FI72342B - Foerfarande foer isolering av bakterieluciferas och affinitetsharts anvaendbart daeri - Google Patents

Description

1 72342

Bakteerilusiferaasin eristysmenetelmä ja siinä käytettävä affiniteettihartsi

Yleisesti käytettyä menetelmää, jossa bakteerilusiferaasi eristetään panoksittaan toteutetulla adsorptiotekniikalla, selostetaan julkaisussa J. Woodland Hastings et ai., Methods in Enzymology, Voi. LVII, 135 (1973) ja A. Gunsalus-Miguel et ai., J. Biol. Chem. 247 (2), 398-404 (1972). Bakteerilusiferaasin eristämistä affiniteettikromatograafisesti käyttämällä immobilisoitua flaviinimononukleotidia entsyymin sitomiseen on kuvattu julkaisussa C.A. Waters et ai., Bio-chem. Biophys. Res. Comm. _57, n:o 4 , 1152 (1974). Kumpikaan näistä menetelmistä ei ole erityisen tehokas, sillä ne ovat huomattavan hitaita ja/tai entsyymin saannot ovat huonoja.

Nyt käsillä oleva bakteerilusiferaasin eristysmenetelmä vähentää huomattavasti entsyymin eristämiseen tarvittavaa aikaa ja lisäksi saadaan suhteellisen puhdasta entsyymiä suurilla saannoilla.

Tämän keksinnön yksi toteutustapa koskee bakteerilusiferaasin eristys- ja puhdistusmenetelmää, jossa eristettävän entsyymin sisältävä näyte suspensoidaan anioniseen puskuriin, mainittu suspendoitu näyte saatetaan kosketukseen af-finiteettihartsin kanssa, jota kuvataan jäljempänä, seos pestään anionisella puskurilla ja sen jälkeen käsitellään kationisella puskurilla niin, että entsyymi irtoaa ja voidaan eristää.

Toinen tämän keksinnön toteutustapa koskee uutta affiniteet-tihartsia, joka sisältää tukiaineen, johon on kiinnitetty välikevarsi, joka puolestaan on kiinnitetty ligandiin, joka sitoo bakteerilusiferaasin spesifisesti. Affiniteettihartsi voidaan kaaviollisesti esittää seuraavasti:

tukiaine ~ välike ~ligandi kaava I

____ _ TT" 2 72342

Sopivia tukiaineita, joita voidaan myös kutsua geelikerrok-siksi tai hartseiksi, ovat mitkä tahansa polysakkaridiemäs-matriisit, kuten Sepharose , Sephadex :n tai selluloosa, tai akryyliamidiemäs tai polyakryyliamidi, joka voi myös olla verkkoutettu Separose18:!! tai Sephadex®:n kanssa, tai poly- akrylonitriiliemäs, kuten US-patenttijulkaisussa n:o 4 143 203 kuvattu hiukkasmainen tukiaine, tai nailonpinnat, kuten nailonkuidut tai -verkot, tai lasipinnat, kuten lasi-pallot ja varsinkin erityinen huokostettu lasi (CPG), jota on kuvattu julkaisussa H.H. Weetall and A.M. Filbert, Meth. Enzymol. 34, 59-72 (1974).

Välikevarsi sisällytetään affiniteettihartsiin saattamalla tukiaine reagoimaan minkä tahansa tavallisen kaksifunktio-naalisen yhdisteen, kuten alkyleenidiamiinin, alifaattisen aminohapon tai diglysidyylieetterin kanssa, ja ligandi on yhdiste, joka sitoutuu bakteerilusiferaasin kanssa.

Tämän keksinnön mukaisen affiniteettihartsin valmistuksessa käytettäväksi sopiva tukiaine sisältää ryhmiä, jotka reagoivat sen kaksifunktionaalisen yhdisteen kanssa, jota käytetään välikevarren sisällyttämiseen affiniteettihartsiin, tai jotka kykenevät muuttumaan aktiivisiksi mainittujen yhdisteiden suhteen. Tukiaineen sisältämiä sopivia reaktiivisia ryhmiä ovat mm. karboksi-, hydroksi-, sulfhydryyli-, amino-, epoksi- tai karboksimeripihkahappoimidiryhmät. On tärkeätä, ettei tukiaine ole vuorovaikutuksessa eristettävän proteiinin, so. bakteerilusiferaasin, kanssa. Jos tukiaineena käytetään nailonia, se käsitellään esim. N,N-dime~ tyyli-1,3-diaminopropaanilla soveltamalla yleistä menetelmää, joka on selostettu julkaisussa W.E. Hornby et ai. FEBS Letters 23, 114 (1972). Karboksiryhmiä sisältävien hartsien meripihkahappoimidijohdannaiset voidaan valmistaa käsittelemällä N-hydroksyloidulla meripihkahappoimidillä käyttämällä karbodi-imidiaktivointia. Kun CPG on tukiaineena, funktionaalinen OH on silanoli, joka käsitellään orgaanisella si-laanilla, kuten epoksisilaanilla, sulfhydryylisilaanilla, 3 72342 alkyyli-C^_^-amiinisilaanilla tai alkyyli-C^_^-halogeeni-silaanilla, kuten alkyylikloorisilaanilla, noudattamalla yleisesti tunnettuja menetelmiä, kts. H.H. Weetall and A.M. Filbert, ibid.

Yksinkertaisuuden vuoksi tämän keksinnön mukainen affini-teettihartsi esitetään kaaviollisesti kaavalla I, ja affi-niteettihartsi valmistetaan siten, että aloitetaan saattamalla tukiaine reagoimaan kaksifunktionaalisen yhdisteen kanssa niin, että syntyy tukiaine ^ välikevarsiyksikkö, joka sitten puolestaan saatetaan reagoimaan ligandin kanssa. Kuitenkin on selvää, että affiniteettihartsi voidaan rakentaa saattamalla ligandi reagoimaan kaksifunktionaalisen yhdisteen kanssa niin, että syntyy välikevarsi ^ ligandiyksikkö, joka sitten puolestaan saatetaan reagoimaan tukiaineen kanssa. Tämän keksinnön mukaisten affiniteettihartsien valmistuksessa voidaan käyttää myös markkinoilla olevia hartseja tai kytkentägeelejä, joissa välikevarsi on jo valmiina, kuten "AH-Sepharqse 4B®":tä ja "CH-Sepharose 4B°":tä (Pharmacic Fine Chemicals).

Kaksifunktionaaliset yhdisteet, joita käytetään tämän keksinnön mukaisten affiniteettihartsien välikevarsien aikaansaamiseen, ovat seuraavien kaavojen II ja III mukaisia:

Nl^-Q-R kaava II

r—7— CH0-0-(CH-,) -0-CHo-r—7 kaava III

\/ 2 m 2 V

Kaavassa II Q on suora- tai haaraketjuinen alkyleeniryhmä, jossa on 2-8 hiiliatomia, ja R on amino-, karboksi- tai karboksimeripihkahappoimidiryhmä. Kaavassa III m on kokonaisluku 2-6.

Karboksimeripihkahappoimidillä tarkoitetaan seuraavaa ryhmää: 4 72342 °y~\

COON

yi o

Kaavassa II on edullista, jos Q on suoraketjuinen alkylee-niryhmä, so. -(CH2)2..g-/ mutta keksinnön tarkoituksiin sopivat myös 1 tai 2 hiiliatomin muodostamat haarat. Kaavojen II ja III mukaiset yhdisteet ovat kaupallisesti saatavissa tai ne voidaan valmistaa alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Kaavan II mukaisista yhdisteistä voidaan mainita esim. etyleenidiamiini, 1,3-propyleenidiamiini, 1,6-heksametyleeni-diamiini, 1,3-isobutyleenidiamiini, 1,4-butyleenidiamiini, glysiini, β-alaniini, alaniini, a-aminopropionihappo, γ-ami-nopropionihappo, γ-aminovoihappo, γ-aminoheksaanihappo ja tietysti näiden vastaavat karboksimeripihkahappojohdannaiset, jotka on saatu reaktiossa N-hydroksimeripihkahappoimidin kanssa. Kaavan III mukaisista yhdisteistä voidaan mainita esim. 1,4-bis-(2,3-epoksipropoksi)butaani, 1,2-bis{2,3-epoksipropoksi)etaani ja 1,6-bis(2,3-epoksipropoksi)heksaani.

