JP3946772B2 - 組み換えタンパク質の精製法 - Google Patents
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Description
本明細書は1996年8月16日出願、審査中明細書シリアルナンバー08/698,747の続編部である。
発明の背景
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)は、金属キレートクロマトグラフィーなる用語を使用してPorathより初めておこなわれ(Porath, J., J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage(1975)Nature 258:598−599)、これまでいくつか総説が発表されている(Porath, J.(1992)Protein Purification andExpression 3:263−281;及び本文中で引用されている論文)。IMAC精製過程はCu2+及びNi2+のような軟金属負荷キレートマトリックスの使用が基礎となっている。タンパク質表面の電子供与基、特にヒスチジンのイミダゾール側鎖は負荷金属の無配位部位と結合することができる。金属と電子供与基との間の相互作用はpHの低下あるいはイミダゾールの置換により可逆化することができる。したがって、ヒスチジンのような電子供与基を持つタンパク質は可逆的な金属錯体/タンパク質相互作用により精製することができる。
数種の異なった金属キレートリガンドがタンパク質精製のためのIMACに使用されてきた。イミノジ酢酸(IDA)リガンドは3座配位であり、この3つの配位部位のみで金属と固着する(Porath, J., B. Olim(1983)Biocheistry 22:1621−1630)。金属の弱い固着力のため、金属の漏出が生じることが知られている。トリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン(TED)リガンドは5座配位であり、非常に強力な金属−キレート錯体を形成する。この欠点はタンパク質との相互作用が1価のみで行われるために、タンパク質が非常に弱い結合力でしか結合しないことである。ニトリロトリ酢酸(NTA)は金属ーイオンタンパク質相互作用特性による金属固着力の均衡を起こす4座配位リガンドである(Hochuli, E., H. Dobeli, A. Schacher(1987)J. Chromatography 411:177−184)。その他のキレートリガンドもこれまで名前や性質が報告されている。例えば、上記Porath(1992)を参照せよ。しかしながら、これらのリガンドは結合能の減少、特異性の減少及び金属漏出の増加が含まれる欠点をも持つ。
1991年に、Fordらはヒスチジン残基を含むテイルを持つ組み換えタンパク質(ポリヒスチジン組み換えタンパク質)にIMAC技術(Ni−NTAリガンド)を応用したタンパク質精製法を応用したものを報告した(Ford, C., I. Suominen, C. Glatz(1991)Protein Expression and Purification 2:95−107)。この方法は2残基以上のヒスチジン残基が非常に強力な金属イオン錯体の形成に関与できるという利点がある。アガロース上に固定化され、Ni2+で負荷されたNTAキレートリガンドはこの方法(上記、Hochuli et al.;U. S. Patent No.5,047,513)に有効である。これはQiagen,Inc.(Chatsworth, CA)を通じて市販品として入手できる。しかしながら、この樹脂は金属イオンとポリ−ヒスチジン組み換えタンパク質との間の交換が最高条件では無いという欠点を持っていいる。金属漏出が起こる可能性があり、バックグラウンドタンパク質が時として組み換えタンパク質の精製に混入することがある。
金属キレートゲル、すなわちカルシウムと錯体を形成したカルボキシルメチル化アスパラギン酸(CM−Asp)アガロースは天然カルシウム結合タンパク質の精製に使用されてきた(Mantovaara, T., H., Pertoft, J. Porath(1989)Biotechnology and Applied Biochemistry 11:564−570;Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath(1991)Biotechnology and Applied Biochemistry 13:315−322;Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath(1991)Biotechnology and Applied Biochemistry 13:120−126)。しかしながら、Mantovaaraらが記載したCa1+−CM−Asp錯体はヒスチジン標識組み換えタンパク質に対し強くは結合しないという自身の欠点を抱えている。この弱い結合特性に加えて、これがヒスチジン標識に対し非選択的であることが別の欠点として存在する。
