ES2465715B1 - Péptido, péptido magnético y método para detectar la enfermedad celíaca - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un péptido, a un péptido magnético y a un método para detectar la enfermedad celíaca. También se refiere a un péptido deaminado que se emplea para preparar dicho péptido magnético, y al empleo de ambos para la detección de la enfermedad celíaca. Dicho péptido deaminado comprende una cola de histidinas y está unido a un complejo magnético particulado. También se refiere a un inmunosensor que comprende dicho péptido magnético, a un método apropiado para detectar la enfermedad celíaca basado en un immunoensayo magnético y a un kit que comprende dicho péptido magnético.
Description
PÉPTIDO, PÉPTIDO MAGNETICO Y MÉTODO PARA DETECTAR LA ENFERMEDAD CELÍACA
La presente invención se refiere a un método para la detección de la enfermedad celíaca mediante el empleo de un péptido inmovilizado sobre partículas magnéticas.
La Enfermedad Celíaca (EC) es una forma de enteropatía que afecta a individuos genéticamente predispuestos, al entrar en contacto con alimentos que contienen gluten. Ello determina la aparición de una lesión histológica característica, que en las formas más graves provoca atrofia de las vellosidades intestinales. Como consecuencia de ello, puede producirse un defecto de malabsorción de nutrientes (principios inmediatos, sales minerales y vitaminas) que conduce a diversos estados carenciales responsables de un amplio espectro de manifestaciones clínicas como osteomalacia (reblandecimiento de huesos por pérdida de sales calcáreas), úlceras digestivas y procesos malignos como neoplasia gastrointestinal.
La EC puede presentarse a cualquier edad de la vida y cursa con manifestaciones clínicas muy variadas, aunque en muchos casos la enfermedad es asintomática. Estas premisas hacen especialmente relevante el papel del pediatra y del médico de familia en atención primaria en el diagnóstico precoz, evitando así el desarrollo de complicaciones graves a largo plazo.
La EC consiste en una intolerancia permanente a las proteínas del gluten del trigo (gliadina), del centeno (secalina), de la cebada (hordeina) y del triticale (híbrido de trigo y centeno).
A pesar de que esta enfermedad fue considerada rara en muchos países europeos, la disponibilidad de ensayos serológicos sensibles no invasivos han permitido detectar la enfermedad celíaca en la población en general.
La prevalencia mundial se estima en 1/266, y en España oscila entre 1/118 en la población infantil y 1/389 en la población adulta. Sin embargo, se considera que la epidemiología de la EC tiene las características de un iceberg ya que esta prevalencia podría ser mucho mayor, puesto que un porcentaje importante de casos permanece sin detectar. Se estima que por cada paciente diagnosticado se encuentran entre 5 y 10 que no lo son. Así, según diversos estudios epidemiológicos realizados en todo el mundo, la EC sin sintomatología clásica es más frecuente que la forma sintomática, constituyendo un reto para el sistema sanitario su detección precoz.
Inicialmente, la detección de la enfermedad celíaca se basaba en un ensayo de malabsorción mediante el empleo de D-xilosa. Posteriormente se empezaron a utilizar ensayos serológicos para anticuerpos anti-gliadina (AGA) y anticuerpos anti-endomisio (EMA). Más adelante se incorporó la detección de los anticuerpos anti-transglutaminasa tisular 2 (ATG2) y, más recientemente, de los anticuerpos anti-péptidos deaminados de gliadina (APDG).
Los marcadores séricos son de gran utilidad como indicadores de EC, si bien la biopsia intestinal sigue siendo el método definitivo para establecer el diagnóstico. Dichos marcadores ayudan a seleccionar a los individuos con mayor probabilidad de presentar la EC, siendo particularmente útiles en aquéllos sin síntomas gastrointestinales, en aquellos con enfermedades asociadas a la EC y para el control de familiares de primer grado de enfermos diagnosticados. Debe considerarse, no obstante, que la negatividad de estos marcadores no excluye definitivamente el diagnóstico, siendo necesario en ocasiones recurrir a pruebas más avanzadas (estudio genético) cuando la sospecha diagnóstica es elevada.
Los anticuerpos anti-gliadina (AGA) fueron los primeros en utilizarse, tal como se describe en Stern et al., Validation and standardization of serological screening tests for coeliac disease in 1996, 3rd EMRC/ESPGAN Workshop, Dec. 5-8, 1996, Molsheim, Francia, pág. 9-24. Son tanto de clase IgA como IgG. Se utilizan preferentemente los de clase IgA y su eficacia para el cribado de EC es mayor en niños que en adultos.
Los anticuerpos anti-endomisio (EMA) son también de clase IgA. Su sensibilidad y su especificidad son variables según la edad. Según el documento Diagnóstico precoz de la enfermedad celíaca, Ministerio de Sanidad y Consumo, Madrid, 2008, (NIPO: 351-08-086-X), dichos anticuerpos tienen el inconveniente de la laboriosidad de su determinación y su interpretación es subjetiva. Además, es conocido que algunos pacientes de la EC presentan un déficit de IgA, por lo que dichos pacientes darían negativos con este test.
Los anticuerpos anti-transglutaminasa tisular humana de clase IgA (ATG2) se consideran marcadores sensibles, específicos y muy útiles tanto para el diagnóstico como el seguimiento de la EC. También se han divulgado otras alternativas como los anticuerpos combinados ATG2-IgA/IgG.
En el estado de la técnica se han descrito diversos métodos en los que se emplean los anticuerpos ATG2. Por ejemplo, en el artículo Kergeravat et al., Magneto immunofluorescence assay for diagnosis of celiac disease, Anal. Chim Acta., 2013, 798, 89-96 se describe un método para el diagnóstico de la EC basado en la detección de anticuerpos anti-ATG2 mediante el uso de la enzima ATG2 inmovilizada en partículas magnéticas y la detección se realizó por inmunofluorescencia. Se describe que dicho ensayo presentó una sensibilidad del 96,6% y una especificidad del 89,5%, y una eficiencia del 93,8% comparado con el kit comercial ELISA.
Para evitar la toma de muestras de sangre también se ha divulgado la detección de anticuerpos ATG2 en saliva como, por ejemplo, en la solicitud de patente norteamericana US-A-2008/0038760.
Posteriormente, tal como se describe en Aleanzi et al., Antibody Recognition against Native and Selectively Deamidated Gliadin Peptides, Clin. Chem., 2001, 47, 2023–2028, se comenzó a estudiar la relación entre la enfermedad celíaca y los APDG del isotipo IgG e IgA, ya que en la enfermedad celíaca, los péptidos de gliadina ingeridos en la dieta son selectivamente deaminados en el intestino por la enzima TG2, de modo que la glutamina, H2NCOCH2CH(NH2)COOH, es transformada por dicha enzima en ácido glutámico, HOOCCH2CH(NH2)COOH. Esta deaminación selectiva puede ser el evento que inicia la respuesta inmune al gluten en individuos predispuestos genéticamente. En Schwertz et al., Serologic Assay Based on Gliadin-Related Nonapeptides as a Highly Sensitive and Specific Diagnostic Aid in Celiac Disease, Clin. Chem., 2004, 50, 2370–2375, se describen nonapéptidos derivados de gliadina que son reconocidos por los anticuerpos de pacientes con la ED. También se describe que ninguno de los octadecapéptidos deaminados ensayados fue mejor epitopo que los péptidos de cadena más corta.
En el estado de la técnica se han descrito métodos para detectar estos anticuerpos APDG. Dichos métodos se basan en ensayos ELISA con detección óptica como, por ejemplo, el descrito en Sakly et al., Performance of anti-deamidated gliadin peptides antibodies in celiac disease diagnosis, Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol., 2012, 36, 598-603, o un ensayo inmunofluorimétrico como el descrito en Ankelo et al., Antibody responses to deamidated gliadin peptide show high specificity and parallel antibodies to tissue transglutaminase in developing coeliac disease, Clin. Exp. Immunol., 2007, 150, 285–293.