Kaavan I ligandiosan muodostavat sellaiset yhdisteet, joilla on spesifinen affiniteetti bakteerilusiferaasin suhteen. Tässä Λkeksinnössä tyypillisesti käytettäviä ligandeja ovat seuraavan kaavan IV mukaiset difenyylialkyleeniyhdisteet tai orto-, meta-''K' tai para-bifenylyylialkyleeniyhdisteet.

f1 'fVq

X-(CH_) -C-Z kaava IV

£. Π | (CH9) I 2 p R2 jossa n on 0-4, X on -COOH, -COhalogeeni, halogeeni, OH, SH, NH_ tai epoksi, so. \ / Δ »O * 5 72342 Z on vety tai suoraketjuinen, 1-3 hiiliatomia sisältävä älkyyliryhmä, q on nolla tai yksi, p on nolla tai yksi, on fenyyliryhmä tai fenyyliryhmä, joka on substituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla, jotka voidaan valita halogeeniatomeista ja R2 on fenyyliryhmä tai fenyyliryhmä, joka on substituoitu yhdellä tai kahdella substituentilla, jotka voidaan valita halogeeniatomeista.

Tässä selostuksessa käytetty termi "halogeeni" tarkoittaa klooria, fluoria, bromia ja jodia. Etusijalle asetettavia halogeeneja ovat kloori ja bromi.

Alkyyliryhmistä, joita Z edustaa, voidaan mainita metyyli, etyyli, n-propyyli ja isopropyyli.

Etusijalle asetettavia kaavan IV mukaisia ligandeja ovat ne, joissa X on COOH, COhalogeeni tai NH2. Etusijalle asetettavia kaavan IV mukaisia ligandeja ovat sellaiset, joissa R,j ja R2 ovat fenyyliryhmiä, tai sellaiset, joissa Z on vety, metyyli tai etyyli. Edullisimpia kaavan IV mukaisia ligandeja ovat 2,2-difenyylipropyyliamiini, 1,1-difenyyli-propyyliamiini, 3,3-difenyylipropyyliamiini, 2,2-difenyyli-propionihappo ja 3,3-difenyylipropionihappo.

Jos n kaavassa IV on vähintään kolme, so. _(CH2^n“ on propyleeni tai 1,3-isobutyleeni, ligandi voidaan kiinnittää välittömästi tukiaineeseen tarvitsematta käyttää välikevartta, ja näin saadaan affiniteettihartsi, joka voidaan esittää kaa-viollisesti seuraavasti

tukiaine -n/ ligandi kaava V

jossa tukiaine ja ligandi ovat edellä määriteltyjä, mutta ”^CH2^n~ sisältää vähintään 3 suoraketjuista hiiliatomia.

Huomattakoon, että käytettäessä termiä ligandi affiniteetti-hartsin yhteydessä funktionaalinen pääteryhmä, jota edustaa X kaavassa IV, on saatettu reagoimaan tukiaineen sisältämän funktionaalisen ryhmän kanssa, kun kyseessä olevat kaavan V mukaiset affiniteettihartsit, tai välikevarren distaalisen pään, so. tukiaineesta kauimpana olevan pään, kanssa, kun kyseessä ovat kaavan I mukaiset affiniteettihartsit.

72342

Kaavojen I ja II mukaiset yhdisteet saatetaan reagoimaan sopivien tukiaineiden kanssa alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen. Kun valmistetaan kaavan I mukaista affini-teettihartsia saattamalla sopiva tukiaine jäljempänä kuvatulla tavalla reagoimaan kaavan II tai III mukaisen yhdisteen kanssa, saadaan tukiaine-välikevarsiyksiköitä, joilla on kaavoissa A esitettyjen kaavojen A-F mukaiset yleisrakenteet. Kaavoissa A-F O'-' tarkoittaa tukimateriaalia, ryhmät R ja Q ovat kaavassa II määriteltyjä, m on kaavassa III määritelty, R^ on happi tai rikki ja R^ on happi, rikki tai -NH-. Esimerkiksi tukiaineiden, joissa on hydroksi- tai sulfhydryyliryhmiä, annetaan reagoida kaavan II mukaisten yhdisteiden kanssa menetelmillä, joita on kuvattu julkaisuissa J. Porath, Nature 218, 834 (1968) ja J. Porath et ai., J. Chromatogr. 86^, 53 (1973), jolloin syanogeenibromidi suspendoidaan alkaliseen vesiliuokseen, esim. 0,1M natriumbikarbonaattiin, jonka pH on 12, ja tähän lisätään tukiaine, kuten agaroosi, suhteessa 2 ml syanogeenibromidiliuosta per ml hartsia, joka on suspendoitu natriumbikarbonaatin 0,1M vesiliuokseen. Seosta inkuboidaan kymmenen minuuttia varovasti sekoittaen huoneenlämpötilassa, suodatetaan vakuumissa ja pestään useaan kertaan tilavuudellaan kylmää tislattua vettä niin, että saavutetaan neutraalius ja samalla aktivoitu tukiaine, joka soveltuu liitettäväksi kaavan II mukaiseen yhdisteeseen.

Kaavan II mukaista yhdistettä lisätään natriumbikarbonaatin 0,2M vesiliuospuskuriin (pH 9) niin, että väkevyydeksi tulee 5-50 mg yhdistettä per ml puskuria. Puskuriliuosta lisätään riittävään määrään aktivoitua tukiainetta niin, että saadaan laimennussuhteeksi yhdisteen suhde hartsiin n 1:2, ja seosta inkuboidaan 4°C:ssa 12-24 tuntia. Kts. kaavion A kaavaa A.

Kun edellä kuvattu hydroksiryhmiä sisältävä hartsi tai geeli eli tukiaine liitetään kaavan III mukaiseen yhdisteeseen, tukiainetta ei tarvitse aktivoida, vaan se suspendoidaan natriumhydroksidin 0,6M vesiliuokseen, joka sisältää 2 mg 7 72342 natriumboorihydridiä per ml liuosta. Yhtä suuret tilavuudet näin suspendoitua hartsia ja kaavan III mukaista yhdistettä saatetaan reagoimaan keskenään huoneenlämpötilassa (noin 25°C) sekoittamalla varovasti 12-24 tuntia, ja sen jälkeen pestään tislatulla vedellä niin, että pHrksi tulee 7. Vrt. kaava B, jossa R^ on happi tai rikki. Huomattakoon, että -OH voi olla liittyneenä viimeistä edelliseen hiiliatomiin (kuvattu) tai sivuketjun muodostavaan hiiliatomiin niin, että syntyy primäärinen alkoholi.