これに対して、本発明は幾何八面体構造(配位数6)をとって遷移金属と錯体を形成するCM−Aspキレートリガンドを含んでいる。この独特の形状により、ポリヒスチジンを融合した組み換えタンパク質の精製に有効的に使用することができる。これはCM−Aspリガンドの新使用法であり、ここにおいて記載された発明の主題の一部である。
発明の概要
本発明はポリヒスチジン標識を融合した組み換えタンパク質の精製を特異的に意図する固定化カルボキシルメチル化アスパラギン酸(CM−Asp)リガンドを使用する新たなIMAC精製法に関する。新精製法は次の構造を持つCM−Aspキレートマトリックスが基礎となっている。
マトリクッスの一般式が本発明で使用され、上記で示される。
R4−R5−R6がHの場合;
Mは配位数6を持つ2+酸化状態の遷移金属;
R1はCM−Aspの窒素原子をR2と連結させる結合アーム;
R2はCM−Aspと結合したアームR1をR2に連結させる機能的結合基;
R3はポリマーマトリックス、例えばアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーで一般的に使用されるポリマーマトリックス。
R1−R2−R3がHの場合;
R4はCM−Aspのカルボキシルメチル基の炭素原子をR5と連結させる結合アーム;
R5はCM−Aspと結合したアームR4をR6に連結させる機能的結合基;
R6はポリマーマトリックス、例えばアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーで典型的使用されるポリマーマトリックス。
好ましい具体例は;
MはFe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+あるいはZn2+;
R1は−CH2CH(OH)CH2−,−CH2(OH)CH2−O−CH2CH(OH)CH2−,−(CH2)4NHCH2CH(OH)CH2−,及び−(CH2)2NHCH2CH(OH)CH2−;
R2はO,SあるいはNH;及び
R3はアガロース。
特に好ましい具体例は;
MがCo2+;
R1がCH2CH(OH)CH2;
R2がO;及び
R3がクロスリンクアガロース。
樹脂に6XHis組み換えタンパク質を載せる前に、組み換え細胞は溶解及び音波処理することができる。リゼイトはそれ自身金属とキレートを形成しない水性バファー(pH8)で平衡化することができる。記載される工程のこの段階で使用することができる水溶液の例は50mMリン酸ナトリウム(pH8.0)/10mM Tris−HCl(pH8.0)/100mM NaCl、あるいはその類似物である。平衡バッファーには変性剤あるいは界面活性剤、例えば10%トリトンX−100、6MグアニジウムHCl、あるいはその類似物を含むことができる。調製された6XHis組み換えタンパク質を金属CM−Aspキレート樹脂(「CM−Asp樹脂錯体」)に結合させる前に、タンパク質結合樹脂はpH7.0あるいは8.0の水で洗浄される。タンパク質の溶離は一定のpHであるいはpH勾配の減少により行うことができる。好ましい具体例は、タンパク質の溶離が約6.0から6.3までのpHで行うことである。代わりに、CM−Aspキレート樹脂に結合した6XHis組み換えタンパク質は低濃度(100mM以下)のイミダゾールpH8.0で洗浄することができ、その後、濃度を40−100mMに増加させたイミダゾールで溶離させることができる。
本発明の一つの側面としてCM−Asp誘導アガロースキレート樹脂の大規模合成が含まれる。これは先に報告された小規模調製の改良法である(Mantovaara, T., H. Pertoft, J. Porath(1991)Biotechnology and Applied Biochemistry 13:315−322)。この改良にはオキシレン−アガロース形成のための特殊な条件、オキシラン−アガロースに対するアスパラギン酸の共役を調節する温度、及び外部結合金属除去のための高イオン強度洗浄が含まれる。これらの条件、温度、及びイオン濃度はここで詳細に記載されている。
本発明に付随する応用にはマイクロチッタープレートあるいはフィルター上のタンパク質分画のスクリーニングが含まれる。本発明の付随する応用には、抗原及び抗体の精製だけではなくタンパク質−タンパク質相互作用研究も含まれる。例えば、96穴プレートにCM−AspによりCo2+の半分を固定化することにより、これらのプレートは6XHis標識タンパク質の計量、タンパク質−タンパク質相互作用研究、診断上の疾病のスクリーニング、薬品の拮抗物質及びアゴニストスクリーニング、及びレポーター遺伝子検定に使用することができる。Co2+はまたナイロン膜のような膜上にCM−Aspにより固定化することができ、細胞由来のタンパク質ライブラリー作成のために発現ライブラリーからのタンパク質を得るために使用できる。この膜はまた工業用酵素のスクリーニングに使用することができる。本発明の応用には相互作用分子、例えば核酸あるいは微小コファクターの精製にまで拡大することができる。
【図面の簡単な説明】
図1はCM−Aspキレート樹脂を使用した組み換え6XHisタンパク質の精製の工程を示す図である。
図2A−2BはCo2+CM−Aspキレート樹脂によるpH勾配を使用した変性条件下で6XHisプレプロ−α−因子の精製について、Ni−NTAと比較して示すゲルである。
