JP3165788B2 - 歯周病の診断キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、歯周病の診断キ
ットに関し、特にラクトフェリンやミエロペルオキシダ
ーゼを測定することにより歯周病の診断を行うキットに
関する。

【０００２】

【従来の技術】歯周病は、治癒可能な時期に早期発見し
て治療を開始することが歯を失わないために重要であ
る。歯周病の診断は、従来、歯周ポケットの深さを用手
法で測定する方法や歯周ポケットに存在する歯周病関連
病原菌を検出する方法が主に行われてきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、歯周ポ
ケットの深さを用手法で測定する方法で精度の良い測定
をするためには、測定する人間の熟練が必要であり、人
手に頼るため、処理能力が低いという欠点がある。ま
た、歯周ポケットの歯周病関連病原菌を検出する方法
は、大量処理が可能であるが、原因となる菌が１種類で
はないことなどの理由ですべての歯周病を診断すること
は困難である。この発明は、これらの問題点に着目して
なされたものであって、上記の従来の方法にかわる歯周
病の診断キットを提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、請求項１の発明では、歯周ポケット中の好中球に
由来するラクトフェリンを測定対象としている。本発明
者の研究によると、歯周病患者において歯周ポケット中
のラクトフェリンが健常者よりも高値を示し、なおかつ
病状の悪化で増加することが確認されている（図１）。
したがって、歯周ポケット中のラクトフェリンを測定す
ることにより、歯周病を診断することが可能となる。ラ
クトフェリンは、好中球の顆粒に含まれる蛋白であり、
歯周ポケット中のラクトフェリンの試料には、歯周滲出
液、歯周ポケット部プラーク、唾液などの歯周ポケット
成分が含有される試料が利用できる。なお、歯周ポケッ
ト中のラクトフェリンを測定するには、酵素免疫法やラ
テックス凝集反応、免疫比濁法など日常、多用されてい
る免疫学的測定法を用いることができる。

【０００５】また、請求項２の発明では、歯周病におい
て歯周ポケット中に増加するミエロペルオキシダーゼを
測定対象としている。歯周ポケット中のミエロペルオキ
シダーゼを測定するには、酵素免疫法やラテックス凝集
反応、免疫比濁法など日常、多用されている免疫学的測
定法を用いることができる。測定対象の試料としては歯
周滲出液、歯周ポケット部プラークなどの歯周ポケット
成分が含有される試料（唾液を除く）が利用できる。今
回、本発明者は、歯周病において歯周ポケット中のミエ
ロペルオキシダーゼが正常よりも高値を示し、なおかつ
病状の悪化で増加することを発見した（図２）。しか
も、歯周ポケットの深さを中心に歯周病診断を行うＣＰ
ＩＴＮ法とも関連性が高いことが確認された（図３）。
以上のごとく、歯周ポケット中のミエロペルオキシダー
ゼを測定することにより、歯周病の診断ができる。

【０００６】

【発明の実施の態様】

（１）酵素免疫法によるラクトフェリンの測定 〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕マイクロプレー
トの各ウェルに抗ラクトフェリン抗体５μg/mlを含むト
リス−塩酸緩衝液(0.05M pH8.4) を 100μl ずつ分注
し、一夜４℃で放置して抗体を物理吸着の原理でウェル
に固相化する。 〔酵素標識抗体の調製〕別途、過ヨーソ酸法により、ア
ルカリホスファターゼを抗ラクトフェリン抗体に標識し
て調製する。 〔歯周ポケット中ラクトフェリン測定〕各ウェルに 0.1
％の牛血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M
pH7.5) で希釈した歯周ポケット成分含有サンプルを 1
00μl 分注し、混和した後、37℃で１時間反応させる。
次にマイクロプレートをTween20 を0.05％含むトリス−
塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄する。その後、酵
素標識抗ラクトフェリン抗体 2.5μg/mlおよび１％の牛
血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水(0.1
M pH8.0)を 100μl ずつ分注し、混和した後、37℃で１
時間反応させる。次にマイクロプレートをTween20 を0.
05％含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄
する。その後、Kind-King 法の基質緩衝液 100μl を各
ウェルに加え、37℃で30分間反応させる。ここで基質緩
衝液は、Disodium Phenyl phosphate 0.215gと4-aminoa
ntipyrine 0.09g を炭酸緩衝液(0.05M pH10.15) 100ml
に溶解したものである。次いで、 100μl の呈色液を各
ウェルに加えて、呈色させる。ここで呈色液は、200ml
の脱イオン水に 2.6ｇのホウ酸を溶解させた後、0.38ｇ
のPotassium Ferricyanideを溶解させたものである。最
後に、各ウェルの呈色をマイクロプレート用比色計を用
いて510/630nm の波長で比色し検量線から歯周ポケット
中ラクトフェリン濃度を算出する。