Aminoryhmiä sisältävät tukiaineet voidaan liittää kaavan II mukaisiin yhdisteisiin, joissa R on karboksiryhmä tai karbok-simeripihkahappoimidiryhmä,tai kaavan III mukaisiin yhdisteisiin käyttämällä alalla tunnettuja reaktioita ja menetelmiä. Esimerkiksi liitettäessä aminoryhmän sisältävä tukiaine kaavan II mukaiseen aminokarboksyylihappoon yhdistetään happoyli-määrä tukiaineen kanssa proottisessa liuottimessa kuten dime-tyyliformamidin vesiliuoksessa, pHtssa noin 4,7 käyttämällä reaktiossa 10-100-kertaista molaarista ylimäärää vesiliukoista karbodi-imidiä, kuten N-etyyli-N'-(3-dimetyyliamonipro-pyyliJkarbodi-imidi.HCl. Kts. kaava C. Kun kaavan II mukainen meripihkahappoimidijohdannainen liitetään aminoryhmiä sisältävään tukiaineeseen, lisätään tukiaineeseen 10-kertainen molaa-rinen ylimäärä meripihkahappoimidijohdannaista vesipitoisessa puskurisysteemissä, kuten 0,2M trietyyliamiiniasetaatissa tai -fosfaatissa tai -pyrofosfaatissa, jonka pH on alueella 7-9,5, ja seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 12-24 tuntia. Kts. kaava C. Kaavan III mukaiset yhdisteet liitetäänaminoryhmiä sisältäviin tukiaineisiin suorittamalla reaktio kaavan III mukaisen yhdisteen ylimäärän ja tukiaineen kanssa dioksaanin 50 % vesiliuoksessa pHrssa noin 11. Reaktioaika on noin 12 tuntia 50°C:ssa tai korkeintaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Kts. kaava B, jossa R^ on NH. Halogeeniryhmän sisältävät tukiaineet liitetään kaavan II mukaisiin yhdisteisiin oleellisesti ottaen samoissa olosuhteissa. Kts. kaava D.

Karboksiryhmiä sisältävät tukiaineet voidaan liittää kaavan II mukaisiin yhdisteisiin samalla yleisellä karbodi-imidiaktivointi-menetelmällä kuin edellä kuvattiin liitettäessä aminoryhmiä sisältävä tukiaine kaavan I mukaiseen aminokarboksyylihappoon. Kts. kaava E. Meripihkahappoimidejä sisältävät tukiaineet voidaan liittää kaavan II mukaisiin yhdisteisiin samoja yleisiä menetelmiä käyttämällä kuin edellä kuvattiin liitettäessä aminoryhmiä 8 72342 sisältävät tukiaineet kaavan II mukaisiin yhdisteisiin, joissa R on karboksimeripihkahappoimidiryhmä. Kts. kaava F. Myös funktionaalisia epoksiryhmiä sisältävät tukimateriaalit voidaan liittää kaavan II mukaisiin yhdisteisiin noudattamalla samoja yleisiä menetelmiä joita kuvattiin yhdistettäessä ami-noryhmiä sisältävä tukimateriaali kaavan III mukaiseen yhdisteeseen. Kts. kaava F.

Kun kaavan III mukaiset yhdisteet liitetään sellaisiin tukiaineisiin, joissa on joko funktionaalisia amiiniryhmiä, hyd-roksyyliryhmiä tai sulfhydryyliryhmiä, edellä mainittua alemmassa pH:ssa, epoksidirengas aukeaa siten, että syntyy tuki-aine-välikevarsiyksikkö, jossa on primäärinen alkoholi, kuten on kuvattu kaavassa G, jossa R4 on happi, rikki tai -NH- ja m on kokonaisluku 2-6. Samoin suoritettaessa reaktio kaavan II mukaisen yhdisteen ja epoksiryhmiä sisältävän tukiaineen kanssa alemmassa pH:ssa, saadaan tukiaine-välikevarsiyksikkö-jä, jotka ovat kaavan H mukaisia, jossa Q ja R ovat kaavassa II määriteltyjä.

Näin saadut kaavojen A-H mukaiset yksiköt saatetaan reagoimaan kaavan IV mukaisten ligandien kanssa tunnetuilla menetelmillä, joita on kuvattu edellä. Kaavojen A, C-F ja G mukaiset yksiköt, joissa on pääteaminiiniryhmä, saatetaan reagoimaan kaavan IV mukaisten yhdisteiden kanssa, joissa X on COOH, ja kaavojen, A, D-F ja H mukaiset yhdisteet, joissa on päätekarboksiryhmä, saatetaan reagoimaan kaavan IV mukaisten yhdisteiden kanssa, joissa X on NH2, tai 2-(2,4-dikloori- 6-fenyylifenoksi)etyyliamiinin tai 2-(2,3-dikloori-6-fenyyli-fenoksi)etyyliamiinin kanssa käyttämällä tavanomaisia edellä kuvattuja karbodi-imidillä aktivoituja kytkentäreaktioita. Kaavojen A, D-F ja H mukaiset yhdisteyksiköt, joissa on pää-tekarboksimeripihkahappoimidiryhmä, liitetään kaavan IV mukaiseen ligandiin, jossa X on NH2# tai 2-(2,4-dikloori-6-fenyyli-fenoksi) etyyliaminiinin tai 2- (2,3-dikloori-6-fenyylifenoksi)- 9 72342 etyyliaitiiiniin saattamalla tarvittava yhdisteyksikkö reagoimaan 10-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa ligandia vesipitoisessa puskurisysteemissä, esim. 0,2M trietyyliamiini-asetaatissa tai -fosfaatissa tai-pyrofosfaatissa, jonka pH on alueella noin 7-9,5/ noin 25°C:ssa sekoittamalla noin 12-24 tuntia. Kaavojen B ja G mukaiset yhdisteet liitetään kaavan IV mukaisiin ligandeihin, joissa X on NH2 , sulfhyd-ryyli tai hydroksyyli, tai 2-(2/4-dikloori-6-fenyylifenoksi) etyyldamiinixi tai 2-(2,3-dikloori-6-fenyylifenoksi) etyyli-amiiniin saattamalla ligandi ja kaavan B tai G mukaisen epok-sidiyhdisteen ylimäärä reagoimaan esim. dioksaanin 50 % vesi-liuoksessa pH:ssa noin 11 ja antamalla reaktion tapahtua noin 50°C:ssa noin 12 tuntia. Samalla tavalla liitetään kaavojen A, C-F ja H raukaiset yhdisteet, joissa on pääteamiiniryhmä, yhteen kaavan IV mukaisten ligandien kanssa, joissa X on epoksi tai halogeeni tai

O

II

-C halogeeni ja jos X sisältää halogeenin, voi olla toivottavaa suorittaa reaktio noin 25°C:ssa korkeintaan 24 tunnissa.

Näin syntyneet affiniteettihartsit voidaan esittää kaavoilla J ja K. Kaavassa J Cr* edustaa tukiainetta, johon on liittynyt yksi funktionaalinen sidonnainen, joka on kuvattu vasemmanpuoleisissa hakasuluissa, ja joka on liittynyt kaavassa II määriteltyyn ryhmän Q toiseen päähän. Ryhmän Q toinen pää on liittynyt toiseen funktionaaliseen sidonnaiseen, joka on esitetty oikeanpuoleisissa hakasuluissa, ja joka on liittynyt L:ään. Ryhmä L kaavoissa J ja K on sama kuin kaavan IV mukaiset yhdisteet; ainoastaan kaavan IV ryhmä X on poistettu, so. L on f1 f2>q -<ch2)„-c-z 'fVp R2 jossa n, Z, q, p, ja R2 ovat kaavassa IV määriteltyjä, tai jos funktionaalinen sidonnainen oikeanpuoleisissa su luissa on muu kuin ^ 10 72342 -NHC- L voi olla 2-(2,4-dikloori-6-fenyylifenoksi)etanyyli tai 2-(2,3-dikloori-6-fenyylifenoksi)etanyyli.

Kaavan K esittämässä af f initeettihartseissa tukimateriaali CT-on liitetty hakasuluissa olevaan yhteen funktionaaliseen sidonnaiseen, joka puolestaan on liittynyt molekyylin loppuosaan ryhmän -C^- välityksellä. Kaavassa K m on kokonaisluku 2-6, ja kukin ryhmistä R^ ja R,. on rikki, happi tai NH ja L on kaavassa J määritelty edellyttäen, että R^ on NH, kun L on 2-(2,4-dikloori-6-fenyylifenoksi)etanyyli tai 2-(2,3-dikloori-6-fenyylifenoksi)etanyyli.