図2A−2Bの凡例のそれぞれは、レーン1:未精製リゼイト、レーン2:通過流出物、レーン3:6M Gu−HCl、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH8.0による洗浄物、レーン4:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウムによる洗浄物、レーン5:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH8.0による洗浄物、レーン6:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン7:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン8:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH6.3による溶出物、レーン9:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH5.9による溶出物、レーン10:8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、pH4.5による溶出物;レーン11:6M Gu−HCl、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.2M酢酸による溶出物;レーンM:分子量マーカーの泳動結果を示す。
図3は未変性条件でCo2+CM−Aspキレート樹脂による6XHis標識DHFR精製を示すゲルである。凡例:レーン1:未精製リゼイト、レーン2:通過流出物、レーン3:1回目の洗浄物、レーン4:3回目の洗浄物、レーン5:最終溶出DHFRの泳動結果を示す。
図4は変性条件でのCo2+CM−Aspキレート樹脂による6XHis標識DHFR精製を示すゲルである。凡例:レーン1:未精製リゼイト、レーン2:通過流出物、レーン3:1回目のpH7.0での洗浄物、レーン4:2回目のpH7.0での洗浄物、レーン5:1回目のpH6.0での溶出DHFR;レーン6:2回目のpH6.0での溶出DHFRの泳動結果を示す。
図5はβ−メルカプトエタノールの濃度を増加させた未変成条件でCo2+CM−Aspキレート樹脂による6XHis標識DHFR精製を示すゲルである。凡例:レーン1:20μl細胞リゼイト;レーン2,4,6,8:20μl通過流出物;レーン3,5,7,9:5μl溶出物の泳動結果を示す。
図6はNi−NTAと比較したCo2+CM−Aspキレート樹脂によるβ−メルカプトエタノール存在下での細胞リゼイトから精製された6XHis DHFR生産量を示すグラフである。タンパク質濃度はブラッドフォード検定により決定された。生産量は細胞リゼイト中の総タンパク質に対するパーセントで表示される。
図7A−7Bは未変成条件でCo2+CM−Aspキレート樹脂による6XHis GFPの精製を示すゲルである。GPFバンドはClontech製chemiluminescence Western Exposure Kitを使用しX線フィルムに一晩感光させて検出した。
凡例:レーン1:リゼイト上清、レーン2:通過流出物、レーン3:1回目の洗浄物、レーン4:1回目の溶出物、レーン5:2回目の溶出物、レーン6:3回目の溶出物、レーン7:4回目の溶出物の泳動結果を示す。
図8はCo2+CM−Aspキレート樹脂により精製した6XHis GFPの生物的活性を示す。凡例はチューブ1:細胞リゼイト、チューブ2:通過流出物、チューブ3:洗浄物、チューブ4:1回目の溶出物、チューブ5:2回目の溶出物、チューブ6:3回目の溶物の泳動結果を示す。
発明の詳細な説明
CM−Asp金属キレート錯体を使用する本発明は、ポリヒスチジンテイルあるいは「標識」を持つ組み換えタンパク質の精製に有効に使用することができる。
本発明の実施態様に従うと、樹脂リガンド、例えばCM−AspはCa2+以外の金属と結合し、CM−Asp−金属錯体を形成する。好ましくは、本発明で使用されるCM−Aspリガンドは例えばFe2+,Co2+,Ni2+,Cu2+あるいはZn2+のような遷移金属(サードブロック遷移金属として知られる)の一つと、幾何八面体構造をとって錯体を形成する。他のポリマーマトリックス、例えばポリスチレン(マイクロチッタープレートに対しての)、ナイロン(ナイロンフィルターに対しての)、セファローズ(Pharmacial, Uppeala, Sweden)あるいはその類似物が本発明で使用することが可能であり、この技術の一般的技能を持つ人にはすぐに認知できると思われる。ポリヒスチジン標識は組み換えタンパク質をこれら遷移金属に非常に強力な金属イオン錯体を形成するために協同的な方法で有効に結合させることができる「隣接」ヒスチジン残基を所有している。この協同結合とはこの技術において一般に「隣接ヒスチジン効果」として知られていることを言う。本発明の目的のため、及びこの技術の一般的技能を持つ人に理解されるように、「強力」あるいは「非常に強力な」金属イオン錯体とは金属イオンとキレートリガンドとの間の結合力について言う。例えば、強力あるいは非常に強力な金属イオン錯体は、錯体から金属漏出がほとんど、あるいは本質的に全く起こらないため、例えばポリヒスチジン標識を持つ組み換えタンパク質のような精製タンパク質が別起源あるいは精製される混合物からの「バックグラウンド」タンパク質に汚染されない。