【０００７】（２）酵素免疫法によるミエロペルオキシ
ダーゼの測定 〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕マイクロプレー
トの各ウェルに抗ミエロペルオキシダーゼ抗体５μg/ml
を含むトリス−塩酸緩衝液（0.05M pH 8.4）を 100μl
ずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を物理吸着の原理
でウェルに固相化する。 〔酵素標識抗体の調製〕別途、過ヨーソ酸法により、ア
ルカリホスファターゼを抗ミエロペルオキシダーゼ抗体
に標識して調製する。 〔歯周ポケット試料の採取〕濾紙片を歯周ポケットに差
し込み、歯周ポケット成分を染み込ませ、容器中で0.1
％の牛血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝液（0.05
M pH 7.5）を用いてミエロペルオキシダーゼを抽出す
る。 〔歯周ポケット中ミエロペルオキシダーゼの測定〕各ウ
ェルに歯周ポケット成分含有サンプルを 100μl 分注
し、混和した後、37℃で１時間反応させる。次にマイク
ロプレートをTween 20を0.05％含むトリス−塩酸緩衝液
（0.05M pH7.5）で３回洗浄する。その後、酵素標識抗
ミエロペルオキシダーゼ抗体 2.5μg/mlおよび１％の牛
血清アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水（0.
1M pH 8.0)を 100μl ずつ分注し、混和した後、37℃で
１時間反応させる。次にマイクロプレートをTween 20を
0.05％含むトリス−塩酸緩衝液（0.05M pH7.5）で３回
洗浄する。その後、Kind-King 法の基質緩衝液 100μl
を各ウェルに加え、37℃で30分間反応させる。ここで基
質緩衝液は、Disodium Phenyl phosphate 0.215gと4-am
inoantipyrine 0.09g を炭酸緩衝液（0.05M pH 10.15）
100ml に溶解したものである。次いで、 100μl の呈色
液を各ウェルに加えて、呈色させる。ここで呈色液は、
200ml の脱イオン水に2.6gのホウ酸を溶解させた後、0.
38g のPotassium Ferricyanideを溶解させたものであ
る。最後に、各ウェルの呈色をマイクロプレート用比色
計を用いて510/630nm の波長で比色し検量線から歯周ポ
ケット中ミエロペルオキシダーゼ濃度を算出する。

【０００８】

【発明の効果】以上説明したように、歯周ポケット中の
ラクトフェリンやミエロペルオキシダーゼを測定すれ
ば、歯周病の診断および病状の把握ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】歯周ポケット中のラクトフェリン値の比較図で
ある。

【図２】歯周ポケット中のミエロペルオキシダーゼ値の
比較図である。

【図３】歯周ポケット中ミエロペルオキシダーゼ値とＣ
ＰＩＴＮ法の関連性を示す図面である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗ラクトフェリン抗体を備えて、酵素免疫
   法、ラテックス凝集反応法、免疫比濁法などの免疫学的
   方法によって歯周ポケット中のラクトフェリンを測定す
   る歯周病の診断キット。
2. 【請求項２】抗ミエロペルオキシダーゼ抗体を備えて、
   酵素免疫法、ラテックス凝集反応法、免疫比濁法などの
   免疫学的測定法によって、歯周ポケット中のミエロペル
   オキシダーゼ（試料として唾液を除く）を測定する歯周
   病の診断キット。