Kaavan V mukaiset af f initeettihartsit valmistetaan saattamalla kaavan IV mukainen yhdiste, jossa n on vähintään 3, reagoimaan sopivan tukiaineen kanssa käyttämällä samoja kemiallisia menetelmiä, joita kuvattiin edellä kaavojen J ja K mukaisten affiniteettihartsien valmistuksen yhteydessä. Kaava M esittää saatuja tuotteita, ja Rg on NH, rikki tai happi ja L on sama kuin kaavan IV mukainen yhdiste, josta ryhmä X on poistettu, ja n on vähintään kolme.

Useimmat yleisen kaavan IV mukaisista yhdisteistä ovat alalla tunnettuja ja saatavissa joko kaupallisesti tai valmistettavissa yleisesti tunnetuilla menetelmillä, ja on selvää, että eräitä kaavan IV mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää muiden mainitun kaavan mukaisten yhdisteiden valmistukseen.

Yhdisteet, joissa n on 1 ja p ja q ovat kumpikin nollia, voidaan valmistaa alkyloimalla esim. sopivasti substituoitu di-fenyyliasetonitriili alkyyli-C^_4~halogenidilla dimetyyliform- 11 72342 amidin ja natriumhydridin liuoksessa ja pelkistämällä sen jälkeen esim. litiumalumiinihydridillä niin, että syntyy vastaavasti substituoitu 2-alkyyli-2,2-difenyylietaaniamiini. Amiinit voidaan myös saada muuntamalla alkyloitu nitriili vastaavaksi amidiksi käsittelemällä rikkihapolla ja pelkistämällä amidi sen jälkeen käyttämällä esim. booria. Tai alkyloitu nitriili voidaan pelkistää esim. di-isobutyylialu-miinihydridillä niin, että saadaan vastaava karboksialdehy-dijohdannainen, joka voidaan muuntaa vastaavaksi epoksidik-si käyttämällä trimetyylisulfoniumhalogeenidia. Myös nitriili voidaan muuntaa vastaavaksi karboksyylihapoksi käsittelemällä vesipitoisella emäksellä, ja hapon käsittely tionyy-lihalogenidilla, esim. tionyylikloridilla, antaa vastaavan happohalogenidin. Tai happo voidaan käsitellä alemmalla alkoholilla, kuten etanolilla, miedosti happamissa olosuhteissa niin, että saadaan alempi alkyyliesteri, joka puolestaan pelkistetään esim. litiumalumiinihydridillä niin, että saadaan vastaava alkoholi. Näin saatu alkoholi voidaan käsitellä P2Sj-:llä niin, että saadaan vastaava tioli, tai näin saatu alkoholi voidaan käsitellä tionyylihalogenidilla, kuten tionyylikloridilla, tai fosfonyylikloridi/fosforipentaklori-dilla hiilitetrahalogenidissa, kuten hiilitetrakloridissa, ja trifenyylifosfiinissa, niin, että saadaan vastaava halo-genidijohdannainen. Saatu halogenidi voidaan käsitellä kal-siumsyanidilla niin, että saadaan vastaavasti substituoitu 2-alkyyli-2,2-difenyylietanonitriili, joka voidaan käsitellä edellä kuvatulla tavalla niin, että saadaan kaavan IV mukainen yhdiste, jossa n on 2, ja tätä menettelyä noudattamalla voidaan valmistaa kaikki yhdisteet, joissa n on 1-4 ja p ja q ovat kumpikin nolla. Kaavan IV mukaiset yhdisteet, joissa p ja q ovat muita kuin nolla, voidaan valmistaa samalla tavalla vastaavista nitriileistä tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi nitriili voidaan saada käsittelemällä sopivasti substituoitu ketonijohdannainen, esim. bentsyyli-fenyyliketoni, fenetyylifenyyliketoni tai bentsofenoni, alkyyli-Grignardilla niin, 12 72342 että saadaan vastaava alkyloitu alkoholi, joka voidaan muuntaa vastaavaksi tioliksi käyttämällä ?2S^:ttä tai vastaavaksi halogenidiksi hiilitetrahalogenidissa, kuten hiili-tetrakloridissa, ja trifenyylifosfiinissa. Halogenidiä voidaan sitten käyttää nitriilinvalmistukseen käsittelemällä kaliumsyanidilla ja dimetyylisulfoksidilla, ja nitriilistä voidaan valmistaa muut kaavan IV mukaiset yhdisteet, kuten edellä on kuvattu. Kuitenkin käytettäessä tällaista nitrii-liä amiinijohdannaisten valmistuksessa saattaa olla parempi ensin hydrolysoida nitriili amidiksi käyttämällä rikkihappoa ja sen jälkeen käsitellä amidi B^/NaOHtlla Hofman-reaktion olosuhteissa /Ber. 14, 2775 (1881j_/ niin, että saadaan amiini.

Näin muodostuneet uudet affiniteettihartsit sitovat spesifisesti bakteerilusiferaasia ja erityisesti sellainen lusi-ferääsi, jota saadaan Vibrio fischerin ja Photobacterium phosphoreumin ja Vibrio harveyin hajotetuista soluista, sitoutuu ja eluoituu affiniteettihartseista ja saadaan puhdasta entsyymiä hyvällä saannolla. Tapaa, jolla tämän sitoutumisen uskotaan tapahtuvan, selostetaan julkaisussa Biochemistry 1981, 2_0, 5524-5528. Kts. myös Biophysical Journal 33, part 2, 255 (1981). Vielä eräs tähän keksintöön liittyvä seikka on se, että tämän homogeenisen entsyymin saamiseen suurella saannolla tarvitaan merkittävästi pienempi aika kuin entisissä menetelmissä. Vielä eräs nyt käsillä olevaan menetelmään liittyvä merkittävä etu on se, että sen mittakaavaa voidaan suhteellisen helposti suurentaa tai pienentää vastaamaan tarvittavaa suurta tai pientä entsyymimäärää. Lisäksi tämän keksinnön kohteena olevia uusia affiniteetti-hartseja voidaan käyttää useaan kertaan entsyymineristämi-sessä. Tällä tarkoitetaan sitä, että bakteerilusiferaasin eristämiseen käytetty hartsi voidaan pestä esim. 8M urean ja 50 % etanolin 1:1 seoksella, joka on 0,08M fosfaatin suhteen, sen jälkeen tasapainottaa uudelleen anionisella puskurilla ja käyttää taas entsyymin eristämiseen.

il 13 72342

Bakteerilusiferaasin tiedetään olevan hyödyllinen prote-aasien määrityksessä, koska lusiferaasientsyymi on erittäin altis inaktivoitumaan useiden eri proteaasien vaikutuksesta, joita ovat esim. trypsiini, elastaasi, kymotrypsiini, plas-minogeeni ja kollagenaasi, joista useiden tiedetään olevan yhteydessä tai mukana eräissä sairaustiloissa, kuten autoimmuunisairauksissa, esim. nivelreumassa, eräissä karsinoma-ja emphysema-tyypeissä ja peridontaalisissa sairauksissa.

Näin ollen bakteerilusiferaasin käyttö entsyymimäärityssys-teemeissä tarjoaa käyttökelpoisen keinon proteaasiaktiivisuu-den ilmaisemiseen, mikä taas voi johtaa eräiden sairaustilojen toteamiseen. Paitsi proteinaasien määrityksessä voidaan lusiferaasia myös käyttää entsymaattisessa yhdistelmässä, jota käytetään sellaisten nukleotidien kuin NADH, NADPH ja FNM määrittämiseen seerumi- tai kudosnäytteistä.

Kts. P.E. Stanley (1978) Meth. Enzymol. 52, 215-223 tai muiden entsyymien läsnäolon toteaminen, jotka käyttävät näitä nukleotideja, kts. P.E. Stanley (1978) Meth. Enzymol. 57, 181-189.