En el estado de la técnica se siguen divulgando nuevos métodos para la detección de la EC. Por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO-A2009/131909 se describe un método para detectar la EC en un individuo en el que se emplea un antígeno formado por una gliadina recombinante deaminada unida a una cola tal como la proteína glutationa-S-transferasa o His-tag, que puede incluir transaminasa tisular. Dicho antígeno se encuentra inmovilizado en partículas magnéticas modificadas con grupos carboxilo.
Recientemente, en la solicitud de patente internacional WO-A2013/083866, se ha descrito el empleo de anticuerpos anti-beta-lactoglobulina en el diagnóstico y el seguimiento de la EC mediante el análisis de una muestra de sangre del paciente.
A pesar de las soluciones descritas en el estado de la técnica, persiste la necesidad de proporcionar un método simple, rápido y con una selectividad y especificidad mejoradas para detectar la enfermedad celíaca y superar, al menos en parte, los inconvenientes que presentan los métodos del estado de la técnica.
El objeto de la presente invención es un péptido.
Forma también parte del objeto de la invención un péptido magnético que comprende dicho péptido y un complejo magnético particulado.
También forma parte del objeto de la invención un inmunosensor que comprende dicho péptido magnético.
También forma parte del objeto de la invención un método para detectar la enfermedad celíaca.
Forma parte también del objeto de la invención el uso de dicho péptido para detectar la enfermedad celíaca.
También forma parte del objeto de la invención el uso de dicho péptido magnético para detectar la enfermedad celíaca.
También forma parte del objeto de la invención el uso de dicho inmunosensor para detectar la enfermedad celíaca.
Forma parte también del objeto de la invención un kit para detectar la enfermedad celíaca.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un péptido lineal que responde a la fórmula general (I): H2N-(H)n-LPFPXXPXXPFPXPXXPX-(H)m-COOH (I) en donde: X es Q o E indistintamente, y al menos un X es E, y
en donde:
n está comprendido entre 2 y 20, y m es 0, o
m está comprendido entre 2 y 20, y n es 0.
Dicho péptido resulta apropiado para ser empleado en un método para la detección de la EC una vez inmovilizado con un complejo magnético particulado.
Los autores de la presente invención han desarrollado un método para detectar la enfermedad celíaca en el que se emplea como antígeno el péptido de fórmula general (I) inmovilizado sobre un complejo magnético particulado, y que, sorprendentemente, permite una detección con una elevada sensibilidad y especificidad y, además, se trata de un método simple y rápido.
Las abreviaturas empleadas para los aminoácidos en esta descripción siguen la normativa de la Comisión para la Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, según se describe en el artículo Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides, Pure & Appl. Chem., 1984, 56(5), 595-624. De esta forma H es Lhistidina, L es L-leucina, F es L-fenilalanina, P es L-prolina, Q es L-glutamina y E es ácido glutámico.
En la presente descripción, así como en las reivindicaciones, las formas singular “un”, “una” y “el” o “la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Péptido
El péptido de la invención responde a la fórmula general (I):
H2N-(H)n-LPFPXXPXXPFPXPXXPX-(H)m-COOH (I)
en donde:
X es Q o E indistintamente, y al menos un X es E, y
en donde:
n está comprendido entre 2 y 20, y m es 0, o
m está comprendido entre 2 y 20, y n es 0.
Dichos péptidos, definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a 38, derivan de péptidos deaminados de gliadina a los que se ha añadido una cola de entre 2 y 20 histidinas (H) en el extremo N-terminal, donde se encuentra el grupo amino (NH2) o en el extremo C-terminal, donde se encuentra el grupo carboxilo (COOH), preferiblemente n y m están comprendidas entre 4 y 15, más preferiblemente entre 6 y 10 y aún más preferiblemente entre 6 y 8.
Más preferiblemente el péptido de la invención responde a la fórmula general (I), en donde m es cero (0) y n está comprendida 2 y 20, más preferiblemente entre 4 y 15, más preferiblemente entre 6 y 10 y aún más preferiblemente entre 6 y 8.
De forma más preferida, el péptido de la invención responde a la estructura H2N-(H)6-LPFPEQPEQPFPQPEQPQ-COOH (SEQ_ID_NO: 39), donde n es
6.
En el artículo de Schwertz et al., ya mencionado, se describen 12 octadecapéptidos deaminados, sin cola de histidinas, que vienen definidos por las secuencias siguientes:
- Péptido deaminado
- SEQ_ID_NO:
- H2N-LPFPEQPEQPFPQPEQPQ-COOH
- 40
- H2N-LPFPQQPEQPFPQPEQPQ-COOH
- 41
- H2N-LPFPEQPQQPFPQPEQPQ-COOH
- 42
- H2N-LPFPEQPEQPFPQPQQPQ-COOH
- 43
- H2N-LPFPQQPQQPFPQPQQPE-COOH
- 44
- H2N-LPFPQQPQQPFPQPQEPQ-COOH
- 45
- H2N-LPFPQQPQQPFPQPEQPQ-COOH
- 46
- H2N-LPFPQQPQQPFPEPQQPQ-COOH
- 47
- H2N-LPFPQQPQEPFPQPQQPQ-COOH
- 48
- H2N-LPFPQQPEQPFPQPQQPQ-COOH
- 49
- H2N-LPFPQEPQQPFPQPQQPQ-COOH
- 50
- H2N-LPFPEQPQQPFPQPQQPQ-COOH
- 51
Dichos péptidos modificados convenientemente con una cola de histidina también son apropiados para ser empleados en el método de la invención.
Preferiblemente, comprenden de entre 2 y 20 histidinas (H) en el extremo N-terminal, esto es n está comprendida entre 2 y 20 y m es cero (0), o en el extremo C-terminal, esto es m está comprendida entre 2 y 20 y n es cero (0), preferiblemente n y m están comprendidas entre 4 y 15, más preferiblemente entre 6 y 10 y aún más preferiblemente entre 6 y 8. Más preferiblemente dichos péptidos comprenden una cola de histidinas en donde m es cero (0) y n está comprendida 2 y 20, más preferiblemente entre 4 y 15, más preferiblemente entre 6 y 10 y aún más preferiblemente entre 6 y 8.
En el artículo de Ankelo et al., ya mencionado, se describen dos derivados del péptido definido por la fórmula (SEQ_ID_NO_ 40), sin cola de histidinas. Uno de ellos está modificado con biotina en el extremo N-terminal, y en el otro en el extremo C-terminal, habiéndose incluido un residuo adicional de lisina para facilitar la incorporación de la biotina, H2N-LPFPEQPEQPFPQPEQPQK-COOH (SEQ_ID_NO: 52). La incorporación de la biotina en dichos péptidos se debe al empleo de placas recubiertas con la proteína estreptavidina, que forma un complejo de afinidad muy fuerte con la biotina, y así se inmoviliza el péptido.
Los péptidos descritos en la invención están formados por entre 20 y 38 aminoácidos que los hace apropiados para ser preparados empleando los procedimientos habituales de síntesis de péptidos en fase sólida como, por ejemplo, los descritos por R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154. También pueden adquirirse comercialmente como, por ejemplo, a las compañías Eurogentec,
S.A. (Seraing, Bélgica) o GenScript (Piscataway, EE.UU.).
Péptido magnético También forma parte del objeto de la invención un péptido magnético que comprende: a) el péptido de fórmula general (I): H2N-(H)n-LPFPXXPXXPFPXPXXPX-(H)m-COOH (I) en donde: X es Q o E indistintamente, y al menos un X es E, y
en donde:
n está comprendido entre 2 y 20, y m es 0, o
m está comprendido entre 2 y 20, y n es 0, y
b) un complejo magnético particulado de fórmula general (II):
O
O
M imagen59 N (II)
O
O
O O
en donde:
Z es una partícula polimérica magnética unida covalentemente al
ligando aspartato carboximetilado a través de R1,
R1 es un brazo de unión que conecta el átomo de nitrógeno del
ligando aspartato carboximetilado con la partícula polimérica
magnética Z, y
M es un ion de un metal de transición con un número de
coordinación 6.