CM−Asp金属錯体は組み換えタンパク質の表面の2つの近接ヒスチジン残基と強力で可逆的な金属錯体を形成することができる2価の有効原子価を供給する。CM−Aspリガンドを使用する別の利点は強力に金属イオンを固着し、そこでは金属イオンの漏出が別の錯体結合剤、例えばNi−NTAで観測される金属漏出に比較して、事実上無いとすることができるところである。特に好ましい具体例では、Co2+がCM−Aspにおける遷移金属として使用される。Co2+−CM−Aspはβ−メルカプトエタノールのような還元剤に対しての感受性を低下させることができる。30mMまでのβ−メルカプトエタノールの存在下で、金属イオン漏出は無視できる程度の低い値を示している。
本発明の精製工程の一つの具体例は以下の通りである
1. 本技術で詳しく知られている通常手順と技法に従って行う組み換え6XHisタンパク質を含むリゼイト/音波処理物の調製。
2. 弱アルカリpH、例えば約pH8.0での金属負荷CM−Aspキレート樹脂への6XHisタンパク質の結合。
3. 同じ弱アルカリpH(約pH8.0)でのタンパク質/樹脂錯体の洗浄。約7.0のpHあるいはイミダゾールを添加したものでの任意の洗浄も可能である。
4. pHが約6.0−6.3溶離バッファー、あるいはイミタゾールを約40から100mM加えたpHが約8.0の溶離バッファーによる純粋な組み換え6XHisタンパク質の溶出。
本発明の精製工程の好ましい具体的例を図1に表す。本工程はバッチワイズ、スピンカラム、及び大規模連続フローカラムで使用することができる。
上記工程で使用されるバッファーは同様な工程で通常使用される標準バッファーで、本技術において知られているように適切に調節及び修正が行わてれる。例えば、50mMリン酸/10mM Tris/100mM NaClなどの高イオン強度バッファーの場合は必要とされるpHの調節を行ってから使用することができる。リン酸塩成分は10−100mM、Trisは5−25mM、NaClは50−200mMの範囲で存在することができる。
任意の溶離条件は不純物の種類、精製されるタンパク質の量、及びタンパク質の特有の性質に依存し、この技術の一般的技能を持つ人にすぐに理解されるようにケースバイケースの基準で決定される。
本発明には
(a) マレイン酸に対する単一保護α,ω−ジアミノ酸のα−アミノ機能のミカエル付加。
(b) ω−アミノ機能性の脱保護。及び
(c) 固体マトリックスへの1次アミノ分子キレート剤の付着
を含むカルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスの合成方法も付随する。
以下は発明の実行の工程を示す実施例である。すべてのパーセントは重量パーセントであり、すべての溶媒混合比率は特に記載のない限り容積比率である。
実施例1−CM−Aspキレート樹脂の大規模調製
セファローズCL−6BあるいはCL−6B(Phamacia, 8.0L)はddH2Oで洗浄し、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22L丸底フラスコに移された。エピクロロヒドリン(約2.0L)が加えられ、セファローズ樹脂で混合した高濃度懸濁液は約20分間、室温で放置される。水酸化ナトリウム(約560g)及びボロハイドライドナトリウム(約48g)を含むほぼ6400ml ddH2Oの水溶液が加えられ、常温で一晩撹拌混合される。濾過により収集されたオキシレン派生樹脂はddH2O(1回約10L)で10回、10%炭酸ナトリウム(約10L)で1回洗浄され、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22L丸底フラスコに移された。1.3Mチオ硫酸ナトリウムで処理されたオキシラン派生樹脂の標本はオキシラン濃度(好ましくは、>700μmol/g)を決定するためにほぼpH7.0まで滴定される。
約7.6L ddH2Oに水酸化ナトリウム(ほぼ268g)を加えた水溶液にL−アスパラギン酸(約575g)及び炭酸ナトリウム(約1700g)を加えて、約25℃以下の温度に保っておく。pHをほぼ11.0に調節し、樹脂に溶液を加える。撹拌装置及び温熱マントルを使用して約80℃で4時間加熱し、その後、一晩室温まで冷却される。樹脂は濾過により収集され、ddH2O(1回約10L)で10回、10%炭酸ナトリウム(約10L)で1回洗浄され、吸引乾燥の後、撹拌装置を備えた22L丸底フラスコに移された。
氷温冷却した12L ddH2O中の水酸化ナトリウム(約900g)溶液にブロモ酢酸(約3000g)をほぼ750g増加するように、温度を約30℃以下に保ったまま加えた。炭酸ナトリウム(約660g)が加えられ、pHを約10に調節する。樹脂を溶液と常温で一晩反応させる。樹脂は濾過により収集され、ddH2O(1回約10L)で6回、10%酢酸で6回、さらにddH2Oで10回洗浄する。洗浄はリトマス試験紙によってpHが約6.0を示すまでddH2Oで連続して洗浄する。CM−Aspキレート樹脂は金属負荷に対する準備として吸引乾燥された。
実施例2−C−結合CM−Aspキレート樹脂