Kun bakteerilusiferaasi eristetään tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, niin yleisesti ottaen toimitaan siten, että uusi affiniteettihartsi tasapainotetaan anionisella puskuriliuoksella ja sitten se saatetaan kosketukseen sellaisen määrän kanssa samaan anioniseen puskuriliuokseen suspendoi-tua entsyyminäytettä, että affiniteettihartsin sidoskohdat tulevat kyllästetyiksi, sitten hartsia pestään anionisella puskurilla entsyyminäytteen sisältämien sitoutumattomien aineiden poistamiseksi ja lopuksi affiniteettihartsi eluoidaan tai pestään kationisella tai neutraalilla puskurilla niin, että sidottu entsyymi irtoaa. Näin ollen entsyymi voidaan eristää millä tahansa sellaisella tavalla, joka sallii eristettävää bakteerilusiferaasia sisältävän näytteen kontaktin tasapainotetun affiniteettihartsin kanssa sopivassa anioni-sessa puskurissa, tätä seuraavan sidottua entsyymiä sisältävän affiniteettihartsin pesun ja sen jälkeisen käsittelyn 14 72342 sopivalla kationisella tai neutraalilla puskurilla. Näin ollen entsyymi voidaan eristää käyttämällä panoksittain toteutettavia eristysmenetelmiä tai pylväskromatograafisiä menetelmiä, joista viimeksimainitut asetetaan etusijalle. Varsinkin pylväskromatografisiä menetelmiä käytettäessä on tärkeätä, että affiniteettihartsi kyllästetään entsyyminäyt-teellä. Kun käytetään panoksittain tapahtuvia menetelmiä, sitoutuminen affiniteettihartsiin mitataan entsyymiaktiivisuuden häviämisenä suspendointiliuoksesta, ja sen jälkeen kun sitoutumaton proteiini on poistettu seoksesta, entsyymin vapautuminen ja talteenotto kationisella puskurilla käsiteltäessä mitataan entsyymiaktiivisuuden lisääntymisenä emäliuoksessa. Vastaavasti pylväskromatografiaa käytettäessä mitataan affiniteettihartsin kyllästyminen entsyymiaktiivisuuden ilmenemisenä kerätyissä eluaattijakeissa.

On määritelty, että affiniteettihartsin entsyyminsidonta-kapasiteetti on noin 5-25 mg bakteerilusiferaasia per milli-litra (ml) suspendoitua affiniteettihartsia riippuen tukiaineeseen kiinnittyneiden ligandimolekyylien lukumäärästä.

Kun käytetään pylväskromatografiaa, on tasapainotettua hartsia sisältävän pylvään kapasiteetti noin 5-25 mg bakteerilusif eraasia pylvään tilavuusmillilitraa kohti.

Entsyymin eristäminen voidaan suorittaa eri lämpötiloissa, mutta käytännön syistä on edullista toimia kylmähuoneessa, esim. noin 4°C:ssa. Eristäminen voidaan tietysti suorittaa huomattavasti korkeammassa tai matalammassa lämpötilassa, mutta saattaa olla tarpeen lisätä väliaineeseen bakteerien kasvua estäviä aineita ja tietysti hyvin matalissa lämpötiloissa toimittaessa pitää lisätä jäätymisenestoainetta.

On tunnettua, että bakteerilusiferaasissa on anioninen sidos-kohta. Kts. esim. Holzman and Baldwin, Biochem. Biphys. Res. Comm. iM, n:o 4, 1199 (1980) ja Proc. Natl. Acad. Sei. 77, n:o 11, 6262 (1980). Tästä syystä tässä keksinnössä käyte-

II

15 72342 tään anionista puskurisysteemiä helpottamaan entsyymin sitoutumista affiniteettihartsiin. Yleensä entsyymin affiniteetti uuden hartsin suhteen paranee puskurin anionivah-vuuden kasvaessa. Anionisen puskurin pH on alueella noin 6,5-9,5 ja kokonaisionivahvuus on noin 0,01-211. Edullinen puskurin pH on noin 8-8,5 ja ionivahvuus noin 0,2-lM. Sopivia anionisia puskureita ovat alkalimetallisuolojen., esim. kaliumin tai natriumin, vesiliuokset, fosfaattien vesiliuokset ja mielellään sitraattien, arsenaattien, sulfaattien tai näiden ekvivalenttien suolojen tai näiden suolojen seosten vesiliuokset. Anioninen puskuri sisältää myös tiolipi-toista pelkistintä noin 1 nM väkevyytenä. Sopivia pelkisti-miä ovat mm. ditioerytritoli, ditiotrietoli, merkaptoeta-noli, kysteamiini, kysteiini, tiodiglykoli tai glutationi.

Kuten edellä mainittiin anionista puskuria käytetään affini-teettihartsin tasapainottamiseen, eristettävän bakteerilusi-feraasin suspendoitiin ja kiinnittymättömän materiaalin pesemiseen pois affiniteettihartsista sen jälkeen, kun se on tullut kyllästetyksi entsyymillä.

Tässä keksinnössä käytetty kationinen tai neutraali puskuri vähentää entsyymin affiniteettia uuden hartsin suhteen. Yleisesti ottaen voidaan käyttää mitä tahansa orgaanista amiinia sisältävää puskuria, joita ovat esim. kaupallisesti saatavissa oleva TRIS, 2-amino-2-hydroksimetyyli-2,4-propaa-nidioli; HEPES, 4-(2-hydroksietyyli)-1-piperatsiinietaani-sulfonihappo; TES, 2-{/tris (hydroksimetyyli)metyyl_i/amino}-etaanisulfonihappo, tai etanoliamiini yksin tai yhdessä muiden amiinipuskurien kanssa. Etanoliamiini on erittäin hyödyllinen eristettäessä Vibrio harveyi-lusiferaasia. Puskurin ionivahvuuden pitäisi olla suhteellisen pieni, eli ei yli IM. pH pitäisi pitää alueella noin 6,5-9,5. Kationinen pus-kurisysteemi sisältää myös tiolipitoista pelkistintä noin 1 nM väkevyytenä. Sopivia pelkistimiä ovat mm. ne, jotka lueteltiin edellä anionisen puskurisysteemin yhteydessä.

Γ.

ie 72342 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän tyypillisessä käytännön toteutuksessa edellä kuvatun kaltainen affiniteetti-hartsi suspendoidaan edellä kuvattuun anioniseen puskuriin ja kaadetaan pylvääseen. Hartsi tasapainotetaan anionisel-la puskurilla. Eristettävää bakteerilusiferaasia sisältävä näyte suspendoidaan anioniseen puskuriin ja kaadetaan pylvääseen. Pylvään koko valitaan näytteen sisältämän eristettävän entsyymimäärän mukaan, joka taas määritetään näytteen entsyymiaktiivisuudesta. Kun affiniteettihartsi on kyllästynyt, pylväs pestään anionisella puskurilla kiinnittymät-tömän materiaalin poistamiseksi ja sitten pylväs eluoidaan käyttämällä kationista tai neutraalia puskuria, joita on selostettu edellä. Eluointivaihe tarvitsee tavallisesti noin 4-8 pylvään tilavuutta puskuria. Jakeet kerätään ja eluointikäyrä määritetään. Saadun entsyymin saanto määritetään saavutettuna entsyymiaktiivisuutena.

Jos kaikki kerätyt jakeet yhdistetään, saadaan entsyymi talteen käytännöllisesti katsoen 100-prosenttisesti. On havaittu, että otettaessa talteen 90 % alkuperäisestä entsyymin kokonaisaktiivisuudesta on proteiinin tai entsyymin puhtausaste noin 50 %. Tietysti voidaan valita vain korkean entsyymiaktiivisuuden sisältävät jakeet ja näin kohottaa talteenotetun proteiinin puhtausastetta. Kun 75 % alkuperäisestä kokonaisaktiivisuudesta otetaan talteen on entsyymin puhtausaste noin 65 %, ja kun 50 % kokonaisaktiivisuudesta otetaan talteen, on puhtausaste noin 90 %.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Seuraavassa selostetaan tyypillisen kaavan K mukaisen affi-niteettihartsin valmistusta, jossa hakasuluissa oleva funktionaalinen ryhmä on -r4-ch2-ch-

OH

II

17 72342 jossa on happi, m on 4, R,- on NH ja L on 2,2-difenyyli-propanyyli.