El péptido de la invención se encuentra inmovilizado sobre una partícula polimérica magnética (en adelante PM) por medio de la cola de histidina que forma complejos con el metal de transición, y así se completa la esfera de coordinación de dicho metal. De acuerdo con las divulgaciones del estado de la técnica, por ejemplo, la patente norteamericana US5962641, el complejo de coordinación formado entre un péptido que contiene una cola de histidina y el metal de transición se puede clasificar como muy fuerte. En el contexto de esta invención se considera que la unión del péptido con el metal de transición se trata sustancialmente de un complejo de coordinación, que no incluye enlaces covalentes.
Eventualmente el complejo magnético particulado incluye contracationes, por ejemplo, Na+ o Li+, para compensar las cargas negativas en exceso del ligando aspartato carboximetilado que forma parte del mismo.
Partícula polimérica magnética
En el contexto de la invención se entiende por partícula polimérica magnética (PM) una partícula formada por un polímero que contiene una sustancia superparamagnética. De este modo las PM son desplazables por el efecto de un campo magnético, pero no son magnetizables permanentemente.
Se entiende por partícula polimérica magnética funcionalizada aquella PM que incluye grupos funcionales situados preferiblemente en la superficie de la misma que permiten el anclaje ulterior de otras moléculas.
Las PM están formadas habitualmente a partir de combinaciones de polímeros vinílicos (per ejemplo, estireno), acrilatos y/o metacrilatos. El polímero puede estar reticulado mediante la incorporación de agentes reticulantes como comonómeros, por ejemplo, divilbenceno o dimetacrilato de etilenglicol. Preferiblemente el polímero es un polimérico estirénico reticulado, por ejemplo, un polímero formado por estireno y divinilbenceno, y que se encuentra funcionalizado en la superficie del mismo, o bien un polímero (met)acrílico reticulado funcionalizado en la superficie con un comonómero que contiene, por ejemplo, un grupo epoxi. El experto en la materia no encuentra dificultades para determinar las cantidades apropiadas de cada uno de los monómeros implicados en la formación de las partículas poliméricas. Por ejemplo, en la solicitud de patente WO-A-00/61647 se describen procedimientos para la preparación de partículas poliméricas, que pueden incluir materiales magnéticos, entre otros.
La funcionalización de la superficie de las partículas poliméricas permite obtener PM funcionalizadas que facilitan el acoplamiento del ligando aspartato carboximetilado a dichas partículas. Dicha funcionalización puede llevarse a cabo mediante la incorporación de, por ejemplo, grupos carboxilo, nitro, amino, tosilo, epoxi,
o tiol. A menudo, las PM funcionalizadas son preparadas a partir de polímeros de estireno que son nitrados para introducir un grupo nitro en la superficie de las mismas. La reducción del grupo nitro a grupo amino por medios convencionales permite disponer de PM funcionalizadas con grupos amino que fácilmente pueden reaccionar con otros grupos, por ejemplo, haloderivados.
Como sustancia superparamagnética se pueden emplear óxidos de hierro como, por ejemplo, la magnetita (Fe3O4). Se han descrito diferentes procedimientos para la preparación de PM como, por ejemplo, el que se encuentra en la patente US4654267.
Las PM de la invención tienen típicamente un diámetro medio comprendido entre 0,3 y 100 micras, preferiblemente entre 0,5 y 50 micras, más preferiblemente entre 0,8 y 8 micras, y aún más preferiblemente entre 0,8 y 1,2 micras.
Habitualmente las PM son sustancialmente esféricas y sustancialmente monodispersas. Se entiende por sustancialmente monodispersas que para una pluralidad de partículas, las mismas tienen un coeficiente de variación (CV) de menos del 20%, preferiblemente menos del 15%, más preferiblemente menos del 10%, y más preferiblemente no más del 8%, por ejemplo, entre 2 y 5%. El coeficiente de variación se determina en porcentaje como CV = (100 x desviación estándar)/media.
Debido a su pequeño tamaño y geometría sustancialmente esférica, un gran número de biomoléculas pueden ser inmovilizadas sobre la superficie de estas PM funcionalizadas. La utilización de estas partículas presenta una serie de ventajas, entre las que se pueden destacar: la mejora de la sensibilidad del ensayo, la disminución del posible efecto matriz de la muestra, evitar etapas complejas de pretratamientos, la reducción de los tiempos de reacción y la posibilidad de manipularlas en diferentes plataformas mediante la aplicación de un campo magnético permanente, como por ejemplo en la superficie del electrodo de trabajo o en una placa de microtitulación.
Ligando aspartato carboximetilado
El ligando aspartato carboximetilado se emplea habitualmente en la purificación de proteínas mediante la técnica de cromatografía de afinidad sobre metales inmovilizados (en inglés IMAC), tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente WO-A-98/06739.
El ligando aspartato carboximetilato está unido covalentemente a la partícula polimérica magnética Z a través del brazo de unión R1.
Dicha unión puede efectuarse por medio de diferentes procedimientos. Por ejemplo, puede efectuarse por reacción entre un grupo electrófilo del ligando funcionalizado (por ejemplo, un haloalquileno, o un grupo alquilenocarboxílico) y un grupo nucleófilo de Z (por ejemplo, un grupo amino, aminoalquileno, hidroxi, hidroxialquileno, tiol, o tioalquileno). También puede efectuarse por reacción entre un grupo nucleófilo del ligando funcionalizado (por ejemplo, un grupo aminoalquileno, hidroxialquileno, o tioalquileno) y un grupo electrófilo de Z (por ejemplo, un grupo haloalquileno, o un grupo carboxílico). Preferiblemente la reacción se efectúa entre el ligando modificado con un grupo nucleófilo y un grupo electrófilo de Z, tal como se describe, por ejemplo, en los ejemplos de la solicitud de patente WO-A-2005/089933. Para ello el ligando puede ser funcionalizado introduciendo un grupo nucleófilo, como el grupo amino, para que pueda reaccionar con un grupo electrófilo de la partícula Z, por ejemplo, un grupo metileno que incluye un átomo de halógeno como el bromo. El grupo reactivo de la partícula Z se encuentra preferiblemente en la superficie de la misma y es el resultado de la funcionalización del polímero que constituye dicha partícula tal como se ha expuesto anteriormente.
Preferiblemente el grupo R1, que es el brazo de unión entre el átomo de nitrógeno del ligando aspartato carboximetilado y la superficie de la partícula, consta de una cadena de entre 3 y 20 átomos, más preferiblemente de entre 5 y 20 átomos, y aún más preferiblemente de entre 6 y 20 átomos. El brazo de unión R1 entre el átomo de nitrógeno del ligando aspartato carboximetilado y la partícula Z, se selecciona preferiblemente de entre -alquileno-NH-, -alquileno-CO-NH-, -alquileno-NH-CO-, alquileno-O-, -alquileno-CO-O-, -alquileno-O-CO-, -alquileno-S-, -alquileno-CO-S-, alquileno-S-CO-, -alquileno-NH-alquileno-R2, -alquileno-NH-CO-alquileno-R2, alquileno-CO-NH-alquileno-R2, -alquileno-O-alquileno-R2, -alquileno-O-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-O-alquileno-R2, -alquileno-S-alquileno-R2, -alquileno-S-COalquileno-R2, -alquileno-CO-S-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-, -hidroxialquileno-CO-NH-, -hidroxialquileno-NH-CO-, -hidroxialquileno-O-, -hidroxialquileno-CO-O-, hidroxialquileno-O-CO-, -hidroxialquileno-S-, -hidroxialquileno-CO-S-, -hidroxialquileno-S-CO-, -hidroxialquileno-NH-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-CO-alquileno-R2, hidroxialquileno-CO-NH-alquileno-R2, -hidroxialquileno-O-alquileno-R2, hidroxialquileno-O-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-O-alquileno-R2, hidroxialquileno-S-alquileno-R2, -hidroxialquileno-S-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-S-alquileno-R2, -alquileno-NH-hidroxialquileno-R2, -alquileno-NH-COhidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-NH-hidroxialquileno-R2 , -alquileno-Ohidroxialquileno-R2, -alquileno-O-CO-hidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-Ohidroxialquileno-R2, -alquileno-S-hidroxialquileno-R2, -alquileno-S-CO-hidroxialquileno-R2, y -alquileno-CO-S-hidroxialquileno-R2, en donde R2 es un grupo funcional de enlace y preferiblemente es O, S o NH, y más preferiblemente es NH.