N6−カルボベンジルオキシ−L−リジン(6.15g)及び過剰のマレイン酸(17.6g)を2M NaOH(35mL)に溶解させた。溶液は24時間還流させ、その後常温まで冷却された。溶液は6M HClでpHを3に調節させて冷蔵された。混合液は水(15mL)で洗浄された未反応マレイン酸を除去するために濾過された。濾液及び洗浄液を混合し、その後蒸発乾燥させた。残滓を4%ギ酸アルミニウム(120mL)に溶解し、短時間脱気した。10%Pb/C(600mg)を加え、混合液をアルゴン雰囲気中で5時間撹拌しながら還流した。混合物はセライトを通し濾過し、濾液を蒸発乾燥させた。残滓は水酸化ナトリウム(1.3g)及び炭酸ナトリウム(8.7g)を含むddH2O(40mL)させた。最終的なpHをHに調整した。実施例1の記載法で調整した(ベット容量40mL)オキシラン派生樹脂にこの溶液を加えた。混合液は60℃で機械的に4時間撹拌した後、16時間室温で放置した。樹脂は濾過により収集され、ddH2O(6×100mL)、10%HOAc(6×100mL)およびddH2O(6×100mL)で、あるいはリトマス試験紙によってpHが約6.0を示すまで洗浄された。C−結合CM−Aspキレート樹脂は金属負荷に対する準備として吸引乾燥された。
実施例3−CM−Aspキレート樹脂の金属負荷
実施例1のCM−Aspキレート樹脂(吸引乾燥されたベッド体積が約1L)は遷移金属イオン溶液、例えばヘキサハイドレイト塩化コバルト、ヘキサハイドレイト硫酸ニッケル、ペンタハイドレイト硫酸銅、あるいは塩化亜鉛の溶液で金属イオン価に従って処理される。樹脂は200mM金属溶液と室温でほぼ72時間反応させ、その後濾過によって収集された。金属を負荷したCM−Aspキレート樹脂はddH2O(1回約1L)で5回、100mM NaCl(1回約1L)で2回、ddH2O(1回約1L)で6回、20%エタノール水(1回約1L)で1回洗浄する。樹脂は20%エタノール水中で保存する。
実施例4−pH勾配を使用した変性条件下で組み換え6XHisプレプロ−α−因子の精製のNi 2+ −NTAとCo 2+ CM−Aspキレート樹脂との比較
変性条件下でCo2+CM−Aspキレート樹脂とNi−NTAの精製の定性比較のために、S. cerevisiaeのC末端6XHis標識プレプロ−α−因子をE. coliで発現させた。1グラムの沈殿させた細菌細胞は6Mグアニジウム塩酸(Gu−HCl)、0.1Mリン酸二水素ナトリウム液、pH8.0中で破壊される。3ミリリットルのリゼイト上清をCo2+CM−Aspキレート樹脂重力流出カラムに載せた。樹脂−タンパク質混合物は8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム液、pH8.0で洗浄され、6.3,5.9及び4.5の3つの異なるpHの8M尿素、0.1Mリン酸二水素ナトリウム液で溶出された。最後に、すべての結合タンパク質は6M Gu−HCl、0.1Mリン酸二水素ナトリウム、0.1M酢酸液で溶出された。それぞれの段階のサンプルは12%ポリアクリルアミド/SDSゲルに載せられ、電気泳動の後、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。6XHis標識プレプロ−α−因子はpH6.3でゲル上では一本の主要なバンドとして確認されるものとして溶出された。
同じ方法で、3ミリリットルのリゼイト上清をNi−NTA重力流出カラムに載せた。樹脂−タンパク質混合物は上記と同じ方法で洗浄及び溶出された。それぞれの段階のサンプルは12%ポリアクリルアミド/SDSゲルに載せられ、電気泳動の後、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。pH6.3の溶出液には10本以上のタンパク質バンドが存在した。6XHis標識プレプロ−α−因子のバンドはそれらの中では弱いバンドであった。タンパク質の主要部は他の混入タンパク質が存在しないpH4.5で溶出された。このことは高度に精製された6XHis標識プレプロ−α−因子は、Ni−NTAでは混入物も放出する条件(pH6.3)でCo2+CM−Aspキレート樹脂から溶出されることを示す。Co2+CM−Aspキレート樹脂の6XHis標識プレプロ−α−因子に対する親和性はNi−NTAのタンパク質に対するものに比較してより選択性があった。
この結果は高度に精製された6XHis標識プレプロ−α−因子は、Ni−NTAでは混入物も放出する条件でCo2+CM−Aspキレート樹脂から溶離されることを示す。図2A−2Bを参照。図2AはCo2+CM−Aspキレート樹脂からの1mlを使用した結果である。図2Bはニッケル−NTAからの1mlを使用した結果である。
実施例5−未変性条件でのCM−Aspキレート樹脂による組み換え6XHis DHFR精製
