 1 ч в вакууме (15-20 мм рт. ст.) при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натри  и еще раз дополнительно боратным буфером дл  удалени  несв занного белка. Получают сорбент, содержащий 50 мг овомукоида на 1 г сухого носител . Пример
3. 3. К 5,0 г силохрома, обработанного 7-аминопропилтриэтоксиланом (содержащим 240 мк-экв. аминогрупп на 1 г носител ), прибавл ют 300 мл 70%-ного раствора изопропилового спирта, содержа щего 1,05 г п-бензохинона, и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем носитель отфильтровывают, промывают 3X200 мл изопропилового спирта и высушивают. Получают 5,0 г носител , включаюш;его 240 мг-экв. хиноновых групп на 1 г носител . Далее активированный носитель промывают 17,5 мл раствора овомукоида в боратном буфере, рН 8,0 (содержащем 250 мг овомукоида) и выдерлсивают в течение 1 ч в вакууме при комнатной температуре. После этого препарат фильтруют, промывают боратным буфером, рН 8,0, 1 М раствором хлористого натри  и еще раз дополнительно боратным буфером дл  удалени  несв занного белка. Получают 15,0 г влажного носител , содержащего 48 мг овомукоида на 1 г сухого носител . Приготовленный биоспецифический сорбент дл  аффинной хроматографии трипсина внос т в колонку (1,9X25 см) и промывают до уравновешивани  0,05 М буферным раствором ТРИС-НС1, содержащим 0,02 М хлористого кальци , рП 8,0, при комнатной температуре. 210 мг производственного трипсина (производства ОЗХР марки Б) с удельной активностью 16 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка раствор ют в 40 мл 0,05 М ТРИС-НС1-буфера, рН 8,0, содержащего М хлористого кальци , и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат нанос т на колонку с уравновешенным тем же буферным раствором биоспецифическим сорбентом, Скорость пропускани  жидкости через колонку 40 мл/ч. После нанесени  раствора трипсина колонку промывают тем же буферным раствором до отрицательной реакции на белок у выхода колонки. Десорбцию провод т при температуре от О до 4°С пропусканием через колонку 0,05 М б ферного раствора глицина - НС1, рН 2,2-2,3, до отрицательной реакции на белок у выхода колонки . Фракции трипсина собирают и после диализа лиофильно высушивают. Получают 140 г очищенного трипсина с удельной активностью 64 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка . Степень очистки 4 раза. Выход препарата - высокоочищенного трипсина с активностью 64-67 ед. БАЭЭ/мкмоль/мин/мг белка зависит от времени использовани  колонки с биоспецифическим сорбентом. За единицу эстеразной активности трипсина прин то количество фермента, которое за 1 мин при 30°С и рН 8,0 катализирует расщепление 1 мкмоль БАЭЭ. Технико-экономический эффект изобретени  заключаетс  в создании стабильного. долговечного и дешевого биоспецифического сорбента дл  аффинной хроматографии. Использование такого сорбента обеспечивает получение высокоочищенных препаратов трипсина, которые по качеству не уступают продукции ведущих фирм мира. Формула изобретени  Биоспецифический сорбент общей формулы Обомуноид -0-$1-(СН2)з-Ш

   где P - остаток силохрома, дл  аффинной хроматографии трипсина. 5 10 Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Мосолов В. В., Лушникова Е. В. Принцип очистки пептидгидролаз, основанный на применении нерастворимых ингибиторов белковой природы, «Биохими , т. 35, 1970, вып. 3. 2.N. S. Robinson, R. W. Туе, Н. Neurath, К. А. Walsh Isolation of trypsin by affinite chromatography, «Biochem., 1971. V. 10, № 14, p. 2743-2747.