Más preferiblemente R1 se selecciona de entre -alquileno-NH-, alquileno-CO-NH-, -alquileno-NH-CO-, -alquileno-O-, -alquileno-CO-O-, -alquileno-O-CO-, -alquileno-NH-alquileno-R2, -alquileno-NH-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-NHalquileno-R2, -alquileno-O-alquileno-R2, -alquileno-O-CO-alquileno-R2, -alquileno-COO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-, -hidroxialquileno-CO-NH-, -hidroxialquileno-NH-CO-, -hidroxialquileno-O-, -hidroxialquileno-CO-O-, -hidroxialquileno-O-CO-, hidroxialquileno-NH-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-CO-alquileno-R2, hidroxialquileno-CO-NH-alquileno-R2, -hidroxialquileno-O-alquileno-R2, hidroxialquileno-O-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-O-alquileno-R2, -alquileno-NH-hidroxialquileno-R2, -alquileno-NH-CO-hidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-NHhidroxialquileno-R2, -alquileno-O-hidroxialquileno-R2, -alquileno-O-CO-hidroxialquileno-R2, y -alquileno-CO-O-hidroxialquileno-R2. Aún más preferiblemente R1 se selecciona de entre -alquileno-NH-alquileno-R2, -alquileno-NH-CO-alquileno-R2, -alquileno-CONH-alquileno-R2, -alquileno-O-alquileno-R2, -alquileno-O-CO-alquileno-R2, y -alquileno-CO-O-alquileno-R2; todavía más preferiblemente de entre -alquileno-NH-alquileno-R2, y -alquileno-O-alquileno-R2; aún más preferiblemente es -alquileno-NH-alquileno-R2, en donde R2 es un grupo funcional de enlace y preferiblemente es O, S o NH, y más preferiblemente es NH. Aún más preferiblemente R1 es el grupo -(CH2)x-NH-(CH2)y-NH, en donde x e y están comprendidos entre 1 y 6, más preferiblemente entre 3 y 5, en donde el grupo (CH2)x se encuentra unido al átomo de nitrógeno del ligando aspartato carboximetilado, y el grupo NH situado a la derecha es el que se encuentra unido a la partícula polimérica magnética Z.
El metal de transición
El metal de transición M con un número de coordinación 6 se selecciona preferiblemente de entre el grupo formado por Ni, Fe, Ga, Mn, Co, Cu y Zn, más preferiblemente por Ni, Fe, Mn y Co, y más preferiblemente Co. El ion del metal de transición M tiene preferiblemente un estado de oxidación de +2 o +3, más preferiblemente es +2. De forma particularmente preferida el ion del metal de transición es Co+2. En la partícula polimérica magnética de fórmula (II) el metal M está complejado por los tres grupos carboxilato y el grupo amino del ligante aspartato carboximetilado. Para la formación del complejo entre el metal de transición y el ligando aspartato carboximetilado se pueden emplear métodos bien conocidos por el experto en la materia como, por ejemplo, exponiendo una sal del metal al ligando. Por ejemplo, se puede preparar suspendiendo las partículas poliméricas magnéticas que comprenden el ligando en agua y añadiendo a dicha suspensión una solución de una sal del metal correspondiente. Entre otras, pueden emplearse las siguientes sales: CoCl2, CuS04, FeCl3, GaCl2, GaCl3, MnS04, NiCl2, o ZnCl2.
Un complejo magnético particulado particularmente preferido es el descrito en el Ejemplo 4 de la solicitud de patente WO-A-2007/089933. En dicho ejemplo se cargan con cloruro de cobalto (II) unas PM que comprenden el ligando carboximetil aspartato y que se obtienen de acuerdo con el siguiente proceso: se hacen reaccionar partículas magnéticas de estireno funcionalizadas con grupos alilo con un agente de bromación, a continuación se hacen reaccionar dichas partículas bromadas con el N-aminopentil-N-etoxicarboximetilaspartato de dietilo, y finalmente se hidrolizan los grupos éster. Dicha secuencia de reacciones se visualiza en el siguiente esquema:
1) Bromación
PMM (CH2)3 NH
(CH2)5 N
PMM alil
2)
CO2Et
H2N
CO2Et 3) Hidrólisis
Los complejos magnéticos particulados que forman parte del péptido magnético de la invención se pueden preparar empleando procedimientos análogos a los descritos anteriormente, o bien se pueden adquirir comercialmente a través de las compañías Clontech, Invitrogen Dynal, Merck Millipore. Especialmente preferidos son los complejos magnéticos particulados denominados Dynabeads® TALON® que pueden obtenerse comercialmente a través de la compañía Invitrogen Dynal (Oslo, Noruega), y que responden al complejo magnético particulado obtenido en el Ejemplo 4 de la solicitud de patente WO-A-2007/089933.
El péptido magnético se obtiene por inmovilización del péptido de la invención sobre el complejo magnético particulado.
Dicha inmovilización se puede efectuar, por ejemplo, empleando las condiciones descritas por el fabricante para el producto Dynabeads® TALON®, por ejemplo, en el apartado de Manuales y Protocolos de la página web http://lifetechnologies.com/, o en el folleto técnico del mismo. Se trata de un proceso de incubación del péptido con dicho complejo magnético particulado en el seno de un tampón de inmovilización formado por fosfato de sodio 0,05 M, pH 8, NaCl 0,3 M, y 0,01 % de Tween® 20 (monolaurato de sorbitán con 20 moles de óxido de etileno) durante un período de tiempo de unos 10 minutos a una temperatura de 25º C.
La eficiencia de la inmovilización para obtener el péptido magnético de la invención es prácticamente cuantitativa.
En una realización particularmente preferida el péptido magnético de la invención comprende el péptido definido por la secuencia SEQ_ID_NO: 39, Z son partículas magnéticas de poliestireno, R1 es el grupo -(CH2)5-NH-(CH2)3-NH, y M es Co2+, en donde el grupo (CH2)5 se encuentra unido al átomo de nitrógeno del ligando aspartato carboximetilado, y el grupo NH situado a la derecha es el que se encuentra unido a la partícula polimérica magnética Z.
Inmunosensor
Forma parte de la invención un inmunosensor que comprende el péptido magnético de la invención y un transductor que tiene acoplado o integrado un imán.
En general, un inmunosensor consta de un elemento de reconocimiento biológico (antígeno o anticuerpo) y un transductor (electroquímico: potenciométrico, amperométrico o conductimétrico; óptico; piezoeléctico; termométrico; magnético; micromecánico). Algunos de ellos se encuentran definidos como directos, en los cuales se detecta un cambio físico durante la formación del complejo y otros como indirectos, en los cuales la señal es generada por un marcador (generalmente es enzimático).
En el marco de la invención el transductor preferiblemente es electroquímico u óptico. En una realización preferida el método se lleva a cabo mediante el empleo de un inmunosensor que comprende un transductor electroquímico al que se le ha incluido un imán.
En este caso concreto, las medidas electroquímicas, basadas en tres tipos de señales analíticas (potencial, corriente y carga), se realizan en una celda electroquímica constituida por dos o más electrodos y asociados electrónicamente para controlar y medir el potencial y la corriente. En el caso de una celda compuesta de dos electrodos inmersos en una solución, al aplicar un potencial externo entre dichos electrodos, se producirá la circulación de una corriente eléctrica derivada de los procesos electroquímicos que ocurren en la interfase electrodo-solución. El origen de esta corriente puede ser la transferencia de carga debida a reacciones químicas (procesos faradaicos) o a la reorganización de la carga en la interfase (procesos no faradaicos).
