JP3727739B2 - 糞便中の血液成分の検出方法及びこれに用いる検出キット - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糞便中の血液成分の検出方法及びこれに用いる検出キットに関し、特にアルファ１−アシドグリコプロテインを測定することにより糞便中の血液成分を検出する方法及びこれに用いる検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸癌や潰瘍性大腸炎などの出血性消化管疾患や、クローン病などの血液蛋白漏出性消化管疾患においては、糞便中の血液成分の検出は診断および病状の把握のために不可欠である。
血液成分の検出は、従来、出血性消化管疾患においてはヘモグロビンを検出する方法が、血液蛋白漏出性消化管疾患においてはアルファ１−アンチトリプシンを検出する方法が主に行われてきている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヘモグロビンは、消化管中で不安定であるという欠点があり、排便までの時間の短い大腸の疾患以外では正確に血液を検出することが困難である。また、アルファ１−アンチトリプシンは、糞便中で安定であるが腸の細胞が産生するという理由で正確に血液を検出することが困難である。
この発明は、これらの問題点に着目してなされたものであって、上記の従来の方法にかわる糞便中の血液成分を検出する方法及びこれに用いる検出キットを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、この発明では、糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定対象としている。なお糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定するには、酵素免疫法やラテックス凝集反応、免疫比濁法など日常、多用されている免疫学的測定法を用いることができる。
アルファ１−アシドグリコプロテイン（略称α１−ＡＧ）はオロソムコイドとも呼ばれる血液中の蛋白である。
今回、本発明者らは、残存消化酵素および細菌による蛋白分解能を保有する点で消化管中状態に類似する糞便中においてアルファ１−アシドグリコプロテインが安定であることを発見した（図１）。
さらに、アルファ１−アンチトリプシンと比較して腸の細胞での産生が非常に少ないことを確認できた（図２）。なお、図２のデータは、Ｃａｃｏ−２細胞培養上清中の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定して得たものである。
また、出血性消化管疾患である潰瘍性大腸炎や血液蛋白漏出性消化管疾患であるクローン病の患者において糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインが健常者よりも高値を示し、病状の悪化で増加することを発見した（図３）。
以上のごとく、糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定することにより、正確な糞便中の血液成分の検出ができる。
【０００５】
【実施例】
酵素免疫法によるアルファ１−アシドグリコプロテインの測定
〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕
マイクロプレートの各ウェルに抗アルファ１−アシドグリコプロテイン抗体５μg/mlを含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH8.4) を 100μl ずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を物理吸着の原理でウェルに固相化する。
〔酵素標識抗体の調製〕
別途、過ヨーソ酸法により、アルカリホスファターゼを抗アルファ１−アシドグリコプロテイン抗体に標識して調製する。
〔糞便中アルファ１−アシドグリコプロテイン測定〕
各ウェルに 0.1％の牛血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で 100倍に希釈した糞便希釈サンプルを 100μl 分注し、混和した後、37℃で１時間反応させる。
次にマイクロプレートをTween 20を0.05％含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄する。その後、酵素標識抗アルファ１−アシドグリコプロテイン抗体 2.5μg/mlおよび１％の牛血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水(0.1M pH8.0)を 100μl ずつ分注し、混和した後、37℃で１時間反応させる。
次にマイクロプレートをTween 20を0.05％含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄する。その後、Kind-king 法の基質緩衝液 100μl を各ウェルに加え、37℃で30分間反応させる。ここで基質緩衝液は、Disodium Phenylphosphate 0.215g と4-aminoantipyrine 0.09g を炭酸緩衝液(0.05M pH10.15) 100ml に溶解したものである。
次いで、 100μl の呈色液を各ウェルに加えて、呈色させる。ここで呈色液は、200ml の脱イオン水に2.6gのホウ酸を溶解させた後、0.38g のPotassium Ferricyanideを溶解させたものである。
最後に、各ウェルの呈色をマイクロプレート用比色計を用いて510/630nm の波長で比色し検量線から糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテイン濃度を算出する。
【０００６】
【発明の効果】
以上説明したように、糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定すれば、大腸癌や潰瘍性大腸炎、クローン病などの消化管疾患の診断および病状の把握ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】糞便中での血液淡白の保存性を比較した図面である。
【図２】培養腸上皮細胞のα１−ＡＧおよびα１−ＡＴ産生量の比較を示す図面である。
【図３】疾病別の糞便中α１−ＡＧ濃度を示す図面である。

Claims (3)

1. 糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定することを特徴とする糞便中の血液成分の検出方法。
2. 酵素免疫法やラテックス凝集反応、免疫比濁法などの免疫学的測定法を用いることを特徴とする請求項１に記載の糞便中の血液成分の検出方法。
3. 少なくとも、抗アルファ１−アシドグリコプロテイン抗体と酵素標識抗アルファ１−アシドグリコプロテイン抗体と酵素測定用の試薬とを備え、免疫学的方法によって糞便中のアルファ１−アシドグリコプロテインを測定する糞便中の血液成分検出キット。

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