Noin 50 ml:aan "Sepharose 6E ":tä lisätään 50 ml 1,4-digly-sidyylieetteriä, so. 1,4-bis(2,3-epoksipropoksi) butaania, 50 ml 0,6M natriumhydroksidia ja 100 mg natriumboorihydri-diä. Näin saatua suspensiota sekoitetaan rotaatiosekoittimessa noin 8 tuntia noin 25°C:ssa, sitten se kaadetaan sintratuun lasisuppiloon, pestään neutraaliksi tislatulla vedellä ja kuivataan imulla. Tämä menetelmä on kuvattu yleisesti julkaisussa Sunderberg and Porath, J. Chrom. 9J), 87 (1974).

Näin saatu epoksiaktivoitu "Sepharose " saatetaan reagoimaan 2,2-difenyylipropyyliamiinin kanssa. Jokaista epoksi-aktivoidun "Sepharose®": n grammaa kohti käytetään 100 mg 2,2-difenyylipropyyliamiinia. Alkyyliamiini liuotetaan seokseen, jossa on 50 % dioksaania ja 50 % 0,20M karbonaatti-puskuria, pH 10,5 (1 ml nestettä dioksaanipuskurissa per gramma "Sepharose®'ia) . Liuoksen pH pidetään arvossa 10,5. Sitten lisätään aktivoitu "Sepharose®"ja näin saadun suspension sisältävä pullo laitetaan vesihauteelle (60°C) ja sitä pyöritetään 24 tuntia. Ensimmäisten 12 tunnin aikana suspension pH tarkistetaan kolmen tunnin välein ja sitten 18 tunnin kohdalla ja 24 tunnin kohdalla ja säädetään tarvittaessa arvoon 10,5. Sitten immobilisoitu inhibiitti eli näin muodostunut hartsi pestään huolellisesti pullosta ja siirretään karkeahuokoiseen sintterilasisuppiloon, joka on kytketty vakuumisuodatussysteemiin. Jokaista alunperin käytettyä ®

imukuivattua "Sepharose -grammaa kohti pestään affiniteetti-hartsi perättäisesti seuraavilla seoksilla: 6 ml dioksaani-vesiseosta (1:1), 6 ml dioksaanin ja 0,20 M fosfaatin, pH

7,0, seosta (1:1) ja 12 ml 95 % etanolia. Affiniteettihartsi voidaan käyttää heti tai sitä voidaan varastoida etanolin 50 % vesiliuoksessa. Yleensä tällä menetelmällä 1-2 ^umoolia ligandia liittyy millilitraan hartsia.

Pylvään täyttämistä varten valmistetaan geelisuspensio

V . J

\ is 72342 lisäämällä yhtä suuri tilavuus käytettävää puskuria, so. anionista puskuria, ja sekoittamalla varovasti. Suspensio kaadetaan pylvääseen. Täytetty pylväs tasapainotetaan pesemällä noin 4 tilavuudella anionista puskuria ennen näytteen sijoittamista.

Esimerkki 2

Seuraavassa kuvataan kaavan J mukaisen affiniteettihartsin valmistusta, jossa vasemmanpuoleisissa hakasuluissa oleva funktionaalinen ryhmä on

NH

-R3-C-NH- jossa R3 on happi, ja oikeanpuoleisissa hakasuluissa oleva funktionaalinen ryhmä on

O

-NH-C- ja L on 2,2-difenyylipropanyyli.

5 ml syanigeenibromidin dimetyyliformamidiliuosta (100 mg/ml) <s> lisätään 100 ml:aan "Sepharose 6B M:tä, joka on tasapainotettu 100 ml:ssa 2 M natriumkarbonaattia. Syanogeenibromidi-aktivoinnin aikana, joka kestää noin 10 min ja suoritetaan noin 25°C:ssa, geeliä pidetään sintratussa lasisuppilossa ja sitä sekoitetaan varovasti antamalla typen kuplia suppilon huokoisen lasilevyn läpi. Aktivointi on kuvattu pääpiirteissään julkaisussa March et ai. (1974) Anal. Biochem. 60, 149. Syanogeenibromidiaktivoinnin jälkeen geeli pestään neutraaliksi ja sitten se.suspendoidaan uudelleen 200 ml:aan 1,6-heksaanidiamiinin 0,10 M vesiliuosta, pH 9,5. Seosta sekoitetaan varovasti 12 tuntia 4°C:ssa ja sitten se pestään neutraaliksi vedellä sintratussa lasisuppilossa.

10 ml:aan näin muodostunutta hartsi- tai geeli-välikevarsi-yksikköä lisätään 100 mg N-etyyli-N'-(3-dimetyyliaminopro-pyyli) karbodi-imidi HCl:a ja 200 mg 2,2-difenyylipropioni- 19 72342 happoa 20 ml:ssa 50 % dioksaani-vesiseosta, pH 6,0. Lisäyksen jälkeen pH säädetään arvoon 6,0 ja seosta sekoitetaan käyttämällä kiertosekoituslaitetta. Noin 2 tunnin kuluttua pH pyrki laskemaan ja se säädettiin tarvittaessa arvoon 6. Seoksessa tapahtuneen alkuperäisen pH:n laskun jälkeen seosta sekoitetaan 24 tuntia noin 25°C:ssa. Kun geeli pestään neutraaliksi vedellä vakuumisuotimessa, saadaan uusi affiniteettihartsi.

Edellä kuvattu karbodi-imidikytkentä johtaa tyypillisesti substituutioon, joka on alueella 1-2 ^umoolia per ml hartsia .

Esimerkki 3

Seuraavassa selostetaan bakteerilusiferaasin eristämistä näytteestä tämän keksinnön mukaisella tavalla. Entsyymiläh-de on Vibrio harveyi.

Solulysaatti valmistetaan 100 grammasta jäädytettyä solupas-taa osmoottisella liuotustekniikalla, jota on selostettu julkaisussa Hastings et ai., Meth. Enzymol. 57, 135 (1978). Lysaattiin (1100 ml) lisätään ammoniumsulfaattia 40 % kyl-lästymisasteeseen asti ja sentrifugoidaan 1-1,5 tuntia 4°C:ssa Sorvali GSA-roottorilla nopeudella 8000 kierr/min. Lysaatin annetaan tasapainottua 30 minuuttia ammoniumsulfaa-tin kanssa ennen sentrifugointia. Emäliuos kerätään (1100 ml) ja siihen lisätään ammoniumsulfaattia niin, että saavutetaan 80 % kyllästymisaste. Ensimmäisessä sentrifugoinnissa saatu pelletti, joka sisältää solupirstaleet ja saostuneen proteiinin, heitetään pois. Emäliuosta, jonka kyllästymisaste ammo-niumsulfaatin suhteen on 80 %, sentrifugoidaan 1 tunti 4° C:ssa GSA-roottorissa nopeudella 8000 kierr/min. Pelletti kerätään talteen ja siirretään dialyysiputkeen, jossa se dialysoidaan 4°C:ssa käyttöpuskuriin tai anioniseen puskuriin. Pelletin siirto dialyysiputkeen, dialyysipuskurin valmistus jne. vaatii noin 2 tuntia. Epäpuhdasta lusiferaa- 20 72342 sinäytettä dialysoidaan 3 vaihdon ajan (kukin 1 litra) 4° C:ssa kaikkiaan noin 12 tuntia. Sitten näytettä sentrifu-goidaan 4°C:ssa 30 min SS-34-roottorissa nopeudella 15 000 kierr/min. Emäliuoksen kokonaistilavuus on 245 ml. Sitten puolet kirkkaasta liuoksesta (120 ml) johdetaan 15 ml:n af-finiteettihartsipylvääseen, joka on tasapainotettu käyttö-puskurilla. Näytteen virtausnopeus on noin 40 mlA. Kun pylväästä saadusta eluaatista määritetään lusiferaasiaktii-visuus, voidaan todeta, että pylväs tulee kyllästetyksi tällä aktiivisuusmäärällä. Sitten pylväs pestään neljällä pylvään tilavuudella (60 ml) käyttöpuskuria virtausnopeudella noin 15 ml/h niin, että sitoutumaton tai heikosti sitoutunut proteiini eluoitmi. Sitten pylväs eluoidaan 4 pylvään tilavuudella eluointipuskuria ja 1 ml jakeet kerätään ja niistä analysoidaan lusiferaasiaktiivisuus. Jakeet, jotka sisältävät kaikkiaan noin 90 % lusiferaasiaktiivisuudesta, yhdistetään, väkevöidään ammoniumsulfaattisaostuksella (80 % kyllästymisaste), dialysoidaan ja kromatografoidaan amino-heksyylisegaroosilla, kuten on kuvattu julkaisussa Hastings et ai., ibid.