Método de detección
El método de detección de la enfermedad celíaca consiste en lo que se denomina un inmunoensayo que, en el marco de la presente invención, incluye conjuntos de técnicas inmunoquímicas analíticas de laboratorio que tienen en común la utilización de complejos inmunes, es decir el resultado de hacer interaccionar anticuerpos con antígenos, con la finalidad de detectar y/o cuantificar analitos en muestras. La selectividad de los anticuerpos para unirse a sus ligandos permite a estas biomoléculas ser empleadas en métodos analíticos altamente específicos cuando se trata de matrices complejas como sangre, plasma u orina. Combinando la selectividad de las interacciones anticuerpo-antígeno con una gran diversidad de anticuerpos preformados en los procesos de inmunización de animales huéspedes y la disponibilidad de numerosos marcadores fácilmente detectables (radioisótopos, absorbancia, fluorescencia o quimio-luminiscencia inducida enzimática o electroquímicamente) los inmunoensayos pueden ser diseñados para una amplia variedad de analitos con límites de detección extraordinariamente bajos. Ejemplos de estos límites son niveles de concentración de hormonas, enzimas, virus, antígenos tumorales y bacteriales cercanos a 10-12 -10-9 mol/L.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores incluyen elementos radiactivos (por ejemplo, azufre, iodo, etc.); enzimas (por ejemplo, peroxidasa, glicosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa HRP, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, βgalactosidasa, β-glucosidasa, β-glucuronidasa, etc.); compuestos o colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rhodamina, etc.), fosforescentes o quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio, luminol, etc.). La selección de un marcador particular no es crítica, siempre y cuando sea capaz de producir una señal por sí mismo o conjuntamente con una o más sustancias adicionales. Así, el complejo formado puede ser detectado o visualizado por cualquier técnica apropiada, dependiendo del marcador elegido, bien conocida por los técnicos en la materia, utilizando los dispositivos apropiados, por ejemplo, mediante técnicas basadas en métodos radiactivos, electroquímicos, colorimétricos, fluorimétricos, (quimio)luminiscentes, etc., todas ellas conocidas por los técnicos en la materia.
A modo de ejemplo, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo (antígeno-anticuerpo)/marcador puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato apropiado y, opcionalmente, con los activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. Ejemplos ilustrativos de dichos sustratos incluyen para:
la fosfatasa alcalina: sustratos basados en p-nitrofenil fosfato (p-NPP) o 2-(5
cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)quinazolinona (CPPCQ);
peroxidasas: sustratos basados en ácido 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6
sulfónico) (ABTS), ofenilendiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB),
o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB) y
3-metil-2-benzotiazolinhidrazone (MBTH), 3-amino-9etilcarbazol (AEC) y
tetracloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB), ácido 4-hidroxi-3
metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiazinas reducidas.
glicosidasas: sustratos basados en o-nitrofenil-β-D-galactósido (o-NPG), p
nitrofenil-β-D-galactósido y 4-metilumbelifenil-β-D-galactósido (MUG) para β
D-galactosidasa
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de formatos de inmunoensayos adecuados para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención incluyen ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), DAS-ELISA ("Double Antibody Sandwich-ELISA"), DELFIA (fluoroinmunoensayo de disociación aumentada por lantánidos), FPIA (inmunoensayo por polarización de fluorescencia), CMIA (inmunoensayo magnético quimioluminiscente), IRMA (radioinmunoensayo heterogéneo y no competitivo), MEIA (inmunoensayo por micropartícula), luminoinmunoensayos, técnicas inmunocitoquímicas e inmuno-histoquímicas, ensayos basados en la precipitación coloidal (dipsticks). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de plataformas para la realización de estos inmunoensayos incluyen placas de microtitulación, biochips, biosensores (por ejemplo, inmunosensores) o microarrays, lab-on-a-chip, dipsticks, inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral basado en el empleo de tiras inmunocromatográficas, y, en todos los casos, a los que se les ha acoplado o integrado un imán.
Así pues, también forma parte del objeto de la invención un método para detectar la enfermedad celíaca, que comprende las siguientes etapas: 1) incubar una suspensión del péptido magnético de la invención con una muestra de suero o sangre de un individuo,
2) añadir anti-suero humana-HRP, seleccionado de entre anti-IgA humana-HRP y
anti-IgG humana-HRP, a la suspensión incubada en el punto 1) e incubar la
suspensión obtenida, y
3) medir la señal electroquímica u óptica obtenida a partir de la suspensión
obtenida en el punto 2).
En la etapa 2) se emplean anticuerpos anti-suero humana-HRP, que preferiblemente son anti-IgA humana-HRP, donde HRP corresponde a la enzima peroxidasa del rábano, porque presentan ventajas con respecto a otros anticuerpos. La peroxidasa HRP es una proteína de 40 kDa que cataliza la oxidación de sustratos por medio del peróxido de hidrógeno, resultando un producto coloreado o fluorescente
o la emisión de luz como producto secundario. Dicha enzima funciona óptimamente a un pH aproximadamente neutro, y puede ser inhibido por cianuros, sulfuros y azidas. Los conjugados anticuerpos-HRP son superiores a los conjugados anticuerposfosfatasa alcalina con respecto a las actividades específicas de la enzima y del anticuerpo. Además, dicha peroxidasa presenta una elevada velocidad enzimática, buena estabilidad, bajo coste y amplia disponibilidad, por lo que es una de las enzimas a escoger para la mayoría de aplicaciones.
El método de la invención se trata de un immunoensayo en el que el antígeno inmovilizado en la partícula magnética (péptido magnético de la invención) capta al anticuerpo a investigar (presente en el suero o sangre de un individuo) y el immunocomplejo así formado luego se une a un anticuerpo marcado con la enzima (anti-IgA humana-HRP) que genera una señal electroquímica u óptica directamente proporcional a la concentración de anticuerpo en la muestra, una vez que todo el immunocomplejo se capta en una plataforma para su detección a partir de la aplicación de campo magnético permanente. La incubación se puede llevar a cabo en tubos Eppendorff empleando entre 50 y 100 µL, preferiblemente entre 60 y 80 µL de una solución de péptido magnético de la invención a una concentración de 0,2 mg/mL. La incubación de la suspensión del péptido magnético con una muestra de suero o sangre de un individuo que puede padecer la EC se lleva a cabo habitualmente a una temperatura comprendida entre 20º C y 27º C, preferiblemente alrededor de 25º C, durante un período de tiempo comprendido entre 20 y 45 minutos, preferiblemente entre 25 y 35 minutos, y aún más preferiblemente alrededor de 30 minutos.
La incubación de la suspensión obtenida después de añadir anti-IgA humana-HRP se lleva a cabo habitualmente a una temperatura comprendida entre 20º C y 27º C, preferiblemente alrededor de 25º C, durante un período de tiempo comprendido entre 20 y 45 minutos, preferiblemente entre 25 y 35 minutos, y aún más preferiblemente alrededor de 30 minutos.
Después de cada etapa se aplica un campo magnético permanente para capturar las partículas magnéticas y proceder a lavados con tampón PBS, siguiendo procedimientos bien conocidos por el experto en la materia.
La medida de la señal electroquímica u óptica se puede realizar mediante la medición de una señal generada por la enzima HRP por reacción con peróxido de hidrógeno como sustrato y un mediador seleccionado de un grupo formado por fenol, o-fenilendiamina (OPD), 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB), hidroquinona, -clorofenol, pirocatecol y p-aminofenol. Preferiblemente se emplea hidroquinona como mediador para la detección electroquímica y TMB para la óptica.
Forma parte del objeto de la invención el uso del péptido de la invención para detectar la enfermedad celíaca.
También forma parte del objeto de la invención el uso del péptido magnético de la invención para detectar la enfermedad celíaca.