N末端6XHis標識マウスジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR、分子量20.3kDa)をE. coli細胞で発現させた。細胞はその後0.75mg/mlリソチームで調製され、溶解バッファー(100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Tris−HCl、pH8.0)で機械的に撹拌しながら破壊させ、800μlのリゼイト上清をの溶解バッファーで前平衡した100μlのCo2+CM−Aspキレート樹脂を使い作業実施し、溶解バッファーで3回洗浄した。すべての結合タンパク質は300μlの100mM EDTA、pH8.0で溶解させた。20ミリリットルのリゼイト及び溶離液のそれぞれの40μlの続分画を12%ポリアクリルアミド/SDSゲルで泳動した。ゲルはクーマーシーブルーで染色された。分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。この結果は未変性精製条件で6XHis標識DHFRに対してCo2+CM−Aspキレート樹脂が選択的結合親和性をもつことを示した。宿主タンパク質の識別できる結合は起こらなかった。
この結果はCo2+CM−Aspキレート樹脂が6Xヒスジンに対して選択的結合親和性もつことを示した。宿主タンパク質の識別できる結合は起こらなかった。図3参照。
実施例6−変性条件でのCM−Asp樹脂による組み換え6XHis DHFR精製
N末端6XHis標識マウスDHFRを25mlの培養E. coli細胞で発現させた。細胞を沈殿させ、溶解バッファー(100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Tris−HCl、8M尿素、pH8.0)に再懸濁させ、そして渦動により破壊した。600μlのリゼイト上清を0.5mlのCo2+CM−Aspキレート樹脂−NX金属親和性樹脂を含むCo2+CM−Aspキレート樹脂で作業を実施し、2,000×gで2分間遠心分離した。カラムは1mlの洗浄バッファー(100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM PIPES、pH7.0)で2回洗浄し、結合タンパク質は600μl溶離バファー(20mM PIPES、100mM NaCl、8M尿素、pH6.0)で溶出した。20ミリリットルのリゼイト及び40μlの溶出液のそれぞれの続分画を12%ポリアクリルアミド/SDSゲルで泳動した。ゲルはクーマーシーブルーで染色された。分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。この結果は変性条件下で6XHis標識DHFRに対してCo2+CM−Aspキレート樹脂が選択的結合親和性をもつことを示した。6Xヒスチジンに対してのCo2+CM−Aspキレート樹脂の結合特性により完全なタンパク質状態を保つ中性pH条件(pH6.0)でタンパク質を溶出させることができる。
この結果は結合タンパク質が中性pH(pH6.0)で溶出させることができることを示す。このことはCo2+CM−Aspキレート樹脂の結合特性により完全なタンパク質状態を保つ中性pH条件でタンパク質を溶出させることができることを示す。図4を参照。
実施例7−未変性条件でベータメルカプトエタノールの濃度を増加によるCM−Asp樹脂を使用したよる組み換え6XHis DHFR精製
N末端6XHis標識マウスDHFRをE. coli細胞で発現させた。25mlの培養細胞は2mlの音波処理バッファー(100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Tris−HCl、100mM NaCl、pH8.0)中で凍結融解により破壊した。その後、2.66mlのリゼイト上清を200μlの音波処理バッファーで前平衡化したCo2+CM−Aspキレート樹脂重力流出カラムを使い作業を実施分離した。タンパク質/樹脂混合物は音波処理バッファー、pH8.0で3回洗浄した。すべての結合タンパク質は600μlの100mM EDTA、pH8.0で溶出した。未変性条件下でCo2+CM−Aspキレート樹脂精製のβ−メルカプトエタノールの効果を検査するため、ここで使用されるすべてのバッファーには0,10,20あるいは30mMのいずれかの濃度のβ−メルカプトエタノールを含んでいた。それぞれの溶出液のサンプルは12%ポリアクリルアミド/SDSゲルで電気泳動し、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。すべての溶出液で分子量20.3kDaの位置に一本のタンパク質バンドが検出された。β−メルカプトエタノールの存在はCo2+CM−Aspキレート樹脂により行われる6XHis標識DHFRの精製に影響を与えることはない。30mMまでのβ−メルカプトエタノールを含むすべての精製バッファーでは、通過流出物の20.3kDaの位置の顕著なバンドは無く、β−メルカプトエタノール存在下でCo2+CM−Aspキレート樹脂を使用したタンパク質精製の工程中金属の損失が起こらないことを示している。
この結果は30mMまでのβ−メルカプトエタノールを含む精製バッファーの場合、通過流出物に20.3kDaの顕著なバンドは無く、β−メルカプトエタノール存在下でCo2+CM−Aspキレート樹脂を使用したタンパク質精製の工程中金属の損失が起こらないことを示している。図5参照。
実施倒8−Ni−NTAと比較したCo 2+ CM−Aspキレート樹脂によるベータ−メルカプトエタノール存在下での細胞リゼイトから精製された6XHis DHFR生産量