Entsyymin puhtaus arvioidaan Coomassie-sinivärjäämällä pro-teiinikaistat, jotka oli erotettu natriumsulfaattigeeli-elektroforeesilla polyakryyliamidissa noudattamalla julkaisussa Laemmli, Nature 227, 680 (1970) kuvattua menetelmää. Puhtaan lusiferaasin ( > 95 %) aktiivisuus on noin 30 000 (+10 %) valoyksikköä proteiinimilligrammaa kohti, kun mittaus suoritetaan tavallisella flaviini-injektiomäärityksellä, jota on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa Hastings et ai. Yksi valoyksikkö on 1,06 x 10^ kvanttia/sekunti perustuneena nestemäiseen valostandardiin, joka on esitetty julkaisussa Hastings and Weber, J. Opt. Soc. Am. 53, 1410 (1963).

Edellä selostetuista toimenpiteistä ja saaduista tuloksista on esitetty yhteenveto seuraavassa taulukossa.

.. < *

II

2i 72342

Kun noudatetaan esimerkissä 3 kuvattua yleistä menettelytapaa, mutta käytetään vain 2-5 grammaa pastaa, joka on valmistettu Vibrio (photobacterium) fischeristä tai Photobac-terium phosphoreumista, ja reagenssitilavuudet säädetään sopiviksi, saadaan lähes kaikki käytetty affiniteetti (> 95 %) talteen >95 % puhtausasteella.

I — 22 72342 <#> ι :3 en ι 3 <#>

I O -P -H -P -P

Ο ft en (0 > en o

U 3 1) C -H (P I I O

C Λ en Ο ·Ρ Ό ι—ι <0 Ρ -Ρ Ai -Ρ 3 (0 (0 :rö O Λί 33 C/3 ^ p Ai 3 en \ ι m G a m (0 10 I P 1 -Ρ | o P roo

<0 10 £53 0)1 -H β 3 'd (1) I -H rl I 4J

\ o ή -Hm ·ρ < ρ öm-i«.-h<5m-p3x: rö jz; 3 3 3 fi -Ρ -P Ai W O 3 ·Ρ -P Ai W O G Ai ·Ρ

Ai -P en -P -P G P -P O -P -P P -P C> -P 3 en 3 h (0 ι m ω 3-PCo-P 4J£5o-P-P3>

< > -G -Ρ -P -P £5 -P o G O O n C -P O fi O ft G

033 O O O -Ρ O O I O O O -P O rs -H

^ rH 3 iP rs en Cnoo E P 2 p ra tnoo EP ip n p O f > (0 l Λ ( ι -p -p ·ρ oo en p ip 3 l σ\ •P (1) rp P> ) ^

T3 Ai O (N

3 »13 C 3 3 0 0 Pj -P '— £5 0 o

Ai I 00

Ai I I 3 «N

3 en -P > < rp -P > ^ \ es 3 3 -P en oo I ιο 3 3 -P en Ai ip in -P -Ρ -P 3 >i

m E Ai 3 O

3 O <0 en .p

-P en •P

Ό —

A5 I

h 3 en ι en vo a -P -P a: o vo vo

O 3 > >i iP O O

Ai G G -Ρ O X rP ip

Ai-PO-PeniPin χ X

3 tn Ai ·Ρ 3 3 oo in m •P 3 O Ai 3 > - oo oo 3 3 Ä 3 tn m 3 P m m

H O

vp \ ♦H · en ι en 3 -P Ai

H > >i O

1 -P1 O O O o p -P en ip o ro o >i D 3 n m σν O Ai 3 > H in ro > < en ^ E es

P

3 Λ • rs > I O ,p

O ω o O

Ai -P CO CO I o O 3 rs o p « £5 <c ro m o o «.

co - ι rs rs oo rr <C rs ^ o o m

H H O O

•H S r-H rH ΓΜ i—I p—l ι a ι ω ι ι ι ι -h I I :fd 10 c 1H rl 4J -rl

o o ι E o I 3 -P C >i >i P

IX! E iP O Epw O -P ft :3 3

p „ E 3 -P E 3 -P WS-IPAA

O o C 5 S eiUJ il) Oen-P >i1p -P ω jC O O 3 E-PO E-U P3+J£53 •P E G ^ dP 3 3 3 dP 3 3 tn 30:3ft 2 3 en -P o o -P 3 -P o -P 3 3 ·ρ -h o -.3 :o

> O -P n S' β P H ΟΟβίΡ-Ρ Q -P -P > -P

I — 23 7 2 3 4 2 r-f <*> I :3 to I 3 σν I 1) -P ·Η ·ιΗ Ί-* c#5 c#> * 0 CliM (d > M -H a 4J 3 0 C -H 0) 00 VO Ed,

C ϋ » Ο Ή fl ¢0 VO

(0 Η -H 44 a 3 L.O

3 3 :3 O Ai 3 a cfl CO '—' i-ί (¾ 03 -H H 3 II P Oh 3

Il II 3 H 3 CO -H 10 -H CO Ai 4-1 \ CU -H 3 CN -H d) 33tflSn3 3-3 3 :0 r-\ 3 3 :0 vo 3 3 3 E d

Ai -H 3 a > -H C+JrH-H >d E

H 3 O-P'-P Ο-Ρϊ-Ρ 3 -H in 3 < > a: >1 c a: >i c aa d 0 :3 3 3 O :3 3 3 -H 3 - — !X Ai Ai +> « Ai Ai a a ·Η -H to CU O 3 :3 3 I a 3 3 -H >

1 a ·Η d :3 d ·Η γ—I

m M h id oo LO :3 cu £ >i •H CU d > - O > 3 d a) X cu r- - n 3 -h -h aWT3CCS CN >i :3 a to

3 3 CU CU d :3 O O

d a ^ 3 > 3 O

0 · 3 Ή 3 W P

X 3 :3 >i 4-) ΐ-t ro

X +J fl d O Q 'H

3 0 CO -P -H CU

i—i i oo cu cu 4-) s 2 tn

3 I I id CN to 4-> 4J E I

r-sfdco-H><o Ai >, (U m a (d-P-ri>^-'vvv o o 3 :id 0 n o < OCOfd-HCO vo o a Ai a o m M 3 fi-H 01,¾ m o O -H ·> - :3 -p 4-1 -rl 4-> 3 >1 r-l CN ·γλ:3 3 o o a