También forma parte del objeto de la invención el uso del inmunosensor para detectar la enfermedad celíaca.
Forma parte también de la invención un kit para detectar la enfermedad celíaca que comprende el péptido magnético de la invención.
El kit de la invención incluye, además del péptido magnético, un inmunoensayo adecuado o plataforma para la puesta en práctica del método para detectar la enfermedad celíaca. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de formatos de inmunoensayos adecuados para la puesta en práctica de los métodos de la presente invención incluyen ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), DAS-ELISA ("Double Antibody Sandwich-ELISA"), DELFIA (fluoroinmunoensayo de disociación aumentada por lantánidos), FPIA (inmunoensayo por polarización de fluorescencia), CMIA (inmunoensayo magnético quimioluminiscente), IRMA (radioinmunoensayo heterogéneo y no competitivo), MEIA (inmunoensayo por micropartícula), luminoinmunoensayos, técnicas inmunocitoquímicas e inmuno-histoquímicas, ensayos basados en la precipitación coloidal (dipsticks). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de plataformas para la realización de estos inmunoensayos incluyen placas de microtitulación, biochips, biosensores (por ejemplo, inmunosensores) o microarrays, lab-on-a-chip, dipsticks, inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral basado en el empleo de tiras inmunocromatográficas, y, en todos los casos, a los que se les ha acoplado o integrado un imán.
Ensayos de detección
Se evaluaron sueros de pacientes clínicamente clasificados como celíacos y no-celíacos, en ambos casos confirmados por biopsia, mediante el inmunosensor electroquímico de la invención destinado a la detección individual de los anticuerpos anti-APDG-IgA. Además, estos sueros también fueron analizados con un ELISA óptico. Además se ensayó un inmunosensor electroquímico obtenido en el Ejemplo de referencia 1, en el que el péptido de la invención se unió de forma covalente a partículas poliméricas magnéticas funcionalizadas con grupos tosilo.
Los resultados de cada inmunosensor fueron analizados a partir de los datos de sensibilidad y de especificidad.
La sensibilidad corresponde a la probabilidad de obtener un resultado positivo cuando el individuo tiene la enfermedad, y viene definida por la siguiente ecuación:
enfermos positivos vp
SE
total enfermos vp fn
en donde vp corresponde a una muestra verdaderamente positiva y fn corresponde a una muestra falsa negativa.
Por su parte, la especificidad se calcula como la probabilidad de obtener un resultado negativo cuando el individuo no tiene la enfermedad y viene definida por la siguiente ecuación:
sanos negativos vn
ES
total sanos vn fp
en donde vn corresponde a una muestra verdaderamente negativa, y fp corresponde a una muestra falsa positiva.
Una prueba diagnóstica ideal debería tener una SE y una ES tan próximas al 100% como fuera posible. En la práctica se debe dudar de pruebas cuyas SE y ES sean inferiores al 80%.
Se ha observado que el inmunosensor con el péptido magnético de la invención presenta para las diversas muestras ensayadas las mayores señales electroquímicas y permitió una mejor diferenciación entre muestras positivas y negativas con respecto al inmunosensor obtenido en el Ejemplo de referencia 1, en el que el péptido de la invención se unió de forma covalente a partículas poliméricas magnéticas funcionalizadas con grupos tosilo. En un ensayo con 11 muestras, 7 positivas y 4 negativas, el inmunosensor con el péptido magnético de la invención presentó una sensibilidad del 100%, una especificidad del 100%, y una eficiencia del 100%, mientras que el inmunosensor con el péptido unido covalentemente presentó una sensibilidad del 86%, una especificidad del 75%, y una eficiencia del 82%, en donde este último parámetro es calculado como porcentaje de los resultados correctamente positivos y correctamente negativos con respecto al valor de referencia esperado.
También se ha observado que con el péptido magnético de la invención se han podido discriminar el 100% de los 23 pacientes que tenían la EC confirmada por biopsia. Se puede observar también que, sorprendentemente, el péptido magnético de la invención, que comprende el péptido de la invención y un complejo magnético particulado, permite proporcionar un método de detección de la EC con una selectividad y especificidad significativamente superiores a las de los otros métodos de detección descritos en el estado de la técnica. En comparación con el método descrito en Ankelo et al., ya citado, en el que se emplea el péptido definido por la secuencia SEQ_ID_NO: 40 modificado con biotina en un ensayo inmunofluorométrico en fase sólida lantánido, presenta una sensibilidad y una especificidad superiores, 100% vs 92%, y 100% vs 96%, respectivamente. En comparación con el método descrito en Schwertz et al., en el que se emplean octadecapéptidos deaminados definidos por las SEQ_ID_NO: 40 a 51, el péptido de la invención presenta una sensibilidad y especificidad superiores, 100% vs 85% y 100% vs 95%, respectivamente.
Dicho método constituye un ensayo de detección rápido, económico, mínima manipulación, y puede ser empleado para análisis ambulatorios, por lo que el objeto de la invención representa un desarrollo significativo para la detección de la enfermedad celíaca. Además, cabe destacar que las metodologías electroquímicas presentan la potencialidad, frente a los ensayos ELISA ópticos, de poder desarrollar dispositivos de pequeñas dimensiones que permiten disminuir el volumen de muestra y reactivos y ser acoplados a instrumentación portátil fácilmente transportable a los diferentes centros de salud alejados de las grandes urbanizaciones.
El experto en la materia no tiene dificultad en aplicar el péptido magnético de la invención a otras plataformas con sistemas de detección distintos al inmunosensor electroquímico o al inmunoensayo ELISA óptico que se han descrito, tales como ensayos de flujo lateral o sistemas de microfluídica.
A continuación se incluyen algunos ejemplos para ilustrar la presente invención, si bien no deben ser considerados como limitantes de la misma.
Ejemplos
La inmovilización de los péptidos sobre las partículas magnéticas se llevó a cabo usando un Termomixer Eppendorf. Se utilizaron placas ELISA de poliestireno marca Nunc (Roskilde, Dinamarca). La separación magnética de las partículas se realizó mediante un separador magnético Dynal MPC-S (Dynal, Noruega). En las etapas de incubaciones y lavados se utilizaron un Miniagitador MS1 (IKA, R.F.A.) y un Termomixer Eppendorf. Las medidas ópticas y electroquímicas se realizaron con un lector de placas TECAN Sunrise y con un controlador amperométrico LC-4C (BAS Bioanalytical System Inc., E.E.U.U.).
Se utilizó una celda electroquímica que consistió en un sistema de tres electrodos independientes: un electrodo m-GEC (composite grafito–epoxi con conector magnético, por sus siglas en inglés) como trabajo; un electrodo de platino como auxiliar y un electrodo de Ag/AgCl en solución 3 mol L-1 de NaCl como referencia (Orion 92-02-00). Los electrodos m-GEC se encuentran descritos en Zacco et al., Electrochemical Magnetoimmunosensing Strategy for the Detection of Pesticides Residues, Anal. Chem., 2006, 78, 1780-1788. Se prepararon diez electrodos m-GEC con sus conectores magnéticos y el CV% obtenido del promedio de las inducciones magnéticas medidas en el centro de la superficie del electrodo fue 6,4%.
Ejemplo comparativo: Inmovilización del péptido en partículas magnéticas
modificadas con el grupo tosilo
El péptido deaminado de gliadina (PDG) de secuencia HHHHHHLPFPEQPEQPFPQPEQPQ (99,2% pureza) (GenScript, Cat. nº 246440) se inmovilizó sobre las partículas magnéticas (PM) de 1 µm de diámetro modificadas con grupos tosilo Dynabeads MyOneTM Tosylactivated (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Para ello, 10 mg de PM, equivalente a un volumen de 100 μL (100 mg mL-1) se lavaron dos veces con 200 L de solución tampón de inmovilización (fosfato de sodio 0,05 M, pH 8). Posteriormente, las PM se resuspendieron en 83 μL de sulfato de amonio 3 mol L-1, 50 μL de la solución concentrada de PDG (4,3 mg mL-1), y se añadió solución tampón de inmovilización hasta llegar a un volumen final de 250 μL. Las PM se incubaron durante 24 horas a 37º C y 800 rpm. Se eliminó el sobrenadante con la ayuda de un imán y las PM modificadas se resuspendieron en 250 μL de solución tampón bloqueante (QUÉ ES?) y se incubaron durante toda la noche, en las mismas condiciones que la inmovilización. Las PM se sometieron a tres etapas de lavado con el solución tampón de lavado y finalmente se resuspendieron en el solución tampón de conservación para
mL-1
lograr las soluciones concentradas de 4 mg de PM-PDG las cuales se conservaron a 4ºC.