N末端6XHis標識DHFRを発現させ、実施例7で記載された未変性条件下でCo2+CM−Aspキレート樹脂により精製した。タンパク質濃度はブラッドフォード検定により決定された。生産量は細胞リゼイト中の総タンパク質に対するパーセントで表示された。精製された6XHis標識DHFRの生産量は、精製バッファー中に含まれるβ−メルカプトエタノールの濃度が0,10,20,30mMのそれぞれに対して、14%,28%,34%,35%であった。同じ未変性条件下でNi−NTAで精製されたタンパク質では、精製された6XHis標識DHFRの生産量は、精製バッファー中に含まれるβ−メルカプトエタノールの濃度が0,10,20,30mMのそれぞれに対して、4%,8.8%,3.4%,4%であった。β−メルカプトエタノールが存在する未変性条件下では精製6XHis標識DHFRの生産量は、Ni−NTAに比較してCo2+CM−Aspキレート樹脂を使用する場合には、有意に高くなる。このことは、Co2+CM−Aspキレート樹脂上の金属イオンは八面体金属結合に最善であるCM−Asp金属キレートによりセファローズビーズに強力に固着することを示す。結果はβ−メルカプトエタノールの濃度が0,10,20,30mMでNi−NTA使用に比較してCo2+CM−Aspキレート樹脂を使用する場合には、精製された6XHis標識DHFRの生産量は有意に高くなる。このことは、Co2+CM−Aspキレート樹脂上の金属イオンは八面体構造金属結合に有効であるCM−Asp金属キレートによりセファローズビーズに強力に固着することを示す。図6を参照。
実施例9−未変成条件でCo 2+ −CM−Aspによる6XHis GFPの精製
N末端6XHis標識グリーン蛍光タンパク質(GFP)をE. Coli細胞で発現させた。細胞を沈殿させ、音波処理バッファー(100mMリン酸二水素ナトリウム、10mM Tris−HCl、100mM NaCl、pH8.0)に再懸濁させ、凍結融解を3回行うことで破壊した。2mlのリゼイト上清を音波処理バッファーで前平衡化した400μlのCo2+CM−Aspキレート樹脂で作業を実施し、2mlの音波処理バッファー、pH8.0で3回洗浄した。6XHis標識GFPは20mMTris−HCl、100mM NaClを含む400μlの75mMイミダゾールバッファー、pH8.0で溶出した。それぞれの精製段階のサンプルは12%ポリアクリルアミド/SDSゲルで電気泳動し、ゲルはクーマーシーブルーで染色された。75mMイミダゾールバッファーの溶出液には分子量27.8kDaの位置に一本のバンドが検出された。このことは、6XHis標識GFPはCo2+CM−Aspキレート樹脂に選択的に結合し、未変性精製条件で低濃度のイミダゾールで溶出できることを示した。
それぞれの精製段階のサンプルまたは12%ポリアクリルアミド/SDSゲルで電気泳動し、PVDF膜にトランスブロットした。ブロット上のタンパク質はアンチGFPモノクローナル抗体をプローブに調べられた。一本のGFPバンドは細胞リゼイト及び溶離液のサンプルで明確に検出された。通過流出物にはGFPバンドは検出されず、細胞リゼイト中に出現したすべてのGFPはCo2+CM−Aspキレート樹脂結合したことを示した。
この結果は75mMイミダゾール溶出液ではクーマーシーブルーで染色でゲルには一本のバンドが現れる(図7A)。このことは、6XHis標識GFPはCo2+CM−Aspキレート樹脂に選択的に結合することを示す。ウエスタン分析のデータは通過流出物にはGDFが含まれず、Co2+CM−Aspキレート樹脂と6Xヒスチジンの間に高い親和性があることを示した(図7B)。
実施例10−Co 2+ CM−Aspより精製した6XHis GFPの生物学的活性
N末端6XHis標識GFPをE. Coliで発現させた。細胞リゼイトは実施例7で記載のとおり調製された。細胞リゼイトは2ml Co2+CM−Aspキレート樹脂ディスポーザブルグラビティーカラムに載せられ、実施例9で記載の方法でバッチ/グラビティーフローカラムを使用して精製した。カラムは音波処理バッファーで3回洗浄し、100mM EDTA,pH8.0で溶出した。それぞれの精製段階から微小遠心管にサンプルが集められた。収集されたすべてのサンプルの蛍光はUltraLum Electronic U. V. Transilluminatorによって検出した。この実験では6XHis標識GFPがCo2+CM−Aspキレート樹脂によって未変性条件で生物学的活性を保ったまま等質的に精製することができることを示した。
それぞれの精製段階でのサンプルの写真はGFDはCo2+CM−Aspキレート樹脂によって未変性条件で等質的に精製することができ、蛍光はCo2+CM−Aspキレート樹脂によって精製されたGFPが生物学的活性をなお保っている事を示す。
ここにおいて記載される実施例と具体例は説明する目的のためものであり、またこの点でこの技術の技能を有する人に暗示されうる様々な修正あるいは変更は、この明細書の精神および範囲及び添付された請求項の分野の内部に含まれるべきことを理解しなければならない。
Claims (22)
- ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質の精製方法であって、該方法が、
(a)下記構造式を有するカルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスを供給するステップ、