3 CO £ -X 3 O oo (0 4-1 -H -P

n Tl o m «I H £ UI ή a

'-'Td :3 CP

X :3 P < to H 3 —- 4-> :rd Kd dl· to :id >

Ocnitnvo vo <i) E —i £ C ·η·η £ o o tn tn >i X -H 3 > >, d rH -H -H d 3 CO S d 0 X X Kd cd -3

H (d 0 3 C0 H 00 Ν’ PC -P

3 <d Ai -P 3 cd <N oo CU0 -P

3 p o -X 3 > - - d Ai a> B Φ K ro m - N ro 3 0 o

cp Ai Ai -P

•P i—I Ή CO fd £3 3 3 I to CU in -h d -H Ai 3 CU - C4_i 1 > >1 O O 4-1 -P ·* co cp d dX o O VO CO 4-1 -H 3

>1 -rl COH O rH 3 >iPS

Q)-P33r-^in O -P :3 3 d :3 > Ai 3 > d O in CO 3 Ai Ai

P «! CO —' E d CO - (U

3 tn E+J 3r M

X \ H CD d'H

• > 3 <H :o -P

>i a > o -p -p E

ocoo VO rH O CO 3 d 3 O

Ai Ή 00 N* CN Γ-H :3 d >1 3 3 O 3 CN d r—i o > :3 cp a

« 3 <C d d 3 Ai CO

X Spd O

CO VO d 3 3 cp o H tn o -h > :3 l

oo - - - 4-> :3 X

CN VO rH rH 4-1 \ < 0) E rl 3

Il CU O

VO H-ι d^ W

*· :0 *H CN d £h

•r- VO S I Ai 3 -P O Q

rH rH N· t" E O X Ή 3 £ ft •HE CN | O *· W -X -H »P -n <u 2

Eh —- tn 3 I ooi o o B O m cp -h cu 2 e rH

3 > :3 -PO cnco - - Q Ai I Ai 3C0-P HU

III 13 :0 >10 I < 3 m r- 2 -X >i -H-HOOU3 1 -H-H 3 >iCOCOtOAi -PPCO >i d VO>i 0 ·Η«3Ηιη«2 3 cp 4JT-K dddOAi CU 3:3 ·· dX 3 ffi 2 O O rH UI X H - - P cp 4-> COX d 3 > d d 4->CP>-P dX in UI d E H H :ci 3 -X d cp O O 2 2

CU C0 3 CU KdX CU 3d X C0 CO (UrH C1)DH3 U! X3:0 > 3 3 <P

a -h cu >a a o-hvoa; -h cq ><cu4-> ε**··η·*οοο>α; « a < oo •h a a a rH cu >vX avo>i 3 ι ςύχ >, en ρ <«n - ·η x a χ mm

3 a >rH >1 CU :3 O Ai - O 43 K-H 3:3 0 3 0 ^ a 3 -H X X

> iH a e d-X Ai Ai 3 m rH >H < co-r-vx vo II A! ft O I 3 MK X X OO

24 72342

KAAVIO A NH

r3-c-nh-Q-r Kaava A

R4-CH2-CH-CH2-0- (CH2)m-0-CH2—r—7 Kaava B

OH V

O

NHC_Q“NH2 Kaava C

O NH-Q-R Kaava D

0

C-NH-Q-R Kaava E

0~CH2-OH-NH-Q-R Kaava F

OH

O^r4-CH-CH2-0- (CH2)m-0-CH2--7 Kaava G

ch2oh 0

O^CH-NH-Q-R Kaava H

ch2oh (>, r * il 25 7 2 3 4 2

KAAVIO B

Γ Ί Γ Ί ΝΗ

II

R,-C-NH- O

M

tai -NH-C- 0 n tai

-NH-C- O

tai -C-NH- -NH-

tai--q-- tai --L

O" 0 -NH-CH-CH,- II , ^

-C-NH- OH

tai -ch9-chnh- tai

OH

-NH- tai -CH-NH-

CH2OH

_ J. L -

Kaava J

-r4-ch2-ch-

OH

tai --CH2-0-(CH2)m-0-CH2CH-CH2-R5-L

-R4-^H- °H

ch2oh

Kaava K

26 7 2 3 4 2 KAAVIO B (jatkoa) 0

M

-C-NH- tai -0- tai -S- tai -NH- tai 0 -NH-C- tai -CHo-CH-Rz-- CK OH — l tai -r6-ch-ch2-

OH

tai

O

M

-0-C- tai 0 11 -s-c- tai ! ° ; n ! -NH-C- i_

Kaava M

II

rr f · , <

Claims (7)

27 7 2 3 4 2

1. Affiniteettihartsi käytettäväksi bakteerilusiferaasin eristämisessä ja puhdistamisessa, joka hartsi koostuu tukiaineesta, välikevarresta ja ligandista, tunnettu siitä, että sen rakenne on kaavojen K tai J mukainen, joissa a) tukiaineena on polysakkaridiemäsmatriisi, b) välikevartena on jokin sekä tukiaineen että ligandin kanssa reagoimaan kykenevä kaksifunktionaalinen yhdiste, jolla on seuraava rakenne NH2-Q-R tai V" CH2-0-(CH2)m-0-cB2 ~^7 joissa Q on suora- tai haaraketjuinen alkyleeniryhmä, jossa on 2-8 hiiliatomia, ja R on amino-, karboksi- tai karboksimeri-pihkahappoimidiryhmä, m on kokonaisluku 2-6, ja c) ligandilla L on spesifinen affiniteetti bakteerilusiferaasin suhteen ja se on seuraavan kaavan mukainen: (f) <9H2>q -(CH-) - C - Z b Π | (0¾ »p jossa n on 0-3, q ja p on nolla tai yksi ja Z on vety, metyyli tai etyyli.

2. I (CH^ ) έ jossa n on 0-3, q ja p on nolla tai yksi, ja Z on vety, metyyli tai etyyli.

2. I (CH2»p 6 jossa n' on 3 tai 4, q ja p on nolla tai yksi ja Z on vety, metyyli tai etyyli.

2. Affiniteettihartsi käytettäväksi bakteerilusiferaasin eristämisessä ja puhdistamisessa, joka hartsi koostuu tukiaineesta ja ligandista, tunnettu siitä, että sen rakenne on kaavan M mukainen, jossa a) tukiaineena on polysakkaridiemäsmatriisi, b) ligandilla L on spesifinen affiniteetti bakteerilusiferaasin suhteen ja se on seuraavan kaavan mukainen: 28 72342 Φ ‘fVq —(CH,) , _ c - z

3. Bakteerilusiferaasin eristysmenetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukainen affiniteettihartsi kyllästetään bakteerilusiferaasinäytteellä, joka on supendoi-tu sopivaan anioniseen puskuriliuokseen, mainitusta kyllästetystä hartsista pestään kiinnittymätön proteiini pois ylimääräisellä anionisella puskurilla, mainittu kyllästetty hartsi eluoidaan sopivalla kationisella puskuriliuoksella ja bakteerilusiferaasi otetaan talteen tästä.

4. Bakteerilusiferaasin eristysmenetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 2 mukainen affiniteettihartsi kyllästetään bakteerilusiferaasinäytteellä, joka on suspen-doitu sopivaan anioniseen puskuriliuokseen, mainitusta kyllästetystä hartsista pestään kiinnittymätön proteiini pois ylimääräisellä anionisella puskurilla, mainittu kyllästetty hartsi eluoidaan sopivalla kationisella puskuriliuoksella ja bakteerilusiferaasi otetaan talteen tästä.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lusiferaasilähde on Vibrio fischeri, Photobacterium phosphoreum tai Vibrio harveyi.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi L on rakenteeltaan seuraava li 29 7 2 3 4 2 Θ ‘«2», --(CH )--C -Z

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi L on rakenteeltaan seuraava - <CH2)n’ - C — z <CH2>p jossa n’ on 3 tai 4, q ja p on nolla tai yksi, ja Z on vety, metyyli tai etyyli. 30 7 2 3 4 2