- Ejemplo 1:
- Inmovilización del péptido en partículas magnéticas Dynabeads®
- TALON®
- El péptido
- deaminado de gliadina (PDG) de secuencia
HHHHHHLPFPEQPEQPFPQPEQPQ (99,2% pureza) (GenScript, Cat. nº 246440) se inmovilizó sobre las partículas magnéticas (PM) de 1 µm de diámetro Dynabeads®
TALON® (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Noruega) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Es decir, en un tubo Eppendorf se lavaron 50 μL o 2 mg de PM (40 mg mL1) con 650 μL de solución tampón de inmovilización/lavado (fosfato de sodio 0,05 M, pH 8, NaCl 0,3 M, y 0,01 % de Tween® 20, monolaurato de sorbitán con 20 moles de óxido de etileno). Luego se descartó el sobrenadante mediante la aplicación de un campo magnético y las PM se incubaron con 10 μL, equivalentes a 4,3 μg de PDG (a partir de la solución concentrada en agua desionizada de 4,3 mg mL-1) en un volumen final de 700 μL con solución tampón de inmovilización/lavado, durante 10 minutos a 750 rpm y 25º C. Después de la incubación, el líquido sobrenadante de cada tubo se separó con la ayuda de un magneto y las PM modificadas se lavaron cuatro veces con 700 μL del solución tampón de inmovilización/lavado y finalmente se resuspendieron en tampón PBS para lograr una solución de trabajo de 4 mg/mL, a partir de la cual se preparó una solución diluida con una concentración de 0,2 mg/mL.
Ejemplo 2: Ensayos de detección de la enfermedad celíaca Se efectuaron ensayos de detección empleando una celda electroquímica y también empleando el inmunoensayo óptico ELISA. En el primer caso, el ensayo de detección comprendió las siguientes etapas:
1) Primer etapa de incubación: 70 µL de la solución de 0,2 mg/mL de péptido magnético obtenido en el Ejemplo 1, se incubaron con 70 µL de los controles positivo y negativo, y de suero problema en sendos tubos Eppendorff de 2 mL a 800 rpm y 25º C durante 30 minutos. Luego, se descartó el sobrenadante con la ayuda de un separador magnético y se realizaron tres etapas de lavado con 100 µL de solución tampón PBS a 800 rpm y 25º C durante 3 minutos, aplicando el separador magnético después de cada etapa.
2) Segunda etapa de incubación: se adicionaron 140 µL de anti-IgA humana-HRP diluido 1:20000 y se incubaron a 800 rpm y 25º C durante 30 minutos. Posteriormente, se aplicaron las etapas de lavado de igual manera que en el paso (i).
3) Medida electroquímica: en la última etapa de lavado se capturaron las partículas magnéticas modificadas mediante los electrodos m-GEC y este electrodo de trabajo junto con los electrodos de referencia y auxiliar se sumergieron en 20 mL de solución tampón PBS contenido en una celda electroquímica. La medida electroquímica se determinó por polarización del electrodo de trabajo a E = − 0,050 V (contra Ag/AgCl en solución 3 mol/L de NaCl como electrodo de referencia). La señal amperométrica se basó en la actividad enzimática de HRP después de la adición de hidroquinona (2,0 × 10−3 mol/L) como mediador y H O2 (2,0 × 10−3 mol/L) como sustrato.
Los anticuerpos anti-IgA humana-HRP se obtuvieron de Sigma-Aldrich. En el segundo caso, se realizó un ensayo ELISA con detección óptica en una placa de 96 pocillos, que comprendió las siguientes etapas:
1) Primera etapa de incubación: 70 µL de la solución de 0,2 mg/mL de péptido magnético obtenido en el Ejemplo 1, se incubaron con 70 µL de los controles positivo y negativo, y de suero problema en placas de microtitulación, en condiciones de agitación durante 30 min a temperatura ambiente, y luego se realizaron tres lavados con 100 L de PBST, aplicando un campo magnético entre los lavados con la finalidad de separar las PM modificadas del sobrenadante.
2) Segunda etapa de incubación: se adicionaron 100 l de anti-IgA humana-HRP diluido 1:20000 y el inmunocomplejo resultante se incubó durante 30 min a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación. Posteriormente, se aplicó nuevamente la etapa de lavado explicada en (1).
3) Se adicionaron a cada pocillo 100 µL de solución TMB:H2O2 (1:1) y la placa se incubó durante 30 minutos en oscuridad, luego se agregaron 100 µL de solución de parada (H2SO4 2 M);
4) Finalmente se realizó la lectura de absorbancia de cada pocillo con un lector de placa a λ= 450 nm.
Con ambos métodos se analizaron 23 sueros, que habían sido confirmados histológicamente con biopsia duodenal, de los cuáles, a su vez, 13 y 10 sueros fueron clasificados como celíacos y no celíacos, respectivamente.
En la tabla I se muestran los resultados obtenidos (sensibilidad, SE, y especificidad, ES) con el péptido magnético de la invención tanto con el inmunosensor electroquímico, como con el inmunoensayo óptico ELISA y los resultados obtenidos en los hospitales de origen para las mismas muestras (23) mediante el empleo de métodos comerciales:
TABLA I
- Método
- Anticuerpo SE (%) ES (%)
- Electrodo m-GEC Inmunosensor electroquímico (Invención)
- APDG-IgA 100 100
- Microplaca ELISA Inmunoensayo óptico (Invención)
- APDG-IgA 100 100
- Método comercial 1
- AGA-IgA 96,3 50,0
- Método comercial 2
- AGA-IgA 96,2 91,7
- Método comercial 3
- ATG2-IgA 95,0 99,4
- Método comercial 4
- ATG2-IgA 93,6 94,3
En la tabla II se muestran los resultados obtenidos resultados obtenidos (sensibilidad, SE, y especificidad, ES) con el péptido magnético de la invención tanto con el inmunosensor electroquímico, como con el inmunoensayo óptico ELISA y resultados descritos en el estado de la técnica para la detección de anticuerpos anti-PDG como diagnóstico de la enfermedad celíaca:
TABLA II
- Soporte
- Técnica analítica Isotipo SE (%) ES (%) Nº de muestras* Ref.
- Electrodo m-GEC
- Inmunosensor electroquímico IgA 100 100 23 Invención
- Microplaca ELISA
- Inmunoensayo óptico IgA 100 100 23 Invención
- Fase sólida lantánido
- Ensayo inmunofluorométrico IgA 92 90 168 1
- Microplaca ELISA
- Inmunoensayo óptico IgA 97 92 139 2
- Microplaca ELISA
- Inmunoensayo óptico IgA 85 96 128 3
* Muestras positivas comprobadas por biopsia duodenal 1 Ankelo et al., 2007 2 Sakly et al., 2012 3 Schwertz et al., 2004 Se puede observar que el método de la invención presenta una
sensibilidad y especificidad superiores a otros métodos descritos en el estado de la técnica basados en la detección de anticuerpos frente a péptidos deaminados de gliadina.
Ejemplo 3: Ensayo de detección de la enfermedad celíaca con dos tipos de
péptidos magnéticos
Se ensayaron los péptidos magnéticos obtenidos en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo comparativo de acuerdo con un procedimiento sustancialmente análogo al del Ejemplo 2. Se ensayaron once muestras: siete sueros positivos y cuatro sueros negativos.