ここで、
R1−R2−R3はH;
Mは配位数6を持つ2+酸化状態の遷移金属イオン;
R4はCM−Aspのカルボキシルメチル基のメチレン基の炭素原子をR5と連結させる結合アーム;
R5はCM−Aspと結合したアームR4をR6に連結させる機能的結合基;及び
R6はポリマーマトリックスであり、
(b)ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質を含むサンプルを前記マトリックスと接触させて、前記タンパク質を前記マトリックスに結合させるステップ、及び
(c)前記ポリヒスチジンタグを有するタンパク質を前記マトリックスから溶離して、精製ポリヒスチジンタグを有する組み換えタンパク質を得るステップ
を含む方法。 - 遷移金属イオンが、Fe 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Cu 2+ およびZn 2+ からなる群から選択される請求項1の方法。
- 結合アームが−(CH 2 ) 4 NHCH 2 CH(OH)CH 2 −及び−(CH 2 ) 4 NH−からなる群から選択される請求項1の精製方法。
- 機能的結合基がO、S、NH及びCOで構成される群より選択される請求項1の方法。
- ポリマーマトリックスがアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーでの使用に適したマトリックスである請求項1の方法。
- ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファロース及びナイロンから構成される群から選択される請求項1の方法。
- MがFe 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Cu 2+ あるいはZn 2+ ;
R 4 が−(CH 2 ) 4 NHCH 2 CH(OH)CH 2 −あるいは−(CH 2 ) 4 NH−;
R 5 がO、S、NHあるいはCO;及び
R 6 がアガロースあるいはポリスチレン
である請求項1の方法。 - MがCo 2+ ;
R 4 が−(CH 2 ) 4 NHCH 2 CH(OH)CH 2 −あるいは−(CH 2 ) 4 NH−;
R 5 がOあるいはCO;及び
R 6 がアガロース、クロスリンクアガロースあるいはポリスチレン
である請求項1の方法。 - 遷移金属イオンがFe 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Cu 2+ 及びZn 2+ から構成される群から選択される請求項9の錯体。
- 結合アームが、−(CH 2 ) 4 NHCH 2 CH(OH)CH 2 −及び−(CH 2 ) 4 NH−からなる群から選択される請求項9の錯体。
- 機能結合基が、O、S、NH及びCOからなる群から選択される請求項9の錯体。
- ポリマーマトリックスがアフィニティーあるいはゲルクロマトグラフィーの使用に適するマトリックスからなる請求項9の錯体。
- ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファロース及びナイロンから構成される群から選択される請求項9の錯体。
- MがFe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+あるいはZn2+ ;
R4が−(CH2)4NHCH2CH(OH)CH2−あるいは−(CH2)4NH−;
R5がO、S、NHあるいはCO;及び
R6がアガロースあるいはポリスチレン
である請求項9の錯体。 - MがCo2+;
R4が−(CH2)4NHCH2CH(OH)CH2−あるいは−(CH2)4NH−;
R5がOあるいはCO;及び
R6がアガロース、クロスリンクアガロースあるいはポリスチレン
である請求項9の錯体。 - カルボキシルメチル化アスパラギン酸キレートマトリックスの合成方法であって、該方法が、
(a)ωモノプロテクテッドα,ω−ジアミノ酸とマレイン酸とを反応させて、ミカエル付加生成物を形成し、
(b)ミカエル付加生成物のω−アミノ機能基を脱保護し、
(c)ポリマーマトリックスにミカエル付加生成物を付着させる
段階を含む方法。 - プロテクテッドアミノ基の保護基がベンジルオキシカルボニル基である請求項17の方法。
- ポリマーマトリックスが、アフィニティー又はゲルクロマトグラフィーの使用に適するマトリックスである請求項17の方法。
- ポリマーマトリックスが、アガロース、クロスリンクアガロース、ポリスチレン、セファローズ及びナイロンから構成される群から選択される請求項17の方法。
- ω−モノプロテクテッドα,ω−ジアミノ酸が、N 6 −カルボベンジルオキシ−L−リシンである請求項17の方法。
- ミクロチッタープレートあるいはフィルターでのタンパク質機能のスクリーニングにおいて、
(a)請求項9の錯体のプレートあるいはフィルターへの固定
(b)前記固定化された錯体のスクリーニングされる機能を持つタンパク質への結合
(c)結合タンパク質に対するタンパク質機能に対する検査の実行
の段階を含む方法。
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