Los resultados obtenidos permitieron concluir que el inmunosensor con el péptido magnético de la invención presentó para las diversas muestras las mayores señales electroquímicas y permitió una mejor diferenciación entre muestras positivas y negativas con respecto al inmunosensor preparado a partir del péptido obtenido en el Ejemplo comparativo, en el que el péptido estaba unido covalentemente con las partículas magnéticas modificadas con el grupo tosilo.
En la Tabla III se presentan los resultados obtenidos:
TABLA III
- Parámetro
- Ejemplo 1 Ejemplo comparativo
- Sensibilidad (%)
- 100 86
- Especificidad (%)
- 100 75
- Eficiencia (%)
- 100 82
Claims (22)
-
imagen1 imagen2 REIVINDICACIONES1.-Péptido caracterizado porque responde a la fórmula general (I):H2N-(H)n-LPFPXXPXXPFPXPXXPX-(H)m-COOH (I)en donde:X es Q o E indistintamente, y al menos un X es E, yen donde:n está comprendido entre 2 y 20, y m es 0, om está comprendido entre 2 y 20, y n es 0. - 2.-Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque m es 0 y n está comprendida entre 4 y 15.
- 3.-Péptido según la reivindicación 2, caracterizado porque m es 0 y n está comprendida entre 6 y 8.
- 4.-Péptido según la reivindicación 3, caracterizado porque responde a la estructura H2N-(H)6-LPFPEQPEQPFPQPEQPQ-COOH (SEQ_ID_NO: 39).
- 5.-Péptido magnético, caracterizado porque comprende:a) el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, yb) un complejo magnético particulado de fórmula general (II):O
imagen3 (II)OOen donde: Z es una partícula polimérica magnética unida covalentemente al ligando aspartato carboximetilado a través de R1, R1 es un brazo de unión que conecta el átomo de nitrógeno del ligando aspartato carboximetilado con la partícula polimérica magnética Z, y M es un ion de un metal de transición con un número de coordinación 6.imagen4 imagen5 - 6.-Péptido magnético según la reivindicación 5, caracterizado porque la partícula polimérica magnética está constituida por un polímero estirénico reticulado.
- 7.-Péptido magnético según las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque el brazo de unión R1 consta de una cadena de entre 3 y 20 átomos y se selecciona de entre alquileno-NH-, -alquileno-CO-NH-, -alquileno-NH-CO-, -alquileno-O-, -alquileno-CO-O-, -alquileno-O-CO-, -alquileno-S-, -alquileno-CO-S-, -alquileno-S-CO-, -alquileno-NHalquileno-R2, -alquileno-NH-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-NH-alquileno-R2, alquileno-O-alquileno-R2, -alquileno-O-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-O-alquileno-R2, -alquileno-S-alquileno-R2, -alquileno-S-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-S-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-, -hidroxialquileno-CO-NH-, -hidroxialquileno-NH-CO-, hidroxialquileno-O-, -hidroxialquileno-CO-O-, -hidroxialquileno-O-CO-, hidroxialquileno-S-, -hidroxialquileno-CO-S-, -hidroxialquileno-S-CO-, -hidroxialquileno-NH-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-NHalquileno-R2, -hidroxialquileno-O-alquileno-R2, -hidroxialquileno-O-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-O-alquileno-R2, -hidroxialquileno-S-alquileno-R2, -hidroxialquilenoS-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-S-alquileno-R2, -alquileno-NHhidroxialquileno-R2, -alquileno-NH-CO-hidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-NHhidroxialquileno-R2 , -alquileno-O-hidroxialquileno-R2, -alquileno-O-COhidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-O-hidroxialquileno-R2, -alquileno-S-hidroxialquileno-R2, -alquileno-S-CO-hidroxialquileno-R2, y -alquileno-CO-S-hidroxialquileno-R2, en donde R2 es O, S o NH, y preferiblemente es NH.
- 8.-Péptido magnético la reivindicación 7, caracterizado porque el brazo de unión R1 se selecciona de entre -alquileno-NH-, -alquileno-CO-NH-, -alquileno-NH-CO-, -alquileno-O-, -alquileno-CO-O-, -alquileno-O-CO-, -alquileno-NH-alquileno-R2, -alquileno-NH-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-NH-alquileno-R2, -alquileno-O-alquileno-R2, -alquilenoO-CO-alquileno-R2, -alquileno-CO-O-alquileno-R2, -hidroxialquileno-NH-, hidroxialquileno-CO-NH-, -hidroxialquileno-NH-CO-, -hidroxialquileno-O-, hidroxialquileno-CO-O-, -hidroxialquileno-O-CO-, -hidroxialquileno-NH-alquileno-R2, hidroxialquileno-NH-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-NH-alquileno-R2, hidroxialquileno-O-alquileno-R2, -hidroxialquileno-O-CO-alquileno-R2, -hidroxialquileno-CO-O-alquileno-R2, -alquileno-NH-hidroxialquileno-R2, -alquileno-NH-COhidroxialquileno-R2, -alquileno-CO-NH-hidroxialquileno-R2, -alquileno-Ohidroxialquileno-R2, -alquileno-O-CO-hidroxialquileno-R2, y -alquileno-CO-Ohidroxialquileno-R2, en donde R2 es O, S o NH, y preferiblemente es NH.
imagen6 imagen7 - 9.-Péptido magnético según la reivindicación 8, caracterizado porque el brazo de unión R1 se selecciona de entre -alquileno-NH-alquileno-R2, -alquileno-NH-COalquileno-R2, -alquileno-CO-NH-alquileno-R2, -alquileno-O-alquileno-R2, -alquileno-O-CO-alquileno-R2, y -alquileno-CO-O-alquileno-R2 en donde R2 es O, S o NH, y preferiblemente es NH.
- 10.-Péptido magnético según la reivindicación 9, caracterizado porque el brazo de unión R1 es -alquileno-NH-alquileno-R2 en donde R2 es O, S o NH, y preferiblemente es NH.
- 11.-Péptido magnético según la reivindicación 10, caracterizado porque el brazo de unión R1 es -(CH2)x-NH-(CH2)y-NH, en donde x e y están comprendidos entre 1 y 6, y preferiblemente entre 3 y 5.
- 12.-Péptido magnético según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, caracterizado porque el metal de transición M se selecciona de entre el grupo formado por Ni, Fe, Ga, Mn, Co, Cu y Zn.
- 13.-Péptido magnético según la reivindicación 12, caracterizado porque el metal de transición M se selecciona de entre el grupo formado por Ni, Fe, Mn y Co.
- 14.-Péptido magnético según la reivindicación 13, caracterizado porque el metal de transición M es Co.
- 15.-Péptido magnético según la reivindicación 14, caracterizado porque el metal de transición tiene un estado de oxidación de +2.
- 16.-Péptido magnético según la reivindicación 5, caracterizado porque el complejo magnético particulado es Dynabeads®TALON®.
imagen8 imagen9 imagen10 imagen11 imagen12 imagen13 - 17.-Inmunosensor caracterizado porque comprende el péptido magnético de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16 y un transductor que tiene acoplado o integrado un imán.
- 18.-Método para detectar la enfermedad celíaca, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: 1) incubar una suspensión del péptido magnético de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15 con una muestra de suero o sangre de un individuo,2) añadir anti-suero humana-HRP, seleccionado de entre anti-IgA humana-HRP y anti-IgG humana-HRP, a la suspensión incubada en el punto 1) e incubar la suspensión obtenida, y3) medir la señal electroquímica u óptica obtenida a partir de la suspensión obtenida en el punto 2).
- 19.-Kit para detectar la enfermedad celíaca, caracterizado porque comprende el péptido magnético de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16.
- 20.-Uso del péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para detectar la enfermedad celíaca.
- 21.-Uso del péptido magnético de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16 para detectar la enfermedad celíaca.
- 22.-Uso del inmunosensor de la reivindicación 17 para detectar la enfermedad celíaca.
imagen14
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